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Mercedes Guerra, Grisel Ortega

Separación, caracterización estructural y cuantificación de antocianinas mediante métodos químico-físicos.
Parte I
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. XL, núm. 2, mayo-agosto, 2006, pp. 35-44,
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120664005

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de

Azúcar,
ISSN (Versión impresa): 0138-6204
revista@icidca.edu.cu
Instituto Cubano de Investigaciones de los
Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba

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Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
 Mercedes Guerra, Grisel Ortega

Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA)

e.mail: mercedes.guerra@icidca.edu.cu

RESUMEN

Las antocianinas son compuestos fenólicos del grupo de los flavonoides y están presen-
tes en la naturaleza como pigmentos en las flores, frutos y hojas de algunas plantas. Se
presenta una revisión bibliográfica sobre separación y caracterización estructural de las
antocianinas. Se describen las propiedades químico-físicas y los métodos utilizados para
la separación y purificación de las mismas en materiales vegetales y en extractos comer-
ciales. Se muestran diferentes adsorbentes y sistemas de fase móvil específicos en análi-
sis de mezclas de antocianinas utilizando los métodos de cromatografía de placa delga-
da y HPLC.

Palabras clave: Antocianinas, flavonoides, Cromatografía de Capa Delgada,

Espectroscopía UV-VIS, adsorbente, fase móvil

ABSTRACT

Anthocyanins are phenolic compounds that belong to the flavonoid group and appear in
nature as pigments in flowers, fruits and leaves of some plants.
The present paper is a bibliographic description concerning to the separation and struc-
tural characterization of anthocyanins and describe its physico-chemical properties and
the methods used in their separation and purification from plant materials and com-
mercial extracts. Different adsorbents as well as specific movil-fhase systems in tests of
anthocyanins mixtures, using methods of thin layer chromatography are shown.

Key words: Anthocyanins, flavonoid, Thin Layer Chromatography, VIS-UV Spectroscopy,

