Práctica No 4 y 5.

Identificación cualitativa y cuantificación de

carbohidratos.
Laura Juliana Ortiz - 2181204
Andrea Pinilla Da Silva- 2181398
Angélica Ramírez Vásquez ​- 2180825
Grupo de Laboratorio: ​____J1____

Fecha de la elaboración de la práctica: 2019-10-15 y 2019-11-.

Fecha de presentación del informe: 2020-01-Día

❖ Objetivos
✔ Diferenciar las sustancias que contienen carbohidratos simples por medio de
reacciones químicas.
✔ Identificar monosacáridos, disacáridos y polisacáridos a través de pruebas
cualitativas.
✔ Identificar la presencia de azúcares reductores en una muestra biológica.

✔ Cuantificar el contenido de carbohidratos totales en una muestra biológica mediante

métodos colorimétricos.
✔ Cuantificar el contenido de glucosa en una muestra biológica mediante el método
enzimático.

❖ Resultados y discusión

Análisis cualitativo de carbohidratos

Se realizaron las siguientes pruebas por duplicado: Molisch, Benedict, Barfoed y Lugol.

a) Ensayo de Molisch

El ensayo de Molisch se realiza para detectar la presencia de carbohidratos en una muestra. Su

fundamento se basa en la hidrólisis de los enlaces glicosídicos y deshidratación de carbohidratos
para la formación de furfural (caso de las pentosas) e hidroximetilfurfural (caso de las hexosas).
Estos productos se condensan con dos moléculas de α-naftol para dar un compuesto de color
púrpura en la interfaz α-naftol-muestra/ácido sulfúrico concentrado (véase la reacción en la Figura
No.1) ​[1].

Como se observa en la Tabla No.1 (anexo 1, sección Anexos-Tablas de Resultados), para las
muestras de carbohidratos conocidos los resultados fueron positivos. La diferencia radicó en cuanto
al grosor del halo púrpura, lo que se le atribuye a la concentración del carbohidrato presente en la
muestra. Los resultados de las 4 muestras biológicas fueron positivos, siendo la miel la que presentó
un halo púrpura de mayor grosor. Al comparar estos resultados con los datos teóricos suministrados
por cada uno de los productos, el resultado de la miel coincide al tener la mayor cantidad de
carbohidratos; sin embargo, los resultados para el Jugo Hit y el Speed no coinciden ya que
teóricamente el speed debería presentar una mucho menor cantidad de carbohidratos que el Jugo
Hit, y en la prueba el halo púrpura del Speed es más grueso y de coloración más oscura que la del
Jugo. ​[2,3,4,5]

b) Ensayo de Benedict

La prueba de Benedict identifica la presencia de azúcares reductores en una muestra, es decir,

carbohidratos que tienen libre su OH del carbono anomérico. Entre ellos están todos los
monosacáridos y algunos disacáridos como la maltosa. Su fundamento radica en que, en medio
alcalino, el ion Cu​+2 ​(aportado por el sulfato cúprico, CuSO​4​) que se encuentran en solución gracias
al citrato de sodio (estabiliza al ion), se reduce por acción del grupo aldehído del glúcido al ion Cu​+​.
Los iones Cu​+2 se reducen a Cu​+ los cuales reaccionan para formar óxido cuproso (Cu​2​O) que se
evidencia como un precipitado rojo ladrillo (véase la reacción en la figura No.2) ​[6] ​Debido a que
en solución los carbohidratos se encuentran en su estructura cíclica en mayor proporción, el medio
alcalino se emplea para facilitar que el glúcido se halle en su forma lineal, así su grupo aldehído
puede reaccionar con el ion Cu​+2​. ​[7]

Los monosacáridos evaluados presentaron un resultado positivo (véase Estructuras 1 y 2 en la

sección Estructuras Químicas); de los disacáridos que se sometieron a la prueba de Benedict, la
maltosa resultó positiva gracias a su capacidad reductora (véase Estructura 4 en la sección
Estructuras Químicas), mientras que la sacarosa no reaccionó debido al enlace entre el C1 de la
D-glucosa y el C2 de la D-fructosa (véase Estructura 3 en la sección Estructuras Químicas). Ambos
carbonos son los implicados en la ciclación de dichos carbohidratos. En cuanto a los polisacáridos
evaluados, el almidón reaccionó levemente por la proporción de grupos aldehídos libres presentes
solo en los extremos de las cadenas (véase Estructura 5 en la sección Estructuras Químicas); sin
embargo, la carboxicelulosa no presentó reacción porque la cantidad de grupos aldehídos libres es
muy bajo en proporción con el resto de la molécula (véase Estructura 6 en la sección Estructuras
Químicas).

