UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA

LAMBAYEQUE

MANUAL DE PRÁCTICAS DE

M.V. CÉSAR MORANTE CHAVARRY

LAMBAYEQUE – PERÚ

2019
 INTRODUCCIÓN

La Inmunología es una rama de las Ciencias Biológicas que ha experimentado un gran avance en
estos últimos tiempos contribuyendo a explicar diversos fenómenos, tanto fisiológicos como patológicos.

Actualmente, el aprendizaje y dominio de las técnicas inmunológicas se ha convertido en una

necesidad imprescindible en todo estudiante de Ciencias Veterinarias, puesto que su conocimiento
permite el diagnóstico mucho más preciso de entidades patólogicas que requieren de un tratamiento
destinado a su resolución definitiva.

Bajo esta premisa, se presenta la nueva edición del Manual de Prácticas de Inmunología
Veterinaria cuya finalidad es familiarizar al estudiante que cursa la asignatura con la ejecución de prácticas
y técnicas elementales en un laboratorio de inmunología.

El Manual empieza con una práctica destinada a instruir al estudiante sobre las medidas de
bioseguridad en los diferentes niveles enfatizando la importancia de observarlas. Continúa luego con las
técnicas de inoculación más utilizadas, la revisión de la histología normal de los órganos linfoides para
poder, más adelante, diferenciarlos de los tejidos anormales. La secuencia prosigue con el protocolo para
preparar el nefelómetro de Mac Farland, herramienta bastante útil.

Las siguientes prácticas son técnicas para aprender a hacer diluciones, estudiar la sangre, lavar los
eritrocitos, hemoaglutinación viral, entre otras.

Es necesario hacer hincapié que existen carencias infraestructurales, de equipamiento y de

escasez de reactivos que impiden la ejecución de mayor número de prácticas.

El Autor

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 NORMAS QUE DEBE OBSERVAR EL ESTUDIANTE EN EL LABORATORIO

01. La asistencia a las prácticas es obligatoria. Si pierde una práctica no podrá recuperarla.

02. Adquiera los conocimientos teóricos claros y precisos acerca de la práctica a realizar. Para ello,
antes de iniciar cada experiencia estudie bien sus bases y fundamentos. Haga un esquema
ordenado de su plan de trabajo.

03. Conozca bien el material que necesita, así como las técnicas en forma teórica.

04. Llegue al laboratorio unos minutos antes de iniciarse la práctica a fin de poder ingresar con la
tranquilidad adecuada.

05. Antes de entrar al laboratorio, vista con un guardapolvo blanco limpio y sin arrugas.

06. No beba agua directamente del grifo, ni emplee para beber ningún instrumento de trabajo.

07. No fume ni coma dentro del laboratorio.

08. No moje directamente con la boca el material de trabajo a menos que sea inocuo o estéril.

09. Mantenga el cuidado y limpieza escrupulosos en el instrumental que se emplee antes, durante y
después de la práctica realizada.

10. No coloque en la mesa de trabajo libros, cuadernos, mochilas y otros objetos que impidan el
desarrollo adecuado de la práctica.

11. Cualquier accidente que ocurra con el manejo de reactivos y material de laboratorio, comuníquelo
al profesor para tomar las medidas necesarias.

12. Al terminar la práctica, lávese cuidadosamente las manos con agua y jabón.

13. Respete las señales de advertencia.

14. Antes de retirarse del laboratorio verifique que todo quede limpio y en orden.

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 Práctica N° 1

BIOSEGURIDAD

Las medidas de bioseguridad en los laboratorios son un conjunto de medidas preventivas

destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de
la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia
el exterior.

Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en
forma rutinaria.

El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer
y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental la realización meticulosa de cada
técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con
que se trabaja.

1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como:
matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas, lavaojos, gabinete para contener derrames,
accionamiento de alarmas, etc.

2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse.

3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan drogas.

4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido
(guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso
de accesorios colgantes).

5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la

zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.

6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de laboratorio y

antes de retirarse del mismo.

7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o material
biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni
superficies, tales como teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.

8. No se permitirá pipetear con la boca.

9. No se permitirá correr en los laboratorios.

10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán
anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de protección. Cuando se
manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el
uso de lentes de contacto.

11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, máquinas u otros elementos
que entorpezcan la correcta circulación.

12. Todo material corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo deberá estar
adecuadamente etiquetado. No se permitirán instalaciones eléctricas precarias o provisorias.

13. Se requerirá el uso de mascarillas desechables cuando exista riesgo de producción de aerosoles
(mezcla de partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias
tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc.

14. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, aquellas que pueden ser
riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana.

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15. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignición.
No se operará con materiales inflamables o solventes sobre llamas directa o cerca de las mismas.
Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas calefactoras blindadas.
Se prestará especial atención al punto de inflamación y de autoignición del producto.

16. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente ubicarlo
en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas. El que sea necesario reparar
se entregará limpio al taller.

17. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser
descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con
agua varias veces.

18. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos o material biológico por los
desagües de las piletas, sanitarios o recientes comunes para residuos.

19. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (más de 5 litros.)
deberá tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestión.

20. Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tambor a un recipiente más pequeño,
realice una conexión con una cadena del tambor a tierra y con otra entre el tambor y el recipiente
de manera de igualar potenciales y eliminar la posible carga estática.

21. Al almacenar sustancias químicas considere que hay cierto número de ellas que son incompatibles
pues almacenadas juntas pueden dar lugar a reacciones peligrosas.

22. No almacene en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas, hágalo en estantes bajo mesadas
y en caso de ácidos o álcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidas dentro de lo
posible en bandejas de material adecuado.

23. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse en posición vertical con pinzas,
grampas y correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulación, protegidos de la humedad
y fuentes de calor, de ser posible en el exterior.

24. Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios con los elementos indispensables
para atender casos de emergencia.

Procedimientos ante emergencias.

Emergencias médicas

Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión accidental de
algún producto químico, tóxico o peligroso, se deberá proceder:

1. A los accidentados se les proveerán los primeros auxilios.

2. Simultáneamente se tomará contacto con el servicio médico de la universidad o con el hospital del
ministerio de salud o de Essalud más cercano.

3. Avise al Jefe de Laboratorio o a quien corresponda para que tome las medidas pertinentes.

4. El Jefe de Laboratorio notificará el accidente a las autoridades de la Facultad para su evaluación

e informe, donde se determinarán las causas y se elaborarán las propuestas para modificar dichas
causas y evitar futuras repeticiones.

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Principios de Bioseguridad

1. Universalidad. Todo trabajador o usuario tiene que cumplir con las obligaciones estándar tanto en los
laboratorios como con los pacientes. Toda persona es portadora de algún agente infeccioso hasta no
demostrar lo contrario.

2. Uso de barreras de contención. Dispositivos que previenen el escape y dispersión de los agentes
biológicos.

3. Medidas de eliminación de material contaminado. Conjunto de dispositivos y procedimientos

adecuados a través de los cuales los materiales utilizados en los laboratorios o en atención a los
pacientes, son eliminados.

El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos
en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención
es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio
ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

La contención primaria, la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de
la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a
través del uso de equipos de seguridad adecuados. El uso de vacunas puede brindar un mayor nivel de
protección del personal. La contención secundaria, la protección del medio ambiente externo al laboratorio
de la exposición a materiales infecciosos, se logra a través de una combinación del diseño de la instalación
y prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de
laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a
realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos.

Riesgo biológico

Probabilidad de la ocurrencia de un evento adverso que involucra exposición a agentes biológicos o

toxinas y sus consecuencias.

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 Las formas de exposición a los agentes biológicos pueden ser: contacto, inhalación, ingestión y
percutáneo.

Prácticas y técnicas de laboratorio.

El elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas

microbiológicas estándar. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente
infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en
las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. El director o la
persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del
personal.

Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad

que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y
procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al
personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y
procedimientos requeridos. Un científico capacitado y bien informado acerca de las técnicas de laboratorio
adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos
debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta
persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros
profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo.

Cuando las prácticas de laboratorio estándar no son suficientes para controlar los riesgos asociados
a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas
adicionales. El director del laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales,
que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento.

Niveles de Bioseguridad en los laboratorios

La designación del NIVEL DE BIOSEGURIDAD se basa en una combinación de las características

del diseño, de construcción, de medios de contención, de equipo, de prácticas y procedimientos de
operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos GRUPOS DE RIESGO.

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Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1)

El Nivel de Bioseguridad 1 es adecuado para trabajos que involucran agentes bien caracterizados
que no producen enfermedad en humanos adultos sanos, y que imponen un riesgo potencial mínimo para
el personal del laboratorio y el medio ambiente. El laboratorio no está necesariamente separado de los
patrones de tránsito generales en el edificio. El trabajo se realiza generalmente sobre mesas de trabajo
utilizando prácticas microbiológicas estándar. No es necesario el uso de equipos de contención especiales
y en general no se los utiliza. El personal de laboratorio cuenta con una capacitación específica acerca de
los procedimientos realizados en el laboratorio y es supervisado por un científico con capacitación general
en microbiología o una ciencia relacionada.

Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2)

El Nivel de Bioseguridad 2 es similar al Nivel de Bioseguridad 1 y es adecuado para trabajos que

involucren agentes de riesgo potencial moderado para el personal y el medio ambiente. Difiere del BSL-1
en que (1) el personal del laboratorio cuenta con una capacitación específica en la manipulación de
agentes patogénicos y está dirigido por científicos competentes; (2) el acceso al laboratorio es limitado
cuando se están desarrollando actividades; (3) se toman precauciones extremas con elementos cortantes
contaminados y (4) ciertos procedimientos que pueden generar aerosoles o gotitas infecciosas se llevan a
cabo en gabinetes de seguridad biológica o en otros equipos de contención física.

Nivel de Bioseguridad 3 (BSL-3)

El Nivel de Bioseguridad 3 es aplicable a las instalaciones clínicas, de diagnóstico, enseñanza,

investigación o producción en las que se llevan a cabo trabajos con agentes indígenas o exóticos que
pueden producir una enfermedad grave o potencialmente letal como resultado de la exposición por vía de
inhalación. El personal de laboratorio recibe instrucción específica en el manejo de agentes patogénicos y
potencialmente letales, y es supervisado por científicos competentes con experiencia en el trabajo con
estos agentes.

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 Todos los procedimientos que involucren la manipulación de materiales infecciosos se realizan dentro
de gabinetes de bioseguridad u otros dispositivos de contención física o por personal que lleva ropa y
equipo protector adecuado. El laboratorio tiene características de diseño e ingeniería especiales.

Sin embargo, se reconoce que algunas instalaciones existentes pueden no presentar todas las
características recomendadas para el Nivel de Bioseguridad 3 (por ejemplo, zona de acceso con doble
puerta y penetraciones selladas). En esta circunstancia, se puede lograr un nivel de seguridad aceptable
para la práctica de procedimientos de rutina (por ejemplo, procedimientos diagnósticos que involucren la
propagación de un agente para su identificación, tipificación y ensayos de sensibilidad) en una instalación
de Nivel de Bioseguridad 2, siempre que 1) se descargue el aire viciado del laboratorio al exterior, 2) la
ventilación del laboratorio sea equilibrada para brindar un flujo de aire direccional dentro de la sala, 3) se
restrinja el acceso al laboratorio cuando se está practicando algún procedimiento y 4) se cumplan
rigurosamente con las Prácticas Microbiológicas Estándar, las Prácticas Especiales y los Equipos de
Seguridad de Nivel de Bioseguridad 3 recomendados. La decisión de implementar esta modificación a las
recomendaciones del Nivel de Bioseguridad 3 debe solamente tomarla el director del laboratorio.

Nivel de Bioseguridad 4 (BSL-4)

El Nivel de Bioseguridad 4 debe aplicarse para trabajar con agentes peligrosos y exóticos que
poseen un riesgo individual alto de producir infecciones de laboratorio transmitidas por aerosoles y
enfermedades mortales. Los agentes que tienen una relación antigénica cercana o idéntica a los agentes
del Nivel de Bioseguridad 4 se manipulan en este nivel hasta que se obtienen datos suficientes, ya sea
para confirmar la continuación del trabajo en este nivel o para trabajar con ellos en un nivel más bajo. Los
miembros del personal de laboratorio poseen una capacitación específica y completa para manipular
agentes infecciosos extremadamente peligrosos y conocen las funciones de contención primaria y
secundaria de las prácticas estándar y especiales, los equipos de contención y las características de
diseño del laboratorio. Este personal es supervisado por científicos competentes que poseen capacitación
y experiencia para trabajar con estos agentes. El acceso al laboratorio es controlado estrictamente por el
director del laboratorio. El establecimiento se encuentra en un edificio separado o en un área controlada
dentro de un edificio, la cual está totalmente aislada de todas las demás áreas del edificio. Se prepara o
se adopta un manual de operaciones específico para el establecimiento.

Dentro de las áreas de trabajo del establecimiento, todas las actividades se restringen a los gabinetes
de seguridad biológica Clase III o a los gabinetes de seguridad biológica Clase II utilizados con trajes de
personal presurizado con presión positiva y de una sola pieza ventilados por aire externo. El laboratorio de
Nivel de Bioseguridad 4 tiene características especiales de ingeniería y diseño para evitar la diseminación
de los microorganismos en el medio ambiente.

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Cuestionario para el informe de prácticas

Revise literatura sobre bioseguridad en el laboratorio y resuelva los siguientes casos de accidente
ocupacional:

CASO No. 1
Edad: 34 años
Sexo: femenino
Profesión: técnico de laboratorio
Evento: Manipulación de tubo de ensayo para procedimiento de valores sanguíneos
Situación: Ruptura de tubo de ensayo que provocó herida del dedo medio de la mano derecha en contacto
con sangre de paciente VIH positivo, se desconoce valores de CD4 y carga viral.
¿Cuál es el riesgo para el técnico de laboratorio al entrar en contacto con la sangre del paciente?
¿Qué medidas de intervención se le deben de realizársele al técnico de laboratorio?
¿Qué medidas de protección y prevención que debió utilizar el técnico para disminuir el riesgo de contacto
con el material infeccioso?

CASO No. 2
Edad 27 años
Sexo. Femenino
Profesión: Médico
Evento: colocación de sonda nasogástrica a con tuberculosis pulmonar, con franca hemoptisis y
hematemesis.
Situación: hemoptisis y hematemesis activa durante el procedimiento de colocación de la sonda que
contamina la conjuntiva del médico.
¿Cuál es el riesgo para el médico al entrar en contacto con los fluidos del paciente?
¿Qué medidas de intervención se le deben de realizársele al médico?
¿Qué medidas de protección y prevención que debió utilizar el médico para disminuir el riesgo de contacto
con el material infeccioso?

CASO No. 3
Edad: 42 años
Sexo: masculino
Profesión: médico
Evento: punción del ganglio cervical en paciente VIH positivo en fase de SIDA,
Situación: realiza procedimiento de obtención de muestra y al separar la aguja de la jeringuilla el protector
se separa y se introduce profundamente en el pulgar de la mano derecha
¿Cuál es el riesgo para el médico al entrar en contacto con los fluidos del paciente?
¿Qué medidas de intervención se le deben realizar al médico?
¿Qué medidas de protección y prevención que debió utilizar el médico para disminuir el riesgo de contacto
con el material infeccioso?

CASO No. 4
Edad: 22 años
Sexo: masculino
Profesión: estudiante de medicina
Evento: preparación de pipetas de Westergreen para la evaluación de velocidad de sedimentación.
Situación: realiza procedimiento de llenado de la pipeta, sin embargo el estudiante NO utiliza un
portapipetas y lo hace con la boca. La sangre entra en contacto con su boca.
¿Cuál es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con los sangre del paciente?
¿Qué medidas de intervención se le deben de realizársele al estudiante?
¿Qué medidas de protección y prevención que debió utilizar el estudiante para disminuir el riesgo de
contacto con el material infeccioso?

CASO No. 5
Edad: 19 años
Sexo: femenino
Profesión: estudiante del curso de Inmunología
Evento: preparación de reactivos para la elaboración de agua regia (Ácido clorhídrico y ácido nítrico,
proporción 3:1)
Situación: al realizar la mezcla de suero y reactivo el estudiante deja caer sobre la mesa de trabajo gotas
de los mismos y no se da cuenta de ello. Posteriormente pone el antebrazo sobre el líquido derramado.

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¿Cuál es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con el suero y reactivos?
¿Qué medidas de intervención se le deben de realizársele al estudiante?
¿Qué medidas de protección y prevención que debió utilizar el estudiante para disminuir el riesgo de
contacto con el material infeccioso?

CASO No. 6
Evalúe la bioseguridad en el laboratorio de inmunología, haciendo énfasis en los cuidados que se debe de
tener para mantener un ambiente seguro para las personas que trabajen en él, incluya:
- Descarte de material bioinfeccioso
- Limpieza del área de trabajo
- Lavado de cristalería
- Lavado de manos

Informe de la película EPIDEMIA.

1. ¿Cuál es el argumento de la película?

2. ¿Crees que las medidas de bioseguridad que se tomaron en el caso de los enfermos de la selva
africana fueron las adecuadas? ¿Por qué?
3. A pesar de ser el brujo de la tribu, ¿por qué no enfermó?
4. ¿Te parecieron adecuadas las medidas epidemiológicas para evitar la propagación de la enfermedad?
¿Por qué?

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 Práctica N° 2

MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y VÍAS DE INOCULACIÓN

Laura Cobos Marín
Myrna A. Vicencio Mallén

INTRODUCCION:

En la investigación y la docencia de todas las ciencias biomédicas es común la utilización de las

diferentes especies animales. Entre los animales más comúnmente usados en los laboratorios tenemos a
los ratones, las ratas, los gerbos, los hámsters, los conejos y los pollos. Sin embargo, cualquier especie
animal puede ser considerada como un animal de laboratorio; así, cuando empleamos las grandes
especies domésticas (caballos, cerdos, bovinos, etc.) para estudiar sus características anatomo-
fisiológicas, sus necesidades nutricionales o su forma de reacción hacia las enfermedades, estamos
haciendo en realidad, un trabajo de investigación con animales de laboratorio.

