EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

INTRODUCCIÓN:
En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies
para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores
moleculares , segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan información
sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos (schlötterer,2004). estos
marcadores se obtienen con ciertos metodos o tecnicas como la PCR o reacción en cadena
polimerasa y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la molécula del ADN
con un detalle sin precedentes (schlötterer,2004; hudson 2008 ). los datos moleculares han
permitido estudiar con mayor precision los patrones diversidad genetica y su distribucion; el
compartamiento; la seleccion natural ;las interacciones biologicas ; la composicion ; el
funcionamiento y dinamica de comunidades microbianas; las relaciones filogeneticas, entre
otros .

OBJETIVOS :

1. Comprender los principios de la extracción de ADN de células animales.

2. Realizar la extracción y purificación de ADN a partir de sangre periférica.
3. analizar los 2 protocolos o técnicas usadas para la extracción de ADN de las células
sanguíneas

MATERIALES:

● Muestra de 5ml de sangre periférica en tubo con EDTA

● solución lisis c
● solución para la preparacion de la columna
● solucion concentrada de prelavado
● solucion concentrada de lavado
● solucion de elucion
● proteinasa k
● tubos de coleccion
● tubos de ependorf
● columnas
● buffer de carga
● peinetas
● agarosa al 0,7%
● etanol al 95-100%
● Buffer tbe
● escalera de 5 pb
● camara de electroforesis
 ● estufa
● agitador
● vaso de precipitado
● transiluminador
● baño serológico
● moldes
● cybergreen

MÉTODOS:
existen varias técnicas o protocolos para realizar este experimento pero nos guiamos de el
protocolo de sigma-aldrich ; genelute protocolo kit para el adn genomico de la sangre

primeramente se hizo la recolección de sangre en tubo edta ya que este contiene

anticoagulante y es preferible para la extracción del ADN, luego se procedio a la
preparación de la sangre para extraer el ADN , en un tubo de ependorf se puso 20 ul de
proteinasa k y se añadio 200 ul de muestra de sangre y se llevo al vortex a resuspender e
mezclar bien la dilucion , despues de esto se añaden 200 ul de lisis c a la muestra y se lleva
a vortex 15 seg para que esta sea mas eficiente se deja en un baño serologico a 55 grados
celsius para obtener la lisis celular , seguidamente hacemos la preparacion de columna
de encuadernacion al añadirle 500 ul de solucion para la preparacion de esta , centrifugar a
12,000 g por 1 min y descartar el fluido , para realizar el enlace con la muestra en lisis se
añade 200 ul de etanol al (95-100%) este se lleva al vortex entre 5 a 10 seg obteniendo una
mezcla homogenea que es lo ideal para el siguiente paso que es añadir la muestra de lysis
a una columna de encuadernacion y centrifugar a 6,500g por 1 min y descartar el liquido de
el tubo de coleccion para el primer lavado se añaden 500 ul de solucion de prelavado y
centrifugar a 6,500 g por 1 min se descarta el tubo de coleccion cambiandolo por uno nuevo
y proceder a hacer el segundo lavado al cual se añaden 500 ul de solucion para lavado de
la columna luego se centrifuga a 12,000 o 16,000g por 3 min a velocidad maxima asi este
hace el secado a la columna ademas se debe evitar que este contenga etanol por lo tanto
se hace el cambio anteriormente de tubo de coleccion y finalmente se procedio a realizar la
elucion del adn , añdiendo 200 ul de solucion de elucion en el centro de la columna
directamente y se centrifugo a 6,500g por 1 min para incrementar la eficiencia de la elucion
se puede incubar en un cuarto de temperatura por 5 min y despues centrifugar

para saber si los resultados de este protocol fueron buenos en cuanto a calidad y
concentracion del adn genomico se puede determinar por un analisis espectrofotometrico o
por electroforesis en gel de agarosa , nosotros lo determinamos por electroforesis que
consiste en ver las bandas ADN y comparar con la escalera que se siembre con los
siguientes pasos :

primero se preparo el gel en agarosa añadiendo 0,7 g de agarosa y 35 ml de buffer (tbe) ,

se llevo a la estufa , se puso a calentar a medida de que subia la temperatura se mezclaba
hasta que llegara al punto de ebullicion , se retira y luego se pone sobre unos moldes para
el gel en agarosa en donde se le añade 2 ul de cybergreen y se pusieron las 2 peinetas
sobre este para formar los pozos donde se sembramos el adn , por consiguiente se tomo el
adn eluido y se resuspendio en vortex 5 seg mientras que el gel se ponia en la camara de
electroforesis por 20 min para que al sembrar el adn no se cause un choque electrico , este
tiene un electrodo negativo y otro positivo en el cual se movia el molde con una velocidad
electrica de mas de 140 voltios , luego podimos proceder a sembrar el adn se toman
primero 8 ul de ADN y en un papel parafina estan listos 8ul de buffer de carga los cuales se
tomaban con la micropipeta estando en 16 ul para diluir el ADN con el buffer y sembrar en el
pozo indicado , para comparar el ADN se uso una escalera de 5 pares de bases la cual se
sembro de la misma manera que el ADN , en un pozo y luego este se llevo al
transiluminador donde se observaba para determinar la calidad del ADN este tiene rayos
ultravioleta por lo cual se usa una tapa para observar .

