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GUIA DE PRÁCTICA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGIA
2019- II
Introducción
Reglas de bioseguridad en el laboratorio 02
Práctica 1: Preparación de material para microbiología, 04
Coloraciones simples y compuestas. 11
Preparación de medios de cultivo. 17
Práctica 2: Métodos de siembra 23
Observación de colonias 26
Práctica 3: Aislamiento e identificación de Staphylococcus 28
Práctica 4: Aislamiento e identificación de Streptococcus (S. pyogenes, S. 30
agalactiae, S. pneumoniae). Enterococcus.
Práctica 5: Aislamiento e identificación de Bacillus 32
Práctica 6: Aislamiento e identificación de Listeria. 34
Práctica 7: Baciloscopia. 36
Práctica 9: Aislamiento e identificación de Neisserias 40
Práctica 10: Aislamiento e identificación de Enterobacterias.I 42
Práctica 11: Aislamiento e identificación de Enterobacterias II 44
Práctica 12: Aislamiento e identificación de Bacilos gram negativos no 46
fermentadores.
Práctica 13: Aislamiento e identificación de V.cholerae, V.parahaemolyticus. 48
Aeromonas
Práctica 14: Aislamiento e identificación de Campylobacter. Haemophilus . 50
Práctica 15: Aislamiento e identificación de Clostridium
El objetivo de esta guía es dar al estudiante una ayuda para el trabajo que realizará a lo
largo de su preparación en el curso de Microbiología, así mismo mantener una estrecha
comunicación entre el estudiante con el profesor de prácticas.
7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o
material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá
tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceros, manijas de cajones o puertas,
cuadernos, etc.
9. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán
anteojos de seguridad. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o
puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto.
13. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente
ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas.
14. Está prohibido descartar líquidos o material biológico por los desagües de las piletas. En
cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos.
15. Todos los cultivos, stocks y otros desechos biológicos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo,
mediante autoclave.
LA INCUBADORA
Equipo que se caracteriza por tener temperaturas fijas o que fluctúan en un rango muy corto
+- 0.2°C, la cual esta regulada mediante un termostato, se utiliza para mantener los cultivos a
una temperatura adecuada según los requerimientos del germen con el cual se está
trabajando.
LA REFRIGERADORA
Equipo para proporcionar ambientes de temperaturas bajas, se utiliza con fines de
conservación para el material biológico, medios de cultivo ya preparados, reactivos, etc.
EL BAÑO MARIA
Equipo que se utiliza para mantener temperaturas homogéneas que transmitirán calor en
forma indirecta. El rango de temperatura se puede graduar de acuerdo a la utilidad que se le
va a dar, para licuar medios de cultivo por ejemplo se utilizará entre 70°C y 90°C.
DESTILADOR DE AGUA / DESIONIZADOR
Sirve para obtener agua libre de impurezas para la preparación de los medios de cultivo y
reactivos, se puede utilizar cualquiera de los dos aparatos, pero se debe controlar el agua
obtenida.
LA CENTRIFUGA
Equipo que se caracteriza por proporcionar fuerzas centrífugas que permitirán al usuario
separar sustancias a diferentes velocidades y rangos de temperatura predeterminados, para
procesar una muestra de orina se requiere 3,000 r.p.m. x 5'
LA BALANZA
Instrumento de precisión que se utiliza para determinar el peso de diferentes sustancias,
existen diversos tipos de acuerdo a las necesidades, con diferente sensibilidad. Hay balanzas
mecánicas y electrónicas.
EL POTENCIOMETRO
Instrumento de precisión que sirve para determinar la concentración de iones (pH) en
diferentes soluciones, sustancias o medios de cultivo (líquidos o sólidos), dependiendo de la
sustancia que se quiera medir el pH se elige el tipo de electrodo a utilizar.
EL MICROSCOPIO ÓPTICO:
Sus partes:
Sistema óptico
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico
SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.
REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que
consigue el enfoque correcto.
CALOR HUMEDO: también se utiliza para la destrucción de los microorganismos siendo, como
ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho más eficaz que el calor seco; con este
tratamiento las enzimas se desnaturalizan rápidamente, al igual que las membranas celulares.
Además, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresión, es un eficaz transmisor
de calor al interior de la célula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios métodos:
Ebullición, vapor fluente y vapor saturado a presión. Ejemplo el autoclave.
I) Ebullición: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10
minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas
bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el baño
María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando no
se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos mejores, tanto
para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios de cultivo que no puedan
esterilizarse en autoclave.
II) Vapor fluente (tindalización) Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar
medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que
pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se realiza el proceso
durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos
tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (<100ºC) durante 30-45 minutos
destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas
termorresistentes.Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan después del
calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes ciclos.