El término "animales de laboratorio" se ha usado en forma tradicional por la relación que existe entre
el laboratorio y los animales que se utilizan en él, durante una investigación en particular; sin embargo,
sería más aceptado utilizar el término "animales para experimentación" ya que hay ciertas especies
animales que son difíciles de mantener en condiciones adecuadas dentro de un laboratorio. Es
muy importante tener siempre en mente que existe una obligación por parte del investigador,
en cuanto al cuidado de los animales para experimentación. El investigador debe reducir al
mínimo el dolor y la incomodidad así como evitar el uso innecesario de estos animales.

Los animales de experimentación pueden utilizarse como substituto del hombre o de otras
especies animales cuando por razones prácticas, económicas o morales, las investigaciones no pueden
llevarse a cabo directamente en el animal que queremos estudiar. A continuación se enlistan algunos
de los usos que se les da a los animales para experimentación en el laboratorio de Inmunología:

 Producción de antisueros.
 Obtención de complemento.
 Obtención de glóbulos rojos.
 Propagación de antígenos.
 Diagnóstico de enfermedades infecciosas.
 Realización de pruebas de seroneutralización.
 Pruebas de viabilidad, potencia e inocuidad en vacunas y otros productos biológicos.
Los animales que son utilizados para experimentación se pueden clasificar de la siguiente
forma:

a) ANIMALES CONVENCIONALES: son animales que se han criado bajo requisitos mínimos
de higiene, pero sin ningún cuidado especial en cuanto a su origen genético, deficiencias
metabólicas, si sufren o no de parasitosis, con carga microbiana desconocida, etc. Este tipo de
animales generalmente son criados bajo condiciones de cuartos "abiertos" (sin barreras).

b) ANIMALES CONDICIONADOS: son aquellos animales que se han criado bajo ondiciones más
rigurosas de higiene, llevando un control de desparasitación y proporcionándoles una dieta
balanceada de acuerdo a las necesidades de la especie y de su estado fisiológico. Al igual
que en los convencionales, no se tiene ningún cuidado en cuanto a su selección u origen genético.

c) ANIMALES ALTAMENTE CONDICIONADOS: son animales en los que hay un estricto control
genético, medioambiental y nutricional; dentro de este grupo podemos encontrar los siguientes:

1. Libres de patógenos específicos (SPF del inglés “specific pathogen free”). Estos animales
poseen una microflora considerada como "normal" para la especie y no han sido infectados
con microorganismos o virus patógenos. El uso de embriones de pollo SPF, es muy común
en la elaboración de diversas vacunas.
2. Animales axénicos o libres de gérmenes (a= sin, xenos= extraño). Animales obtenidos por
17
 cesárea dentro de un ambiente estéril en los cuales no se puede detectar ningún
microorganismo o virus.
3. Animales gnotobióticos (gnotos=conocido,bios=vida). Son animales, previamente
axénicos, a los cuales se les han inoculado uno o más microorganismos o virus
conocidos.
4. Animales singénicos o de líneas puras consanguíneas. Son animales resultantes de
la cruza endogámica (entre hermano y hermana, o entre madre e hijos o padre e hijos) de por
lo menos 20 generaciones. Estos animales son genéticamente homogéneos en más de un
98% y por ello resultan muy útiles en investigación, pues prácticamente no existen
variaciones en la respuesta entre un individuo y otro. Los animales singénicos mas
comúnmente utilizados son los ratones, sin embargo también existen, cuyes, hamsters,
conejos y aves singénicos.
5. Animales transgénicos. Son animales a los que por manipulación genética in ovo se les
integra algún gen nuevo en su cromosoma; después del nacimiento, aquellos animales
que expresan el gen son cruzados entre sí, para que sus crías continúen expresando el
nuevo gen. Estos animales son muy útiles en inmunología, para estudiar la función de
alguna molécula en particular.
6. Animales “Knock-out”. Son animales a los que, contrariamente a los transgénicos,
se les ha eliminado un gen determinado; también son muy utilizados en inmunología,
para estudiar la función de distintas moléculas.

I. Manejo de animales:

1. Conejo: Para levantar y transportar a un conejo se deben utilizar las dos manos
(nunca cargue a un conejo sujetándolo de las orejas). Debe tomarse la piel laxa del
dorso con una mano y con la otra soportar el peso del animal tomándolo por la región
sacra (figura 1). Para el sangrado intracardiaco se le coloca sobre la mesa de trabajo
presionando su cuerpo contra el cuerpo del operador, utilizando para esto el
antebrazo derecho. A continuación se debe colocar el dedo cordial entre las orejas
sujetando la mano derecha del conejo con los dedos índice y pulgar, y la izquierda
con el anular y el meñique. Posteriormente se debe pasar la palma de la mano izquierda
por la parte ventral del animal, desde el esternón hasta la articulación de la cadera
(extremo proximal del fémur y el acetábulo), sujetando con esta mano la cadera de
animal, de forma tal que queden los miembros posteriores extendidos. Luego se debe
girar al animal, tomando como eje el antebrazo derecho del operador, hasta que el
conejo quede en una posición decúbito dorsal (figura 2).

Fig. 1. Sujeción de un conejo para transporte en distancias cortas.

18
 Fig. 2 Sujeción de un conejo en posición decúbito dorsal para punción cardíaca.

2. Ratón: Para transportarlo de un lugar a otro cercano (por ejemplo de una caja a otra) se
puede sujetar al animal por la cola (figura 3). Para sujetarlo con fines de inoculación
o toma de muestras, se debe tomar con los dedos pulgar e índice la punta de la cola del
ratón; a continuación se debe detener con los dedos cordial, anular y meñique el resto de la
cola lo más cercano a la base. Esta acción permite utilizar los dedos pulgar e índice
para tomar la piel del dorso, cuello y orejas y así sujetar firmemente al animal para que
no pueda mover la cabeza (figura 4). Esta maniobra se realiza más fácilmente si se
coloca al ratón sobre una superficie donde este se pueda agarrar con las uñas (por ejemplo
la tapa de la jaula).

Fig. 3. Sujeción de un ratón por la cola para transporte distancias cortas.

Fig. 4. Sujeción de un ratón para el sangrado por punción cardiaca.

3. Cuy (cuyo, cobayo, conejillo de indias o cerdo de guinea): Para transportarlo o sujetarlo
para la toma de muestras sanguíneas, primero se debe arrinconar al animal y colocar la
palma de la mano sobre su dorso. A continuación se debe colocar el dedo cordial entre
las orejas sujetando la mano derecha del cuye con los dedos índice y pulgar, y la izquierda
con el anular y el meñique Posteriormente se debe pasar la palma de la mano izquierda
por la parte ventral del animal, desde el esternón hasta la articulación de la cadera
(extremo proximal del fémur y el acetábulo), sujetando con esta mano la cadera de
animal, de forma tal que queden los miembros posteriores extendidos. Luego se debe
girar al animal, tomando como eje el antebrazo derecho del operador, hasta que el cuye
quede en una posición decúbito dorsal (figura 7).
19
 Fig. 5. Sujeción de un cuy para efectuar punción cardíaca.

4. Ave: Para transportar a un ave se le puede sujetar teniendo al animal con la cabeza de
frente al operador poniendo la palma de la mano en la quilla con los dedos dirigidos hacia
la cola y sujetando a continuación las patas y las alas (ayudándose con la otra
mano) entre los dedos pulgar e índice y anular y meñique (figura 6).

Fig. 6. Transporte de un ave en distancias cortas.

Para sujetarla y tomar las muestras sanguíneas del corazón, con una mano fijar las alas
dirigiéndolas hacia el dorso del animal y con la otra mano sujetar las patas. Colocar al
ave sobre la mesa de forma que el lado derecho de la pared del tórax quede sobre la mesa
(figura 7).

Fig. 7. Sujeción de una gallina para efectuar punción cardíaca.

5. Rata: TRATE POR TODOS LOS MEDIOS DE EVITAR SUJETAR A UNA RATA POR

20
 LA COLA. Para transportarla o sujetarla para la toma de muestras, la palma de la mano
se coloca sobre el dorso del animal y los dedos pulgar e índice se pasan alrededor del
tórax, inmediatamente atrás de los miembros anteriores (figura 8). El resto del cuerpo
se levanta con los otros dedos y si la rata es muy grande se puede uno ayudar con la
otra mano (figura 9).

Fig.8. Sujeción de una rata por el dorso.

Fig. 9. Sujeción de una rata para punción cardíaca.

5. Hamster: Para transportarlos distancias muy cortas se pueden sostener por la piel laxa
del dorso con una mano. Para sujetarlo con fines de inoculación o toma de muestras,
con la mano derecha se fija la piel laxa del cuello, del dorso y del cuerpo con los dedos
pulgar, índice y medio. Con los dedos anular y meñique se aprisiona una pierna
empujándola hacia adelante (figura 10).

Fig. 10. Sujeción de un hámster para punción cardíaca.

21
VÍAS DE INOCULACIÓN: En las investigaciones y diagnóstico que se llevan a cabo en el Laboratorio
de Inmunología es necesario inocular diferentes sustancias en los animales en experimentación; es
importante mencionar que las normas internacionales de protección de los animales de laboratorio
establecen: “cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia en los animales, que la
producida por inyección o marcaje en orejas, requerirá el uso de tranquilizantes, analgésicos o
anestésicos. Si es necesario efectuar un procedimiento doloroso sin el uso de anestesia, analgésicos,
o tranquilizantes, porque su uso afectaría los resultados del experimento, éstos debe ser aprobado
previamente”

A continuación se describen las vías de inoculación más comúnmente empleadas en inmunología:

AVE:

INOCULACIÓN INTRAMUSCULAR
1. Sujetar al ave, con el método descrito anteriormente (ver figura 9).
2. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara lateral del músculo pectoral, con el bisel hacia arriba
y dando una inclinación de 30 grados con respecto a la piel.
4. Introducir la jeringa con un movimiento firme hasta la inserción en la masa muscular.
5. Depositar el inóculo lentamente y retirar la jeringa.
6. Presionar con una torunda el sitio de la inoculación.