De las muestras evaluadas, la miel, el Speed Max y el Jugo Hit resultaron positivas, indicando la
presencia de azúcares reductores, lo que concuerda con lo esperado para dichas muestras; ya que, la
miel contiene glucosa y fructosa, el Speed Max contiene glucosa y fructosa, entre otros
carbohidratos, y el Jugo Hit contiene carbohidratos como fructosa proveniente de la fruta y glucosa
de la azúcar añadida ​[2,3,4,5]​. El hecho de que la fructosa logre dar positivo radica en que en el
medio alcalino caliente esta se tautomeriza a glucosa y manosa (pasa por un intermediario enólico)
[7].

Por otra parte, en la reacción de Benedict con la leche se esperaba una reacción positiva porque la
lactosa (el carbohidrato de la leche) es un azúcar reductor, sin embargo, resultó negativa.
 c) Barfoed:

La prueba de Barfoed permite la identificación de monosacáridos y disacáridos reductores. Se basa

en la oxidación del aldehído reductor por el ion Cu​+2​, formando un precipitado rojizo de Óxido de
Cobre (I). La diferenciación entre mono y disacáridos se da por el tiempo de reacción, siendo hasta
3 minutos para monosacáridos y mayor a 3 minutos para disacáridos ​[8]​.

La glucosa, la fructosa y la maltosa presentan un resultado aproximado al esperado (véase Tabla

No.1 en anexos-Tablas de Resultados). De igual forma los resultados para la sacarosa, almidón y
carboxicelulosa, en los cuales los tiempos indican que no reaccionaron (véase Tabla No.1 en
anexos-Tablas de Resultados). En cuanto a las muestras, se confirma la presencia de monosacáridos
en la miel, el jugo y el Speed Max. Sin embargo, la leche no presenta resultado positivo como se
esperaba.

d) Prueba de lugol

La prueba de Lugol se utiliza para la identificación de almidón presente en una muestra. El Lugol es
una mezcla de diyodo disuelto en yoduro de potasio. Los iones I​3​- se sitúan entre la amilosa
(conformación helicoidal), formando una “red” de poliyoduros, lo cual tiene un efecto óptico de
color azul o negra dependiendo de la concentración del azúcar ​[9] (véase la figura No.3 en
Anexos-Figuras).

Los resultados obtenidos para las muestras de carbohidratos conocidos concuerdan con lo esperado.
Por otro lado, de las muestras biológicas el Jugo Hit presentó un resultado positivo lo que indica la
presencia de almidón. Los datos nutricionales proporcionados por el producto no indican la
presencia o ausencia del almidón por lo que no puede comprobarse la veracidad de la información;
sin embargo, la tabla nutricional sí indica un porcentaje de carbohidratos que, aunque no es muy
específico podría abarcar la presencia de dicho carbohidrato.

e) Diferenciación cualitativa de los homopolisacáridos: Celulosa y Almidón.

Esta prueba permite demostrar que las unidades constitutivas de los polisacáridos son
monosacáridos unidos mediante enlaces glicosídicos. El almidón y la celulosa son polisacáridos
constituidos de monómeros de glucosa; sin embargo, la estructura del almidón es ramificada,
mientras que la de la celulosa es lineal; esto debido a diferencias en los enlaces glicosídicos lo que
genera que ambas sean moléculas con propiedades muy diferentes. La hidrólisis de estos
polisacáridos puede darse de forma enzimática o química y puede evidenciarse la presencia de la
glucosa (azúcar reductor) mediante pruebas cualitativas que permitan la identificación de azúcares
reductores ​[10]​.