RESULTADOS :

aca pues pone lo de las imágenes que se van a poner y el cuestionario este
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1) ¿Cuál es la función del buffer de lisis de glóbulos
rojos dentro de la reacción?
Explique su reacción osmótica.
2) ¿Para qué sirve el etanol frío?
3) ¿Para qué se precipitan las proteínas?

Discusión:

El kit de ADN genómico de sangre GenElute ™ proporciona una manera simple y

conveniente de aislar ADN genómico puro de sangre entera fresca o de (más de 24 horas).
El kit combina las ventajas de la unión de sílice con un formato de microspin y elimina la
necesidad de resinas costosas, precipitación de alcohol y compuestos orgánicos peligrosos
como fenol y cloroformo. El material de partida se lisó en una solución que contiene sal
caotrópica para asegurar la desnaturalización completa de las macromoléculas. La adición
de etanol hace que el ADN se una cuando el lisado se hace girar a través de una membrana
de sílice en un tubo de microcentrífuga. Se proporciona una solución de prelavado para
ayudar a eliminar los contaminantes asociados con muestras de sangre entera e (mayor de
24 horas). Después de lavar para eliminar los contaminantes, el ADN se eluye en 200 µL de
una solución de Tris-EDTA.
Este método es rápido, útil y muy práctico ya que vienen incluidos los reactivos con sus
respectivas cantidades, así aunque se obtiene una menor cantidad de ADN pero es un
método más eficaz. Por esta razón los laboratorios la utilizan rn la actualidad

Los rendimientos esperados de ADN genómico variarán dependiendo de la cantidad y la

naturaleza del material de partida utilizado (por ejemplo, se pueden aislar 4–10 µg de ADN
tratado con RNasa A de 200 µL de sangre entera fresca en menos de una hora. El ADN
purificado con este kit tiene una relación A260 / A280 entre 1.6 y 1.9 y puede tener hasta 50
kb de longitud. Este ADN está listo para aplicaciones posteriores, como las digestiones de
endonucleasas de restricción, PCR, transferencias Southern y reacciones de secuenciación.

La electroforesis es una técnica que emplean los cientificos en el laboratorio utilizada para
separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica. Se
utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un gel.
Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se
muevan más rápido que las grandes. Las condiciones utilizadas durante la electroforesis se
pueden ajustar para separar moléculas en el rango de tamaño que se desee

es una técnica que se utiliza de forma generalizada en la que, fundamentalmente, se aplica

corriente eléctrica a moléculas biológicas, ya sean ADN, proteínas o ARN..., y se separan
en función de si son más grandes o más pequeñas. Se utiliza en una gran variedad de
aplicaciones... como en medicina forense para determinar la identidad de las personas que
puedan haber participado en un delito, mediante la vinculación de su patrón de ADN -su
patrón de electroforesis- a uno que esté en una base de datos. El proyecto genoma humano
se llevó a cabo con algo que se llama electroforesis capilar, mediante la separación de ADN
en piezas más cortas y su separacion en geles de electroforesis que permite a los patrones
de A, C, T y G ser caracterizados. También son muy importantes en la investigación de
proteínas, y en la investigación de mutaciones genéticas, porque cuando las proteínas o el
ADN están mutados, son con frecuencia más o menos largos, y por lo tanto, aparecen en un
gel de electroforesis de manera diferente de lo normal. Las pruebas de diagnóstico para
muchos casos todavía se realizan mediante electroforesis. Es una técnica muy utilizada en
la investigación básica, muy importante para la comprensión de la función de genes y
proteínas, pero ahora ha irrumpido en el área de diagnóstico clínico y forense. Una
electroforesis se realiza generalmente en una especie de caja que tiene una carga positiva
en un extremo y una carga negativa en el otro. Y como todos aprendimos en las clases de
física, cuando se pone una molécula cargada en un entorno así, las moléculas negativas
van a la carga positiva, y viceversa. Al analizar las proteínas en un gel, en una de estas
cajas, por lo general se toma la proteína completa para ver lo grande que es. Cuanto más
corta, más migran en el gel, de modo que las proteínas pequeñas terminará en la parte
inferior del gel, porque han ido más lejos, y las más grandes terminarán quedándose en la
parte superior. En el caso del ADN, el ADN es una molécula muy larga, así que no se puede
hacer un gel de una molécula entera de ADN de una célula. Es tan grande que nunca se
metería en el gel, así que lo que hacen los científicos es cortar el ADN con cosas como las
enzimas de restricción, que cortan el ADN en pedazos más manejables, y entonces esas
piezas, dependiendo de lo grande que sean, migran más o menos por el gel y terminan más
arriba o más abajo. (Agustín, M. D)

Conclusiónes:

1. Los avances para la obtención y estudio del ADN han avanzado a pasos
agigantados, por esto es necesario comprender su importancia en la vida diaria.
2.

Referencias:

1. Sambrook, J.; et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989.
2. Birren, B.; Lai, E. Pulsed Field Gel Electrophoresis: A Practical Guide; Academic
Press: San Diego, CA, 1993.
3. Austin M. D, national human genome research institute
4. Schlötterer, C. 2004. The evolution of molecular markers –just a matter of fashion?
Nature Reviews 5: 63-69.
5. Hudson, M. E. 2008. Sequencing breakthroughs for genomic ecology and
evolutionary biology. Molecular Ecology Resources 8:3–17.