Imunologia e imunodiagnóstico

das estreptococcias: a febre

reumática e a glomerulonefrite

2018

Profª. Sandra Mara A. Aristides

 Introdução: Doenças
Febre reumática aguda (FRA)
– Resposta autoimune tardia após infecção pelos Streptococcus
do grupo A (GAS) quando não tratada.
– Geralmente afeta as articulações, o coração, o cérebro e a
pele.
– É mais frequente na faixa etária entre 5 a 15 anos.
– Pode reaparecer após infecções subsequentes pelo GAS
quando não tratadas.
 Doença Cardíaca Reumática (DCR)
– Dano residual nas valvas cardíacas após FRA recorrente.
– As valvas cardíacas ficam lesadas e espessadas.
– Vazamento de sangue (o sangue reflui através das valvas).

Glomerulonefrite aguda
– Resposta autoimune tardia após infecção pelos Streptococcus
do grupo A (GAS) quando não tratada.
– Surge pela deposição de complexo imune nos nefrons.
Os Streptococcus

Classificação sorológica se dá pelas características antigênicas:

 Baseada no polissacarídeo da parede celular de composição variada, o
carboidrato C;
 São divididos em 20 grupos sorológicos (grupos de Lancefield)  (A, B, C, D,
E, F, G, H, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U e V);
 Grupo A de Lancefield: S. pyogenes
Os estreptococos podem ser destruídos por:
- Pasteurização
- Hipoclorito 5%
- Desinfetantes iodados
- Fenol 5%
- Água fervente
Podem estar presentes em secreções (perdigotos) e
permanecerem viáveis por vários dias ou semanas.
Streptococcus do grupo A de Lancefield (S. pyogenes)

História:
 1879  descrito (Louis Pasteur)
 1884  nome genérico Streptococcus (Rosenbach)
 1903  zonas claras de lise (Schottmüller)  Streptococcus
 hemolítico
 1920-1970  Rebecca Lancefield  descobriu
polissacarídeo e proteína M (parede celular) 
Streptococcus do grupo A de Lancefield.
Fatores de virulência dos Streptococcus
 INFECÇÕES POR STREPTOCOCCUS
GRUPO A (GAS)

Fatores de virulência de GAS (imunogênicos)

 NADase (nicotinamida adenina dinucleotidase)  liquidifica
pus para disseminação da bactéria nos tecidos.

 Estreptoquinase  converte plasminogênio e plasmina.

 Cisteína protease  disseminação, colonização e invasão

 cliva fibronectina e cliva vitronectina.

 Esterase  essencial para infecção grave e disseminação

sistêmica da pele para o sangue e órgãos.

 C5a peptidase (endopeptidase  cliva quimiotaxina C5a 

destroem o componente do complemento C5a.

Continua......
 Superantígeno (exotoxinas pirogênicas) ligam-se MHC II
região externa  ativam  LyT de forma não especifica,
provocando uma resposta imunitária com febre, choque e
insuficiência de órgãos.

 Citolisinas (estreptolisinas S e O)  destroem as membranas

de eritrócitos e outras células, matando-as.
 SLO facilita o escape da GAS do endossomo-lisossomo seguindo
invasão das células do hospedeiro e a penetração de superantígenos
na mucosa escamosa estratificada.

 Protease de interleucina-8 (IL-8) (SpyCEP; também

conhecido como ScpC)  cliva e inativa a IL-8 (quimiotático
para neutrófilos) inibindo o recrutamento para o sítio de
infecção.
Continua......
 Cápsula ácido hialurônico  protege contra a fagocitose e
reconhecimento pelo SI.
 DNAses  destrói o DNA, um componente importante no pus,
tornando-o mais líquido.
 Proteína F  liga-se a fibronectina  dá aderência ao meio,
impedindo-a de ser arrastada facilmente.
 SIC  (inibidor de complemento)  inibe complexo de ataque de
membrana  contribui p/ virulência.
 Hialuronidase  permite degradar o meio extracelular,
composto de ácido hialurônico para mais rápida invasão dos
tecidos.

 Proteína M  principal fator de virulência.

