Tecnológico Nacional de México en Celaya

Procesos biotecnológicos

Integrantes:

Maldonado Sánchez Michell Ivonne

Reséndiz Gallegos Catalina

Rodríguez Fernández María Angélica

Semestre Agosto-Diciembre 2019

3 de Diciembre del 2019

Celaya, Gto.
Cultivo de tejidos vegetales.

El punto de partida para el cultivo de tejidos es el hecho de que la célula vegetal es

totipotente. El cultivo de células y tejidos vegetales se refiere al conjunto de técnicas
usadas para crecer células, tejidos u órganos vegetales in vitro, bajo condiciones
asépticas, controladas y libres de microorganismos (Street 1977, Calva y Ríos
1999).

Se basa en el principio de totipotencia, que indica que cualquier célula vegetal

contiene una copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece sin
importar su función o posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar
una nueva planta completa (Ferl y Paul 2000).

Requiere la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente

higiénicas con el propósito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece
activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un
recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos
que crecerán y se desarrollarán desde este inicio dependerán de los objetivos del
cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa
aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes
otras estructuras reconocibles como tallos, órganos, raíces, bulbos u otros órganos.

El proceso involucrado en la transformación de una célula a una planta u órgano,

en ese entonces lo llamaron diferenciación celular, pero actualmente se denomina
organogénesis.

Dos descubrimientos favorecieron la biotecnología vegetal.

 La identificación de las auxinas como reguladoras naturales del crecimiento

vegetal
 El reconocimiento de la importancia de las vitaminas del complejo B en el
crecimiento de las plantas

El éxito depende del explante.

El procedimiento general consiste en inocular un medio de cultivo gelificado con un
fragmento de tejido u órgano vegetal, llamado explante, previamente tratado para
eliminar todo organismo que se encuentre en su superficie.

El cultivo se incuba bajo condiciones ambientales de luz, temperatura y humedad

controladas, que junto con las fisicoquímicas y nutricionales conducen el desarrollo
del explante hacia la formación de una masa celular amorfa denominada callo, o
hacia la diferenciación en un tejido organizado que producirá órganos o embriones.

Los callos obtenidos mediante este procedimiento pueden subcultivarse para su

mantenimiento y propagación o inducir su diferenciación para formar órganos
(organogénesis), embriones (embriogénesis) o pasarse a un medio de cultivo
líquido para obtener células y pequeños agregados en suspensión.

Los cultivos se mantienen bajo las mismas condiciones físicas y fisicoquímicas

usadas para la inducción de callos. Los cultivos de órganos se pueden rediferenciar
hasta plantas completas (micropropagación) que luego se transfieren a invernadero.
La temperatura de los cultivos generalmente se controla entre 25 y 28 °C, el pH
entre 5.2 y 6.5 y la luz de 0 a 12,000 lux (Calva y Ríos 1999, Seabrook 1980, Martin
1980, Yasuda et al 1972).
El éxito en la inducción y establecimiento de cultivos de callos, y en consecuencia
la subsiguiente regeneración a tejidos y plantas, son función de la calidad del
explante usado, que a su vez depende de la planta madre o del tejido del que se
inició el cultivo. De cualquier forma, para el inicio de los cultivos se prefieren utilizar
tejidos que contengan células meristemáticas. Estas se diferencian rápidamente en
respuesta a estímulos organogenéticos como variación en el tipo y concentración
de substancias reguladoras del crecimiento vegetal.

Las células meristemáticas se distinguen de otras células por su tamaño

relativamente pequeño, citoplasma denso, forma isodiamétrica, pared celular fina,
mínima vacuolación y un gran núcleo (Doerner 2000). En los cultivos in vitro, este
tipo de células se encuentran en la periferia de los callos o en las suspensiones
como masas o nódulos de tejidos preembriónicos, lo que produce una gran
variabilidad en la expresión genética entre la población celular de esos cultivos.
También es necesaria la presencia de este tipo de células para poder regenerar una
planta a partir de un cultivo in vitro.

