LABORATORIO DE CULTIVO CON PRUEBAS DE

ANTIBIOGRAMA Y TINCION GRAM.

José David Ramos Castaño1, Juan David Castro Rojas2
Laboratorio, Universidad Unisarc, Santa Rosa de Cabal, Colombia

RESUMEN

Como objetivo de la práctica de microbiología es conocer a cerca de los cultivos en agar sangre y
agar nutritivo con el fin de observar el crecimiento de las bacterias que se han cultivado y tener un
diagnóstico de la enfermedad que causa la bacteria, teniendo en cuenta a que antibiótico es sensible
esta bacteria.

As an objective of the practice of microbiology is to know about the cultures in blood agar and nutritive
agar in order to observe the growth of the bacteria that have been grown and have a diagnosis of the
disease that causes the bacteria, taking into account what antibiotic is this bacterium sensitive.

INTRODUCCIÓN ayudar a observar las bacterias como es su

La microbiología es la ciencia y una
herramienta que estudia los diferentes tipos de
microorganismos ya que no son observados a
simple vista por el ojo humano, estos
microorganismos son causante de diferentes
enfermedades, con el fin de proporcionar un
servicio adecuado para la salud animal, la
salud pública y erradicar la enfermedad.
Este procedimiento se hace con el fin de
conocer el microorganismo a fondo y saber a
qué medicamento tiene potencial de
resistencia, emplear un tratamiento y
medicamento específico para dicha
enfermedad.
En esta práctica se puede observar la
morfología de las bacterias, en donde se utilizó
distintas sustancias como son cristal violeta,
Lugol, alcohol, acetona, y safranina, para
forma o agrupación y la coloración al
microscopio empleando unas vistas a 10x, 40x
y a 100x con aceite de inmersión.
Cuando realizamos estos procesos nos
podemos encontrar con varias fallas en los
resultados ya que estos procedimientos se
necesitan de mucha practica y con ayuda de un
espacio totalmente estéril, pero gracias a estos
procesos obtenemos experiencia para futuros
procedimientos.
La elaboración de los medios de cultivo es
muy importante en los espacios de
microbiología ya que cumple un papel muy
importante para obtención de resultados
confiables en los procesos realizados.
METODOLOGÍA
Esta siembra por agotamiento tiene como fin
el flameo del microorganismo, se procedió a la
utilización de las cajas de Petri que en su
interior se encontraba el agar nutritivo (figura
1).
Figura 1.
Después procedimos a la utilización de las
asas para sembrar en la caja la muestra que se
asignó (figura 2).
Figura 2.
Este proceso se hacía con mucho cuidado al
lado del mechero ya que este permite que no
se contamine la muestra y esté en un ambiente
estéril (figura 3),
Figura 3.
Para realizar esta muestra se debe girar el agar
de sangre cuatro veces en contra de las
manecillas del reloj, siempre este proceso se
debe hacer al lado del mechero; está muestra
tiene como función tener un mayor número de
colonias (figura 4).
Figura 4.
Después procedimos a utilizar el agar nutritivo
en dónde se hace con los mismos materiales,
pero en este caso el procedimiento se hace en
forma de Zic Zac en donde cubrimos toda la
muestra; luego procedimos a ver la morfología
del microorganismo que nos asignaron,
procedimos cogiendo una cepa con el
microorganismo asignado, luego tomamos un
porta objetos en dónde procedimos a marcarlo
por uno de sus extremos (figura 5).
Figura 5.
Luego colocamos una gota de agua destilada
sobre el porta objetos, procedimos a hacer el
frotis bacteriano utilizando las asas de siembra
cogiendo el microorganismo de la caja de agar
y luego introduciendo sobre el porta objetos
(figura 6).
Figura 6.
Y luego lo fijamos con calor (figura 7).
Figura 7.
Luego procedimos a fijar el cristal violeta en
una cantidad suficiente para cubrir todo el
frotis y dejamos actuar durante 1 minuto
(figura 8).
Figura 8.
Luego lavamos con una pequeña cantidad de
agua para eliminar el exceso de colorante
(figura 9),
Figura 9.
Después agregamos lugol y dejamos actuar
durante 30 segundos (figura 10).
Figura 10.
Procedimos a lavar con agua; después
colocamos alcohol acetona hasta que decolore
o durante 15 segundos (figura 11).
Figura 11.
Luego lavamos con agua para eliminar el
exceso de disolvente; luego agregamos
safranina durante un minuto (figura 12).
Figura 12.
Y luego procedimos a lavar con agua el exceso
de colorante; ya una vez hacíamos estos pasos
procedimos a observar en el microscopio en
vistas de 10x, 40x y 100x con utilización de
aceite de inmersión, en dónde vimos la
morfología y la tinción de Gram del
microorganismo asignado (figura 13).