Moléculas de superfície celular: Prot. M
Proteína M
GAS e dano tecidual
 CDC: https://www.cdc.gov/groupastrep/lab.html

Proteína M
 Atualmente existem mais de 225 tipos M e mais de 450 subtipos diferentes
de acordo com o Centers for Disease Control and Prevention (CDC).
 Maior fator de virulência (aderência).
 Confere resistência à fagocitose:
 Degrada C3b,
 Liga-se ao fator H (prot. regulatória para via alternativa do
complemento.)  (fator H liga à região constante de prot M).
 Aumenta a sobrevivência em NETs de neutrófilos.
 Adesina  liga prot. matriz extracelular (colágeno e fibronectina).
 Fibrinogênio ligada à superfície de GAS bloqueia ativação da via alternativa
do complemento e reduz C3b ligado ao estrepto  inibe fagocitose por PMN
 e lesão tecidual.
 Liga-se a Fc de Igs  fagocitose.
 Sequenciamento de DNA revelou que genes da prot. M e do receptor de IgG
têm alto grau de homologia  gene ancestral comum  regulados por genes
da patogenicidade (Mga)  classif. sorotipos
 Mga  foram identificadas sequências emm (genes que codifica prot M).
 Os 25 tipos mais comuns dos genes emm que contribuem
para doença faringeana na America Latina.

Figura. Os 25 tipos mais comuns dos genes emm que contribuem para doença
faringeana na America Latina: de um total de 49 tipos de emm.
Barras pretas= tipos envolvidos no desenvovimento de vacinas, barras brancas= não envolvidos.

https://www.cdc.gov/groupastrep/lab.html
Os 25 tipos mais comuns dos genes emm que contribuem para
doença de pele na America Latina.

Figura. Os 25 tipos mais comuns dos genes emm que contribuem

para doença de pele na America Latina: de um total de 34 tipos de
emm.
https://www.cdc.gov/groupastrep/lab.html
Sorotipos de S. pyogenes (prot M) associados com
sequelas não supurativas:

O tipo M mais frequente na glomerulonefrite desenvolvida a

partir de infecções de orofaringe são os tipos M1, M4,
M12 e M25;
Os sorotipos M2, M4, M12, M49, M55, M57, M59, M60 e
M61, têm sido associados com pioderma e
glomerulonefrite aguda;
Os sorotipos (desenvolvidos a partir de infecções de
orofaringe) são M3, M5, M6, M18 e M24  associados
com febre reumática.
Cepas reumatogênicas não colonizam a pele.
Cepas nefritogênicas colonizam a pele e garganta,
mas não causam FRA.
Infecções por S. pyogenes:
 Sítios focais: pele e trato respiratório superior 
principais reservatórios de transmissão.
 GAS  Causam dç supurativa ou não supurativa.
De simples faringite a dç sistêmica grave.

Grupos: -superficial
-profunda
-dç mediada por toxinas
-dç mediada imunologicamente
Doenças causadas por S. pyogenes
Categoria de dç Exemplos de infecções
Dçs superficiais Faringite, infecções de tecidos moles e
pele, impetigo, erisipela, vaginites,
infecções pós parto.

Infecções profundas Bacteremia, fasciitis necrosante, infecções

profundas de tecidos moles, celulite,
miosites, sepse puerperal, pericardite,
meningites, pneumonias, artrite séptica.

Mediada por toxinas Escarlatina, síndrome choque tóxico.

Mediada imunologicamente Febre reumática, doença cardíaca

reumática, glomerulonefrite pós-
estreptocócica, artrite reativa (S. Reiter).
Dçs causadas por S. pyogenes
 Impetigo Fasciiti necrosante Faringite

Febre escarlate (escalatina) Erisipela

Escarlatina –As bactérias causam

diferentes infecções, garganta e
pele. Algumas produzem toxinas
que causam a vermelhidão
(escalate) da febre escarlate.
Usualmente é doença leve,
afetando crianças entre 5 e 15
anos de idade (CDC) .
Imunidade protetiva:
Imunidade humoral à infecção:
 Acs opsônicos e de mucosa X prot M.

 Acs opsônicos são produzidos tardiamente, enquanto não-

opsônicos no início.
 Adultos têm menos infecção por GAS  múltiplas infecções
na infância  Ac
 Confere proteção ao mesmo tipo de prot. M improvável
encontrar todos sorotipos M  outro mecanismo
 GAS são anti-fagocíticos  Prot M e cápsula ác.

hialurônico.
 Ac X prot M supera propriedade anti-fagocitária  ativa via
clássica do complemento  fagocitose.
 Fagocitose

Fagocitose

Cunningham, 2000
 Papel de IgA:
 Bloqueia aderência de bactérias na superfície mucosa.
 Permite que o estrepto seja capturado no muco e
eliminado pelo fluido do hospedeiro.

