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Sistema de Información Científica

Mercedes Guerra, Grisel Ortega


Separación, caracterización estructural y cuantificación de antocianinas mediante métodos químico-físicos.
Parte I
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. XL, núm. 2, mayo-agosto, 2006, pp. 35-44,
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120664005

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de


Azúcar,
ISSN (Versión impresa): 0138-6204
revista@icidca.edu.cu
Instituto Cubano de Investigaciones de los
Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba

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Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
Mercedes Guerra, Grisel Ortega

Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA)


e.mail: mercedes.guerra@icidca.edu.cu

RESUMEN

Las antocianinas son compuestos fenólicos del grupo de los flavonoides y están presen-
tes en la naturaleza como pigmentos en las flores, frutos y hojas de algunas plantas. Se
presenta una revisión bibliográfica sobre separación y caracterización estructural de las
antocianinas. Se describen las propiedades químico-físicas y los métodos utilizados para
la separación y purificación de las mismas en materiales vegetales y en extractos comer-
ciales. Se muestran diferentes adsorbentes y sistemas de fase móvil específicos en análi-
sis de mezclas de antocianinas utilizando los métodos de cromatografía de placa delga-
da y HPLC.

Palabras clave: Antocianinas, flavonoides, Cromatografía de Capa Delgada,


Espectroscopía UV-VIS, adsorbente, fase móvil

ABSTRACT

Anthocyanins are phenolic compounds that belong to the flavonoid group and appear in
nature as pigments in flowers, fruits and leaves of some plants.
The present paper is a bibliographic description concerning to the separation and struc-
tural characterization of anthocyanins and describe its physico-chemical properties and
the methods used in their separation and purification from plant materials and com-
mercial extracts. Different adsorbents as well as specific movil-fhase systems in tests of
anthocyanins mixtures, using methods of thin layer chromatography are shown.

Key words: Anthocyanins, flavonoid, Thin Layer Chromatography, VIS-UV Spectroscopy,


adsorbent, movil-phase

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INTRODUCCIÓN El paso principal en la biosíntesis de
todos los flavonoides está relacionado con
Las antocianinas son compuestos fenóli- la formación de un intermediario chalcona.
cos del grupo de los flavonoides (1) y están Se reporta que la formación de la chalcona
presentes en la naturaleza en forma de pig- se produce por condensación de la coenzi-
mentos en flores, frutos, bayas y hojas con ma p- coumaril.
grandes variedades de estructuras químicas, En los primeros intermediarios de la for-
concentraciones y siendo característica de mación de chalcona se identifican tres uni-
cada material y atributo específico para la dades de malonil-CoA enzima (acetil -CoA.
caracterización del mismo. También se con- La chalcona y echinatina presentan un
sidera que son metabolitos secundarios de modelo de hidroxilación inusual, ya que la
las plantas con actividad biológica. función cetona insaturada en la molécula de
En la actualidad en la industria alimen- chalcona normal sufre una transposición.
taria, cosmetológica y farmacéutica son uti- Los grupos hidroxilos se convierten en 5,7
lizados una gran cantidad de compuestos dihidroxiflavonoides.
obtenidos por vía sintética que ocasionan La síntesis de flavona es altamente espe-
graves daños a la salud, entre los cuales se cífica sólo para p-coumaril-CoA enzima y
encuentran los colorantes. Por esto, la ten- para grupos hidroxilos.
dencia actual es sustituir este tipo de com- Las Flavonas se forman a partir de meca-
puesto de amplio uso por pigmentos de ori- nismos de oxidación. Las dihidroflavonas
gen natural, sobre todo de compuestos que son intermediarios importantes en la biosín-
imparten coloraciones rojos brillantes (2) tesis de diferentes flavonoides. Por ejemplo,
que brindan un aspecto más atractivo para para la biosíntesis de cianidina y quercitina,
la comercialización de algunos productos. el dihidrokaempferol se reporta como un
En estudios recientes, se ha reportado excelente precursor.
que las antocianinas inhiben el crecimiento En la biosíntesis de taxifolina ocurre la
de las células (3) cancerígenas y ayudan a incorporación de chalcona con retención de
prevenir el cáncer del colón e impiden un protón en la posición C-2. Esto excluye
enfermedades del corazón al inhibir la sín- que para los intermediarios y la formación
tesis del colesterol, mejoran la circulación y de chalcona pueda ocurrir por la vía de un
fragilidad de los vasos capilares (4), logran- epóxido.
do beneficios antienvejecimiento. Por esta La formación de isoflavonoides puede
razón, se ha incrementado la demanda del ocurrir mediante una reestructuración en el
producto, lo que conlleva a la búsqueda de esqueleto de la chalcona involucrando un
nuevas técnicas para la obtención de anto- cambio en las posiciones de enlaces 1,2 -arí-
cianinas a grandes escalas y en particular la licos.
de origen natural, por lo que se ha encami-
nado la vía biosintética, lo cual ha conlleva- Característica químico-física de las antocia-
do a los estudios de separación, caracteriza- ninas
ción estructural y al desarrollo de nuevas Las antocianinas son compuestos fenóli-
técnicas analíticas para cuantificar las anto- cos caracterizados por la presencia de un
cianinas obtenidas. aglicón (antocianidina) del grupo de los fla-
vonoides. Su fórmula básica está conforma-
da por dos anillos aromáticos unidos por
DESARROLLO DEL TRABAJO una estructura de tres carbonos. En su
forma natural, esta estructura corresponde a
Mecanismo de biosíntesis de los flavonoides heterósidos formado por la combinación de
un aglicón (antocianidina) y de un azúcar
Las variaciones en la estructura del (generalmente glucosa). Si además del azú-
esqueleto de los flavonoides se reportan que car en la molécula existe un radical acilo,
dependen de reacciones de hidroxilación entonces son antocianinas aciladas (1) (5).
O- metilación y formación de glucósidos y Con pH ácido las antocianinas son muy
oxidación del anillo B. Algunas variaciones estables, pero esta estabilidad se reduce,
asociadas con el anillo B han sido encontra- cuando el pH se aproxima a la neutralidad,
das para los isoflavonoides y rotenonas. (5) llegando a destruirse completamente con