adsorbent, movil-phase

ICIDCA No. 2, 2006 35

INTRODUCCIÓN
Las antocianinas son compuestos fenóli-
cos del grupo de los flavonoides (1) y están
presentes en la naturaleza en forma de pig-
mentos en flores, frutos, bayas y hojas con
grandes variedades de estructuras químicas,
concentraciones y siendo característica de
cada material y atributo específico para la
caracterización del mismo. También se con-
sidera que son metabolitos secundarios de
las plantas con actividad biológica.
En la actualidad en la industria alimen-
taria, cosmetológica y farmacéutica son uti-
lizados una gran cantidad de compuestos
obtenidos por vía sintética que ocasionan
graves daños a la salud, entre los cuales se
encuentran los colorantes. Por esto, la ten-
dencia actual es sustituir este tipo de com-
puesto de amplio uso por pigmentos de ori-
gen natural, sobre todo de compuestos que
imparten coloraciones rojos brillantes (2)
que brindan un aspecto más atractivo para
la comercialización de algunos productos.
En estudios recientes, se ha reportado
que las antocianinas inhiben el crecimiento
de las células (3) cancerígenas y ayudan a
prevenir el cáncer del colón e impiden
enfermedades del corazón al inhibir la sín-
tesis del colesterol, mejoran la circulación y
fragilidad de los vasos capilares (4), logran-
do beneficios antienvejecimiento. Por esta
razón, se ha incrementado la demanda del
producto, lo que conlleva a la búsqueda de
nuevas técnicas para la obtención de anto-
cianinas a grandes escalas y en particular la
de origen natural, por lo que se ha encami-
nado la vía biosintética, lo cual ha conlleva-
do a los estudios de separación, caracteriza-
ción estructural y al desarrollo de nuevas
técnicas analíticas para cuantificar las anto-
cianinas obtenidas.
DESARROLLO DEL TRABAJO
Mecanismo de biosíntesis de los flavonoides
Las variaciones en la estructura del
esqueleto de los flavonoides se reportan que
dependen de reacciones de hidroxilación
O- metilación y formación de glucósidos y
oxidación del anillo B. Algunas variaciones
asociadas con el anillo B han sido encontra-
das para los isoflavonoides y rotenonas. (5)
36
El paso principal en la biosíntesis de
todos los flavonoides está relacionado con
la formación de un intermediario chalcona.
Se reporta que la formación de la chalcona
se produce por condensación de la coenzi-
ma p- coumaril.
En los primeros intermediarios de la for-
mación de chalcona se identifican tres uni-
dades de malonil-CoA enzima (acetil -CoA.
La chalcona y echinatina presentan un
modelo de hidroxilación inusual, ya que la
función cetona insaturada en la molécula de
chalcona normal sufre una transposición.
Los grupos hidroxilos se convierten en 5,7
dihidroxiflavonoides.
La síntesis de flavona es altamente espe-
cífica sólo para p-coumaril-CoA enzima y
para grupos hidroxilos.
Las Flavonas se forman a partir de meca-
nismos de oxidación. Las dihidroflavonas
son intermediarios importantes en la biosín-
tesis de diferentes flavonoides. Por ejemplo,
para la biosíntesis de cianidina y quercitina,
el dihidrokaempferol se reporta como un
excelente precursor.
En la biosíntesis de taxifolina ocurre la
incorporación de chalcona con retención de
un protón en la posición C-2. Esto excluye
que para los intermediarios y la formación
de chalcona pueda ocurrir por la vía de un
epóxido.
La formación de isoflavonoides puede
ocurrir mediante una reestructuración en el
esqueleto de la chalcona involucrando un
cambio en las posiciones de enlaces 1,2 -arí-
licos.
Característica químico-física de las antocia-
ninas
Las antocianinas son compuestos fenóli-
cos caracterizados por la presencia de un
aglicón (antocianidina) del grupo de los fla-
vonoides. Su fórmula básica está conforma-
da por dos anillos aromáticos unidos por
una estructura de tres carbonos. En su
forma natural, esta estructura corresponde a
heterósidos formado por la combinación de
un aglicón (antocianidina) y de un azúcar
(generalmente glucosa). Si además del azú-
car en la molécula existe un radical acilo,
entonces son antocianinas aciladas (1) (5).
Con pH ácido las antocianinas son muy
estables, pero esta estabilidad se reduce,
cuando el pH se aproxima a la neutralidad,
llegando a destruirse completamente con
ICIDCA No.2, 2006
pH superior a 7. Sin embargo, las antociani- Soluble en agua, metanol, etanol, HCl
nas de tipo aciladas, como la petanina 0.5-7 % y moderadamente soluble en HCl
[petunidina 3-(6``,4`` p-coumarilramnosi- 10 %.
do)-5glucósido] son más estables y conser-
van su color característico con pH alcalino. Pelargonidina 3,5 diglucósido
Las diferencias entre los antocianos
individuales se encuentran en el número de Fórmula empírica: C27H31ClO15.
grupos hidróxilos de la molécula y el grado Forma cristalina: Agujas rojas
de metilación de estos grupos hidroxilos Se descompone 175-180 °C
(que son los factores que caracterizan a las Soluble: en agua, alcohol
diferentes antocianidinas), de la naturaleza
y el número de azúcares ligados a la molé- Peonidina
cula y de la posición del enlace y en la
naturaleza y el número de ácidos alifáticos O C H3
o aromáticos unidos a los azúcares en la +
ο
molécula. Respecto a estos últimos, son ΗΟ OH
importantes los derivados acetilados y los p- -
Cl
cumarilados. (6)
Cuando en las antocianidinas se sustitu- ΟΗ
ΟΗ
ye el grupo hidroxilo de la posición 3 con
una molécula de azúcar se conoce como
derivado sustituido 3- glucósido y con la Fórmula empírica: C16H13ClO6
sustitución del hidroxilo en la posición 3 y Peso molecular: 336.73
5 se conoce como el derivado sustituido 3,5 Forma cristalina: Agujas carmelita rojizo
diglucósido. Soluble: En alcohol dando una solución
Las estructuras más comunes y sencillas rojo oscuro y moderadamente soluble
son: en agua dando una solución carmelita
rojizo.
Pelargonidina
Derivados mono y disustituidos de la
Estructura molecular Peonidina