Figura 13.
Luego hicimos una prueba de antibiograma de
los microorganismos cultivados en dónde
procedimos con un hisopo cogiendo el
microorganismo y cultivándolo por siembra
masiva en un agar nutritivo (figura 14).
Figura 14.
Luego procedimos a colocar los discos de los
diferentes antibióticos que fueron
oxitetraciclina, penicilina y enrofloxacina
separadamente para observar la colonización
de los microorganismos (figura 15).
Figura 15.
En dónde al pasar de 4 días obtuvimos que el
microorganismo solo fue resistente a la
penicilina (figura 16).
Figura 16.
OBJETIVOS
1. Utilizar adecuadamente las técnicas
básicas de identificación de microorganismos.
2. Reconocer los diferentes medios de
cultivo y su uso.
3. Aplicar las técnicas de repique y siembra
de microorganismos.
4. Reconocer las características que presenta
el crecimiento bacteriano en un medio de
cultivo.
5. Conocer las técnicas para observar
microorganismos al microscopio.
6. Reconocimiento de bacterias por tinción
de Gram.
7. Reconocer el uso de los colorantes.
MATERIALES - Mechero
Un mechero o quemador
- Microscopio: Bunsen instrumento utilizado en los
laboratorios científicos para
Es una herramienta que permite observar .
calentar, esterilizar o proceder a
objetos que son demasiado pequeños para la combustión de muestras
ser observados a simple vista. o reactivos químicos.

- El cristal violeta
- Alcohol acetona
colorante catiónico penetra en todas las
células bacterianas (tanto gram positivas Quita los excesos de colorante
como gram negativas) a través de la pared
bacteriana. Para poner de manifiesto las
células gram negativas se utiliza una
coloración de contraste.

- Lugol
Es un compuesto formado por yodo, hace
que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la célula bacteriana
- La caja o placa de Petri:
Es un recipiente redondo, de vidrio o
cristal, Se utiliza en microbiología para
cultivar células o examinar el
comportamiento de microorganismos.
- Safranina
es un colorante biológico, de contraste
que se utiliza en la Tinción de Gram para
proporcionar un color violeta más
intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de
rosa a las bacterias G- t

Asas:
El asa bacteriológica, asa de platino
o también llamada asa de kohle es
un instrumento de laboratorio, sirve
para coger microorganismos.
 CONSULTAS

A) ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo?

Según su estado físico
• Medios de cultivo sólidos: con intervención de los líquidos, se preparan
composiciones solidas gelatinosas provenientes de proteína ósea animal o
biopolímeros de glucosa provenientes de algas marinas.
• Medios de cultivo líquidos: los presentados de esta forma, pueden cultivar una
gran variedad de microorganismos en forma suspensoria. Son utilizados como
medios de mantenimiento.
• Medios de cultivo semisólidos: es similar al sólido, pero con un porcentaje menos
de líquido.
Según su utilización
• Medio complejo o indefinido: componen sus herramientas químicas de cultivo con
diferentes nutrientes, sin saber su composición.
• Medio de enriquecimiento: no se limitan a los nutrientes normalmente utilizados,
sino que también hace uso de los que tienen características establecidas.
• Medio selectivo o poli microbiano: es en el que se controla por completo el
crecimiento del microorganismo, diseñando por completo la forma en que será
cultivado y los medios para hacerlo.
• Medio inhibidor: es una variante del selectivo, en el que, en vez del crecimiento del
organismo cultivado, tiene como objetivo detenerlo o ralentizarlo.
• Medio de transporte: en el que no se cultiva, sino que se mantiene durante un
tiempo hasta su traslado al sitio de cultivo definitivo.
• Medio de multiplicación: es clase de cultivo que se centra en la producción de
microorganismos múltiples, en grandes cantidades.
• Medio diferencial: se clasifican y cultivan los organismos por separado,
dependiendo de sus particularidades. Las sustancias nutritivas utilizadas son las
más indicadas para cada microorganismo.
• Medio de mantenimiento: se caracteriza por promover el crecimiento lento en vez
de rápido, de modo que las células puedan ser cultivadas durante mucho tiempo sin
riesgo a su deceso.
• Medio de identificación: tienen un objeto específico: evidenciar una característica
peculiar del microorganismo, de forma que el conocimiento del mismo sea más
profundo.
Cuando lo determina su posición.
• Medio común: se cultiva con los componentes mínimos necesarios para el
desarrollo de microorganismos no especiales.
• Medio sintético o definido: al ser usadas las sustancias químicas estas van a
incrementar el crecimiento del organismo que se pretenda cultivar.
• Medio semisintético: una combinación entre los dos anteriores.