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pH superior a 7. Sin embargo, las antociani- Soluble en agua, metanol, etanol, HCl
nas de tipo aciladas, como la petanina 0.5-7 % y moderadamente soluble en HCl
[petunidina 3-(6``,4`` p-coumarilramnosi- 10 %.
do)-5glucósido] son más estables y conser-
van su color característico con pH alcalino. Pelargonidina 3,5 diglucósido
Las diferencias entre los antocianos
individuales se encuentran en el número de Fórmula empírica: C27H31ClO15.
grupos hidróxilos de la molécula y el grado Forma cristalina: Agujas rojas
de metilación de estos grupos hidroxilos Se descompone 175-180 °C
(que son los factores que caracterizan a las Soluble: en agua, alcohol
diferentes antocianidinas), de la naturaleza
y el número de azúcares ligados a la molé- Peonidina
cula y de la posición del enlace y en la
naturaleza y el número de ácidos alifáticos O C H3
o aromáticos unidos a los azúcares en la +
ο
molécula. Respecto a estos últimos, son ΗΟ OH
importantes los derivados acetilados y los p- -
Cl
cumarilados. (6)
Cuando en las antocianidinas se sustitu- ΟΗ
ΟΗ
ye el grupo hidroxilo de la posición 3 con
una molécula de azúcar se conoce como
derivado sustituido 3- glucósido y con la Fórmula empírica: C16H13ClO6
sustitución del hidroxilo en la posición 3 y Peso molecular: 336.73
5 se conoce como el derivado sustituido 3,5 Forma cristalina: Agujas carmelita rojizo
diglucósido. Soluble: En alcohol dando una solución
Las estructuras más comunes y sencillas rojo oscuro y moderadamente soluble
son: en agua dando una solución carmelita
rojizo.
Pelargonidina
Derivados mono y disustituidos de la
Estructura molecular Peonidina