+
ο Peonidina 3, 5 diglucósido
ΗΟ OH Fórmula empírica: C28H33ClO6
- Soluble en HCl formando agujas púrpura
Cl
intenso
ΟΗ Punto de fusión: 165-167 °C
ΟΗ
Cianidina
Fórmula empírica: C15H11ClO5
Peso molecular: 306.7 OH
No funde a 350 °C +
ο
Forma de cristales: Prisma de color carmeli- ΗΟ OH -
ta rojizo y soluble en alcohol, metanol, Cl
moderadamente soluble en agua y ligera- ΟΗ
mente soluble en cloroformo. ΟΗ
Derivados mono y disustítuidos de la
Pelargonidina Fórmula empírica: C15H11ClO6 (7)
Soluble HCl alcohólico para dar agujas rojo
Pelargonidina-3-monoglucósido castaño monohidratado, muy soluble en
alcohol y alcohol amílico dando una solu-
Fórmula empírica: C21H21ClO10 ción violeta, soluble en carbonato de sodio
Forma cristalina: Agujas con color rojo cas- con color azul. y poco soluble en HCl dilui-
taño y brillo bronceado. do o H2SO4.

ICIDCA No. 2, 2006 37

Cianidina 3-glucósido
Fórmula empírica: C21H21ClO11
Soluble en HCl diluido en medio alcohólico
con formación de láminas o prisma carmeli-
ta rojizo con brillo metálico. Soluble en
alcohol con fuerte florescencia y en carbo-
nato de sodio con azul-violeta.
Se descompone a 205 °C sin fundir
Cianidina 3-ramnoglucósido
Fórmula empírica: C27H31ClO15
Agujas rojas en HCl o primas oscuros en
HCl diluido metanólico.
Soluble en agua caliente, alcohol.
Cianidina 3-galactósido
Fórmula empírica: C21H21ClO11
Agujas rojas con brillo bronce metálico en
HCl en medio metanol
Descompone a 210-212 °C
Soluble en agua, etanol, metanol, HCl dilui-
do. Prácticamente insoluble en HCl al 7 %.
Cianidina 3,5 -diglucósido
Fórmula empírica: C27H31ClO6
Láminas con brillo metálico en HCl diluido
Punto de fusión: 203-204 °C.
Cianidina 3-soforosida o mecocianina
Fórmula empírica: C27H31ClO16.
Cristales rojos oscuros en HCl diluido y ace-
tato de etilo o agujas rojo oscuro en HCl en
medio alcohólico al 2 %
Soluble en agua.
Delfinidina
Fórmula empírica.C15H11ClO7
Prismas o agujas carmelita-chocolate con
brillo metálico en HCl 5 %
Soluble en metanol, etanol, acetato de etilo
Derivados de la delfidina mono y disusti-
tuido
Delfidina 3-glucósido
Fórmula empírica: C21H21ClO12
Cristales rojo oscuro en HCl diluido
38
Delfidina 3,5 diglucósido
Fórmula empírica: C27H31ClO17
Cristales en forma de hoja con brillo bron-
ceado en HCl diluido
Insoluble en agua fría, alcohol, ácido dilui-
do. Soluble en HCl diluido y caliente.
Delfina
Con sustitución de una molécula de glucosa
y ácido hidroxibenzoico.
Fórmula empírica: C41H39ClO21
Cinta o prisma de color rojo-carmelitoso
oscuro en HCl al 3 %
Descompone a 200-203 °C.
Soluble en agua con descomposición, alco-
hol diluido, acetona, alcohol en ebullición.
Violana
Con sustitución de glucosa, ramnosa y
ácido p-hidroxicinamico
Fórmula empírica: C36H37ClO18
Lámina violeta azulado con brillo verde
metálico en HCl metanólico y éter
Soluble en alcohol amílico, HCl 0.15-0.5 %,
menos soluble en HCl 1 %, ligeramente
soluble en agua y prácticamente insoluble
en HCl 5-12 %.
Malvidina
H3C O OH
+
ο
ΗΟ O C H3 C l-
ΟΗ
Fórmula empírica: C17H15ClO7
Peso molecular: 366.75
Prismas con forma rómbica con aparición
del color rojo por luz trasmitida y brillo
verde cuando tiene contacto con el solvente
toma un brillo azul acero.
Usualmente se obtienen los cristales mono
o dihidratado y las sales anhidra son muy
higroscópica y no funde a 300 °C
Soluble en alcohol absoluto dando una
solución rojo-violeta, soluble alcohol amíli-