B) ¿Medios más empleados en microbiología veterinaria?

¿Con que están enriquecidos estos medios?
Medios de cultivo selectivos: sólidos y la selectividad se adquiere alterando las
condiciones físicas del medio o eliminando compuestos químicos que sean
específicos para inhibir el crecimiento de especies químicas, este medio solo
permite el crecimiento de un grupo de microorganismos suprimiendo el de los
demás, se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos.
Los medios más utilizados en medicina veterinaria son:

● Agar Mc
● Agar Ss
● Agar sangre
● Agar MacConkey
● Medios no enriquecidos
Son enriquecidos con:
Un medio enriquecido con sangre que les proporciona todos los nutrientes
necesarios para sobrevivir con Agar CLED. Tenemos Agar chocolate, Agar
abouraud, caldo selenito y Agar MacConkey.

C) ¿Qué condiciones ambientales son necesarias para permitir el crecimiento y

multiplicación de los microorganismos?
Los microorganismos como seres vivos que son, necesitan condiciones adecuadas
de temperatura, humedad y presencia de nutrientes para desarrollarse.
- Temperatura. - Nutrientes.
- Humedad. - Tiempo.
- Acidez (PH). - Oxígeno.
D) ¿Que características permiten determinar la calidad y aptitud de un medio de
cultivo?
- Cada preparación de medios de cultivos se debe tener en cuenta lo siguiente:
- Se debe tener cada caja petri marcada con el nombre del producto.
- Cada lote de cultivos se debe probar antes de su utilización
- Se debe medir el pH, reacción, profundidad del agar, capacidad de crecimiento.

E) ¿Características o requerimientos que deben tener los medios de cultivo para

virus?
- Los virus deben ser lo más parecido a su medio natural, con células vivas a las
que poder infectar.

- Para crecer virus en el laboratorio es indispensable crecer un cultivo de tejido

animal, vegetal, fúngico o bacteriano, dependiendo de qué infecte el virus. Las
células hospedadoras harán capaz al virus de aumentar su número.

- Uno de los componentes comunes en los medios ricos suele ser albumina de
suero bovino, la albumina extraída de la sangre.

F) ¿Cómo se realiza la interpretación del antibiograma?

Con un antibiograma se pueden obtener resultados cualitativos que indican si la
bacteria es sensible o resistente a un antibiótico, o cuantitativos que determinan la
concentración mínima (CMI) de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano
(en μg/ ml o en mg/l).
La interpretación de los resultados del antibiograma (sensible, intermedio o
resistente) se realiza en función de los valores establecidos por diferentes comités,
como el Clinical and Laboratory Standards Institute en Estados Unidos2, el
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing en Europa y la Mesa
Española de Normalización de la Sensibilidad y Resistencia a los Antimicrobianos.
Estos comités determinan y establecen puntos de corte basados en propiedades
microbiológicas, farmacocinéticas y de eficacia clínica, para definir la sensibilidad
(éxito terapéutico) o resistencia de las diferentes especies bacterianas a cada
antimicrobiano.

G) Defina concentración mínima inhibitoria y consulte un protocolo para determinar