+
ο Peonidina 3, 5 diglucósido
ΗΟ OH Fórmula empírica: C28H33ClO6
- Soluble en HCl formando agujas púrpura
Cl
intenso
ΟΗ Punto de fusión: 165-167 °C
ΟΗ
Cianidina
Fórmula empírica: C15H11ClO5
Peso molecular: 306.7 OH
No funde a 350 °C +
ο
Forma de cristales: Prisma de color carmeli- ΗΟ OH -
ta rojizo y soluble en alcohol, metanol, Cl
moderadamente soluble en agua y ligera- ΟΗ
mente soluble en cloroformo. ΟΗ
Derivados mono y disustítuidos de la
Pelargonidina Fórmula empírica: C15H11ClO6 (7)
Soluble HCl alcohólico para dar agujas rojo
Pelargonidina-3-monoglucósido castaño monohidratado, muy soluble en
alcohol y alcohol amílico dando una solu-
Fórmula empírica: C21H21ClO10 ción violeta, soluble en carbonato de sodio
Forma cristalina: Agujas con color rojo cas- con color azul. y poco soluble en HCl dilui-
taño y brillo bronceado. do o H2SO4.

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Cianidina 3-glucósido Delfidina 3,5 diglucósido

Fórmula empírica: C21H21ClO11 Fórmula empírica: C27H31ClO17


Soluble en HCl diluido en medio alcohólico Cristales en forma de hoja con brillo bron-
con formación de láminas o prisma carmeli- ceado en HCl diluido
ta rojizo con brillo metálico. Soluble en Insoluble en agua fría, alcohol, ácido dilui-
alcohol con fuerte florescencia y en carbo- do. Soluble en HCl diluido y caliente.
nato de sodio con azul-violeta.
Se descompone a 205 °C sin fundir Delfina

Cianidina 3-ramnoglucósido Con sustitución de una molécula de glucosa


y ácido hidroxibenzoico.
Fórmula empírica: C27H31ClO15 Fórmula empírica: C41H39ClO21
Agujas rojas en HCl o primas oscuros en Cinta o prisma de color rojo-carmelitoso
HCl diluido metanólico. oscuro en HCl al 3 %
Soluble en agua caliente, alcohol. Descompone a 200-203 °C.
Soluble en agua con descomposición, alco-
Cianidina 3-galactósido hol diluido, acetona, alcohol en ebullición.
Fórmula empírica: C21H21ClO11
Agujas rojas con brillo bronce metálico en Violana
HCl en medio metanol
Descompone a 210-212 °C Con sustitución de glucosa, ramnosa y
Soluble en agua, etanol, metanol, HCl dilui- ácido p-hidroxicinamico
do. Prácticamente insoluble en HCl al 7 %. Fórmula empírica: C36H37ClO18
Lámina violeta azulado con brillo verde
Cianidina 3,5 -diglucósido metálico en HCl metanólico y éter
Soluble en alcohol amílico, HCl 0.15-0.5 %,
Fórmula empírica: C27H31ClO6 menos soluble en HCl 1 %, ligeramente
Láminas con brillo metálico en HCl diluido soluble en agua y prácticamente insoluble
Punto de fusión: 203-204 °C. en HCl 5-12 %.

Cianidina 3-soforosida o mecocianina Malvidina

Fórmula empírica: C27H31ClO16.


Cristales rojos oscuros en HCl diluido y ace- H3C O OH
+
ο
tato de etilo o agujas rojo oscuro en HCl en
medio alcohólico al 2 % ΗΟ O C H3 C l-
Soluble en agua.
ΟΗ
Delfinidina

Fórmula empírica.C15H11ClO7 Fórmula empírica: C17H15ClO7


Prismas o agujas carmelita-chocolate con Peso molecular: 366.75
brillo metálico en HCl 5 % Prismas con forma rómbica con aparición
Soluble en metanol, etanol, acetato de etilo del color rojo por luz trasmitida y brillo
verde cuando tiene contacto con el solvente
toma un brillo azul acero.
Derivados de la delfidina mono y disusti- Usualmente se obtienen los cristales mono
tuido o dihidratado y las sales anhidra son muy
higroscópica y no funde a 300 °C
Delfidina 3-glucósido Soluble en alcohol absoluto dando una
solución rojo-violeta, soluble alcohol amíli-
Fórmula empírica: C21H21ClO12 co. Ligeramente soluble en agua.
Cristales rojo oscuro en HCl diluido En metanol, el compuesto es soluble por
formación de una solución color rojo, pero

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comienzan a separarse cristales de color Punto de fusión: 178 °C
rojo, los cuales se observan violeta por la En HCl diluido se obtienen cristales en
luz transmitida. forma de lámina violeta con brillo cobrizo.