 IgG anti-prot. M  não diminui aderência, mas reduz

a invasão e internalização de GAS às céls. epiteliais da
faringe.
  IgG bloqueia a invasão e IgA previne aderência e
colonização.
IgA

Cunningham, 2000
Imunidade protetiva:

Imunidade de cél. T à infecção:

 Resposta cél. T importante como função
auxiliar de cél. T  cél. B.
 Encontrados epítopos de cél. T
relacionados a prot. M5.
 RI exagerada de cels. T  superantígenos
INFECÇÕES POR STREPTOCOCCUS
GRUPO A (GAS)

Complicações não supurativas (mediadas

imunologicamente):

 Glomerulonefrite pós estreptococos

aguda (APSGN)

 Febre reumática aguda (FRA)

Doença cardíaca reumática (DCR)
 GLOMERULONEFRITE PÓS
ESTREPTOCÓCICA AGUDA (APSGN)
APSGN:
 Processo inflamatório agudo de origem imunológica que acomete
todos os glomérulos de ambos rins.
 Associada a pioderma (infecção de pele  impetigo). Ocorre em
crianças e adultos jovens; homens 2 x mulheres; ou >40 anos.
 Sintomas se manifestam após faringoamidalite em 10 dias e após
piodermite 3 semanas da infecção estreptocócica.
 Ocorre mais no verão.
 APSGN seguindo infecção pele  ASO (ASLO) baixo em 75%.
 APSGN seguindo infecção garganta  ASO alto.
 Cepas de GAS que colonizam a pele (impetigo) pode também
colonizar a garganta, mas não causam FRA ( sorotipos de
proteínas M).
 Surtos tanto de FRA, como de APSGN têm declinado  mudanças
no estrepto ou hospedeiro(?)  HOJE este fato tem mudado.
 Danos renais causados pelos complexos imunes (Ags S. pyogenes
X anticorpos) + C’  depositam nos néfrons e causam lesão.
Diagnóstico – ASPGN:
 Edema, hipertensão, hematúria, proteinúria,
anormalidades sedimento urinário, níveis de
complemento sérico, pouca febre. Em adultos pode
haver perda progressiva da função e insuficiência renal
crônica, mas em crianças não é comum.
 Infecções com pioderma ou cepas nefritogênicas:
Títulos de anti-DNAse B  seguro.
Anti-hialuronidase  elevado.
Estreptoquinase  associada c/ patogênese.
C3, C4, CH50 baixos no sangue.
Mecanismos da patogênese APSGN:
 Relacionados à fenômenos imunológicos:
Deposição complexo imune ( IgG e IgM séricas);
Rç de Ac reagindo cruzadamente c/ estrepto e Ag
glomerular (mimetismo molecular)  presença Igs,
C’ e Ag  quimiotaxia de neutrófilos;
Alterações de tecidos glomerulares por produtos do
estrepto;
Ativação direta do complemento pelos componentes do
estrepto depositado no glomérulo.
Mecanismos da patogênese APSGN
 FEBRE REUMÁTICA AGUDA (FRA)
DOENÇA CARDÍACA REUMÁTICA (DCR)

Dç. de natureza autoimune, resultando da produção de

Acs autorreativos e cél. T que reagem cruzadamente
(mimetismo molecular) com componentes de GAS e
tecidos do hospedeiro (semelhanças entre a proteína M
estreptocócica e a miosina - ambas moléculas -
helicoidais e espiral enrolada).
Epidemiologia: FRA

 Antes da 2ª guerra foram estreptococcias 

causas de ½ mortes pós-parto e maior causa
morte em queimados.
 Penicilina  praticamente eliminou patógeno.
 1980s  ressurgiu como FRA e doença sistêmica
em diferentes áreas (nordeste europeu e EUA).
 EUA – cerca de 10.000 casos de dç. invasiva/ano.
Custo direto associado com faringite  U$ 1
bilhão/ano.
 Impacto para o sistema de saúde
Pode desenvolver se infecções de garganta ou escarlatina (CDC) não
forem tratadas apropriadamente:
Risco de Febre Reumática Aguda é de 0,3 a 3%.
Em epidemias o risco é 10 vezes maior.

