Laura_Oliva_Garcia

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Tema 5. Estructura de proteínas I.pdf

Apuntes Bioquímica URJC

1º Bioquímica y Biología Molecular

Grado en Medicina

Facultad de Ciencias de la Salud. Campus de Alcorcón

URJC - Universidad Rey Juan Carlos

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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Bioquímica y Biología Molecular

Bloque II - Proteínas

Tema 5: Estructura de proteínas I

1. Estructura primaria: análisis de composición y secuencias
La estructura primaria está determinada por la secuencia de aminoácidos, referida a la
conformación tridimensional con patrones espaciales mantenidos de esta forma gracias a
diferentes enlaces. El plegamiento puede ser de manera globular o fibrosa.
Para conocer la secuencia de aminoácidos de una proteína, a partir de los años 70 se comenzó a
clonar un gen. Se sacaba la secuencia de ADN y por el código genético se sacaba la secuencia
de aminoácidos.
Los aminoácidos surgen por la repetición de 20 aminoácidos, tomados de n en n, de tal manera,
una proteína con n aminoácidos puede ser escrita de 20n (proteína de n=100 aminoácidos: 20100
aminoácidos).

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
2. Fragmentación de proteínas
Se usan métodos enzimáticos (utilizando proteasas), o métodos químicos. Ambos rompen proteínas
por unos lugares concretos, es decir, los cortes no se producen al azar.
o Quimiotripsina: corta enlaces siempre que el aminoácido anterior sea aromático (Phe, Tyr,
Trp)
o Tripsina: rompe en Arg y Lys (aminoácidos básicos).
o Bromuro de cianógeno: corta siempre que haya Met.
o Lodosobenzoico: rompe siempre que haya Trp.
o SVB: corta siempre que hay Glu.

3. Determinación del aminoácido N-terminal

Antes se marcaba el extremo radiactivamente, de tal forma que reaccionara con el NH3+,
quedando los demás aminoácidos libres.
Ahora lo que se hace es que se utilizan compuestos como el cloruro de dabsilo. El primer paso es
permitir la unión de la molécula de cloruro con el péptido. Posteriormente tiene lugar una hidrólisis
cuyo resultado es por un lado el aminoácido N-terminal unido a la molécula de cloruro de dabsilo,
y por otro, el resto de aminoácidos. Finalmente tras localizar la molécula de cloruro unido al
aminoácido, ampos componentes son separados.

4. Determinación del aminoácido C-terminal

En este proceso participa la carboxipeptidasa, que elimina los residuos del péptido empezando por
el carboxilo-terminal.
La enzima carboxipeptidasa ataca de modo específico al enlace peptídico –COOH terminal de los
péptidos. Tras eliminar el resto terminal, ataca al nuevo enlace peptídico C-terminal. Resulta por
tanto necesario medir la velocidad de liberación de los aminoácidos del péptido con el fin de
identificar los restos C-terminales de modo inequívoco.
La hidrozina arranca el aminoácido del C-terminal del péptido. Realiza una reacción de sustitución,
liberando el aminoácido C-terminal, y a partir del segundo aminoácido se liberan como derivados
de la hidrizina.

5. Degradación de Edman
Utiliza un reactivo que marca el primer aminoácido, lo saca de la cadena y se continua trabajando
con ella (la cadena está intacta). Este proceso se repite para separar el segundo, el tercer…
conociendo de esta manera la secuencia de aminoácidos. A partir del 15ª aminoácido, hay falsos
positivos (cuando el número de ciclos, la fiabilidad es menor).

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Bioquímica y Biología Molecular

Bloque II - Proteínas

Se pega el extremo amino, y deja un producto de eliminación intacto, que permite seguir
trabajando.
Hoy en día existen aparatos tan eficientes que son capaces de conocer la secuenciación de una
centena de aminoácidos. En general, se suelen fragmentar las cadenas por diferentes puntos
conocidos, y posteriormente se realiza la degradación de Edman en cada uno de ellos. De esta
manera, y superponiendo correctamente las diferentes cadenas, los investigadores han sido
capaces de encontrar la estructura completa de muchas proteínas (se disminuyen los ciclos, y así
se aumenta la fiabilidad)

6. Determinación del número de cadenas

Para determinar el número de cadenas que tiene una proteína es necesaria la ruptura y bloqueo
de los puentes disulfuro, ya que son los que unen varias cadenas peptídicas. Es decir, para saber
cuántas cadenas tiene una proteína, hay que separarlas (una proteína puede estar unida por

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
varios péptidos). Para la reducción de dichos puentes se utiliza ácido perfórmico o β-
mercaptoetanol, y para el bloqueo de los grupos sulfhídricos, para evitar que se vuelvan a formar
los puentes disulfuro, yodoacetato, que se une al residuo de la cisteína covalentemente.
Una vez que hemos reducido los puentes de disulfuro a grupos sulfhídricos, es necesario su bloqueo,
ya que el grupo sulfhídrico de la cisteína es inestable y tiende a oxidarse.
El número de cadenas se deduce habitualmente del número de restos de aminoácidos N-
terminales por molécula de proteína. Si las cadenas polipeptídicas se hallan unidas
transversalmente por enlaces covalentes, éstas deben romperse mediantes reacciones químicas
apropiadas.