co. Ligeramente soluble en agua.
En metanol, el compuesto es soluble por
formación de una solución color rojo, pero
ICIDCA No. 2, 2006
comienzan a separarse cristales de color
rojo, los cuales se observan violeta por la
luz transmitida.
Derivados de la malvidina mono y disustí-
tuidos
Malvidina 3- glucósido tetrahidratado
Fórmula empírica: C23H25ClO12.4H2O
En alcohol-HCl se obtienen unos prismas
oscuros con brillo verde metálico.
Ligeramente soluble en agua, alcohol, glice-
rol; prácticamente insoluble en benceno,
cloroformo, éter.
Malvidina 3,5 diglucósido
Fórmula empírica: C29H35ClO17
En HCl se obtienen prismas o agujas de
color carmelita rojizo con brillo verde.
Descompone a 165 °C
Malividina 3-galactósido hemihendecahi-
drato
Fórmula empírica: C23H25ClO12.5 ½ H2O
En HCl-metanol se obtienen cristales en
forma de prisma o agujas de color bronce
metálico y luz transmitida violeta-azulado.
Muy soluble en metanol, alcohol, agua fría
formando una solución rojo oscuro.
Ligeramente soluble en acetona y práctica-
mente insoluble en acetato de etilo.
Petunidina
OH
+
ο cianinas en las frutas de edulis de
ΗΟ OH
C l-
ΟΗ O C H3
OH
Fórmula empírica: C16H13ClO7
Peso molecular: 352,74
En HCl diluido se obtienen cristales en forma
de prisma o agujas de color carmelita gris.
Derivado de la petunidina 3,5 diglucósido
Petunidina 3,5 diglucósido
Fórmula empírica: C28H33ClO17
ICIDCA No. 2, 2006
Punto de fusión: 178 °C
En HCl diluido se obtienen cristales en
forma de lámina violeta con brillo cobrizo.
Separación y caracterización estructural
de las antocianinas
A continuación se detallan las diferentes
vías de tratamiento y purificación de una
muestra, la evaluación de la estructura
dependiendo del tipo de material de partida
que presente diferentes tipos de antociani-
nas.
Separación y caracterización de antociani-
nas de la flor fistulosa de Monarda
Se extraen las antocianinas y otros flavo-
noides de los pétalos de fistulosa de
Monarda con metanol/ácido acético/agua
(10:1:9) y se purifica el extracto en una
columna Sephadex LH20 (3 x 80 cm). Los
flavonoides se separan por HPLC en una
columna Spheri 10-RP18 10 μ (25 cm x 4.6
mm) con una elución de gradiente, utilizan-
do 5 % ácido fórmico/metanol y un detector
de longitud de onda variable y un fotodiodo.
En el cromatograma aparecen dieciseis
picos, cinco corresponden a pigmentos de
antocianinas, los cuales se identifican utili-
zando longitudes de onda a 280 y 510 nm.
Los derivados de las antocianinas y la pre-
sencia de acilación se pueden caracterizar
por los tiempos de retención y los espectros
UV-Visibles. Los pigmentos hidrolizados en
medio ácido se separan mediante
Cromatografía de papel, TLC y electrofore-
sis.(10)
Separación y caracterización de las anto-
Passiflora y P. de suberosa
Las antocianinas en el edulis de
Passiflora (la fruta de pasión) y P. de subero-
sa se extraen con metanol acidificado con
TFA (trifloroacético) al 2 %. Los extractos
filtrados se concentran a vacío y se purifica
por partición en acetato de etilo y se aplica
a una columna de Amberlite XAD-7
(Andersen, el Acta Chem Scand., 1988, 42,
462). Las antocianinas se separan en una
columna Sephadex de LH-20 (100 x 2.6 cm
i.d.) con metanol/TFA/agua (99:2:99). La
Cromatografía de HPLC se realiza en una
columna ODS (20 cm x 5 mm i.d.) 5μ con
un flujo de elusión de 1.2 ml/min con ácido
39
fórmico/agua (1:9) y H2O/ metanol/fórmico