NOTA. Convencionalmente la inoculación intramuscular en aves se hace en la pechuga, para

no afectar la calidad de la carne; sin embargo, para fines de laboratorio puede utilizarse el
muslo ya que ese animal no será destinado para consumo humano.

INOCULACIÓN SUBCUTÁNEA
1. Sujetar al ave, con el método descrito anteriormente (ver figura 9) con la diferencia de sujetar
la cabeza dejando libre la base del cuello.
2. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol.
3. Introducir la aguja por debajo de la piel de. la región cervical y depositar el inóculo. No debe
formarse pápula en el sitio de inoculación.
4. Retirar la aguja y dar un pequeño masaje.

CONEJO:

INOCULACION SUBCUTÁNEA:
1. Dado que la zona de inoculación para esta vía es el dorso del animal, un ayudante debe
sujetar al conejo colocándolo sobre una mesa en posición decúbito ventral, con una mano se
debe inmovilizar la cabeza y con la otra sujetar la cadera en forma firme para evitar que se mueva.
2. Elegir la(s) zona(s) de inoculación (en algunos casos se recomienda cortar el pelo del animal
con tijeras) y limpiar con una torunda con alcohol.
3. Levantar ligeramente la piel del dorso del conejo e introducir aproximadamente una tercera parte
de la aguja, teniendo cuidado de que el bisel de la misma esté hacia arriba.
4. Depositar el inóculo y retirar la aguja.
5. Dar un ligero masaje en el sitio de la inoculación, no debe haber formación de pápula.

INOCULACIÓN INTRAMUSCULAR:
1. Un ayudante debe sujetar al conejo para inmovilizarlo como se describe en el método anterior.
2. La persona que vaya a inocular debe extender hacia él uno de los miembros posteriores y
desinfectar el área a inocular con una torunda con alcohol.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara interior del muslo (donde la piel es más delgada, sobre
todo en conejos adultos), con el bisel hacia arriba y dando una inclinación de 30 grados con
respecto a la piel.
4. Introducir la aguja en la masa muscular y depositar el material de inoculación en forma lenta.
5. Extraer la aguja.
6. Presionar con una torunda el sitio de la inoculación..

22
CUY:

INOCULACIÓN INTRAMUSCULAR
1. Sujetar al cuy, como se describió anteriormente (ver figura 7).
2. Desinfectar con alcohol uno de los miembros posteriores.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara interior del muslo, con el bisel hacia arriba y dando
una inclinación de 30 grados con respecto a la piel.
4. Introducir la jeringa con un movimiento firme hasta la inserción en la masa muscular.
5. Depositar el inóculo lentamente y retirar la jeringa.
6. Presionar con una torunda el sitio de la inoculación.

INOCULACIÓN SUBCUTÁNEA
1. Sujetar al cuy, con el método descrito anteriormente (ver figura 7)
2. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol.
3. Introducir la aguja por debajo de la piel de. la región inguinal o axilar y depositar el
inóculo. No debe formarse pápula en el sitio de inoculación.
4. Retirar la aguja y dar un pequeño masaje en la zona.

RATÓN:

INOCULACIÓN INTRAMUSCULAR:
1. Sujetar al ratón, como se describió anteriormente (ver figura 4).
2. Desinfectar con alcohol uno de los miembros posteriores.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara exterior del muslo, con el bisel hacia arriba y dando
una inclinación de 30 grados con respecto a la piel.
4. Introducir la jeringa con un movimiento firme hasta la inserción en la masa muscular.
5. Depositar el inóculo lentamente y retirar la jeringa.
6. Presionar con una torunda el sitio de la inoculación.

INOCULACIÓN SUBCUTANEA:
1. Sujetar al ratón, con el método descrito anteriormente (ver figura 4) con la diferencia de
sujetar la cabeza por detrás de la orejas (piel del dorso).
2. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol.
3. Introducir la aguja por debajo de la piel del dorso que quedó entre los dedos del manipulador
y depositar el inóculo. No debe formarse pápula en el sitio de inoculación.
4. Retirar la aguja.

INOCULACIÓN INTRAPERITONEAL:
1. El ratón debe sujetarse como se describió anteriormente (ver figura 4) y posteriormente
debe colocarse en forma inclinada, con la cabeza hacia abajo, para que desciendan las vísceras
del abdomen por gravedad.
2. Desinfectar la zona abdominal con una torunda con alcohol.
3. Retraer uno de los miembros posteriores hacia el manipulador y colocar la punta de la aguja
con el bisel hacia arriba y dando una inclinación de 30 grados con respecto a la piel del
abdomen.
4. Manteniendo la jeringa en esta posición, introducir la punta de la aguja en el abdomen.
5. Depositar el inóculo.
6. Extraer la aguja.
7. Presionar con una torunda con alcohol el sitio de inoculación.

INOCULACIÓN INTRADÉRMICA

a) Sujetando al animal como ya se ha descrito, ubicarse en una zona preferiblemente desnuda. Si

hubiese pelo, afeitarlo con cuidado.
b) Cargar la jeringa e inocular en dirección paralela a la piel para ingresar al espacio intracutáneo.
c) Inocular aproximadamente 0,1 ml de solución salina teniendo cuidado de que se forme una
pápula que indicará que se ha efectuado correctamente la inoculación. Retirar la aguja y no
frotar la zona inoculada.

23
MATERIALES

Un conejo cada dos alumnos

Una jeringa hipodérmica (de tuberculina)
Suero fisiológico estéril
Algodón y alcohol

TABLA 1. Principales vías de inoculación de algunos animales de laboratorio

ESPECIE INOCULACIÓN

Oftálmica
Ave s.c. Pliegue del ala y debajo de la piel del dorso
i.m. Músculos pectorales y de los muslos
i.v. vena radial

s.c. Debajo de la piel del dorso

Conejo i.m. Músculos de los miembros posteriores
i.v. Vena marginal o central de la oreja

s.c. Región inguinal y axilar.

Cuy i.m. Parte interna de los músculos de los miembros posteriores.
i.v. Vena femoral, peniana*, safena, sublingual* y yugular*

s.c. Debajo de la piel del dorso

i.m. Músculos de los miembros posteriores
Hámster i.p. Parte media inferior del abdomen
i.v. yugular*

s.c. Región inguinal y axilar.

Rata i.m. Parte interna de los músculos de los miembros posteriores.
i.p. Parte media inferior del abdomen.
i.v. vena caudal, femoral, peniana*, safena, sublingual* y yugular*

s.c. Debajo de la piel del dorso

Ratón i.m. Músculos de los miembros posteriores
i.p. Parte media inferior del abdomen
i.v. Vena de la cola

*previa anestesia o sedación

s.c. = subcutáneo, i.m. = intramuscular, i.p. = intraperitoneal, i.v. = intravenoso

TABLA 2. Calibres recomendados para la inoculación de algunos animales.

ANIMAL VIAS DE INOCULACIÓN CALIBRE DE LA AGUJA

Intravenosa 27
Subcutánea 27
Ratón Intramuscular 27
Intraperitoneal 27
Intramuscular 21 – 22
Cuy Subcutánea 21 – 22
21 - 22
Intravenosa 27
Conejo Subcutánea 20 – 22
Intramuscular 20 – 22
Intravenosa 22
Gallina Intramuscular 20 – 22
Subcutánea 20 – 22
24
Para el informe de prácticas.

1. ¿Qué es un bioterio? ¿Cómo debe diseñarse?

2. Haz un resumen de la forma cómo se debe realizar la inoculación y sangría en animales de
experimentación según el vídeo presentado.

25
 Práctica N° 3

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE TEJIDO LINFOIDE

Introducción

El sistema inmune está formado por linfocitos y moléculas altamente especializadas secretadas por
éstas, tales como anticuerpos y citoquinas. Las células y los anticuerpos se difunden por todos los tejidos,
a través de la corriente sanguínea, pero están concentrados en el árbol de vasos y ganglios linfáticos
localizados a lo largo de ellos, la médula ósea (la cual se encuentra en los huesos largos), el timo y el
bazo. Los vasos linfáticos colectan células y componentes que debido a su tamaño no han podido ingresar
al torrente circulatorio, pero que finalmente serán llevadas por la linfa hacia el torrente circulatorio general
a través de la vena cava anterior. Los linfocitos son fabricados en la médula ósea y se multiplican por
división celular en el timo, el bazo y los ganglios linfáticos.

