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GLICOSILAZIONE

• La glicosilazione è la modificazione “PTM” più diffusa.


• Circa il 50% delle proteine umane sono glicosilate
• Caratteristica di molte proteine della superficie cellulare e delle
proteine di secrezione
• Molte patologie sono associate con una difettosa formazione delle
glicoproteine
• La glicosilazione è una modifica estremamente eterogenea
• La presenza e la natura degli oligosaccaridi influenza il folding, la
stabilità, il trasporto, l’immuogenicità, le interazioni proteina-
proteina, la segnalazione….
• La funzione di molte catene glicidiche in molte proteine è ancora
sconosciuta
GLICOPROTEINE
Frazione Glucidica:
• Catene generalmente ramificate costituite da 15-20 residui.
• Monosaccaridi più comuni:
Mannosio, galattosio, glucosio, fucosio, N-acetilglucosamina, N-
acetilgalattosamina, acido N-acetilneuraminico

Si dividono in:
• N-glicosilate (su Asparagina)
• O-glicosilate (su Serina o Treonina. Raramente su Tirosina,
idrossiprolina, idrossilisina)

PROTEOGLICANI (sede peri- ed extra-cellulare)


Frazione glucidica:
altopolimeri eterosaccaridici lineari (P.M. molto elevato)
PROTEINE N-GLICOSILATE

• Solo negli EUCARIOTI


• Sequenza consenso: Asn-Xaa-Ser/Thr
• Si formano nell’ER
• Possono contenere diversi tipi di zuccheri (>30)

Su un comune PENTASACCARIDE DI BASE si


possono inserire diverse catene
oligosaccaridiche con formazione di strutture
bi-, tri- e tetra-antennali
Tipo I (alto contenuto mannosio):
con oligosaccaridi costituiti da mannosio

Tipo II (a struttura complessa):


con oligosaccaridi contenenti N-acetilglucosamina,
galattosio, acido sialico, (fucosio).

Tipo III (di tipo ibrido):


con oligosaccaridi costituiti da mannosio e con oligosaccaridi complessi
PROTEINE O-GLICOSILATE

Il legame fra le due porzioni si stabilisce fra un aminoacido idrossilato


(serina o treonina; raramente tirosina, idrossiprolina, idrossilisina) ed
un’unità glicidica (di solito N-acetilgalattosamina. In alcuni casi
galattosio).

Al residuo di GalNAc sono legate altre unità saccaridiche con formazione


di diverse strutture oligosaccaridiche ramificate e non.
ANALISI DI GLICOPROTEINE
Problemi connessi con l’analisi delle glicoproteine:

• Le glicoproteine hanno un comportamento anomalo nella maggior parte dei


processi separativi
• Scarsa abbondanza di proteine modificate
• Molte proteine hanno siti multipli di glicosilazione
• Le parti glucidiche sono eterogenee e la loro analisi strutturale è
estremamente complessa
• La presenza delle componenti glucidiche diminuisce significativamente
l’efficienza dell’analisi MALDI

ARRICCHIMENTO SPECIFICO DI GLICOPROTEINE:

• Cromatografia di affinità (glicani ac. M-aminofenilboronico-like; lectine…)


• Ossidazione con periodato/Biotinilazione
• Estrazione in fase solida (SPEG)
• Frazionamento subcellulare
ISOLAMENTO DI GLICOPROTEINE
MEDIANTE CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ
PER SPECIFICI OLIGOSACARIDI
IDENTIFICAZIONE DELLE GLICOPROTEINE

In fase preliminare le glicoproteine possono essere visualizzate su


gel 2D-E o mediante Western Blot usando sistemi di colorazione
(o sonde fluorescenti) o di rivelazione specifici.

Uno dei sistemi di analisi più usato in WB


prevede la derivatizzazione degli zuccheri con
“biotina modificata” e il successivo
riconoscimento con streptavidina coniugata con
perossidasi o fosfatasi alcalina.
ESEMPIO DI STRATEGIA PER ESPERIMENTI DI
“GLICOPROTEOMICA”

9 Isolare le glicoproteine da lisati cellulari mediante cromatografia di


affinità (es. lectine o biotina/avidina)

9 Frammentare le proteine selezionate, mediante proteolisi specifica (es.


tripsina, SPV8 proteasi, Lys-C….)

9 Analisi MS

9 Rimozione delle catene glucidiche

9 Frazionare

9 Analizzare mediante MS sia la frazione glucidica che quella proteica


RIMOZIONE DELLE CATENE GLUCIDICHE:

• Rimozione chimica
- β-eliminazione in ambiente alcalino (preferita per O-glicosilazioni)
- Ossidazione con periodato
- Trattamento con trifluorometansulfonato (distruzione completa)
- Idrazinolisi (può danneggiare le proteine)

• Rimozione enzimatica
- N-glicosidasi F (PNG-F), per N-glicosilazioni
- Altre glicosidasi

PER UN’ANALISI COMPLETA DELLE GLICOPROTEINE, LE


CATENE GLUCIDICHE DEVONO ESSERE SEQUENZIATE

MASS SPECTROMETRY
L’analisi della frazione glucidica viene effettuata
mediante:

9 Idrolisi acida: si identificano i vari monosaccaridi presenti

9 Sequenziamento (usando esoglicosidasi e MS o MS/MS)


N-GLICOSILAZIONE:
DIGESTIONE SPECIFICA
DEGLI OLIGOSACCARIDI

9La PNGase F rompe il legame


fra la frazione glucosidica e
quella proteica (GlcNAc/Asn)

9Glucosidasi specifiche
rompono selettivamente legami
presenti nella componente
oligosaccaridica
O-GLICOSILAZIONE:
DIGESTIONE SPECIFICA DEGLI OLIGOSACCARIDI

9La O-glicosidasi rompe


il legame fra la frazione
glucosidica e quella
proteica
(GalNAc/Ser-Thr)

9Glucosidasi specifiche
rompono selettivamente
legami presenti nella
componente
oligosaccaridica
ANALISI MS PER INDIVIDUARE LA PRESENZA E
(EVENTUALMENTE) IL TIPO DI OLIGOSACCARIDE
Il sequenziamento degli oligosaccaridi può essere fatto mediante MALDI-Tof
su ioni selezionati o ESI-MS/MS.
ESPERIMENTI MS/MS PER IL SEQUENZIAMENTO DI OLIGOSACCARIDI

Fattori che influenzano la frammentazione dei carboidrati:


9Tipo di ione
9Carica
9Energia depositato sullo ione

Gli spettri di frammentazione in MALDI-MS possono essere prodotti


attraverso:
9in-source decay fragmentation (ISD);
9post-source decay (PSD);
9collisional activation in a collision cell (CID).

IONI A,B,C:
La carica rimane
sull’estremità non
riducente

IONI X; Y; Z:
La carica rimane
sull’estremità riducente
RIASSUMENDO:
ALTRE MODIFICAZIONI POSTTRADUZIONALI

TECNICHE USATE per il loro studio:

9 2D SDS-PAGE
9 2nd D MS
n
9 MSn
9 ……
STRATEGIE di analisi:

9 Rivelazione specifica

9 Eliminazione della PTM


(eventualmente seguita da labeling specifico)

9 Analisi MS