III) Vapor saturado a presión: La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua
saturado que se somete a una atmósfera extra de presión sobre la presión atmosférica
normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100ºC a 121ºC y
consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo los termófilos extremos) en
un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es también necesaria para la destrucción de
las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica y que pueden
sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC durante horas. El vapor de agua difunde por
ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenómeno que
se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta técnica de esterilización requiere el
uso del autoclave.
1.2 Competencias
Conoce el funcionamiento de los equipos utilizados en el laboratorio de microbiología.
Conoce la importancia de la esterilización y familiarizarse con el manejo de los
procedimientos más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo.
1.3 Materiales y equipos
Microscopio
Placas Petri 15 x 100
Tubos de prueba 13 x 100, 16 x 150
Pipetas serológicas 1, 5 y 10 mL
Pipetas Pasteur
Matraz 500 mL
Balón 250 mL
Tubos tapa rosca
Gradillas para tubos
Algodón
Detergente
Probeta 500 mL
Papel Kraft
Escobillas de tubos
Guantes domésticos
1.4 Procedimiento
Mantenimiento y Precauciones
Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de
observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la
misma y dejarlo cubierto con su funda.
Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para
evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe
guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con
un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.
Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el
objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En
cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite
ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-
acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos
disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
B)Material De Vidrio
El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin
contaminar una vez esterilizado:
- El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc., se tapan con algodón o tapones
metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se usa
algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeable (Kraft). En el caso de las pipetas,
se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro, evitando la
contaminación del operario con los microorganismos de la muestra y que éste a su vez
contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o
bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas.
Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno.
- El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo,
las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de
etileno o radiaciones.
- Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan,
generalmente, en autoclave.
1.-Tinción simple: Aquella en la que sólo se utiliza un colorante, que generalmente tiñe a los
microorganismos.
Si el colorante proporciona una coloración al fondo, sin alterar el aspecto de las células, que
permanecen sin teñir, la tinción se denomina negativa.
La tinción simple permite observar morfología celular, tamaño y agrupación de los
microorganismos.
2.-Tinción diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que permiten
distinguir tipos de microorganismos en función de diferencias en su estructura y composición
química. La tinción de Gram y la ácido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la
pared celular bacteriana, son las más utilizadas.
1.- Un primer colorante básico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y
que reacciona con las células (cargadas negativamente), coloreándolas.
2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las células. Parece
ser que el mordiente (solución diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un
compuesto insoluble coloreado en el interior de la célula.
4.- Un colorante de contraste, igualmente de carácter básico pero de distinto color que el
primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta
con el color violeta del primer colorante, y que teñirá sólo a las bacterias decoloradas en el
paso anterior.
Es otra importante tinción diferencial que permite distinguir aquellas bacterias que una vez
teñidas resisten a la decoloración por ácidos y alcoholes.
Esta tinción tiene una gran aplicación en clínica, ya que permite diferenciar microorganismos
patógenos como Mycobacterium tuberculosis, en muestras patológicas como esputos y
secreciones bronquiales.
Técnica general
En la mayoría de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a continuación:
1- Realizar una extensión con el asa de siembra esterilizada, para ello se toma una pequeña
gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un portaobjetos limpio. Si el cultivo procede
de un medio sólido, se coloca una gota de agua en el portaobjetos y se mezcla con una
pequeña porción de la muestra hasta formar una suspensión homogénea, extendiéndola con el
fin de obtener una fina película. Posteriormente, se deja secar al aire o en la parte alta de la
llama del mechero, pero no se debe eliminar el líquido calentando el portaobjetos a la llama
porque pueden distorsionarse las células.
2- Fijar la muestra. La fijación tiene como finalidad coagular el protoplasma de las células y
hacer que se adhieran al portaobjetos, siendo el calor el método más utilizado para la
fijación, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol (metanol) u otros
compuestos químicos. La fijación con calor se recomienda cuando se trabaja con muestras de
un cultivo sólido; en muestras obtenidas de un cultivo líquido es mejor hacer la fijación con
metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor número de células. Es necesario que
la extensión se haya secado antes de proceder a la fijación, por ello se debe esperar hasta
que el líquido de la misma se evapore. La fijación por calor se lleva a cabo pasando varias
veces la preparación seca a través de la llama de un mechero, con la extensión hacia arriba.
El calor desnaturaliza las proteínas y suele matar al microorganismo.
Es importante no excederse en este proceso, para evitar que las bacterias se deformen o se
rompan, siendo suficiente que el portaobjetos se note caliente sobre el dorso de la mano,
pero no demasiado.
3- Realizar la tinción. Para ello es necesario cubrir la preparación con abundante colorante y
dejarlo actuar durante algún tiempo.
4- Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teñidas para eliminar el exceso de
colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del portaobjetos, que se
mantendrá inclinado durante este proceso. No se debe dirigir el agua con demasiada fuerza
sobre la preparación para no arrastrar la muestra.