Derivados de la malvidina mono y disustí- Separación y caracterización estructural


tuidos de las antocianinas
A continuación se detallan las diferentes
Malvidina 3- glucósido tetrahidratado vías de tratamiento y purificación de una
muestra, la evaluación de la estructura
Fórmula empírica: C23H25ClO12.4H2O dependiendo del tipo de material de partida
En alcohol-HCl se obtienen unos prismas que presente diferentes tipos de antociani-
oscuros con brillo verde metálico. nas.
Ligeramente soluble en agua, alcohol, glice-
rol; prácticamente insoluble en benceno, Separación y caracterización de antociani-
cloroformo, éter. nas de la flor fistulosa de Monarda
Se extraen las antocianinas y otros flavo-
Malvidina 3,5 diglucósido noides de los pétalos de fistulosa de
Monarda con metanol/ácido acético/agua
Fórmula empírica: C29H35ClO17 (10:1:9) y se purifica el extracto en una
En HCl se obtienen prismas o agujas de columna Sephadex LH20 (3 x 80 cm). Los
color carmelita rojizo con brillo verde. flavonoides se separan por HPLC en una
Descompone a 165 °C columna Spheri 10-RP18 10 μ (25 cm x 4.6
mm) con una elución de gradiente, utilizan-
Malividina 3-galactósido hemihendecahi- do 5 % ácido fórmico/metanol y un detector
drato de longitud de onda variable y un fotodiodo.
En el cromatograma aparecen dieciseis
Fórmula empírica: C23H25ClO12.5 ½ H2O picos, cinco corresponden a pigmentos de
En HCl-metanol se obtienen cristales en antocianinas, los cuales se identifican utili-
forma de prisma o agujas de color bronce zando longitudes de onda a 280 y 510 nm.
metálico y luz transmitida violeta-azulado. Los derivados de las antocianinas y la pre-
Muy soluble en metanol, alcohol, agua fría sencia de acilación se pueden caracterizar
formando una solución rojo oscuro. por los tiempos de retención y los espectros
Ligeramente soluble en acetona y práctica- UV-Visibles. Los pigmentos hidrolizados en
mente insoluble en acetato de etilo. medio ácido se separan mediante
Cromatografía de papel, TLC y electrofore-
Petunidina sis.(10)

OH Separación y caracterización de las anto-


+
ο cianinas en las frutas de edulis de
ΗΟ OH Passiflora y P. de suberosa
C l-
ΟΗ O C H3 Las antocianinas en el edulis de
OH Passiflora (la fruta de pasión) y P. de subero-
sa se extraen con metanol acidificado con
TFA (trifloroacético) al 2 %. Los extractos
Fórmula empírica: C16H13ClO7 filtrados se concentran a vacío y se purifica
Peso molecular: 352,74 por partición en acetato de etilo y se aplica
En HCl diluido se obtienen cristales en forma a una columna de Amberlite XAD-7
de prisma o agujas de color carmelita gris. (Andersen, el Acta Chem Scand., 1988, 42,
462). Las antocianinas se separan en una
Derivado de la petunidina 3,5 diglucósido columna Sephadex de LH-20 (100 x 2.6 cm
i.d.) con metanol/TFA/agua (99:2:99). La
Petunidina 3,5 diglucósido Cromatografía de HPLC se realiza en una
columna ODS (20 cm x 5 mm i.d.) 5μ con
Fórmula empírica: C28H33ClO17 un flujo de elusión de 1.2 ml/min con ácido