Os gastos gerados pela assistência aos pacientes com FR e DCR no Brasil são
significativos: em 2007, foram gastos pelo SUS cerca de R$ 157.578.000,00 em
internações, de origem clínica ou cirúrgica, sendo que, das cirurgias cardíacas
realizadas neste período, 31% abordaram pacientes com sequelas de febre reumática.

IBGE estima-se que anualmente no Brasil ocorram cerca de 10 milhões de

faringoamidalites estreptocócicas, perfazendo o total de 30.000 novos casos de
FR, dos quais aproximadamente 15.000 poderiam evoluir com acometimento
cardíaco.

Doença Cardíaca Reumática (DCR) constitui a principal causa de cardiopatia

adquirida em crianças e adultos jovens. Estimativas da OMS registraram no ano de
2005 cerca de 15,6 milhões de portadores de DCR; cerca de 300.000 novos casos/ano; e
350.000 mortes diretamente atribuíveis à DCR a cada ano nos países em
desenvolvimento.
Dados: Sociedade Brasileira de Cardiologia e World Heart Federation
 Estudos realizados na população de escolares em algumas capitais
brasileiras estimaram a prevalência de DCR em 1-7 casos/1.000, o que é
significativamente maior do que a prevalência da doença em países
desenvolvidos, como os Estados Unidos, onde varia entre 0,1-0,4
casos/1.000 escolares.

A frequência da FRA no Brasil difere de acordo com a região geográfica,

porém em todas as regiões observa-se uma redução progressiva do total de
internações por esta doença. A taxa de mortalidade por DCR em
pacientes internados pelo SUS foi de 6,8% em 2005 e de 7,5% em
2007, com gasto aproximado no tratamento clínico de 52 milhões de reais em
2005 e de 55 milhões em 2007. Gastos de cerca de 94 milhões de reais em
2005 e de 100 milhões em 2007 em procedimentos intervencionistas, cirurgias
e valvotomias percutâneas como também ao tratamento das sequelas
cardíacas da FR.

Barbosa et al. Diretrizes Brasileiras para Diagnóstico, Tratamento e Prevenção da Febre Reumática da Sociedade Brasileira de Cardiologia, da
Sociedade Brasileira de Pediatria e da Sociedade Brasileira de Reumatologia. Arq Bras Cardiol. 2009;93(3 supl.4):1-18.
 ARF: a doença

 Seguida por infecção garganta e febre escarlate o GAS 

~ 3 sem após início.
 GAS afeta crianças em idade escolar (5 a 15 anos).
 Associação c/ faringite  ARF é sazonal  ocorrendo
inverno.
 Países tropicais (alta prevalência dç cardíaca e pioderma)
 predisposição de ARF) (Carapetis et al,2005).
 Manifestações:
 Artrite migratória 75% (joelho, tornozelo, cotovelo,
pulso)
 Cardite (Ac e C’ depositados).
 Coreia de Sydenham – Dança de São Vito (desordem
neurológica tardia que provoca movimentos
involuntários, enfraquecimento muscular e
alterações de personalidade).
 Eritema marginatum (eritema multiforme migratório
com bordas elevadas).
 Nódulos subcutâneos (geralmente nas extremidades
ósseas e espinha dorsal)  cardite grave.
A febre reumática e
suas manifestações
Os estreptococos são da flora normal, isto é,
a garganta pode carregar bactérias sem
sintomas clínicos (10 a 20% da população).