5- Eliminar el exceso de agua del portaobjetos golpeándolo ligeramente con cuidado por el
canto.
Permitir que se seque la preparación, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien
dejándola secar al aire, aunque lleva más tiempo.
Técnica de Gram
Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que deberán encontrase en fase
exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijación,
siguiendo la técnica ya descrita.
Tinción negativa
1- Colocar un asa de solución de nigrosina o de tinta china en un portaobjetos y mezclar con
un asa de cultivo bacteriano.
2- Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la muestra evitando que se formen burbujas y
presionar el mismo con un papel de filtro hasta obtener una capa fina del material que se va
a observar, absorbiendo el papel secante el exceso de la muestra. Tirar el papel en un
contenedor para material contaminado y lavarse las manos con jabón desinfectante.
3- La observación de la muestra se hace con objetivo de 40 aumentos o con objetivo de
inmersión, utilizando en este caso, una gota de aceite de inmersión. Conviene cerrar el
diafragma del condensador para incrementar el contraste de las células. Para retrasar la
evaporación de la muestra deben sellarse los bordes del cubreobjetos con parafina.
2.5 Resultados
Técnica de Gram
Las bacterias Gram positivas aparecerán coloreadas de violeta, mientras que las Gram
negativas se observan de color rosa.
Técnica de Ziehl Neelsen
Los bacilos ácido-alcohol-resistentes son largos y finos y aparecerán en grupos, teñidos de
color rojo, mientras que las células que no son ácido-alcohol-resistentes aparecerán de color
azul, tras la tinción del contraste.
Técnica de Wirtz Conklin
Las esporas de B.subtilis son ovaladas y aparecen en posición subterminal no deformante,
coloreadas de verde, en el interior de las formas vegetativas, con forma bacilar y que están
teñidas de rosa.
Método de Löeffler
Observe los gránulos metacromáticos coloreados de azul intenso, mientras que el citoplasma
celular aparece de color azul más claro.
Método de Albert
En este caso los corpúsculos metacromáticos se observan como puntos verde oscuro o negros
dentro de una célula de color verde pálido.
2.6 Cuestionario
1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades?
2. ¿Por qué se le llama a un colorante: básico o ácido?
3. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?
4. De qué manera influye el pH en la coloración?
5. Cuál es la diferencia entre bacterias gram positivas y gram negativas, cuál es el
fundamento de la coloración Gram?
6. 2. Qué es un mordiente para qué se utiliza
7. Fundamente la coloración de microorganismos alcohol ácido resistente
8. Cómo realizaría el control de calidad de las tinciones?
9. Mencione ejemplos de tinciones estructurales
Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio,
la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de
agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse:
A) Por su consistencia:
1.-Medios líquidos o caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes
necesarios para el crecimiento de los microorganismos.
2.-Medios sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente
solidificante.
El agar es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodofíceas de origen marino cuyas
propiedades son de gran utilidad en la preparación de medios de cultivo sólidos: No es
degradado enzimáticamente por los microorganismos (a excepción de algunos
microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100ºC y permanece en
estado líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50ºC. Además, una vez
solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se licúe.
Generalmente el agar se añade, para solidificar un medio líquido, en una concentración del
1,5%. Los medios con agar se envasan en tubo o en placa de Petri.
3.-Medios semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente
solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen
una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los
microorganismos.
2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de
productos químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio
definido que permita el desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como
E. coli, debería contener sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2,
Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se
encuentran generalmente presentes como contaminantes de los productos químicos antes
citados, en cantidades suficientes para el crecimiento.
C) Por su utilización:
Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se
pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos
nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra
un microorganismo que se encuentre en un bajo número y que pueda ser enmascarado por
otros microorganismos presentes en un número más elevado. En esos casos es recomendable
utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que,
de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser:
3.6 Cuestionario
1.¿Cuáles son las recomendaciones para preparar agar sangre y agar chocolate?
MÉTODOS DE SIEMBRA
OBSERVACIÓN DE COLONIAS
2.1Marco teórico
Las muestras clínicas pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razón se
utilizan diversas técnicas para separar un microorganismo de otro y obtenerlos en cultivo puro,
para luego identificarlos estudiando sus características de cultivo, bioquímicas, susceptibilidad
a antibióticos, etc. La siembra por estrías si se ejecuta correctamente es el método más útil
para obtener colonias aisladas y cultivos puros.
Definiciones
Siembra.- Es la acción de poner en contacto bacterias con un medio de cultivo; en el cual
luego de un período de incubación se van a desarrollar colonias. Los fines de la siembra son los
de aislamiento de la bacteria, su enriquecimiento, recuento poblacional y estudios
bioquímicos.
Inóculo.- Es la porción de muestra que se siembra.