1. Órganos linfoides centrales o primarios. Incluyen el timo, que existe en mamíferos y aves y la
Bolsa de Fabricio, que solo existe en las aves. Estos órganos consisten de masas de linfocitos dentro
de lóbulos de células epiteliales.

a) La Médula ósea. Ubicada en los huesos largos. Es el lugar de origen de todas las células del
sistema inmune. Los linfocitos T y B se originan en la médula ósea, pero sólo los linfocitos B
maduran en ésta; los linfocitos T migran hacia el timo, lugar en el cual maduran. Los linfocitos B
son denominados así porque se originan y maduran en la médula ósea (Bone Marrow).
b) El timo. Ubicado en la entrada del pecho, en el mediastino anterior, esta formado por dos lóbulos
situados a lo largo de la línea media, por debajo de la tráquea y los grandes vasos. Presenta un
color gris rosáceo y adquiere su mayor tamaño al final del período fetal y en los primeros meses
posteriores al nacimiento, para atrofiarse luego gradualmente e infiltrarse de tejido graso, hasta
26
 quedar muy reducido en el adulto luego de la pubertad. Los linfocitos T se denominan así porque
sufren un proceso de maduración al pasar por el timo.

2. Órganos linfoides periféricos o secundarios. Estos órganos incluyen el bazo, los ganglios linfáticos
y los nódulos linfoides del tubo digestivo, vías respiratorias y aparato genitourinario. En estos órganos
abundan los macrófagos y las células dendríticas que captan y modifican los antígenos. También
existen linfocitos B y T, ejecutantes de las respuestas inmunes. Por lo tanto la estructura anatómica
global de estos órganos parece diseñada para facilitar la captación de antígenos e incrementar las
posibilidades de que el antígeno ya modificado sea presentado a las células sensibles al mismo. Tanto
los linfocitos B y T que han madurado en la médula ósea y timo respectivamente, ingresan a la
circulación sanguínea, de donde migran a los órganos linfoides secundarios o periféricos.
a) Ganglios linfáticos. Son estructuras redondeadas o reniformes que constituyen importantes
organizaciones de tejido linfoide, interpuestas en el trayecto de vasos linfáticos. Esta ubicación
les confiere la condición de verdaderos filtros de la circulación linfática, reteniendo partículas
extrañas y facilitando su relación con las células responsables de la respuesta inmune. La
distribución anatómica y el tamaño de los ganglios varía considerablemente entre especies
dependiendo de su actividad funcional. Los ganglios que drenan territorios en los que asienta un
proceso inflamatorio pueden aumentar varias veces su tamaño.
b) Bazo. Este órgano es el más grande de los órganos linfoides y representa la mayor masa de
tejido linfoide interpuesta en l circulación sanguínea. Su morfología y localización varía entre
especies. El tamaño y color depende de la cantidad de sangre que contiene el órgano, lo que
está en relación con las necesidades de volemia del sistema. Un examen cuidadoso evidencia
la presencia de pequeños nódulos del tamaño de la cabeza de un alfiler de color blanquecino
(pulpa blanca) que resaltan sobre la superficie rojiza del tejido (pulpa roja).
c) Tonsilas o amígdalas. En términos generales pueden describirse como nódulos linfoides
localizados entre los pliegues o invaginaciones de la mucosa, que eventualmente forman
verdaderas criptas, tapizadas por un epitelio densamente infiltrado por linfocitos. Presentan
diferente localización, tamaño y estructura en las distintas especies domésticas y en el hombre,
presentándose en algunos casos pobremente delimitados o sustituidos por nódulos linfáticos no
capsulados. Amígdalas o estructuras equivalentes pueden observarse en toda la escala desde
peces hasta mamíferos, siempre asociadas a la faringe u órganos vecinos. Por su localización
anatómica, el tejido linfoide de las tonsilas parece especialmente dispuesto para la captura y
reconocimiento de partículas antigénicas que ingresan al organismo por vía respiratoria o
digestiva.
d) Placas de Peyer. Estructuras linfoides que se localizan en la mucosa del yeyuno e íleon, en
número y tamaño variable según las especies: 100 a 200 en el caballo, de 15 a 50 en rumiantes
y cerdos, alrededor de 20 en perros, en este último caso también se presentan placas en el
duodeno. En todas las especies se produce una marcada reducción en el número y tamaño de
las placas con la edad. Se localizan en la porción opuesta a la inserción mesentérica y en la
porción terminal del íleon tienden a confluir formando una placa de gran tamaño.

Materiales

Láminas con cortes histológicos de tejido linfoide

Microscopio
Aceite de inmersión

Metodología

Lámina 1 MÉDULA ÓSEA HEMATOPOYÉTICA (Coloración hematoxilina-eosina)

La médula ósea ocupa los espacios que quedan entre las trabéculas del hueso medular. Está formada
por senos vasculares muy ramificados y un armazón de reticulina, en cuyos intersticios se agrupan las
células hematopoyéticas.

En el corte se observará las trabéculas óseas de color morado; los adipocitos, a manera de espacios
circulares vacíos. Entre dichos espacios se observará acúmulos de células precursoras de los eritrocitos,
leucocitos y trombocitos (eritroblastos, mieloblastos, monoblastos, linfoblastos, megacarioblastos). Anotar
la morfología y hacer los esquemas correspondientes.

27
Lámina 2 TIMO (Coloración hematoxilina-eosina)

El timo es el órgano en el que los linfocitos indiferenciados procedentes de la médula ósea se diferencian
convirtiéndose en células maduras. Este proceso implica la diferenciación en linfocitos T-a y T-s/ctx. Este
órgano presenta forma aplanada y estructura lobulada. Consta de dos porciones: una corteza externa con
gran celularidad y una médula central pálida. La corteza se halla dividida en lóbulos regulares de 0,5 a
2,0 mm de diámetro por delgados tabiques que, originados en una cápsula externa de tejido
fibrocolagenoso laxo, se extienden hasta la unión corticomedular. El tejido medular es más pobre en
células y constituye una zona central continua. El timo está formado por epiteliocitos, linfocitos,
macrófagos y eosinófilos.

En la lámina se observará la corteza tímica dividida en lobulillos por tabiques fibrocolagenosos y rodeada
por tejido adiposo del mediastino. Presenta una celularidad densa que difiere de la médula que es menor.
En la corteza tímica se observará gran número de linfocitos densamente agrupados cuyo tamaño varía de
pequeños a grandes. Por toda la corteza se observará macrófagos dispersos. En la médula se observará
los corpúsculos de Hassall que derivan de los epiteliocitos y que tienen una coloración eosinofílica.

Lámina 3 GANGLIOS LINFÁTICOS O LINFONODOS (Coloración hematoxilina-eosina)

Los ganglios linfáticos o linfonodos son pequeños órganos que se encuentran formando agrupamientos o
cadenas en puntos en los que los vasos linfáticos que drenan una región anatómica determinada
convergen para originar vasos linfáticos de mayor calibre, como ocurre, por ejemplo, en el cuello, las axilas,
las ingles y la región paraaórtica.

En la lámina se observará la cápsula, la corteza superficial y los folículos linfáticos. Los folículos linfáticos
tienen forma redondeada constituídos principalmente por linfocitos B. Cada folículo presenta una zona
que rodea al centro germinal denominada manto constituida por pequeños linfocitos B inactivos y algunas
células T. El centro germinal más pálido, contiene linfocitos B que se encuentran en diferentes fases de
maduración.

Lámina 4 BAZO (Coloración hematoxilina-eosina)

El bazo está provisto de una delgada cápsula fibrocolagenosa de la que parten tabiques de escasa longitud
que se adentran en el órgano. Estos tabiques proporcionan puntos de anclaje para una extensa red de
fibras de reticulina que constituyen el esqueleto que sostiene el parénquima esplénico. La mayor parte del
bazo está formada por una gran cantidad de sinusoides y senos vasculares llenos de sangre (pulpa roja).
El resto, entre el 5 y 20% de la masa total del bazo, está formado por una serie de arterias ramificadas
(arterias centrales), que están asociadas a tejido linfoide y que constituyen la denominada pulpa blanca.

En la lámina la pulpa blanca se observa como un agregado intensamente teñido de células linfoides
adyacentes a las arterias centrales. La pulpa roja se nota menos teñida ya que en ella hay un menor
número de núcleos.

Lámina 5 AMÍGDALAS (Coloración hematoxilina-eosina)

En la lámina se observará las criptas amigdalianas revestidas de epitelio escamoso y rodeada de tejido
linfoide. Los folículos linfáticos amigdalianos son de estructura similar a los de los ganglios linfáticos y
demás tejido linfoide.

Lámina 6 HÍGADO (Coloración hematoxilina-eosina)

En la lámina se observará los cordones hepáticos y las células de Kupffer teñidas intensamente de azul
ubicadas en los sinusoides hepáticos.

Lámina 7 FROTIS SANGUÍNEO (Coloración de Wright)

En la lámina se observará las diferentes células sanguíneas (neutrófilos o polimorfonucleares

segmentados y en banda; eosinófilos, linfocitos, monocitos).

Hacer el informe respectivo.

28
 Práctica N° 4

NEFELÓMETRO DE MAC FARLAND

Se llama nefelometría a la medida de la dispersión de la luz por las partículas en suspensión. Si se

mezclan soluciones de antígenos y anticuerpos, límpidas desde el punto de vista óptico, el precipitado que
se produce hará que la mezcla aparezca turbia. Este fenómeno también se produce cuando se mezclan
dos soluciones transparentes conteniendo sustancias químicas.

Otras definiciones al respecto de la nefelometría son:

“Es una técnica de laboratorio que se utiliza para obtener una medición de la cantidad de
inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA de manera precisa y rápida. Esta prueba utiliza un instrumento
especializado para medir el movimiento de partículas en una solución (turbiedad), causada por la
interacción de inmunoglobulinas en el suero y antiinmunoglobulina que ha sido agregada al suero”.

“Procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas
de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas
sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone
la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad
de la radiación es la misma en cualquier ángulo. La intensidad depende de: el número de partículas
suspendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la
longitud de onda de la radiación dispersada”.

“Procedimiento que se basa en las propiedades ópticas de dispersiones o disoluciones coloidales.

Las finas partículas pueden absorber o dispersar la luz (efecto Tyndall). Se basa en la absorción de la luz
midiendo la luz transmitida (turbidimetría). La nefelometría se basa en la luz dispersada; en ambos casos
la luz transmitida o dispersada es proporcional a la concentración”.

En microbiología e inmunología, los estándares de turbidez o nefelómetro de MacFarland se usan

como referencia en suspensiones bacteriológicas para saber que el número de bacterias por mililitro, o
más bien en UFC según una escala que va de 0.5 a 10. Estos estándares son creados al mezclar
soluciones de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos, para asegurar la
densidad correcta se puede controlar usando espectofotometros. Los estándares pueden ser visualmente
comparados con suspensiones de bacterias en salina estéril o en caldos. Si la suspensión es demasiado
turbia, puede añadirse diluyente, y si no es lo suficiente turbia, se puede agregar más bacterias. La ventaja
es que no es necesario incubar ni usar equipo especial para estimar el número de bacterias.3 La
desventaja de este método es que no discrimina a las bacterias vivas de las muertas en la solución, por lo
que se puede sobreestimar la población de bacterias.
Casos específicos en los que se usa es en el de antibiogramas o pruebas de sensibilidad, donde es
necesario para estandarizar el método y se eviten falsos positivos o negativos.

El Nefelómetro o Escala de MacFarland se trata de una serie de patrones de turbidez previamente

calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl2Ba +
cantidades crecientes de SO4H2 al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO 4Ba,
origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de
cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera una turbidez similar. Se trata
de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio
herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2 al 1%}; por lo
tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana
hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias
(en céls/ml) que genera una turbidez similar.

Inconveniente: es un método poco preciso, que sólo se emplea cuando no hace falta exactitud. Ha
sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.

La utilidad del nefelómetro de MacFarland es que permite, por comparación, determinar el número de
bacterias por mililitro contenidas en una suspensión bacteriana obtenida al mezclar suero fisiológico con
las colonias cosechadas de un medio de cultivo sólido.

29
 La utilización del nefelómetro de Mac Farland se efectúa de la manera siguiente:

Se deberá sembrar las bacterias en medio sólido. Transcurridas 24 horas cosechar las colonias
agregando salina estéril y raspando cuidadosamente la superficie del agar para retirar las colonias evitando
tocar el medio de cultivo. Esta cosecha debe trasladarse a un tubo de ensayo del mismo tamaño que los
del nefelómetro y homogenizar mediante agitación del mismo. Una vez obtenida la suspensión (que
presenta una determinada turbidez), compararla con los tubos del nefelómetro para determinar el número
de bacterias por mililitro.

Materiales

Ácido sulfúrico al 1%
Cloruro de bario al 1%
Tubos de ensayo grandes
Gradilla
Pipetas de 1 y 10 ml

Procedimiento

1. Enumerar los tubos de ensayo (del 1 hasta el 10).

2. Colocar en el tubo 1; 0,1 ml de cloruro de bario al 1%; 0,2 ml al tubo 2; e ir aumentando 0,1 ml a cada
tubo hasta llegar a 1 ml en el tubo 10.
3. Agregar luego 9,9 ml de ácido sulfúrico al tubo 1; 9,8 ml al tubo 2 y así sucesivamente hasta completar
10 ml en cada tubo. Al finalizar este paso se observará una turbidez tenue en el tubo 1 que se irá
incrementando hasta el tubo 10.

La cantidad de bacterias por mililitro que puede medir el nefelómetro está dada por el siguiente cuadro:

N° TUBO Nº DE BACTERIAS POR ml Nº TUBO Nº DE BACTERIAS POR ml

01 300 000 000 06 1 800 000 000

02 600 000 000 07 2 100 000 000

03 900 000 000 08 2 400 000 000

04 1 200 000 000 09 2 700 000 000

05 1 500 000 000 10 3 000 000 000

30
 Práctica N° 5

DILUCIONES
Laura Cobos Marín
Myrna Vicencio Mallén

INTRODUCCIÓN:

Diluir es la acción de disminuir la concentración de una sustancia (soluto) en otra (disolvente), a ésta
en Inmunología se le llama diluyente. Cuando el soluto se disuelve en el disolvente, a la mezcla se le
denomina solución: por ejemplo, cuando agregamos cloruro de sodio (soluto) en agua (disolvente); por el
contrario, si el soluto no se disuelve en el diluyente entonces se obtiene una suspensión, por ejemplo al
agregar glóbulos rojos (soluto) en solución salina (diluyente).

En una solución, el soluto y el diluyente pueden ser un sólido, un líquido o un gas; sin embargo, en
Inmunología el diluyente normalmente se encuentra en estado líquido, y el soluto puede ser un sólido (por
ejemplo, glucosa) o un líquido (alcohol). Las diluciones suelen expresarse en proporciones, así una dilución
1/4 (1:4) nos indica las partes de soluto y las partes totales que tiene una dilución, en donde:

1 Corresponde a las partes del soluto

4 Corresponde a las partes totales (soluto+diluyente)

Por lo tanto, una dilución 1/4 contiene 1 parte de soluto, 3 partes de diluyente y la suma de ambas
da las partes totales: 4; de la misma manera una dilución 1/7 contiene 1 parte de soluto, 6 partes de
diluyente y la suma de ambas partes da 7 partes totales.

Las diluciones pueden ser:

1. Diluciones únicas:

Se denominan únicas cuando solamente se requiere esa dilución.

Para realizar una dilución única se necesita:

a) Saber la dilución y el volumen requeridos.

b) Calcular el volumen de soluto y diluente necesarios.

Si queremos preparar una dilución 1/4, en 2 mililitros (ml). Sabemos que se requiere una parte de
soluto y tres partes de diluyente; como el volumen es 2 ml, entonces:

Para calcular el volumen de soluto se tiene que dividir 2 ml (vol. Requerido) ÷ 4 = 0.5 ml y lo que falte
para los 2 ml corresponde al diluyente: 2 ml – 0.5m =1.5 ml

Si necesitamos preparar una dilución 1/10 en 5 ml, el soluto equivale a la décima parte de 5 ml: 5
ml ÷ 10 = 0.5 ml y las nueve partes restantes corresponden al diluyente: 5ml – 0.5ml = 4.5 ml; sumando
el soluto y el diluyente obtenemos 5 ml que corresponde a las partes totales (10).

2. Diluciones seriadas:

Las diluciones seriadas son la disminución de un soluto en un diluyente en forma gradual y

sistemática para lograr reducir su concentración en una secuencia ordenada y, con ello, cuantificar
su actividad biológica. Por ejemplo, si queremos saber cuántos anticuerpos hay en el suero de un
animal (título del suero), podemos ir disminuyendo su concentración a la mitad, y a la mitad, y así
sucesivamente hasta llegar a un punto en el que ya no detectemos estos anticuerpos. Arbitrariamente
podemos decir que el último tubo en el que todavía se encuentra anticuerpos es el inverso a la
cantidad de anticuerpos (título) que tiene el suero concentrado.

31
 Existen diferentes tipos de diluciones seriadas, pero las más utilizadas en Inmunología y Virología
son las diluciones dobles seriadas, las quíntuples seriadas y las décuples seriadas. Se llaman dobles
cuando lo que se está haciendo es diluir a la mitad, quíntuples cuando se está diluyendo a la quinta
parte o décuples cuando se está diluyendo a la décima parte la concentración del soluto.

Todas las diluciones seriadas comienzan con una dilución inicial, misma que se obtiene
exactamente igual que si fuera una dilución única. Puedo hacer una dilución seriada partiendo de una
dilución inicial cualquiera, lo importante es tener en mente que la concentración inicial se va a ir
disminuyendo a la mitad, o a la décima parte, etc.

2.1 Diluciones dobles seriadas:

Para realizar una dilución doble necesito saber:

a) La dilución inicial (que no necesariamente es 1/2, sino que puede ser cualquier otra)
b) El volumen inicial.
c) El número de tubos requerido en mi serie de diluciones.

Por ejemplo, si necesito cuantificar los anticuerpos de un suero contra H. somnus y para ello debo
realizar una dilución doble seriada, iniciando con una dilución 1/5 en un volumen de 1ml, en 4
tubos; los cálculos para hacer esta dilución serían:

a) En el primer tubo se realizan los mismos pasos descritos para las diluciones únicas: para
saber cuántos ml corresponden al soluto, divido mi volumen inicial entre 5 (1ml÷5 = 0.2ml) y
el resto es de diluente (1ml – 0.2ml = 0.8ml).
b) Como la dilución es doble, quiere decir que en el siguiente tubo debo disminuir la
concentración a la mitad, por lo que debo transferir del tubo 1 al 2, la mitad del volumen
inicial: 1ml÷2= 0.5ml (volumen de transferencia), ésta cantidad la recibo en la otra mitad del
volumen: 1ml-0.5ml= 0.5 ml de diluente (volumen de recepción), para complementar el
volumen inicial (1 ml). Como se indicó anteriormente, en una dilución seriada se repiten los
pasos sistemáticamente de un tubo a otro, así debo transferir del tubo 2 al 3 el volumen de
transferencia (0.5 ml) y recibirlo en el volumen de recepción (0.5ml), esto se repite tantas
veces como tubos sean necesarios. Del último tubo hay que desechar el volumen
correspondiente al volumen de transferencia, para que todos los tubos queden con el mismo
volumen.