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fórmico/agua (1:9) y H2O/ metanol/fórmico pués de un proceso de oxidación en presen-
(5:1:4) como fase móvil y se caracterizan las cia de oxígeno del aire. Los extractos se ana-
estructuras mediante: Espectrofotometría lizan utilizando diferentes métodos analíti-
UV-VIS de 210 a 600 nm., Espectrometría de cos para su caracterización y cuantificación
masa FAB y RMN (11). como: TLC en fase inversa, Cromatografía
de HPLC y separación en fase inversa para
Caracterización estructural de antociani- las antocianinas hidrolizadas y determina-
nas de arándano ción por espectrofotometría de antocianinas
Las antocianinas extraídas de arándano totales como cloruro de malvidina. (14)
se analizan por Espectrofotometría UV-VIS,
Densitometría de TLC y HPLC con una eva- Composición de los pigmentos de antocia-
luación cuantitativa de antocianinas totales ninas en tomates rojos
por Espectrofotometría a 535 nm. Las antocianinas presentes en tomates
Las antocianinas se determinan por TLC rojos se extraen previamente utilizando ace-
en celulosa con espesor de capa de 300 F tona y se realiza una segunda extracción
(0.1 mm espesor) con un sistema de solven- con 70 % de acetona seguido por agitación
te formado por ácido fórmico/agua/ácido con cloroformo/acetona (2:1). Se determina
clorhídrico (6:5:1) y se detectan a 540 nm. el contenido de antocianinas monómericas
La Cromatografía de HPLC se realiza uti- por el método de pH diferencial en un rango
lizando una columna de C18 y aplicando un de 2-40 mg/100 g. La composición de anto-
gradiente de elusión de ácido fórmico/aceto- cianinas se caracteriza por HPLC, análisis
nitrilo y detección a 280 nm. El análisis de espectral y espectrometría de masa. En
antocianinas de arándano resultó mejor todas las muestras se detecta el pigmento
empleando el método de espectrofotometría pelargonidina-3-rutinosida-5-glucósido ace-
directa o posterior a una separación croma- tilada con ácido p-coumárico (15).
tográfica (TLC/HPLC). Para la evaluación
cuantitativa, se recomienda el método Complejidad de las antocianinas y su
espectrofotométrico directo. La densitome- expresión de color
tría de TLC sólo se recomienda para extrac- Se presenta una reseña que incluye los
tos de alta pureza y la cromatografía HPLC factores que afectan en la formación del
resulta apropiada para la estandarización de rango de colores de las antocianinas en las
extractos de arándano y la identificación de plantas (diversidad de cromóforos, rango
impurezas como ácidos del tipo fenólico y natural de valores de pH de 3-7, compleji-
taninos (12). dad molecular incluyendo el origen de los
compuestos complejos y efecto intermole-
Caracterización de antocianinas extraídas cular a rango amplio). Los métodos que se
de arándano en muestras comerciales utilizan para estudiar estas propiedades son
Los extractos secos de antocianinas se Espectroscopía UV-VIS, RMN, Dicroismo
disuelven en HCl 0.1 M en metanol, poste- Circular y para lograr mayor selectividad
riormente se miden sus espectros y el conte- Difracción de Rayos X. (16)
nido de antocianinas se determina a 535 nm.
Luego, se disuelven las muestras en 5 % Antocianinas aciladas de los pétalos azules
ácido fórmico y se analizan por HPLC en una de Salvia uliginosa
columna Partisil 10 ODS (25 cm x 4.6 mm) Los pétalos secos y congelados se
con una velocidad de elución de 0.5 min/ml, extraen con ácido fórmico/metanol/agua
utilizando gradiente de ácido fórmico/aceto- 1:10:9); luego se filtra y se evapora hasta
nitrilo (100:0 a 9:1 en 60 min sostenidos a tener un volumen pequeño a presión redu-
90 min) y la detección se realiza a 280 nm. cida. Se realiza una Cromatografía de HPLC
(13) preparativa en columna ODS (10 mm d.i x
250 mm) con fase móvil ácido
Separación y caracterización estructural fórmico/metanol/agua (1:6:13) a (1:8:11) y se
de antocianinas en el Sylvestris de Malva purifica por HPLC utilizando la misma
La extracción de antocianinas se realiza columna con ácido fórmico/acetonitrilo/
con HCl-metanol, y las leucoantocianinas agua (5:16:79). El producto se identifica uti-
en el residuo se extraen similarmente des- lizando técnicas analíticas de espectrome-