(5:1:4) como fase móvil y se caracterizan las
estructuras mediante: Espectrofotometría
UV-VIS de 210 a 600 nm., Espectrometría de
masa FAB y RMN (11).
Caracterización estructural de antociani-
nas de arándano
Las antocianinas extraídas de arándano
se analizan por Espectrofotometría UV-VIS,
Densitometría de TLC y HPLC con una eva-
luación cuantitativa de antocianinas totales
por Espectrofotometría a 535 nm.
Las antocianinas se determinan por TLC
en celulosa con espesor de capa de 300 F
(0.1 mm espesor) con un sistema de solven-
te formado por ácido fórmico/agua/ácido
clorhídrico (6:5:1) y se detectan a 540 nm.
La Cromatografía de HPLC se realiza uti-
lizando una columna de C18 y aplicando un
gradiente de elusión de ácido fórmico/aceto-
nitrilo y detección a 280 nm. El análisis de
antocianinas de arándano resultó mejor
empleando el método de espectrofotometría
directa o posterior a una separación croma-
tográfica (TLC/HPLC). Para la evaluación
cuantitativa, se recomienda el método
espectrofotométrico directo. La densitome-
tría de TLC sólo se recomienda para extrac-
tos de alta pureza y la cromatografía HPLC
resulta apropiada para la estandarización de
extractos de arándano y la identificación de
impurezas como ácidos del tipo fenólico y
taninos (12).
Caracterización de antocianinas extraídas
de arándano en muestras comerciales
Los extractos secos de antocianinas se
disuelven en HCl 0.1 M en metanol, poste-
riormente se miden sus espectros y el conte-
nido de antocianinas se determina a 535 nm.
Luego, se disuelven las muestras en 5 %
ácido fórmico y se analizan por HPLC en una
columna Partisil 10 ODS (25 cm x 4.6 mm)
con una velocidad de elución de 0.5 min/ml,
utilizando gradiente de ácido fórmico/aceto-
nitrilo (100:0 a 9:1 en 60 min sostenidos a
90 min) y la detección se realiza a 280 nm.
(13)
Separación y caracterización estructural
de antocianinas en el Sylvestris de Malva
La extracción de antocianinas se realiza
con HCl-metanol, y las leucoantocianinas
en el residuo se extraen similarmente des-
40
pués de un proceso de oxidación en presen-
cia de oxígeno del aire. Los extractos se ana-
lizan utilizando diferentes métodos analíti-
cos para su caracterización y cuantificación
como: TLC en fase inversa, Cromatografía
de HPLC y separación en fase inversa para
las antocianinas hidrolizadas y determina-
ción por espectrofotometría de antocianinas
totales como cloruro de malvidina. (14)
Composición de los pigmentos de antocia-
ninas en tomates rojos
Las antocianinas presentes en tomates
rojos se extraen previamente utilizando ace-
tona y se realiza una segunda extracción
con 70 % de acetona seguido por agitación
con cloroformo/acetona (2:1). Se determina
el contenido de antocianinas monómericas
por el método de pH diferencial en un rango
de 2-40 mg/100 g. La composición de anto-
cianinas se caracteriza por HPLC, análisis
espectral y espectrometría de masa. En
todas las muestras se detecta el pigmento
pelargonidina-3-rutinosida-5-glucósido ace-
tilada con ácido p-coumárico (15).
Complejidad de las antocianinas y su
expresión de color
Se presenta una reseña que incluye los
factores que afectan en la formación del
rango de colores de las antocianinas en las
plantas (diversidad de cromóforos, rango
natural de valores de pH de 3-7, compleji-
dad molecular incluyendo el origen de los
compuestos complejos y efecto intermole-