A continuación se muestra un esquema de cómo se realiza la dilución seriada de nuestro ejemplo:

Las diluciones que quedan en cada tubo al terminar la dilución seriada corresponden a:

32
 NOTA: Como se podrá observar, el volumen final en todos los tubos corresponde a la mitad del
volumen inicial (0.5 ml). Si quisiéramos que los tubos queden con 1 ml de volumen final, tendríamos que
iniciar la dilución con el doble del volumen (2 ml). Para hacer una dilución doble seriada, iniciando con una
dilución 1/8 en un volumen inicial de 4 ml en 5 tubos se necesita:

Dilución inicial (tubo1):

Cantidad de soluto: 4ml (volumen inicial) ÷ 8 (dilución inicial 1/8) = 0.5 ml

Cantidad de diluente: 4ml – 0.5 ml (soluto) = 3.5 ml
Dilución seriada (tubos 2 a 5)
Volumen de transferencia: 4ml (volumen inicial) ÷2 (dilución doble seriada) = 2 ml
Volumen de recepción: 4ml (volumen inicial) - 2ml (volumen de transferencia) = 2 ml

Dilución final obtenida en cada tubo:

Tubo 1 = 1/8
Tubo 2 = 1/16 (1/8 X 1/2)
Tubo 3 = 1/32 (1/16 X 1/2)
Tubo 4 = 1/64 (1/32 X 1/2)
Tubo 5 = 1/128 (1/64 X 1/2)

Los datos obtenidos se pueden resumir en el siguiente cuadro:

Nº TUBO 1 2 3 4 5
Dilución obtenida 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
Vol. de soluto 0.5ml
Vol. de diluyente 3.5ml 2ml 2ml 2ml 2ml
Vol. de transferencia 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
Vol. final 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml

2.2 Diluciones décuples seriadas:

En las diluciones décuples seriadas (1/10) se deberá transferir una décima parte del volumen
del tubo que estamos trabajando y recibirla en nueve partes de diluente.
Estas diluciones suelen expresarse en forma logarítmica (10-1 )P

Al igual que en las diluciones dobles, para realizar una dilución décuple necesito saber:

a) La dilución inicial (que no necesariamente es 1/10, sino que puede ser cualquier otra)
b) El volumen inicial
c) El número de tubos requerido en mi serie de diluciones.
Supongamos que queremos realizar una dilución décuple seriada en 5 tubos, partiendo
de una dilución inicial 1/8 en un volumen de 4ml; los cálculos para hacer esta dilución serían:
33
 a) En el primer tubo se realizan los mismos pasos descritos para las diluciones únicas: para
saber cuántos ml corresponden al soluto, divido mi volumen inicial entre 8 (4ml÷8 = 0.5ml)
y el resto es de diluyente (4ml – 0.5ml = 3.5ml).
b) Como la dilución es décuple, quiere decir que en el siguiente tubo debo disminuir la
concentración a la décima parte, por lo que debo transferir del tubo 1 al 2, la décima
parte del volumen inicial: 4ml÷10= 0.4ml (volumen de transferencia), ésta cantidad la
recibo en las nueve décimas partes restantes: 4ml-0.4ml= 3.6ml de diluyente (volumen
de recepción), para complementar el volumen inicial (4ml). Como se indicó anteriormente,
en una dilución seriada se repiten los pasos sistemáticamente de un tubo a otro, así
debo transferir del tubo 2 al 3 el volumen de transferencia (0.4ml) y recibirlo en el
volumen de recepción (3.6ml), esto se repite tantas veces como tubos sean necesarios.

A continuación se muestra un esquema de cómo se realiza la dilución seriada de nuestro ejemplo:

Las diluciones que quedan en cada tubo al terminar la dilución seriada corresponden a:

Para hacer una dilución décuple seriada, iniciando con una dilución 1/2 en un volumen inicial de
5 ml en 4 tubos se necesita:

Dilución inicial (tubo1):

Cantidad de soluto: 5ml (volumen inicial) ÷ 2 (dilución inicial 1/2) = 2.5ml
Cantidad de diluyente: 5 ml – 2.5 ml (soluto) = 2.5ml
Dilución seriada (tubos 2 a 4)
Volumen de transferencia: 5 ml (volumen inicial) ÷ 10 (dilución décuple seriada) = 0.5 ml

34
 Volumen de recepción: 5 ml (volumen inicial) – 0.5 ml (volumen de transferencia) =
4.5 ml
Dilución final obtenida en cada tubo:
Tubo 1 = 1/5
Tubo 2 = 1/50 (1/5 X 1/10)
Tubo 3 = 1/500 (1/50 X 1/10)
Tubo 4 = 1/5000 (1/500 X 1/10)

Los datos obtenidos se pueden resumir en el siguiente cuadro:

# TUBO 1 2 3 4
Dilución obtenida 1/5 1/50 1/500 1/5000
Vol. de soluto 2.5ml
Vol. de diluyente 2.5ml 4.5ml 4.5ml 4.5ml
Vol. de transferencia 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml

Vol. final 4.5ml 4.5ml 4.5ml 4.5ml

3. Diluciones en pasos:
Cuando se requiere hacer una dilución alta, no siempre es factible o conveniente hacerla
directamente, por lo que es necesario empezar con una dilución más concentrada que la
que necesitamos y a partir de ésta, realizar una o mas diluciones hasta llegar a la dilución que
queremos obtener.

Si queremos preparar una dilución 1/3500, podemos partir de una más concentrada por ejemplo
1/100. Lo que necesitamos es calcular la dilución intermedia para lo cual tendríamos que dividir la
dilución deseada entre la dilución inicial: 3500÷100 = 35

Este número (35) representa la dilución intermedia, es decir: necesitamos diluir 35 veces la dilución
inicial (1/100) para obtener la dilución requerida (1/3500). Dicho de otra forma: para hacer la dilución
1/3500 debo hacer una dilución 1/100 y a partir de ésta, una dilución 1/35 en el volumen requerido.
Es importante mencionar que el soluto necesario para la dilución 1/35 deberá tomarse de la dilución
1/100:

El volumen de la dilución inicial se obtiene arbitrariamente, lo único importante es:

35
 o Utilizar el menor volumen de soluto (sobretodo si es un reactivo caro a hay poca disponibilidad del
mismo)
o Tener el volumen suficiente para cubrir el volumen de la dilución final requerida. Suponiendo que
se requirieran 7ml de la dilución 1/3500, los cálculos aritméticos necesarios serían:

1. Saber cuánto se requiere de soluto y diluyente para la segunda dilución (1/35) Dilución 1/35,
volumen 7ml:

Soluto: 7 ÷ 35 = 0.2ml
Diluyente: 7 – 0.2 = 6.8ml

2. Obtener el soluto y diluente para la dilución inicial (1/100); el volumen de esta debe
ser el suficiente para poder realizar la siguiente dilución (1/35). En nuestro ejemplo
éste es de por lo menos 0.2ml; generalmente se utiliza un volumen mayor para poder medir
adecuadamente por lo que podemos aumentar el volumen por ejemplo a 1ml.

Dilución 1/100, volumen 1ml:

Soluto: 1ml ÷ 100 = 0.01ml
Diluyente: 1ml – 0.01 ml = 0.99ml

La dilución se realizaría de la siguiente forma:

Los datos obtenidos se pueden resumir en el siguiente cuadro:

# TUBO 1 2
Dilución obtenida 1/100 1/3500
(1/100X1/35)
Vol. de soluto 0.01ml
Vol. de diluyente 0.99 ml 6.8ml
Vol. de transferencia 0.2ml 0.2ml

Vol. final 7.0ml

4. Soluciones Porcentuales:

Como se indicó al inicio de la práctica, una dilución puede expresarse en forma porcentual.
La expresión “tanto por ciento”, por ejemplo 8%, quiere decir que de cada 100 partes totales, 8
corresponden al soluto y el resto (92) al diluyente.
36
 Para preparar una solución porcentual necesito saber:
1) a que concentración la quiero,
2) que cantidad o volumen necesito preparar.

Si deseo preparar 40ml de una suspensión de glóbulos rojos al 3%, quiere decir que cada 100 ml de
esta suspensión tendrán 3 ml de glóbulos rojos. Si requiero un volumen de 40 ml, entonces debo
hacer una regla de tres:

3 ml de glóbulos rojos son para 100ml, ¿cuántos ml de glóbulos rojos (X) son para 40ml totales?,
entonces: 3 :100 :: x : 40, ó
ml de glóbulos
rojos ml totales

3 100
X 40

3 X 40 = 120
120/100= 1.2 ml

Necesito 1.2ml de glóbulos rojos (soluto) y 38.8 ml de solución salina como diluente (40ml -1.2ml=
38.8ml)

Si deseo preparar una solución salina al 0.85%, quiere decir que cada 100 ml de esta solución tendrán
0.85 gr de NaCl. Si requiero un volumen de 30ml, entonces debo hacer una regla de tres:

0.85g son para 100ml, ¿cuántos gramos (X) son para 30ml?: 0.85 :100 :: x : 30 ó

gramos ml totales de
NaCl
0.85 100
X 30
30 x 0.85= 25.5
25.5/100= 0.255 gr

Para esta solución necesito poner 0.255gr de NaCl (soluto); en este caso no pueden restarse los gramos
de NaCl al volumen total por lo que debo usar una probeta para aforar al volumen deseado; es decir,
agregar diluyente cuanto baste para (c.b.p.) 30ml.