Resiembra y repicaje.- Es cuando se extrae con el asa de siembra una fracción de las colonias
a partir de un medio sólido o de un medio líquido y se lleva este inóculo a otro medio líquido o
sólido en el cual se evidencia el desarrollo de colonias por gérmenes de una sola especie,
obteniéndose el aislamiento bacteriano.
Cultivo puro.- Es aquel que consta de una sola especie bacteriana.
Cepa.- Es una especie bacteriana plenamente identificada por sus características morfológicas,
fisiológicas, bioquímicas y serológicas.
2.2Competencias
Utiliza las técnicas de siembra de muestras y aislamiento para la obtención de cultivos puros
de bacterias.
2.3Materiales y equipos
Placas petri con agar tripticasa de soya
Tubos con agar tripticasa de soya en plano inclinado
Tubos con caldo tripticasa de soya en tubo de 13 x 100
Tubos con caldo tripticasa de soya en tubos de 16x150
Hisopos estériles
Frasco con agar tripticasa de soya 50mL a 45ºC
Pipeta de 5mL estéril
Propipeta
Asa de siembra en aro
Asa de siembra en punta
Agar TSI
Agar MIO
4.4 Procedimiento
2.5Resultados
Observe el desarrollo microbiano en forma de zigzag.(Técnica de estria).
Observe el desarrollo microbiano abundante al inicio y en los demás cuadrantes observe las
colonia
separadas (Técnica de dispersión agotamiento).
Observe el desarrollo en todo la superficie del medio en forma homogénea (Placa vertida).
Observe el desarrollo en todo la superficie del medio en forma homogénea (Siembre por
diseminación).
Observe el desarrollo bacteriano en el trazo de siembra ( puntura)y el metabolismo en todo el
medio.
Observe el desarrollo de la bacteria en medio líquido:
a) Turbidez total
b) Formación de película en la superficie
c) Desarrollo en el fondo
2.6Cuestionario
2.2 Competencias
2.6 Cuestionario
1. Describa las características macroscópicas de las cepas estudiadas. Realizar esquemas de sus
observaciones
El género Staphylococcus son un grupo de cocos gram positivos que se agrupan en forma
irregular (racimos), son habitantes comunes de la piel y membrana mucosas del hombre y de
muchos animales, razón por la cual frecuentemente están involucrados en una serie de
infecciones en el ser humano.
3.2 Competencias
3.4 Procedimiento
Recibidas las cepas proceda a realizar un extendido y coloréelo por el método de Gram.
Observe y grafique la morfología, disposición y coloración.
Inocular un tercio de la placa de Agar Sangre para cada cepa, de manera que se obtengan
colonias aisladas.
Sembrar en un tercio de la placa de Agar Manitol salado para cada cepa, no olvidar que este
medio posee alta selectividad y el inóculo debe ser mayor.
3.5 Resultados
Examine las placas de agar sangre: Observe el color, tamaño y actividad hemolítica de las
colonias.
Prepare y examine un extendido coloreado por el método de Gram de una de estas colonias,
anote sus observaciones.
Examine la placa de agar manitol salado, recuerde que en este medio crece casi
exclusivamente estafilococo. Observe si se produce cambio en las colonias y en la coloración
del medio debido a la fermentación del manitol, anote e interprete los resultados.
Con una aguja de cultivo o con un mondadientes tome una porción de una de las colonias bien
aisladas y transfiéralo a la superficie de una lámina portaobjetos, añada una o dos gotas de
peróxido de hidrógeno al 3%, la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas
indica una reacción de catalasa positiva. Observe y grafique su resultado.
Examine la placa de agar DNAsa, bañe la placa con ácido clorhídrico 1N, se revelaran zonas
claras alrededor de las colonias que son desoxiribonucleasas positivas, observe e interprete los
resultados.
Coloque una gota de suero fisiológico estéril sobre una lámina porta-objeto, emulsione
suavemente una porción de una de las colonias en estudio. Coloque una gota de plasma junto a
la gota de suspensión bacteriana, mezcle bien. Rote el portaobjetos suavemente observando si
se produce la formación de grumos lo cual indicaría una prueba positiva para la coagulasa en
lámina.
Tome 2 a 3 colonias de la placa de agar sangre e inocule un tubo de caldo plasma, agite e
incube a 37°C, observando cada medía hora durante las primeras cuatro horas para ver si se
produce la formación de un coagulo visible dentro del tubo. Las pruebas que sean negativas a
las cuatro horas deben observarse después de 24 horas de incubación.
Mida el halo de inhibición con el disco de novobiocina para cada cultivo de Staphylococcus.
Recordando las características de los diferentes tipos de estafilococos, realice la identificación
de las cepas reportando sus resultados.
4.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen a los
géneros Streptococcus y Enterococcus..
4.4 Procedimiento
4.5 Resultados
Observe el crecimiento de los cultivos en los diferentes medios, anote las características
de la colonia, el tamaño y la presencia de hemólisis.