Expresión genética: función del medio de cultivo

Actualmente, la mayoría de los medios son de composición conocida (Tabla 2),

estando constituidos básicamente por cinco grupos de ingredientes: nutrientes
inorgánicos, fuente de carbono, fuente de nitrógeno, vitaminas y reguladores del
crecimiento que in vivo son sintetizados por una parte u órgano de la planta para
luego ser transportados a otros órganos donde se metabolizan y/o acumulan
(Seabrook 1980, Yasuda et al 1972). Las fuentes de nitrógeno más comunes son el
nitrato y amonio, pero también se han utilizado urea, hidrolizado de caseína,
extracto de levadura y aminoácidos, entre otros.

La fuente de carbono más empleada es la sacarosa o glucosa y en menor grado la

maltosa, galactosa, almidón y melaza. Los micronutrientes, generalmente
adicionados al medio de cultivo en forma de sales, son utilizados por las células
como cofactores enzimáticos, como el molibdeno para la nitrato reductasa y el
magnesio para algunas cinasas (Murashige y Skoog 1962, Shenk y Hildebrandt
1972).
Las fitohormonas y sus inhibidores son substancias producidas por las plantas y
regulan su respuesta a estímulos ambientales como luz, temperatura y humedad,
ayudando de esta manera a regular y coordinar los procesos esenciales para el
desarrollo normal de las plantas (Wain 1980, Doerner 2000, Crozier et al 2000).

Este tipo de substancias se pueden dividir principalmente en:

 Auxinas
 Giberelinas
 Citocininas o citoquininas
 Ácido abscísico
 Etileno
 Brasinoesteroides
 Poliaminas
 Ácido jasmónico
 Ácido salicílico

Técnicas usadas en la micropropagación

La estimulación de las yemas axilares es el proceso más común que se conoce

para la micropropagación de las plantas. Aquí, las citocininas causan una
generación continua de estas yemas en la base del cultivo que prolifera. Cada yema
desarrolla en un tallo enanizado el cual a su vez puede producir más yemas en su
base. Esta proliferación de tallos y yemas continuará siempre que sea mantenido
un suministro adecuando de citocinina junto con nutrientes y espacio físico por
subdivisión de los cultivos y transferencia de los mismos a medio fresco cuando sea
necesario.

Alternativamente, el tallo puede separarse del suministro de esta hormona, la cual

tiende a suprimir la formación de raíces, y ser transferido a medio nuevo
conteniendo una hormona del grupo de auxinas, la cual estimulará el desarrollo
radicular en la base del tallo. Tales tallos enraizados pueden transferirse luego
afuera del ambiente estéril del cultivo de tejido y, con cuidadoso control de humedad
y luz, ser aclimatada para volverse una planta que crece convencionalmente en
forma dependiente de la fotosíntesis.

La
Embriogénesis es otro método que puede usarse para propagar las plantas en
masa. Como indica su nombre, esta técnica causa que se formen embriones
generados desde el tejido en cultivo, proceso que por otra parte sólo ocurre en la
formación de una semilla. Bajo el control de ciertas mezclas hormonales se forman
los embriones dentro de una masa aparentemente desorganizada de un callo, en el
cual nódulos de células comienzan a desarrollarse en forma que recuerda la
estructura de un embrión de semilla. Si estos embriones se trasladan a otros
medios, desde los callos, medios que están diseñados para permitir que el embrión
germine, entonces desarrollará una estructura de planta completa, esto es una
plántula, un talluelo enraizado que no difiere mayormente de la obtenida desde
semilla. Como las plantas obtenidas por caulogénesis axilar o adventicia, estas
plántulas también pueden aclimatarse para transformarse en una planta viable con
capacidad de fotosíntesis.