MATERIALES

Azul de metileno
Agua destilada
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradilla

PROCEDIMIENTO

Dilución al doble, al quinto y al décuple seriadas. Colocar en una gradilla cinco (5) tubos de ensayo y
seguir las instrucciones descritas en los acápites correspondientes.

37
 Práctica N° 6

ESTUDIO DE LA SANGRE

La presente práctica provee al estudiante una experiencia sobre hematología.

La sangre es un fluido que contiene elementos celulares y un número de moléculas necesarios para
alimentar a los tejidos y regular las funciones del cuerpo. El fluido y los elementos celulares pueden
separarse por centrifugación. Los elementos celulares pueden estar estacionados dentro de los tejidos o
circular con la misma sangre. La parte fluida contiene una solución acuosa de sales, carbohidratos y
proteínas.

La sangre es un tema de interés para los inmunólogos y los serologistas. Muchos mecanismos
inmunes tienen su origen en células sanguíneas específicas y la porción fluida contiene moléculas que
regulan y son los productos del sistema inmune.

El suero se define como la porción fluida de la sangre que se obtiene mediante el proceso de
coagulación.

LEUCOCITOS

Neutrófilo Monocito Basófilo Linfocito Eosinófilo

38
Sistema de los Grupos sanguíneos ABO

En 1900, Landsteiner describió la aglutinación que se producía al mezclar los glóbulos rojos de un
sujeto con los de otro. Este descubrimiento llevó a Landsteiner a aceptar la existencia de tres grupos
sanguíneos distintos. Se descubrió un cuarto grupo en 1902. Estas cuatro clasificaciones reciben en la
actualidad el nombre de sistema de grupos sanguíneos ABO. Landsteiner vió también que solamente se
necesitaban dos antígenos para explicar los cuatro grupos, el primero tenía un antígeno A, el segundo
tenía el otro (B), el tercero tenía los dos (AB) y el cuarto no tenía ninguno (O).

También reconoció la relación recíproca en una muestra de sangre entre los anticuerpos del suero y
los antígenos de los glóbulos rojos. En cada caso, solamente se encuentran anticuerpos anti-A, anti-B, o
ambos en el suero cuando los glóbulos rojos carecen del antígeno correspondiente. Estas relaciones se
muestran en el siguiente cuadro:

Grupo Antígeno del glóbulo rojo Anticuerpo del plasma

O O Anti – A y anti – B
A A Anti – B
B B Anti – A
AB AB Ninguno

El antígeno Rh

Landsteiner y Wiemer, en 1941, descubrieron el antígeno o factor Rh que denominaron así por haberlo
encontrado primeramente en los glóbulos rojos del mono Macacus rhesus. En los seres humanos, los
individuos que poseen el factor Rh en sus glóbulos rojos, se les denomina Rh positivos (Rh+).

El objetivo de la práctica es familiarizar al estudiante con la técnica de la determinación de grupos

sanguíneos, así como la preparación, coloración y lectura de frotis sanguíneos.

MATERIALES

Kit para determinar grupos sanguíneos

Colorante de Wright o de Giemsa
Lancetas
Láminas portaobjetos
Mondadientes
Microscopio con lente de inmersión
Algodón y alcohol

PROCEDIMIENTO

GRUPOS SANGUÍNEOS
1. Con una lanceta pinchar la yema del dedo medio de un voluntario.
2. Colocar tres gotas de sangre en una lámina portaobjetos.
3. Colocar una gota de reactivo anti-A, anti-B y anti-D; respectivamente.
4. Mezclar con un mondadientes. Observar y anotar.

FROTIS SANGUÍNEOS
1. Colocar una gota de sangre en un extremo de una lámina portaobjetos.
2. Extender la sangre con el borde de una lámina portaobjetos biselada.
3. Secar y colorear con colorante Wright o Giemsa.
4. Secar y observar al microscopio.
5. Anotar sus observaciones.

39
 Práctica N° 7

LAVADO DE ERITROCITOS

El lavado de eritrocitos es un práctica de rutina en el laboratorio de microbiología e inmunología

para llevar a cabo pruebas que demuestren la capacidad hemaglutinante de ciertas bacterias y,
fundamentalmente, de los virus. Esta práctica tiene como finalidad liberar a los eritrocitos de sustancias
que interfieran con los receptores de dichas células e impedir la formación de los complejos antígeno -
anticuerpo.

Las muestras sanguíneas deben tomarse con un anticoagulante que no lesione ni ocasione
fragilidad en los eritrocitos tal que pueda hemolizarlos. Generalmente se emplea sangre de pollo o de
carnero para efectuar las pruebas de hemoaglutinación e inhibición de la hemoaglutinación.

MATERIALES

Sangre de pollo, carnero o de humano

Anticoagulante
Suero fisiológico
Tubos de ensayo
Centrífuga
Pipetas

PROCEDIMIENTO

1. Obtener sangre de pollo, de carnero o de humano en un frasco con anticoagulante.

2. Colocar la sangre en tubos de ensayo y centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos a fin de separar los
glóbulos del plasma. Eliminar el plasma.
3. Al sedimento globular, agregar suero fisiológico en un volumen equivalente al doble de dicho sedimento.
Mezclar con cuidado y centifugar a 3000 rpm por 3 minutos.
4. Repetir el paso 3 por tres o cuatro veces más hasta que el sobrenadante sea completamente
transparente. Eliminar el sobrenadante y utilizar el sedimento globular para llevar a cabo las
suspensiones que requiera la práctica.

40
 Práctica N° 8

HEMAGLUTINACIÓN VIRAL PASIVA

La hemaglutinación indirecta (HAI), también llamada hemaglutinación reversa pasiva, se basa en la
propiedad que tienen los anticuerpos de producir aglutinación específica en presencia de glóbulos rojos
sensibilizados con los correspondientes antígenos. En el suero existen anticuerpos inespecíficos
(heterófilos) que son capaces de aglutinar glóbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga
enfrentando el suero con glóbulos rojos no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan
mediante tratamiento con 2 – mercaptoetanol.

Esta técnica se fundamenta en que hay virus que provocan aglutinación de los eritrocitos por la
presencia de hemoaglutininas de superficie afines con los glóbulos rojos de las especies afectadas. Los
eritrocitos son suspendidos, preferentemente en solución Alsever con anticoagulante en proporción 1:1.
Luego son centrifugados y lavados en solución buffer fosfatada. Se ensayan diferentes concentraciones
de uso 1%, 0.75% y 0.5%, hasta establecer la óptima.

La detección de la hemaglutinación inducida por virus sirve de prueba preliminar cuando se trata de
identificar un virus. Entre los virus hemaglutinantes están los mixovirus, los ortomixovirus y los
paramixovirus, los virus alfa, los flavivirus y los bunyavirus, así como algunos adenovirus, reovirus,
parvovirus y coronavirus. También algunos micoplasmas como Mycoplasma gallisepticum.

El objetivo de la presente práctica es observar el poder hemaglutinante del virus de la enfermedad de

Newcastle que es un mixovirus. Cuando se emplea sangre humana la prueba dará resultado si el individuo
donante es del grupo O.

MATERIALES

Un frasco de vacuna contra la enfermedad de Newcastle

Eritrocitos de pollo lavados al 0,5%
Suero fisiológico estéril
Diez tubos de ensayo limpios
Pipetas de 1 y 10 ml
Gradillas

PROCEDIMIENTO

1. Distribuir los reactivos según el siguiente esquema:

T U B O S
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Control

Solución salina (ml) 0,8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Virus (ml) 0,2 Mezclar, pasar 0,5 ml al tubo 2 y así sucesivamente. Después de
efectuar la mezcla en el tubo 10, eliminar 0,5 ml.

Eritrocitos lavados (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

2. Agitar bien y dejar en reposo a temperatura ambiente por una hora.

3. Leer los resultados de la hemaglutinación.
4. La hemaglutinación se lee en el fondo del tubo, según la manera en que se han depositado los
eritrocitos. La reacción será positiva si se observa una distribución uniforme de los eritrocitos y
negativa si se observa un punto o un botón. En caso de duda, inclinar ligeramente el tubo de prueba:
si los glóbulos rojos caen a manera de lágrima es porque están sueltos (no han aglutinado). El tubo
10 es el control de los glóbulos rojos. El título del virus va a ser determinado por la máxima dilución
donde hay hemaglutinación positiva, de acuerdo al siguiente cuadro:

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 T U B O S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Títulos 5 10 20 40 80 160 320 640 1280 2560

Interpretación

 No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón.

 Reactivo: formación de una película o manto en el fondo de los pocillos. En caso de observar la
presencia de un pequeño anillo de bordes regulares, la muestra se considerará dudosa y deberá ser
ensayada por otro método

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