Para la hidrólisis de ambos compuestos se empleó la enzima 𝛂-amilasa salival. Esta enzima cataliza
la hidrólisis de los enlaces 𝛂-1,4-glucosídicos. Para evidenciar la presencia de glucosa luego de la
reacción de la enzima con los polisacáridos se realizó la prueba de Benedict. El resultado para el
almidón fue positivo mientras que para la celulosa fue negativo. Esto puede explicarse con base en
las diferencias de los enlaces glucosídicos que se encuentran presentes en cada molécula. El
almidón está formado por enlaces 𝛂-1,4-glucosídicos, precisamente sobre los que tiene acción la
enzima. Por otro lado, la celulosa se forma por la unión de moléculas de β-D-glucosa mediante
enlaces β-1,4-glucosídicos, por lo que la enzima no cataliza la reacción de hidrólisis. Solo ciertos
microorganismos tienen la enzima celulasa, la cual es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1,4
β- D-glucosídicos. Aquellos animales que utilizan dichos microorganismos pueden digerir la
celulosa. ​[11]

Análisis cuantitativo de carbohidratos:

a) Método de la Antrona:

Consiste en la deshidratación ácida del carbohidrato presente formando así derivados del furfural.
Este último reacciona con la Antrona formando un compuesto verde azulado el cual absorbe energía
a 620 nm. La intensidad del color es proporcional a la concentración del carbohidrato.

Los resultados de la cuantificación por este método se muestran en la Tabla 2. La muestra con
mayor concentración de glucosa fue la bebida Mr. Tea (con 10890 mM).

b) Método del DNS

Por el método de DNS se puede identificar y cuantificar la concentración de los azúcares reductores
de diferentes muestras; ya que, el ácido 3,5 dinitrosalicílico provoca la oxidación de los azúcares
reductores, y al mismo tiempo su propia reducción endotérmica formando ácido 3-amino 5- nitro
sialicilico, que es de color rojizo. Puesto que, el color del ácido es proporcional a la concentración
de azúcares, por medio de espectrometría se puede determinar la concentración de azúcares
reductores para diferentes muestras (véase la reacción en la figura No.4) ​[12]​.

Esta cuantificación se realizó para una muestra de miel. Sin embargo, este proceso no es
recomendado para muestras coloreadas intensamente, como mieles; ya que, el color de la muestra
puede afectar la lectura en el espectrofotómetro. Esto debido a que, es un método
espectrofotométrico de alta sensibilidad. Por lo tanto, el resultado de la concentración de azúcares
reductores de la muestra de miel en esta práctica fue considerado como inexacto.

Los resultados de la absorbancia de tres muestras (incluyendo la miel) estaban por debajo del rango
de las absorbancias de la curva de calibración. A pesar de esto, se implementó la ecuación lineal de
la curva de calibración para determinar sus concentraciones (Gráfica No.2). Sin embargo, las
concentraciones halladas no corresponden a los valores reales, debido a que no se conoce el
comportamiento de la curva para los valores de absorbancia inferiores a 0,009 y la ecuación lineal
podría variar.

Para la muestra de jugo hit se encontró presencia de azúcares reductores a una concentración de
116mM, esto puede deberse a que por ser un jugo de fruta, tiene pulpa de fruta, y dado que la fruta
tiene dos tipos de azúcares reductores, la fructosa y glucosa, estos azúcares fueron identificados
mediante este método. Otra posibilidad, es que los azúcares reductores no sólo provengan de la
pulpa de fruta, sino también de azúcares sintéticos como el Jarabe de Maíz de Alta Fructosa; ya que,
es uno de los azúcares sintéticos más utilizados en la industria de bebidas a nivel mundial y en
Colombia.​[13].​.
 c) Glucosa-oxidasa

Para la cuantificación de glucosa en sangre se implementó el método de la glucosa oxidasa

enzimática – colorimétrica, debido a la precisión y a la especificidad de la enzima glucosa oxidasa
(Gox) por el substrato β-D-glucosa. Este método se basa en la actividad de la enzima glucosa
oxidasa, que cataliza la oxidación de la β-D-glucosa, por la vía del D-glucano- δ-lactona, hacia
ácido glucónico y peróxido de hidrógeno. Asimismo, en presencia de la enzima peroxidasa (POD),
una amina aromática (como la amino-4-antipirina ) es oxidada por el peróxido de hidrógeno para
dar una coloración rosada debido a la formación de quinoneimina (véase la reacción en la Figura
No.6). La intensidad de la coloración es proporcional a la concentración de glucosa y su longitud de
onda de absorción está entre 500 y 520 nm.