Dentro del proceso de micropropagación diferenciamos varias fases o etapas:

• 0: Selección y Preparación de la planta madre

• 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas

• 2: introducción del material seleccionado in vitro

• 3: Multiplicación de brotes

• 4: Enraizamiento

• 5: Aclimatación

Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de plantas in

vitro; puede ser aplicada a diferentes especies vegetales, en cada caso se podrán
incluir simplificaciones o cambios de acuerdo a las características de las plantas,
pero en términos generales son comunes al proceso de propagación in vitro.

FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE Para poder establecer el cultivo

en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un
grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable
mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un
período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un
invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en
condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados
para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

FASE 1: DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL Una vez elegida la planta

madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los
explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces,
semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los
fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los
contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma
natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener
en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se
trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material
vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de
iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la
desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o
diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua
esterilizada.

FASE 2: INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO Luego de la desinfección

superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se
ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días,
comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales,
iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

FASE 3: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES Durante esta fase se espera que

los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar
o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se
desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo.
Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio
mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados.
Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado
que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el
número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas
que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de
cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación
permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores
que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

FASE 4: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un
tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de
multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que
solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan
pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde
desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento
transcurren en forma simultánea.

FASE 5: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de
manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En
esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la
adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que
se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco
adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y
crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen
estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en
la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad
relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por
otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una
cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la
pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.
La siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta en
condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales
(in vivo): In vitro

• No realiza fotosíntesis

• Crecimiento en condiciones controladas

• Crecimiento en condiciones de asepsia

• Alta humedad relativa

• Estomas no funcionales

• Ausencia de pelos radiculares

• Ausencia de cera en la cutícula In vivo

• Realiza fotosíntesis

• Crecimiento en condiciones no controladas

• Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente

• Humedad relativa variable

• Estomas funcionales

• Presencia de pelos radiculares

• Presencia de cera en la cutícula

Conservación de germoplasma

En el área de los recursos genéticos, un banco de germoplasma o banco de

semillas es un lugar destinado a la conservación de la diversidad genética de uno o
varios cultivos y sus especies silvestres relacionadas. En muchos casos, no se
conservan semillas sino otros propágulos, tales como tubérculos o raíces debido a
que el cultivo en cuestión se multiplica solo asexualmente. La conservación de
las semillas se realiza a bajas temperaturas, de modo de mantener por muchos
años una adecuada viabilidad de las mismas. Físicamente, los bancos
de germoplasma consisten en grandes depósitos de sobres de semillas
conservados a bajas temperaturas.

Las razones para el almacenamiento de semillas en bancos de germoplasma

pueden ser variadas. En el caso de los cultivos destinados a alimento, muchas
plantas útiles que se han desarrollado durante siglos ya no se utiliza para la
producción agrícola comercial y son cada vez más raros, por lo que se hace
imprescindible conservarlas antes de su completa desaparición. El almacenamiento
de semillas también las protege contra eventos catastróficos como los desastres
naturales, brotes de una enfermedad o las guerras.

Las semillas a conservar dentro del banco de germoplasma se cosechan y se secan

hasta un contenido de humedad de menos del 5%. Una vez realizado el proceso de
desecación, se almacenan en congeladores a -18 ° C o menos. Debido a que la
semilla pierde su viabilidad con el tiempo, las semillas tienen que ser periódicamente
resembradas de modo de poder cosechar semillas frescas las cuales inician otra
ronda de almacenamiento a largo plazo.

Hay cerca de 6 millones de accesiones o muestras de una población de plantas en

particular, almacenados como semillas en unos 1.300 bancos de germoplasma en
todo el mundo a partir de 2006. Esta cantidad representa solo una pequeña fracción
de la biodiversidad del mundo, ya que muchas regiones del planeta no han sido
totalmente exploradas para colectar recursos genéticos. Hay bancos de
germoplasma que disponen de acceso libre al material fitogenético almacenado,
como en el caso de la Red de Bancos de Germoplasma chilena.

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Material Didáctico

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