Realice una coloración de Gram de cada una de las colonias.
Realice la prueba de la catalasa con cada una de las colonias.
Examine la placa de agar sangre en la cual se colocó el disco de Bacitracina y Discos de
Trimethoprim- sulfamethoxazole, verifique la sensibilidad:
Amplia zona de inhibición alrededor del disco = Sensible
Crecimiento alrededor del disco = Resistente
Observe lo sucedido alrededor del disco de Optoquina:
Sensible = Zona de inhibición alrededor del disco > 14 mm
Resistente = Sin crecimiento alrededor del disco o halo menor de 14 mm.
Haga una suspensión con las colonias de S. pneumoniae y Enterococcus en suero
fisiológico y añada unas gotas de desoxicolato de sodio al 10% y observe:
Positivo = Lisis total de la colonia con aclaración del tubo con suero fisiológico.
Negativo = No ocurre nada o se aclara muy ligeramente
Examine la placa en la que sembró la cepa de Streptococcus del grupo B. Una prueba de
CAMP positiva estará dada por una intensificación de la hemólisis, que en la zona de
intersección con la cepa de Staphylococcus, asumirá la forma de una cabeza de flecha.
Examine la placa con agar Bilis esculina. Una prueba positiva (hidrólisis de la esculina)
estará dada por la aparición de un halo marrón o negro alrededor de la colonia.
Anote sus resultados
4.6 Cuestionario
5.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen al género
Bacillus.
Una vez recibida las muestras, siembre ambas cepas en agar sangre. Incube a 37°C por 24
horas.
Del mismo modo siembre en las placas de agar almidón. Incube a 37°C por 24 horas
Siembre por puntura en el medio SIM y en los tubos con gelatina nutritiva, incube a 37°C por 24
horas.
Siembre las cepas en los tubos con caldo nutritivo, incube a 37°C por 24 horas.
5.5 Resultados
Revise las placas de agar sangre y observe las colonias de Bacillus que son grandes, blanco
grisáceas, de borde irregulares y que tienden a expandirse. Verifique la producción de
hemólisis. Es una característica útil para diferenciar al B. anthracis, que no produce hemólisis,
de los saprófitos que provocan beta hemólisis.
Tome una porción de las colonias en agar sangre y realice un extendido en dos láminas
portaobjetos; coloree una por el método de Gram y las otras para coloración de esporas con
Wirtz Conklin.
Observe: En la lámina coloreada con Gram se observan los bacilos Gram positivos, en cadenas,
en los cuales las esporas se observan como áreas sin colorear dentro de la célula.
En la lámina coloreada con Wirtz Conklin, las esporas se observan de color verde sobre un fondo
rojo tomado por la bacteria.
Sobre el desarrollo en la placa de agar almidón vierta unas gotas de lugol hasta bañar la placa,
observe. La aparición de un halo claro alrededor de las colonias indicaría que el almidón del
medio ha sido hidrolizado.
5.6 Cuestionario
6.4 Procedimiento
Día 1
Siembre la cepa en las placas de agar sangre y de medio selectivo tratando de obtener colonias
aisladas. Incubar a 37°C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura el medio SIM.
Siembre las cepas en los medio de diferenciación bioquímica. Incubar por 24 horas a 37°C.
Hacer frotises a partir del agar utilizando solución salina y colorear por gram
Día 2
6.5 Resultados
6.6 Cuestionario
BACILOSCOPÍA
7.2 Competencias
Realiza correctamente el procedimiento de preparación y coloración de láminas para la
investigación de bacilos alcohol ácido resistentes, realizar correctamente la lectura de las
baciloscopías.
7.3 Materiales y equipos
Muestras de esputo positivo
Bajalenguas de madera
Fenol al 5%
Batería para coloración de Ziehl Neelsen
Mascarillas descartables N95
Mechero de alcohol
Láminas portaobjetos
Frasco con arena y fenol
Cábina de flujo laminar
Hoja de papel periódico
Lápiz de cera
Aplicador
7.4 Procedimiento
Coloración
Se considera campo microscópico útil aquel en el cual se observa elementos celulares de origen
bronquial (leucocitos, fibras mucosas o células ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos
elementos no deben contabilizarse en la lectura.
Las muestras de esputo deben autoclavarse o incinerarse antes de ser descartadas.
10.5 Resultados
Informe de resultados
Se utiliza la siguiente escala semicuantitativa:
Negativo No se encuentran bacilos ácidos alcohol resistentes (BAAR) en 100
campos microscópicos observados
Positivo 1+ Menos de un BAAR por campo, en 100 campos observados (de 10-99
BAAR).
7.6 Cuestionario
Dos especies del género Neisseria son de mayor importancia médica N. gonorrhoeae y N.
meningitidis, que producen infecciones a nivel del tracto urogenital y meningitis
respectivamente.