cular a rango amplio). Los métodos que se
utilizan para estudiar estas propiedades son
Espectroscopía UV-VIS, RMN, Dicroismo
Circular y para lograr mayor selectividad
Difracción de Rayos X. (16)
Antocianinas aciladas de los pétalos azules
de Salvia uliginosa
Los pétalos secos y congelados se
extraen con ácido fórmico/metanol/agua
1:10:9); luego se filtra y se evapora hasta
tener un volumen pequeño a presión redu-
cida. Se realiza una Cromatografía de HPLC
preparativa en columna ODS (10 mm d.i x
250 mm) con fase móvil ácido
fórmico/metanol/agua (1:6:13) a (1:8:11) y se
purifica por HPLC utilizando la misma
columna con ácido fórmico/acetonitrilo/
agua (5:16:79). El producto se identifica uti-
lizando técnicas analíticas de espectrome-
ICIDCA No. 2, 2006
tría de masa FAB y RMN-H` a 500 y 600
Mhz en metanol conteniendo HCl al 0.1 %
(17).
Cianidina 3-(2``,3``digaloilglucosido) en
hojas rojas
Se pesan 400 g de hojas rojas de la flor
"Crimson King"y se extraen con TFA (triflo-
roacético) al 1 % en metanol. Se filtra y se
purifica por partición con acetato de etilo
seguido por cromatografía usando columna
Amberlita XAD-2. Las antocianinas diaceti-
ladas (cianidinas) se separan en columna de
Sephadex LH-20 utilizando una elución
paso a paso con metanol/TFA/agua de
(19.8:0.2:80 a 59.4:0.6:40). Las estructuras
se identifican empleando Espectrometría
RMN homo y heteronuclear RMN-2D a
600.13 y 150.92 MHz para H`y C13 y los
valores de los datos espectrales UV-VIS de la
cianidinas separadas (18).
Pigmentos de antocianinas de tulipanes
La flor de tulipán "Queen Wilhelmina"
se extrae con metanol conteniendo TFA al
1% y se realiza una partición con acetato de
etilo. Las antocianinas se separan por cro-
matografía de columna Amberlite XAD-7 y
se purifican usando una columna Sephadex
LH20 y un sistema de solvente agua/meta-
nol/TFA(80:19.6:0.4). La Cromatografía de
HPLC se lleva a cabo en columna Hipersil
ODS. La identificación de estructuras se
realiza mediante espectroscopía UV-VIS uti-
lizando como solvente metanol/ácido clor-
hídrico al 0.01 % en un rango de longitud de
onda entre 240-600 nm, espectroscopía
RMN y masa con ionización a presión
atmosférica e inyección de flujo y como
resultado se obtienen estructuras molecula-
res del tipo de dos pelargonidinas y dos cia-
nidinas con grupos acilos enlazados a la
posición axial del azúcar (19).
Purificación e identificación de antociani-
na de capulina (Prunus serotina ERC)
Las antocianinas se extraen en acetona,
se somete a un proceso de partición con clo-
roformo y se purifica en un cartucho de
fase sólida C18 .
Los métodos de bisulfito y pH diferen-
cial se utilizan para determinar el contenido
de antocianinas monoméricas y color poli-
mérico. Las antocianinas se identifican por
análisis espectral, HPLC, Espectrometría de
ICIDCA No. 2, 2006
Masa-electrospray. La Cromatografía HPLC
se realiza (después de hidrólisis alcalina y
ácida) en columna C-18 (25 cm x 4.6 mm
d.i) 5 μ con gradiente de elución (1ml/min)
usando sistema de solvente acetonitrilo/
ácido fosfórico/ácido acético (el programa se
detalla en el trabajo) y detección a 280, 310
y 520 nm. Como resultado del estudio
estructural se obtienen dos tipos de cianidi-
na: cianidina-3-glucósido y cianidina -3-
rutinosida y un tercer pigmento amarillo
naranja detectado por Espectrometría de
Masa (20)
Enlace convalente entre pigmentos de