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tría de masa FAB y RMN-H` a 500 y 600 Masa-electrospray. La Cromatografía HPLC
Mhz en metanol conteniendo HCl al 0.1 % se realiza (después de hidrólisis alcalina y
(17). ácida) en columna C-18 (25 cm x 4.6 mm
d.i) 5 μ con gradiente de elución (1ml/min)
Cianidina 3-(2``,3``digaloilglucosido) en usando sistema de solvente acetonitrilo/
hojas rojas ácido fosfórico/ácido acético (el programa se
Se pesan 400 g de hojas rojas de la flor detalla en el trabajo) y detección a 280, 310
"Crimson King"y se extraen con TFA (triflo- y 520 nm. Como resultado del estudio
roacético) al 1 % en metanol. Se filtra y se estructural se obtienen dos tipos de cianidi-
purifica por partición con acetato de etilo na: cianidina-3-glucósido y cianidina -3-
seguido por cromatografía usando columna rutinosida y un tercer pigmento amarillo
Amberlita XAD-2. Las antocianinas diaceti- naranja detectado por Espectrometría de
ladas (cianidinas) se separan en columna de Masa (20)
Sephadex LH-20 utilizando una elución
paso a paso con metanol/TFA/agua de Enlace convalente entre pigmentos de
(19.8:0.2:80 a 59.4:0.6:40). Las estructuras antocianinas-flovonol de la flor
se identifican empleando Espectrometría Agarparthus azul
RMN homo y heteronuclear RMN-2D a Se separan dos antocianinas de la flor de
600.13 y 150.92 MHz para H`y C13 y los Agaparthus azul. La purificación involucra
valores de los datos espectrales UV-VIS de la varios pasos cromatográficos, el primero
cianidinas separadas (18). con Diaion Hp-20, una comatografía de
columna con Sephadex G25, celulosa, Rp y
Pigmentos de antocianinas de tulipanes Toyopearl HW-40 y los productos separados
La flor de tulipán "Queen Wilhelmina" se caracterizan por RMN-H`, RMN-C13,
se extrae con metanol conteniendo TFA al Espectrometría de Masa-Cromatografía
1% y se realiza una partición con acetato de Gaseosa, HPLC acoplado a un espectrofóto-
etilo. Las antocianinas se separan por cro- metro UV-VIS seguida de una hidrólisis
matografía de columna Amberlite XAD-7 y ácida o básica. La estructura encontrada es
se purifican usando una columna Sephadex una delfidina diglucósido p-coumarilada
LH20 y un sistema de solvente agua/meta- unido a flavonol triglucósido. (21)
nol/TFA(80:19.6:0.4). La Cromatografía de
HPLC se lleva a cabo en columna Hipersil Petunidina 3-O-α α ramnopiranosida-5-O- β
ODS. La identificación de estructuras se glucopiranosa y otras antocianinas de la
realiza mediante espectroscopía UV-VIS uti- flor Vicia villosa
lizando como solvente metanol/ácido clor- Las antocianinas se extraen toda la
hídrico al 0.01 % en un rango de longitud de noche de la flor Vicia Villosa con 1 L de
onda entre 240-600 nm, espectroscopía metanol/ ácido acético (19:1; Solvente A) y
RMN y masa con ionización a presión luego se filtra y se concentra el solvente A
atmosférica e inyección de flujo y como filtrado.
resultado se obtienen estructuras molecula- Este concentrado se extrae con acetato de
res del tipo de dos pelargonidinas y dos cia- etilo 3 x 300 ml y se aplica a una columna
nidinas con grupos acilos enlazados a la Amberlite XAD-7. Las antocianinas se eluyen
posición axial del azúcar (19). con 1 L del solvente A y se separan en colum-
na de Sephadex LH-20 (10 cm x 1 cm d.i) con
Purificación e identificación de antociani- metanol /agua/TFA (39.9:60:0.1). El TLC se
na de capulina (Prunus serotina ERC) realiza con sílica microcristalina F5565
Las antocianinas se extraen en acetona, Merck con 1-butanol/ácido acético/ agua
se somete a un proceso de partición con clo- (4:1:5) como fase superior y ácido
roformo y se purifica en un cartucho de fórmico/ácido clorhídrico/agua (1:1:2). Se
fase sólida C18 . toma una alícuota de 15 μl y se inyecta en
Los métodos de bisulfito y pH diferen- una columna de HPLC Hypersil ODS 5 μm
cial se utilizan para determinar el contenido (20 cm x 5 mm d.i) con ácido fórmico y
de antocianinas monoméricas y color poli- ácido fórmico/agua/metanol (1:4:5) por elu-
mérico. Las antocianinas se identifican por sión isocrática y gradiente. Se separan tres
análisis espectral, HPLC, Espectrometría de antocianinas que se identifican por:

ICIDCA No. 2, 2006 41


Espectrofotometría UV-VIS con registro del mente. El límite detección de la cianidina 3-
espectro de 240 a 600 nm, RMN homo y O- β rutinosida y cianidina 3-O- β rutinosi-
heteronuclear, RMN 2D y como estructuras da-7-O-β-Dglucosido fue de 1.2 μmol. Las
se propone el 3-O- α ramnopiranosida-5-O- estructuras se confirman por Espectrome-
β glucopiranosidas de petunidina (71 %), tría UV-VIS, RMN y masa-FAB. Estos com-
delfidina (12 %) y malvidina (9 %). (22) puestos son los responsables del color rojo
de la flor de lirio.(23)
Antocianinas de flores y Lirio (Liliaceae)
Se pesa 1 g de segmentos secos y conge- Antocianinas en plasma humano después
lados de 10 cultivos de flores, incluyendo de una administración oral de un extracto
además una especie de Lirio y se extraen de baya de saúco
con 13 ml de acetonitrilo al 50 % conte- Un mililitro de plasma se disuelve en
niendo 3 % de TFA. Se filtra y el extracto se 200 μl de una solución acuosa de 0.44 M de
pasa por una columna Develosil ODS-Hg-5 TFA y la mezcla se aplica en un cartucho de
(25 cm x 4.6 mm d.i) a 40 °C con gradiente extracción en fase sólida Sep-Pak C18. Las
de elusión (1ml/min) con acetonitrilo acuo- antocianinas se eluyen con TFA a 0.44 M
so de 0-30 % conteniendo 0.5 % de TFA en metanol y posteriormente, la fase se
durante 30 min y detección de diodo en un evapora a sequedad y se redisuelve en
rango de 260 - 530 nm. Una segunda elusión solución de TFA a 0.44M. Una porción de
con 1.5 ml/min con agua/TFA (99:1, solven- la solución se analiza por HPLC con una
te A) y acetonitrilo/agua/TFA (3:7:0.05, sol- columna Zorbax SB-C18 (25 cm x 4.6 mm
vente B, abarcando 16,38, 44, 50, 67 y 100 % d.i) con un gradiente de elusión (1ml/min)
de B a 0,3,10,20,25 y 40-50 min respectiva- con solución acuosa de acetato de sodio 25
Tabla 1. Valores de Rf x100 de antocianinas y ant ocianidinas en varios sistema s de solventes

Poliacrilonitrilo
-Poliamida (7:2)
mezclada con
Silica Gel Celulosa
Adsorbente 40 ml de 0.05 M Celulosa Poliamida
D-O MN 300
fosfato de
potasio
primario
Antocianid inas A B C D E F G F G
Cianidina 3 glucósido 46
Cianidina 3 triglucósido 42
Cianidina 3,5 glucósido 36 52
Delfinidina 3 glucósido 36
Delfidina 3,5 glucósido 35 26
Malvidina 3 glucósido 57 60 61
Malvidina 3,5 glucósido 54 44 33
Peonidina 3,5 glucósido 56 37
Petunidina 3 glucósido 38
Antocianinas
Cianidina 31 83 92 47 53 70 75 57 75
Delfidina 21 41 34 50 60 50 72
Malvidina 37 95 94 62 61 87 84 84 91
Paeonidina 39 55 65 90 86 83 85
Pelargonidina 41 51 71 95 92 69 78
Petunidina 27 54 46 70 75 72 79