O diagnóstico diferencial da infecção

estreptocócica de orofaringe, responsável por
 30% dos casos de faringoamidalites deve
ser feito, particularmente, com as infecções
virais.
Vias patogênicas para FRA e DCR

Carapetis et al, 2005

http://www.medicinanet.com.br/conteudos/revisoes/1238/febre_reumatica.htm
FRA
 Importância médica  envolvimento cardíaco c/
miocardite ou valvulite  substituição da válvula ou
morte.
 Aspecto mais perigoso de FRA é a alta taxa de
recorrência de novas infecções respiratórias  lesão
cardíaca agravada  tratamento.
 Embora a suscetibilidade e RAI esteja envolvida, o GAS
tem papel central.
 Fatores genéticos  de suscetibilidade à doença estão
diretamente relacionados ao desenvolvimento da FR e
de suas sequelas.
O alelo encontrado com mais frequência,
independentemente da origem étnica, é o HLA-DR7.
Etiopatogenia da febre reumática

Na cardite reumática, anticorpos reativos ao tecido cardíaco, por

reação cruzada com antígenos do estreptococo, se fixam à parede do
endotélio valvar e aumentam a expressão da molécula de adesão
VCAM I, que atrai quimiocinas e favorecem a infiltração celular por
neutrófilos, macrófagos e, principalmente, linfócitos T, gerando
inflamação local, destruição tecidual e necrose.
O número aumentado de linfócitos T CD4+ no sangue periférico de
pacientes com cardite está ligado ao aumento de IL-1, TNF- e IL-2 no
soro.
 No tecido cardíaco de pacientes com cardiopatia reumática grave há
predomínio de células mononucleares secretoras de TNF- e IFN-
(padrão Th1), enquanto raras células mononucleares infiltrantes das válvulas
produzem IL-4 e citocina reguladora da resposta inflamatória.
 Portanto, a baixa produção de IL-4 está correlacionada com a
progressão das lesões valvares na DCR, enquanto no miocárdio, onde há
grande número de células produtoras de IL-4, ocorre cura da miocardite após
algumas semanas.
A produção de citocinas direciona para uma resposta celular (Th1) 
causando quadros de cardite grave e sequela valvar e,
Ou para uma resposta predominantemente humoral (Th2)  que
causaria quadro clínico com coreia e artrite.
O diagnóstico de Febre Reumática baseia-se nos Critérios de Jones, que
foram revisados pela American Heart Association em 2015, segundo tabela:

(em um período de 3 semanas antes dos sintomas de ARF).

Diagnóstico sorológico (FRA):
 Hospedeiro responde imunologicamente às infecções
Streptococcus com Ac X componentes celular e extracelular.
 Ac específicos protetores para sorotipos de proteína M.

Diagnóstico histológico (FRA/DCR):

 Os nódulos de Aschoff, considerados patognomônicos

da doença sendo compostos por agregados de células

semelhantes a macrófagos e monócitos, exercem a função
de células apresentadoras de antígeno para as células T.
Diagnóstico laboratorial (FRA/APSGN):

Cultura: limitação do tempo

Na vigência da FRA/APSGN pode ser negativa

Aglutinação de látex:
Partículas de látex recobertas com a estreptolisina-O (SLO) são misturadas
com o soro do paciente  Pacientes com anticorpos anti-SLO no soro
 Aglutinação
Sensibilidade: 91%, Especificidade: 86%

ELISA
Sensibilidade: 88,1% e especificidade: 94,7 %
concordância com a cultura: 93,7%
Diagnóstico sorológico de GAS baseado na RI contra
produtos extracelulares em FRA/APSGN:
 Estreptolisina O (SLO)
 DNAse B
 Hialuronidase
 NADase
 Estreptoquinase
 Esterase

Frequentemente estrepto não é cultivado da faringe

 pesquisa Ac.
Em geral títulos de Acs contra produtos extracelulares
aumentam em paralelo.
FRA (Diagnóstico sorológico)

 Anti-estreptolisina O (ASO, ASLO)

 Anti-ASO é resposta mais examinada em testes sorológicos para
confirmar infecção antecedente.
 Todd (1932)  teste p/ Ac ASO.
 Título 200 UI (U Todd)  infecção estreptococos.
 ~80%  ASO (>200 UI)  2 meses do início da infecção.
 Recém-nascidos  níveis anti-ASO materno.
 Crianças desenvolvem doença acima de 1 ano idade.
 Crianças entre 1 e 3 anos  sem título de anti-ASO  pouca
infecção  >50% pacientes  <50 UI.
 Crianças idade escolar  >200 UI.
 Declínio de ASO de 2 a 12 meses.
 Útil a repetição da ASO 2 a 3 sem depois do teste inicial,
quando não estiver aumentado.
 APGN  95% nas faringites e 80% nas infecções cutâneas.
Estreptolisina O e S

Lisam hemácias, neutrófilos, etc...