antocianinas-flovonol de la flor
Agarparthus azul
Se separan dos antocianinas de la flor de
Agaparthus azul. La purificación involucra
varios pasos cromatográficos, el primero
con Diaion Hp-20, una comatografía de
columna con Sephadex G25, celulosa, Rp y
Toyopearl HW-40 y los productos separados
se caracterizan por RMN-H`, RMN-C13,
Espectrometría de Masa-Cromatografía
Gaseosa, HPLC acoplado a un espectrofóto-
metro UV-VIS seguida de una hidrólisis
ácida o básica. La estructura encontrada es
una delfidina diglucósido p-coumarilada
unido a flavonol triglucósido. (21)
Petunidina 3-O-α α ramnopiranosida-5-O- β
glucopiranosa y otras antocianinas de la
flor Vicia villosa
Las antocianinas se extraen toda la
noche de la flor Vicia Villosa con 1 L de
metanol/ ácido acético (19:1; Solvente A) y
luego se filtra y se concentra el solvente A
filtrado.
Este concentrado se extrae con acetato de
etilo 3 x 300 ml y se aplica a una columna
Amberlite XAD-7. Las antocianinas se eluyen
con 1 L del solvente A y se separan en colum-
na de Sephadex LH-20 (10 cm x 1 cm d.i) con
metanol /agua/TFA (39.9:60:0.1). El TLC se
realiza con sílica microcristalina F5565
Merck con 1-butanol/ácido acético/ agua
(4:1:5) como fase superior y ácido
fórmico/ácido clorhídrico/agua (1:1:2). Se
toma una alícuota de 15 μl y se inyecta en
una columna de HPLC Hypersil ODS 5 μm
(20 cm x 5 mm d.i) con ácido fórmico y
ácido fórmico/agua/metanol (1:4:5) por elu-
sión isocrática y gradiente. Se separan tres
antocianinas que se identifican por:
41
Espectrofotometría UV-VIS con registro del
espectro de 240 a 600 nm, RMN homo y
heteronuclear, RMN 2D y como estructuras
se propone el 3-O- α ramnopiranosida-5-O-
β glucopiranosidas de petunidina (71 %),
delfidina (12 %) y malvidina (9 %). (22)
Antocianinas de flores y Lirio (Liliaceae)
Se pesa 1 g de segmentos secos y conge-
lados de 10 cultivos de flores, incluyendo
además una especie de Lirio y se extraen
con 13 ml de acetonitrilo al 50 % conte-
niendo 3 % de TFA. Se filtra y el extracto se
pasa por una columna Develosil ODS-Hg-5
(25 cm x 4.6 mm d.i) a 40 °C con gradiente
de elusión (1ml/min) con acetonitrilo acuo-
so de 0-30 % conteniendo 0.5 % de TFA
durante 30 min y detección de diodo en un
rango de 260 - 530 nm. Una segunda elusión
con 1.5 ml/min con agua/TFA (99:1, solven-
te A) y acetonitrilo/agua/TFA (3:7:0.05, sol-
vente B, abarcando 16,38, 44, 50, 67 y 100 %
de B a 0,3,10,20,25 y 40-50 min respectiva-
Tabla 1. Valores de Rf x100 de antocianinas y ant ocianidinas en varios sistema s de solventes
mente. El límite detección de la cianidina 3-
O- β rutinosida y cianidina 3-O- β rutinosi-
da-7-O-β-Dglucosido fue de 1.2 μmol. Las
estructuras se confirman por Espectrome-
tría UV-VIS, RMN y masa-FAB. Estos com-
puestos son los responsables del color rojo
de la flor de lirio.(23)
Antocianinas en plasma humano después
de una administración oral de un extracto
de baya de saúco
Un mililitro de plasma se disuelve en
200 μl de una solución acuosa de 0.44 M de
TFA y la mezcla se aplica en un cartucho de
extracción en fase sólida Sep-Pak C18. Las
antocianinas se eluyen con TFA a 0.44 M
en metanol y posteriormente, la fase se
evapora a sequedad y se redisuelve en
solución de TFA a 0.44M. Una porción de
la solución se analiza por HPLC con una
columna Zorbax SB-C18 (25 cm x 4.6 mm
d.i) con un gradiente de elusión (1ml/min)
con solución acuosa de acetato de sodio 25