7. Alineamiento de secuencias
Una vez determinada la secuencia de aminoácidos de una proteína, el número de cadenas que
poseen las secuencias se puede alinear y comparar unas con otras.
De este modo podemos establecer semejanzas entre proteínas, sean éstas de un mismo o distinto
origen. Así se podrá conocer la evolución molecular de las proteínas (cómo a partir de un mismo
origen se han diversificado), la taxonomía y profundizar en investigación.
La homología consiste en una similitud significativa en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos.
Se detecta mediante el análisis estadístico de secuencias. Se pueden comparar secuencias de
nucleótidos o de aminoácidos. Las de aminoácidos suelen dar más información estructural y
funcional (comparaciones de 20 elementos vs 4).
Algunos restos de aminoácidos situados en posiciones específicas de las proteínas homólogas son
relativamente invariantes (idénticos en todas las especies). Las proteínas homólogas contienen
también restos variables (la mayoría son así; los cuales varían mucho más ampliamente de una
especie a otra). Un ejemplo son las insulinas de muchas especies de vertebrados: poseen la misma
actividad hormonal específica, y tienen un mismo peso molecular. La cadena A de las insulinas del
hombre, del cerdo, del perro y del conejo son idénticas.
La semejanza de secuencia sugiere la existencia de uno mismo origen evolutivo, y en muchas
ocasiones semejanzas en la estructura tridimensional de la proteína. Hay dos tipos de homólogos:
o Los parálogos son homólogos presentes en una misma especie, generalmente con
diferencias en su función.
o Los ortólogos son homólogos presentes en especies diferentes, generalmente con funciones
muy similares.

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Bloque II - Proteínas

8. Comparación de secuencias
Para la comparación de secuencias se utilizan los alineamientos. El análisis de homología se realiza
yuxtaponiendo las secuencias de todas las maneras posibles. Esto se puede lograr simplemente por
desplazamiento de una sobre otra. En ocasiones, la inserción de huecos (que reflejaría inserciones o
delecciones de nucleótidos) en la secuencia permite aumentar la homología. Esto aumenta la
complejidad del análisis, pero la informática ha ayudado a resolver estos problemas.´
Por ejemplo, se ha visto que la mioglobina, la hemoglobina-a y la hemoglobina-β tienen un
ancestro común, una proteína que está en la raíz de las legumbres, que se encarga de unir el
oxígeno para eliminarlo del medio y así fijar el nitrógeno. Y todas las proteínas anteriores actúan
conjuntamente con el oxígeno.
Se ha observado que la hemoglobina tiene 141 aminoácidos y la mioglobina 153. La comparación
del alineamiento sin la inserción de huecos dio 23 residuos emparejados, y si insertamos un solo

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hueco, los emparejamientos aumentaron a 38, un 25’9% de los totales.
Para evitar un uso excesivo de huecos, y optimizar los resultados, existen sistemas de calificación
que puntúan positivamente las coincidencias, y negativamente la introducción de huecos (+10 y -
25 respectivamente). De esta manera, introduciendo un hueco se obtiene una puntuación de 355.
Los estudios de alineamientos sirven para valorar la probabilidad de que las coincidencias se den
por azar, las secuencias se reordenen de todas las formas posibles y se vuelvan a alinear. Cuando
se representa la calificación de cada una de estas secuencias con el número de coincidencias se
aprecia el significado del alineamiento.
Con el tiempo se va refinando el análisis de los estudios de alineación, gracias a matrices de
sustitución empleando sustituciones conservadoras o bien no conservadoras; y teniendo
consideraciones sobre la estructura tridimensional y la función de la proteína.
La matriz de sustitución Blosum-62 es un esquema calificador, que analiza las sustituciones que se
dan en bloques de secuencias entre proteínas con homología. Consiste en cambiar un aminoácido
polar por otro polar (sustitución conservadora), o uno polar por otro apolar (sustitución no
conservadora). Se le da una puntuación positiva a los cambios conservadores, y negativa a las
sustituciones no conservadoras. Con este método se mejora la puntuación del alineamiento.
Hay bancos de datos para el análisis de secuencias, en el que hay secuencias de proteínas, de
aminoácidos, de nucleótidos. La página web del Centro Nacional de Información en Biotecnología
es www.ncbi.nih.gov
También gracias a esto se puede rastrear la evolución de familias de proteínas, y como divergen
para dar lugar a nuevas proteínas, incluso con funciones distintas, como ocurre en el caso de la
mioglobina y hemoglobinas.
Otras metodologías utilizadas para el estudio de proteínas son la espectroscopia, fluorescencia,
dicroísmo circular, RMN, rayos X y espectometría de masas.