El hombre es el único reservorio conocido de las dos especies mencionadas.
9.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen al género
Neisseria.
9.5 Resultados
9.6 Cuestionario
1. Cite dos recomendaciones en la toma de muestra para el aislamiento de Neisseria
2. Medios Selectivos para Neisseria
3. Fundamento de la Oxidasa
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen a la familia
de las enterobacterias.
10.4 Procedimiento
Recibida las cepas proceda a hacer una emulsión de cada una en caldo nutritivo.
Siembre cada una de las cepas en una placa de agar Mac Conkey y agar Eosina Azul de metileno
(EMB) tratando de obtener colonias aisladas. Incubar a 37°C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura en los tubos de TSI y LIA, el profesor de prácticas le indicará la
forma correcta de hacerlo.
Prueba de IMVIC: Siembre cada una de las cepas en caldo peptonado, un tubo con caldo
glucosado y un tubo con Citrato de Simmons, incubar por 24 horas a 37°C.
Observe el desarrollo obtenido en el agar Mac Conkey y EMB, identifique las colonias lactosa
positivas en el agar Mac Conkey y la presencia de brillo metálico en el EMB.
TSI: Observe las reacciones ocurridas en el medio, interprete y grafique los resultados.
Las bacterias que fermentan la glucosa dan una reacción alcalina en el plano inclinado y
ácida en el fondo (K/A).
Si además fermenta glucosa y/o sacarosa se produce acidez suficiente para acidificar tanto el
fondo como el plano inclinado (A/A).
La producción de gas se verifica por la aparición de cavidades en el medio y la producción de
hidrogeno sulfurado (H2S) como un precipitado de color negro (que pueden ir de 1 a 4+).
LIA: Observe las reacciones ocurridas en el medio, interprete y grafique los resultados.
Las bacterias que descarboxilan la lisina originan una reacción alcalina (color púrpura) en
todo el medio (K/K).
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina producen un plano inclinado alcalino y un
fondo ácido (K/A).
Los cultivos de Proteus, Providencia y Morganella producen un plano inclinado de color rojo y
un fondo ácido (R/A).
PRUEBA DE ROJO DE METILO: A tubo con caldo glucosado separar la mitad en otro tubo, y
agregar 5 gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%.
Positivo: El medio cambia a un color rojo magenta.
Negativo: El medio queda de color amarillo o ligeramente rosado.
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER: Al tubo que se había separado caldo glucosado, se debe añadir
0.2 mL de alfa naftol al 5% y 0.2 mL de Hidróxido de potasio al 40%. agitar bien el tubo y dejarlo
en reposo
Positivo: Presencia de color rosa.
Negativo: No hay cambio de color.
UTILIZACION DE CITRATO: Observar la presencia de crecimiento en el plano inclinado y cambio
en el color del medio frente a un tubo no inoculado.
Positivo: Presencia de color azul brillante y crecimiento en el medio de cultivo.
Negativo: No se observa crecimiento ni cambio de color.
CALDO UREA: Observe las reacciones ocurridas en el medio, las bacterias productoras de ureasa
hidrolizan la urea para formar amoniaco:
Positivo: Medio de color rojo
Negativo: El medio no cambia de color.
MEDIO SIM PRUEBA DE INDOL: Añadir 0.2 mL de reactivo de Kovacs al tubo con caldo peptonado
inoculado, agitar y dejar reposar, observar el resultado.
Positivo: Se forma un anillo color rojo cereza en la parte superior del medio.
Negativo: No se observan cambios en el color del medio.
MEDIO SIM PRUEBA DE MOVILIDAD: Observar el crecimiento de la bacteria en el medio semisólido
Positivo: Turbidez en el medio
Negativo: Solo se observa crecimiento en la línea de puntura.
Enterobacteria
Gram Pruebas Bioquímicas
Morfología de colonias en cada
medio
E. coli
10.6 Cuestionario
1. ¿Cuáles son las pruebas que comparten todas las especies pertenecientes a la
Familia Enterobacteriaceae?
2. Explique reacciones en TSI
3. Explique reacciones en LIA
4. Explique reacciones en Citrato
5. Explique reacciones en SIM
6. Explique reacciones en RM-VP
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen a la familia
de las enterobacterias.
Placas de agar SS
Placas de agar XLD
Placas de agar Mac Conkey con sorbitol
Placas de agar Mac conkey
Tubos con caldo nutritivo
Placas con agar nutritivo
Tubos con caldo peptonado
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubos con Citrato de Simons
Tubos con medio SIM
Tubos con agar urea
Reactivo de kovacs
Cloruro de sodio
Lámina portaobjeto
Set de Gram
Reactivo de oxidasa
11.4 Procedimiento
Recibida las cepas proceda a hacer una emulsión de cada una en caldo nutritivo.