Poliacrilonitrilo
-Poliamida (7:2)
mezclada con
Silica Gel Celulosa
Adsorbente 40 ml de 0.05 M Celulosa Poliamida
D-O MN 300
fosfato de
potasio
primario
Antocianid inas A B C D E F G F G
Cianidina 3 glucósido 46
Cianidina 3 triglucósido 42
Cianidina 3,5 glucósido 36 52
Delfinidina 3 glucósido 36
Delfidina 3,5 glucósido 35 26
Malvidina 3 glucósido 57 60 61
Malvidina 3,5 glucósido 54 44 33
Peonidina 3,5 glucósido 56 37
Petunidina 3 glucósido 38
Antocianinas
Cianidina 31 83 92 47 53 70 75 57 75
Delfidina 21 41 34 50 60 50 72
Malvidina 37 95 94 62 61 87 84 84 91
Paeonidina 39 55 65 90 86 83 85
Pelargonidina 41 51 71 95 92 69 78
Petunidina 27 54 46 70 75 72 79

42 ICIDCA No. 2, 2006

mM (fase móvil B) (de 0-24 % de B en A
durante 50 min, 38 % de B en A durante
110 min hasta 100 % de B en A durante
120 min) y detección a 520 nm. Dos picos
de antocianinas se pueden separar si se
modifica la programación de fase móvil de
0-26 % de B en A durante 20 min hasta 33
% de B en A durante 80 min (24).
Características de las antocianinas en
Cromatografía de Capa Delgada
En la tabla 1 se observan los Rf de algu-
nas antocianinas y antocianidina en varios
sistemas de solventes.
Sistema de solvente
A= Pentanol-1-propanol-1- ácido acético-
agua (3:2:2:1) se puede añadir dos partes
de heptanol-1 y un desarrollo a 12 cm para
mejorar la placa.
B= n-butanol- ácido acético-agua (4:1:2).
C= formato de etilo-metil-etil acetona-ácido
formico-agua (3:4:1:2).
D= ácido formico - ácido clorhídrico-agua
(10:1:3).
E= alcohol amílico - ácido acético - agua (2:
1: 1).
F= ácido acético - ácido clorhídrico - agua
(10:1:3), distancia de desarrollo de 12 cm.
G= ácido acético- agua (3:2), distancia de
desarrollo.
La manchas de antocianinas y antociani-
dinas se pueden ver a luz ultravioleta, pero
se puede incrementar su intensidad rocian-
do con una solución de ácido oxálico al 10 %
en acetona.agua (1:1). (25)
CONCLUSIONES
En esta revisión se muestran las diferen-
tes estructuras moleculares de las antociani-
nas presentes en diversos materiales de ori-
gen vegetal, lo cual implica una gran canti-
dad de variantes de técnicas analíticas para
el tratamiento de muestra, de métodos de
purificación por Cromatografía de partición
y extracción; caracterización estructural
mediante técnicas de TLC, Cromatografía
HPLC, Espectrofotometría UV-VIS,
Espectrometría de RMN H` y C13,
Espectrometría de Masa-FAB y Masa-
Electrospray, lo cual constituye una herra-
mienta importante para el desarrollo del tra-
ICIDCA No. 2, 2006
bajo de investigación en el tema de separa-
ción, identificación y cuantificación de
estas moléculas a partir de plantas superio-
res o por cultivo de células inferiores.
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