la CMI
La Concentración mínima inhibitoria (MIC), en microbiología, es la concentración
más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo
después de su incubación. La concentración mínima inhibitoria es importante en
diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un
agente antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes
antimicrobianos.
En un primer momento, el método estándar utilizado para las pruebas in vitro fue el
de dilución en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo. Actualmente
existen varios métodos que se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad
a los antibióticos y todos ellos se realizan bajo condiciones estandarizadas por
organismos internacionales.
Dilución en caldo
Se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente
diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que mantiene el desarrollo del
microorganismo. Los antibióticos se preparan en "soluciones madre" concentradas
y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento.
Después de un periodo de incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos
que indica el desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y
en todos los que no contengan suficiente antibiótico que sea capaz de inhibir su
desarrollo. La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento es
la Concentración Mínima Inhibitoria.
Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea
el mismo sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.
A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los
tubos de caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el número de colonias
que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara
con el número de UFC/ml del cultivo original. La mínima concentración del agente
antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se
denomina concentración bactericida mínima (CBM).
 DATOS OBTENIDOS
- Microorganismo: Número 1
- Forma: Cocobacilo
- Agrupación: Racimo
- Bacteria: Gram negativa
A) Dibuje los microorganismos observados en el microscopio.
B) ¿Porque para visualizar el frotis se utiliza aceite de inmersión?
En general el aceite de inmersión sirve para aumentar la resolución de un
microscopio mediante la inmersión del lente objetivo y el espécimen en un aceite
transparente de alto índice de refracción.
La función del aceite de inmersión es restringir el movimiento de la muestra, además
de evitar el rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se lo utiliza
cuando vamos a observar con el objetivo 100x.
C) Analizar las posibles causas de error en el procedimiento o los factores que
contribuyeron a la correcta tinción de las bacterias en estudio.
1. El Cristal Violeta tiende a formar precipitados lo cual puede ser causa de
observación de estructuras falsas en el frotis. Si se observan precipitados se
debe filtrar el colorante
2. La evaporación puede ser una causa de mal funcionamiento de los colorantes
3. Las placas sucias con residuos de polvo o grasa pueden ser causa de mala
fijación y tinción de la muestra.
4. Sobrecalentamiento de la placa durante la fijación. El exceso de calor provoca
un daño físico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la
retención de los colorantes.
5. Lavado muy fuerte de la placa durante la tinción.
6. Cantidad insuficiente de los colorantes.

Reporte De Los Resultados Obtenidos

microorganismo: X
Sustancias empleadas Halo de inhibición
Oxitetraciclina 2.7cm
Enrofloxacina 3.0 cm
Penicilina Resistente
ANÁLISIS Y DISCUSIONES DE LOS
RESULTADOS
Observamos que para cultivar el
microorganismo se debe meter el asa al fuego
para esterilizar, pero se debe esperar un CONCLUSIONES
momento para coger el microorganismo para • Los agares nutritivos sembrados con
no matarlo por la alta temperatura. el microorganismo crecieron en colonias
Se debe cultivar el microorganismo con irregulares siendo resistentes a la penicilina y
delicadeza para no dañar el cultivo nutritivo, sensibles a la enrofloxacina y a la
de lo contrario no crecerá, oxitetraciclina como podemos observar en la
figura 16.
Pudimos observar que el cultivo del
microorganismo no creció debido a que en el
momento de la siembra el agar nutritivo se • Los primeros agares no fue posible
dañó por la falta de delicadeza al momento de conocer su resultado debido a que hubo un
introducirlo al agar, la otra razón fue porque error en la preparación de los agares nutritivos
fueron mal cultivados los agares nutritivos por por lo tanto tuvimos que repetirlo en el
parte del encargado de hacerlo. segundo laboratorio junto con el antibiograma.
En las láminas pudimos ver por medio del
microscopio que la bacteria tomó un color
rosado claro, por lo que deducimos que es una • Se cumplió la meta del procedimiento
bacteria gran negativa, tuvo más afinidad por de tinción gram donde el microorganismo fue
el colorante de contraste safranina. una bacteria gran negativa debido a que tomó
una coloración rosado claro, fue más
En antibiograma introducimos 3 bolas de susceptible a la safranina (coloración de
antibióticos, Penicilina, enrofloxacina y contraste).
oxitetraciclina, pudimos observar que el
microorganismo resultó ser resistente a la
penicilina.
En el proceso de introducción de las pastillas
antibióticas dejamos espacios para observar la
colonización de los más utilizados.
 BIBLIOGRAFIA
 https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-i/pb-i-2-variedad.htm
 https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1507&sectionid=
102890796
 https://biologia.laguia2000.com/virus/medios-de-cultivo-para-virus-y-
mocrooganismos-parasitos
 https://gestionintegra.com/factores-que-favorecen-el-crecimiento-bacteriano/
 http://microbiologiasena.blogspot.com/2010/05/algunas-causas-de-error-
durante-la.html?m=1
 https://www.tiendamicroscopios.com/es/538-aceite-de-inmersi%C3%B3n-
0710144897137.html