Siembre cada una de las cepas en una placa de agar Mac Conkey Sorbitol. Agar SS, Agar XLD
tratando de obtener colonias aisladas. Incubar a 37°C por 24 horas.
11.5 Resultados
Enterobacteria
Gram Pruebas Bioquímicas
Morfología de colonias en cada
medio
Salmonella typhi
11.6 Cuestionario
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen Al grupo de
bacilos gram negativos no fermentadores.
Siembre una placa de agar sangre y otra de Mac Conkey con las cepas proporcionadas.
Incubar a 37°C por 24 horas.
Por cada cepa inocule tubos de TSI, LIA, SIM y 2 tubos de medio O/F con glucosa. El OF debe
inocularse con una aguja de punción que atraviese el medio hasta llegar casi al fondo del tubo y
cubrir uno de los tubos con una capa de 1 mL de vaselina líquida estéril, dejando el otro tubo
expuesto al aire. Incubar a 37°C por 48 horas.
Inocule por cada cepa un tubo de agar Citrato de Simmons.
12.5 Resultados
Observe y anote las características de las colonias que desarrollaron tanto en las placas de agar
sangre como en las de agar Mac Conkey.
12.6 Cuestionario
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen al género
Vibrio.
Cepas:
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
Aeromona caviae
Aeromona hydrophila
Haga un extendido del cultivo recibido y colorearlo por el método de Gram. Observe y grafique.
Prepare una suspensión de la bacteria e inocule en los medios de cultivo e incube a 37°C por 24
horas.
Con una aguja de puntura tome una de las colonias e inocule los tubos con medios diferenciales y
la batería de tubos para evaluar el crecimiento en presencia de sal. Coloque una tira de papel de
filtro impregnado en reactivo de Kovacs en la boca del tubo de LIA. Asimismo inocule el tubo de
TSA.
Incube a 37°C por 18 a 24 horas.
13.5 Resultados
Examine las placas de agar TCBS, dibuje el color y tamaño de las colonias, interprete sus
resultados.
Observe las reacciones obtenidas en los medios inoculados, anote e interprete los resultados.
Verifique la producción de indol por el cambio de coloración a rosado del papel impregnado con
el reactivo de Kovacs
Impregne una tira de papel de filtro con reactivo de oxidasa y con ayuda de un mondadientes
tome una porción del desarrollo en TSA y tope con esta el papel impregnado, verifique el cambio
de coloración a azul del papel lo que indica una reacción positiva.
Coloque una gota de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lámina portaobjetos, luego tome
una porción del desarrollo en TSA y haga una emulsión en el desoxicolato, con cuidado levante
suavemente el asa y observe la formación de un filamento que asemeja un collar de perlas.
Anote sus resultados
Vibrio parahaemolyticus
Aeromona caviae
Aeromona hydrophila
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen al género
Campylobacter
14.4 Procedimiento
Los alumnos obtendrán muestras de heces de pollo, con un hisopo estéril, el cual colocaran en el
medio de transporte de Cary y Blair. A la vez realizarán dos extendidos de la muestra en láminas
portaobjetos para luego colorearlo por el método de Gram y el de Vago. El medio de transporte
se debe conservar a temperatura de refrigeración (2-8°C).
En el laboratorio sembrar las muestras en una placa de agar sangre con suplemento antibiótico
de Butzler según las indicaciones del profesor y colocar en una campana con atmósfera de
microaerofília incubando a 42°C por 48 horas.
14.5 Resultados
Las placas son examinadas a las 48 horas para observar las colonias características que son
planas, no hemolíticas, grises y que pueden seguir la línea de siembra.
Realizar un extendido de una de las colonias y colorearlo por el método de Gram. Observe la
morfología de Campylobacter que puede ser en forma de S o curvados (ala de gaviota). Grafique
los resultados.
Tome una porción de una colonia con un mondadientes y colóquelo sobre una tira de papel de
filtro impregnado con reactivo de oxidasa, observe si se produce el cambio de coloración a azul
lo que indicaría una prueba positiva.
14.6 Cuestionario
1.¿Qué cuidados se debe tener para su aislamiento?
2. ¿Qué otro método se puede usar para aislar Campylobacter?
Es un huésped habitual del árbol respiratorio del ser humano únicamente. Hay varios tipos,
definidos por el tipo capsular (a, b, c d, e y f) y cepas no tipificables ni encapsuladas (estas
últimas pueden ser las causantes de la septicemia neonatal).
14.2 Competencias
14.4 Procedimiento
Una vez recibida las muestras siembre la cepa de Haemophilus en agar chocolate y agar
sangre, siembre en forma perpendicular la cepa de S. aureus en la placa de agar sangre.
Incube a 37°C por 24 horas.