Los resultados de la concentración de glucosa en las muestras de sangre variaron entre las dos
mediciones realizadas. Teniendo en cuenta que para las dos mediciones se llevó a cabo el mismo
procedimiento, una posible causa de estas diferencias en los resultados, son los errores en el
pipeteo de la muestra; ya que, cada procedimiento fue realizado por personas distintas, y por lo
tanto los volúmenes pudieron variar entre sí, esto significa que no hubo repetibilidad en este
procedimiento

Conclusiones y Recomendaciones

❖ Se identificó la presencia de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos en diversas

muestras a través de ensayos cualitativos cuyos fundamentos se basan en reacciones
químicas.
❖ Se identificó la presencia de azúcares reductores en las diferentes muestras analizadas.
❖ Se demostró que los polisacáridos están conformados de monosacáridos unidos mediante
enlaces glicosídicos.
❖ Se comprendieron los fundamentos teóricos de las diferentes pruebas empleadas tanto para
la identificación cualitativa como la cuantificación de las muestras, lo que conlleva al
reconocimiento de su aplicación en el campo del bioanálisis.
❖ Al momento de realizar las curvas de calibración se recomienda la verificación de la
concentración del patrón.
❖ Se reconoció la importancia, amplitud y aplicación de los carbohidratos en diferentes
campos como la clínica, la biología y la industria.

Bibliografía

[1] KARKI, GAURAUB (2018). Molisch’s Test: Objectives, Principle, Reagents, Procedure and
Result. Véase en: ​https://www.onlinebiologynotes.com/molischs-test-
objectives-principle-reagents-procedure-and-result/
[2] Cultura Científica (2019). Miel y siropes, ¿son mejores que el azúcar?. Véase en:
https://culturacientifica.com/2017/06/29/miel-siropes-mejores-azucar/

[3]​Yogurt in Nutrition (2018). La lactosa como un nutriente. Véase en:

https://www.yogurtinnutrition.com/es/la-lactosa-como-un-nutriente/

[4] ​Postobón (2018). Speed Max. Véase en: ​https://tomatelavida.com.co/informacion-nutricional/

nueva-generacion/speed-max-postobon/

[5] My Fitness Pal (2019). Tabla de calorías Jugo Hit. Véase en:
https://www.myfitnesspal.com/es/food/calories/jugo-hit-19918380

[6] ARYAL, SAGAR (2019). Benedict’s Test- Principle, Composition, Preparation, Procedure and
Result Interpretation. Véase en: ​https://microbiologyinfo.com/benedicts-test-principle-composition-

preparation-procedure-and-result-interpretation/​.

[7] ​Bonner, William A.; Castro, Albert J. (1974). «12». Química orgánica básica (3ª edición).
Madrid: Alhambra

[8]​Harper College (2009). Prueba de Barfoed. Véase en:

http://dept.harpercollege.edu/chemistry/chm/100/dgodambe/thedisk/carbo/barf/barfoed.htm

[9​] B Martín-Sánchez, M., Martín-Sánchez, María Teresa y Pinto G. (2012) Reactivo de Lugol:
Historia de su descubrimiento y aplicaciones didácticas. Universidad Nacional Autónoma de
México. Véase en: ​http://www.scielo.org.mx/pdf/eq/v24n1/v24n1a6.pdf

[10] ​Passos, C. P., Ferreira, S. S., Serodio, A., Basil, E., Marková, L., Kukurová, K., Ciesarová,
Z., Coimbra, M. A. Pectic polyaccharides as an acrylamide mitigation strategy-competition
between reducing sugars and sugar acids. Food Hydrocollids. 2018. Vol. 81 pp 113-119
[11]​ ​McKee, T., McKee, J. (2014). Bioquímica, las bases moleculares de la vida. McGrawHill,
México. 5 ed. pá. 224,225.

[12] ​Otero, M., Reyes, A., & Martínez, S. (1986). Limitaciones del método del ácido 3-5
dinitrosalicílico en mieles finales. ICIDCA. Sobre Los Derivados de La Caña de Azúcar, 20(1),
20–25.