Estreptolisina é imunogênica e antigênica

Ac anti-ASO: 80% dos

Ac anti-ASO em
pacientes com infecções
25% das
estreptocócicas da
infecções de
faringe
pele
1- Nefelometria (dispersão luz) e Turbidimetria (absorção luz)

SLO purificada-látex + soro do paciente = complexos imunes.

Valores normais: 200 UI/mL.

2- Anti-DNAse B
DNA de timo de bezerro + verde de metila (corante).
Na presença de DNAse B a cor desaparece.
Reação positiva = Ac anti-DNAse B do soro do paciente neutraliza
a enzima e o complexo se mantém VERDE.
Confirmação de sequelas estreptocócicas que resultam de
infecções da pele.
3- Anti-Hiaruronidase (AHAD)
Turbidimetria
Ácido hialurônico + proteínas em pH 3,0 = turvação
A hialuronidase despolimeriza as proteínas e diminui a turvação.
Ac anti-hialuronidase = evita a despolimerização e mantém a
turvação.
Diagnóstico de piodermites.

4- Estreptozima:
Teste de hemaglutinação p/ detecção de múltiplos Ac como:
anti-ASO, anti-DNase, anti-hialuronidase, anti-estreptoquinase
e anti-NADase.
 INFECÇÕES POR STREPTOCOCCUS
GRUPO A (GAS)

Tratamento: Antibioticoterapia
Objetivos do tratamento: erradicação do S. pyogenes
 impedir recaídas (recorrência em 50% dos casos)
 diminuir incidência da FRA
 alívio sintomático das manifestações extra-cardíacas

Recomendações para tratamento:

 Escarlatina
 Faringoamigdalite exsudativa
 Contato com portadores
 Faringites em indivíduos com ataque anterior de FRA
 Otite média em crianças menores de 6 anos de idade
 INFECÇÕES POR STREPTOCOCCUS
GRUPO A (GAS)

Profilaxia:
Profilaxia secundária:
 Administração regular e contínua de antibióticos para reduzir ocorrências.
 Prevenir sequelas de estrepto: FRA e APSGN

Penicilina G benzatina intramuscular: cada 3 a 4 semanas

Alergias: eritromicina.

Vacinas:
 Região N-terminal de prot M  induz Ac opsônico e bactericida protetivo (sorotipo
específico).
 Região carboxi-terminal de prot M  proteção a múltiplos sorotipos  Previne
colonização de mucosa.
 Considerações devem ser tomadas, desde que o mimetismo molecular pode ter
papel potencial na patogênese das sequelas das estreptococcias.
 C5a peptidase (camundongos): 98% idêntica entre as GAS   IgA e IgG 
erradica estrepto da garganta antes de se instalar na mucosa epitelial (Ac neutraliza a
protease   resposta inflamatória local).
Referências

Ferreira, AW; Moraes SL. Diagnóstico Laboratorial das principais doenças

infeciosas e autoimunes. Cap. 14. Ed. Guanabara Koogan, 2013. Rio de
Janeiro, RJ. pag. 183-193.
Barbosa PJB, Müller RE, Latado AL, Achutti AC, Ramos AIO, Weksler C, et
al. Diretrizes Brasileiras para Diagnóstico, Tratamento e Prevenção da Febre
Reumática da Sociedade Brasileira de Cardiologia, da Sociedade Brasileira
de Pediatria e da Sociedade Brasileira de Reumatologia. Arq Bras Cardiol.
93(3 supl.4), 2009.
Cole, JN; Barnett, TC.; Nizet, V; Walker, MJ. Molecular insight into invasive
group A streptococcal disease Nature Reviews Microbiology, v.9: 725, 2011.
Sztajnbok, FR. Febre reumática - uma enfermidade ainda frequente.
Revista Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ, ano 1, n. 2, p. 39-46,
2002.
Barbosa PJB; Müller, RE. Guia de Bolso: Diretrizes Brasileiras para o
Diagnóstico, Tratamento e Prevenção da Febre Reumática. Realização:
Sociedade Brasileira de Cardiologia, Sociedade Brasileira de Pediatria e
Sociedade Brasileira de Reumatologia, p. 129-149.
Carapetis JR, McDonald M, Nigel Jwilson. Acute rheumatic fever. Lancet
2005; 366: 155–68.