Requerimiento de factor V y X: prepare una suspensión en caldo tripticasa soya. Teniendo
cuidado de no transferir medio al caldo. Remoje un hisopo de algodón estéril en la suspensión
y siembre por diseminación en una placa de agar tripticasa soya, y colocar discos conteniendo
factores V y X a una distancia de 2 cm. Incube a 37°C por 24 horas
14.5 Resultados
Revise las placas y observe las colonias en agar sangre (fenómeno de satelitismo). En agar
chocolate, H. influenzae aparece como colonias opacas grandes, planas, de incoloras a grises.
No hay hemólisis o decoloración aparente del medio. Las cepas encapsuladas son más
mucoides (acuosas) que las no encapsuladas, que aparecen como colonias compactas
grisáceas.
Revise la placa con los discos de papel conteniendo factores X y V; H. influenzae crecerá
entre los dos discos.
Tome una porción de las colonias y realice un extendido en láminas portaobjetos; coloree
por el método de Gram. Observe la presencia de cocobacilos Gram negativos.
14.6 Cuestionario
Se puede definir a las bacterias anaerobias como aquellas que para crecer en la superficie de
un medio de cultivo necesitan una atmósfera sin oxígeno, ya que este elemento es tóxico para
ellas. Con estos dos conceptos se puede inferir que existe un amplio abanico de
microorganismos, desde los muy tolerantes y resistentes hasta los extremadamente lábiles a
este gas.
El género Clostridium pueden encontrarse algunas especies en el suelo, agua, vegetales y
animales en descomposición, juegan un importante rol en los procesos de putrefacción.
Algunas especies son patógenos oportunistas y pueden producir enfermedad en el hombre
entre ellos está: C. perfringens (gangrena gaseosa), C. tetani, (tétano), C. botulinum,
(botulismo) y C. difficile, (colitis pseudomembranosa). En su forma activa segregan una
exotoxina poderosa responsable de las enfermedades que produce.
- Clostridium botulinum
Es móvil, con espora no terminal relativamente resistente al calor; produce una de las
más potentes toxinas y causa envenenamiento alimentario mortal. Debido a que las
esporas pueden transportarse vía aérea, pueden contaminar alimentos cárnicos,
vegetales y frutas antes de ser enlatados en condiciones anaeróbicas. Luego del sellado
de las latas, las esporas germinan y la bacteria libera su potente toxina. Las personas
afectadas experimentarán parálisis muscular y visión borrosa.
- Clostridium perfringens
- Clostridium tetani
Son móviles, con espora terminal. Las esporas pueden adquirirse por trauma en piel y si
existen condiciones anaeróbicas las células germinarán a su forma activa. En tejido
liberan una exotoxina, la tetanoespasmina que causa irregularidades en el sistema
nervioso, y contracción del músculo esquelético. La infección prolongada conduce a falla
respiratoria y finalmente la muerte. La inmunización es la mejor forma de prevenir la
infección a C. tetani en niños y adultos.
15.2 Competencias
Conoce el mecanismo de aislamiento e identificación de especies de Clostridium.
15.3 Materiales y equipos
CEPAS
Clostridium sp.
Día 1
Haga una suspensión de heces en alcohol al 50% y déjelo una hora a temperatura ambiente o
realice la suspensión en suero fisiológico y pongalo en baño maría durante 10 minutos.
Siembre dos placas de agar sangre anaerobio, una de las placas colóquela en la incubadora
en atmósfera normal.
La otra placa colóquela en la jarra de anaerobiosis, ponga el indicador, el catalizador y el
sobre de anaerobiosis; añadir el agua destilada al sobre y cerrar la jarra. Observar la
presencia de vapor de agua y el cambio del indicador de anaerobiosis. Incube a 37°C por 48
horas.
Día 2
Revise las placas y observe las colonias. Descríbalas
Tome una porción de las colonias y realice un extendido en láminas portaobjetos; coloree por
el método de Gram.
Realice una coloración para ver la presencia de esporas.
15.5 Resultados
a) Se observan bacilos Gram positivos formadores de esporas, típicamente largos, rectos o
ligeramente curvos con extremos ligeramente redondeados. Las esporas pueden ser
terminales o subterminales y deforman el soma bacteriano.
b)Se observan esporas de color verdes, terminales o subterminales que deforman el soma
bacteriano, el bacilo se observa de color rosado.
COLORACIÓN GRAM
AGAR SANGRE
CALDO TIOGLICOLATO DE
SODIO
15.6 Cuestionario
1.¿Cómo funciona la jarra de anaerobiosis?
2. ¿Cómo se prepara un indicador de anaerobiosis?
3.¿Cómo desarrolla Clostridium en un medio líquido?
1. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y Weissfeld, A.S. BAILEY SCOTT. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO.
12 Ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2009.
2. Guillén A., Arrelucé M., Sánchez L, Llamoga A. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE
LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO Y SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS. Lima,
Instituto Nacional de Salud, 2 Ed. 1995.
3. Guillen A., Guerrero C, Benites C. MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA. FTM UNFV,
2010.