[​13] ​Cerón, C., Vallejo, D. Verdades del cumplimiento del rotulado de bebidas azucaradas en
Colombia. Asociación Colombiana de Educación al Consumidor. Tomado de:
https://educarconsumidores.org/wp-content/uploads/2019/04/Estudio-Educar-Consumidores-BBAA
-2019-ISBN.pdf
 ANEXOS: TABLAS DE RESULTADOS

Tabla No. 1. Resultados de las pruebas cualitativas para la identificación de carbohidratos.

Molisch Benedict Barfoed (min) Lugol

CHO
G1 G2 G1 G2 G1 G2 G1 G2

Glucosa + + +++ +++ 3:05 5 - -

Fructosa +++ +++ +++ +++ 4:00 2 - -

Sacarosa ++ ++ - - >21:36 >30 - -

Maltosa + + +++ +++ >21:36 14 - -

Almidón +++ + + +/- >21:36 20 ++ +++

+

Carboxicelulosa +++ ++ - - >21:36 - - -

Miel +++ ++++ +++ ++ 3:27 2 - -

NR NR
Leche +++ - >22 - - -

Speed-Max +++ +++ +++/- +++ 2:11 3 - -

Jugo Tutti +++ ++ ++ +++ 1:37 4 ++ +++

Frutti +
NR: no registra
Las cruces indican la intensidad del color formado durante la muestra.
Tabla No.2. Resultados de la cuantificación de carbohidratos por el método de la Antrona.

Muestra Absorbancia a 620 nm [ ] de azúcar (mM)

Blanco 0,000 0

P1 0,047 0,011

P2 0,191 0,022

P3 0,339 0,044

P4 0,889 0,066

P5 0,843 0,110

Speed Max 4,130 58,22

Miel (1/1000) 0,041 467,5

Mr. Tea (1/1000) 1,243 10890

Hit (1/1000) 0,260 2290

Tabla No.3. Resultados de la cuantificación de carbohidratos por el método DNS.

Muestra Absorbancia [ ] mM

Blanco 0,000 0,000

1 - 0,055

2 0,009 0,111

3 0,034 0,167

4 0,055 0,222

5 0,073 0,278

Speed Max (1/10) 0,001 0,7

Miel (1/1000) 0,001 70

Mr. Tea (1/1000) 0,003 75,4

Jugo Hit (1/100) 0,017 116

Tabla No.4. Cuantificación de glucosa en sangre por el método de la glucosa oxidasa.

[ ] de glucosa 1 [ ] de glucosa 2
Muestra Absorbancia 1 Absorbancia 2
(g/dL) (g/dL)

Blanco 0,000 0 0,000 0

Patrón 0,423 100 0,305 100

Muestra 1 0,414 97,87 0,350 114,7

Muestra 2 0,317 74,94 0,243 79,7

Muestra 3 0,472 111,6 0,422 138,3

Muestra 4 0,501 118,4 0,363 119,0

 ANEXOS: ESTRUCTURAS QUÍMICAS*

Estructura 1. Glucosa

Estructura 5. Almidón

Estrucura 2. Fructosa

Estructura 6. Carboxicelulosa

Estructura 3. Sacarosa

Estructura 7. D-Glucosa
Estructura 4. Maltosa
Estructura 8. D-fructosa

*Las imágenes presentadas fueron tomadas de es.wikipedia.org

 ANEXOS: FIGURAS

Figura No.1. ​Reacción del Ensayo de Molisch.

Tomado de:​ h​ ttps://sites.google.com/site/bioquia9/reaccion-de-molish
Figura No.2. ​Reacción química de la Prueba de Benedict.

Tomado de: ​http://organica1.org/

Figura No. 3. ​Hélice de amilosa con iones I3- embebidos.

Tomado de:​ https://www.wikiwand.com/es/Prueba_del_yodo
Figura No.4. ​Reacción de oxidación de azúcares reductores, método DNS.
Tomado de:​ https://sites.google.com/site/enzineticupiig/bradford-y-dns

Figura No. 5. ​Reacción de deshidratación del carbohidrato y condensación del furfural por el
método de la Antrona.
Tomado de: ​http://adbsunidoc.blogspot.com/2017/02/el-glucogeno-y-las-antronas.html

Figura No.6. ​Reacción de oxidación, método glucosa oxidasa enzimática-colorimétrica.