42 ICIDCA No. 2, 2006


mM (fase móvil B) (de 0-24 % de B en A bajo de investigación en el tema de separa-
durante 50 min, 38 % de B en A durante ción, identificación y cuantificación de
110 min hasta 100 % de B en A durante estas moléculas a partir de plantas superio-
120 min) y detección a 520 nm. Dos picos res o por cultivo de células inferiores.
de antocianinas se pueden separar si se
modifica la programación de fase móvil de
0-26 % de B en A durante 20 min hasta 33 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
% de B en A durante 80 min (24).
1. Salinas, Y.; Martínez, F.; Soto, M. Efectos
Características de las antocianinas en de la mixtamalización sobre las antociani-
Cromatografía de Capa Delgada nas del grano de maíces pigmentados
En la tabla 1 se observan los Rf de algu- Agrociencia .37 (6) pp. 617-628, Nov-Dic
nas antocianinas y antocianidina en varios 2003.
sistemas de solventes. 2. Harbone, J.; Grayer, R. The anthocyanins
in: The flavonoids. Advances in research
Sistema de solvente since 1980. Londres: Chapman and Hall,
1988. p 1-20.
A= Pentanol-1-propanol-1- ácido acético- 3. Kame, H.; Kojima, S.; Hasegawa, M.;
agua (3:2:2:1) se puede añadir dos partes Yukawa, K. Suppressive effect of flavo-
de heptanol-1 y un desarrollo a 12 cm para noid extracts from flower petals on culte-
mejorar la placa. red human malignant cells. J Clin Exp
B= n-butanol- ácido acético-agua (4:1:2). Med 164 : p. 829, 1993.
C= formato de etilo-metil-etil acetona-ácido 4. Miniati, E.; Coli, R. Anthocyanins not
formico-agua (3:4:1:2). only for colour for foods in: Papers pre-
D= ácido formico - ácido clorhídrico-agua sented at the 1st International Symposium
(10:1:3). on natural colorants for foods.
E= alcohol amílico - ácido acético - agua (2: Nutraceuticals, Beverages and
1: 1). Confectionary. The Herald Organization,
F= ácido acético - ácido clorhídrico - agua 1993.
(10:1:3), distancia de desarrollo de 12 cm. 5. Harbone, J. B. Phytochemical methods: A
G= ácido acético- agua (3:2), distancia de guide to modern techniques of plant
desarrollo. analysis. Ed. Chapman and Hall. UK.
La manchas de antocianinas y antociani- 1984, pp:61-68.
dinas se pueden ver a luz ultravioleta, pero 6. Valls, J; Mateos, S; Lampreave, M; Nadal,
se puede incrementar su intensidad rocian- M; Arola, L. Contenido y evolución de los
do con una solución de ácido oxálico al 10 % antocianos en la maduración de varieda-
en acetona.agua (1:1). (25) des antóctonas y foráneas. Revista Técnica
de Interés permanente No 3.056 5 de
marzo de 2005. pp. 726-730.
CONCLUSIONES 7. Valls, J.; Lampreave, M.; Nadal, N.; y
Arola, L. Importancia de los compuestos
En esta revisión se muestran las diferen- fenólicos en la calidad de los vinos tintos
tes estructuras moleculares de las antociani- Enología: pp 119-121, marzo 2000.
nas presentes en diversos materiales de ori- 8. Indice de MERCK Eleventh Edition, USA:
gen vegetal, lo cual implica una gran canti- Merck Co, 1989
dad de variantes de técnicas analíticas para 9. Rao, C. Espectroscopía ultravioleta y visi-
el tratamiento de muestra, de métodos de ble,. madrid: Alambra, S.A., 1970. p. 258.
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y extracción; caracterización estructural characterization of anthocyanins of
mediante técnicas de TLC, Cromatografía Nonarda fistulosa by high performance
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Espectrometría de Masa-FAB y Masa- 11. Kidoy, L.; Nygard, A.M.; Andersen,
Electrospray, lo cual constituye una herra- O.M.; Pedersen, A.; Aksnes, D.W.;
mienta importante para el desarrollo del tra- Anthocyanins in fruits of Passiflora edulis

ICIDCA No. 2, 2006 43


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