Tomado de:
https://jugandoconpipetas.wordpress.com/2016/11/05/practica-7-determinacion-de-glucosa-en-suer
oorina-glucosa-oxidasa/
 ANEXOS: GRÁFICAS

Gráfica No.1. Curva de Calibración de la Antrona

Gráfica No.2. Curva de Calibración de DNS

 Cuestionario

❖ Consulte y escriba las reacciones químicas entre glucosa, sacarosa, almidón (amilosa y
amilopectina) y celulosa con los indicadores que empleará para su detección cualitativa
(sección experimental).
-Las estructuras y reacciones químicas se encuentran en los anexos en las secciones
Estructuras químicas y Figuras, respectivamente.
❖ a. ¿Por qué es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?
-La pregunta está resuelta en la discusión de la prueba.
b. ¿Qué enlaces hidroliza la enzima α-amilasa?
-La pregunta está resuelta en la discusión de la prueba.
c. ¿Qué enlaces hidroliza el ácido clorhídrico cuando se utiliza para hidrolizar el almidón?
-Se produce un rompimiento total de los enlaces que mantienen unido a los monómeros del
almidón y se forma glucosa, maltosa, isomaltosa.
❖ Escriba las fórmulas estructurales en proyección FISHER y de HAWORTH de los
monosacáridos y disacáridos utilizados en la práctica de laboratorio.
-Las estructuras se encuentran en los anexos en la sección Estructuras químicas.
❖ ¿Qué importancia biológica tiene cada uno de los carbohidratos que se utilizarán en la
práctica de laboratorio?
Fructosa: ​Se utilizan cantidades importantes de fructosa en el sistema reproductor
masculino. Ésta se sintetiza en las vesículas seminales y después se incorpora al semen. Los
espermatozoides utilizan el azúcar como fuente de energía
Glucosa: ​Es el principal combustible de las células. En los animales, la glucosa es la fuente
de energía preferida de las células cerebrales y de las células que tienen pocas mitocondrias
o que carecen de ellas, como los eritrocitos.
Sacarosa: Aporte de energía a los diferentes tejidos, para cumplir esta función pasa por un
proceso digestivo que empieza en la boca y continúa en el estómago e intestino delgado
descomponiéndose en glucosa y fructosa, sólo de esta forma se absorben.
Maltosa: Tiene como función el aporte energético celular. pueden ser metabolizados con la
adición de moléculas de agua
Almidón : El almidón, la reserva energética de las células, es una fuente significativa de
carbohidratos en la alimentación humana. La mayor parte del valor nutritivo de los
principales alimentos mundiales (p. ej., las patatas, el arroz, el maíz y el trigo) proviene del
almidón.
Celulosa: ​Es el polisacárido estructural más importante de las plantas. Debido a que la
celulosa representa casi un tercio de la biomasa de las plantas, es la sustancia orgánica más
abundante de la tierra
❖ Consulte y escriba las reacciones químicas involucradas en el método de cuantificación de
carbohidratos utilizando antrona.
-Véase anexos-figuras, Figura No.5.
❖ ¿Por qué la prueba de la glucosa oxidasa es específica para la determinación de glucosa?
-Porque la enzima glucosa oxidasa cataliza la oxidación de D-glucosa a ácido glucónico,
pero no oxida L-glucosa. La especificidad de esta enzima es de tal grado que diferencia los
estereoisómeros.
❖ ¿Qué otros métodos se podrían utilizar para cuantificar carbohidratos?
➢ Método de fenol-sulfúrico.
➢ Método óptico de polarimetría.
➢ Determinación de azúcares por HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución).
➢ Determinación de azúcares por espectroscopia por infrarrojo cercano.
➢ Método de Lane-Eynon.
➢ Método Fehling-Soxhlet.
➢ Método de Munson-Walker.
➢ Método fenol-ácido sulfúrico.
➢ Método ácido sulfúrico-UV.
➢ Nelson-Somogyi.
➢ Ferrocianuro alcalino.
➢ Trifenil tetrazolio.