Actualización en la medición de

hormonas tiroideas en el
contexto del tamizaje neonatal

Gladys Laverde de Arbeláez

Bacterióloga Directora Científica
Laboratorio de Investigación Hormonal
Miembro de ACEP - ACE

XVI REUNION NACIONAL ANUAL DE TAMIZAJE

13 y 14 de Octubre /2016
Actualización en la medición de hormonas tiroideas
en el contexto del tamizaje neonatal
Objetivos

 Introducción –Fisiología –Secreción

 Que es lo normal?
 Fase preanalítica –Estabilidad muestras
 Fase analítica
 Definiciones Inmunoensayo – Marcadores
 Evolución técnicas IE Métodos
 Fase Postanalítica
 Pruebas diagnósticas - confirmatorias
 Conceptos de calidad
 Resumen –Recomendaciones
 Introducción
• Es necesario el respaldo de un
laboratorio de alta calidad para lograr
un diagnóstico preciso, un manejo
efectivo y a un costo razonable de los
problemas tiroideos.
• En la presencia de una masa tiroidea
de crecimiento rápido, las pruebas de
laboratorio simplemente confirman la
sospecha clínica.
• Los síntomas son tan sutiles que la
patología sólo se puede detectar
mediante una evaluación bioquímica o
citopatológica.
•
 Introducción
• Los programas de screening neonatal se basan en
grandes números de muestras provenientes de
una región relativamente amplia. La logística del
transporte de las muestras (es decir, el tiempo de
envió postal, las demoras en enviar el material a
las salas de maternidad y las demoras en actuar
después que se emite el resultado), son factores
de tiempo limitantes más significativos que la
velocidad de los procedimientos analíticos, para
identificar a recién nacidos con riesgo de HC.
 Criterios que deberían reunir los
laboratorios de screening de HC
• Solamente los laboratorios con experiencia en
Inmunoensayos automatizados, que cuenten
con tecnología informática y personal
adecuadamente capacitado, deberían realizar
screening de hipotiroidismo congénito.
 Fisiología
• La interpretación correcta de la función Hipotálamo -
tiroidea del recién nacido, requiere la T -
comprensión de la interacción entre la 3
madre y el feto.
• El yodo, la hormona liberadora de
tirotrofina o TRH, los fármacos + TRH - SOMATOSTATINA
antitiroideos y los anticuerpos anti IgG
atraviesan la placenta con facilidad.
• No hay paso transplacentario de TSH ni de PIT
triyodotironina (T3) T4 T3 -
• Por el contrario, en oposición a lo que se +TSH
creía anteriormente, en la actualidad se
reconoce que la tiroxina, atraviesa la -
placenta en cantidades suficientes como
para proteger al feto hipotiroideo de las
consecuencias de la deficiencia de tiroxina, T4
hasta su detección mediante programas de
screening neonatal TIROIDES T3

Eje Hipotálamo Hipófisis Tiroides

 Fisiología
• Inmediatamente después del parto se produce un
pico de TSH en el neonato durante las primeras
24 horas, supuestamente en respuesta a la
exposición al frío.
• En el recién nacido a término, durante las
primeras 48 horas de vida, la tiroxina circulante
duplica o triplica su nivel en comparación con los
niveles adultos, luego se estabiliza y retorna a los
niveles observados en el cordón en 5 –6 días.
 Secreción de hormonas tiroideas
• Este patrón de respuesta, en el niño
prematuro es menos marcado y se relaciona
inversamente con la inmadurez.
• Las concentraciones de T4 circulante y de TSH
permanecen sobre los niveles de los adultos
durante la lactancia y disminuyen en la niñez
hasta alcanzar las concentraciones de los
adultos después de la pubertad.
Que es lo normal ? Guía NACB Recomendación Nº 69. Valores de
corte de TSH para el screening de neonatos de más de 48 horas de vida.

 TSH en gota de sangre inicial < 10 mUI/L de sangre entera: ninguna

acción posterior

 TSH en gota de sangre inicial 10-20 mUI/L de sangre entera: repetir

la determinación en una segunda gota de sangre.

 TSH en gota de sangre inicial >20 mUI/L de sangre entera: remitir al

niño para su evaluación por el endocrinólogo pediatra.

 Colombia Tamizaje sangre Cordon umbilical.

PUNTO DE CORTE
< 15 mUI/L - μUI/mL
 LIH: Rangos de referencia para TSH y T4L
EDAD Rangos de Rangos de T4L Rangos de T3L
TSH mUI/L - ng/dL pg/mL
µUI/ml
Recién nacidos a 5.17 – 14.6 0.66 - 2.71 1.97 - 7.87
termino 0- 3 días
4 - 30 días 0.43 – 16.1 0.83 – 3.09 1.96 - 5.24

2 - 12 meses 0.62 – 8.05 0.48 – 2.34 1.55 – 6.38

2 - 6 años 0.54 – 4.53 0.85 – 1.75 1.96 – 5.95
7 - 11 años 0.66 – 4.14 0.90 – 1.67 2.68 – 5.16

Adolecentes 0.53 – 3.59 0.93 - 1.6 2.28 – 5.01

12 - 19 años
Adultos Eutiroideos 0.27 – 4.2 0.93 – 1.7 2.0 – 4.4

Reference Range for Adults and children.

Preanalitical Conditions ELECSYS® Thyroid Tests
 LIH: R.R para T4 Totales T3 Totales
EDAD Rangos de T4 Rangos de T3
nmol/L nmol/L

Recién nacidos a 141- 270 1.54 – 11.4

termino 1- 3 días
1 - 4 semanas 105 - 214 1.4 – 4.6

1 - 12 meses 93 - 200 1.6 – 3.8

1 - 5 años 94 -193 1.6 – 4.1
5 - 10 años 82 - 171 1.4 – 3.7
Adolecentes 59 – 154 1.3 – 3.1
12 - 19 años
Adultos Eutiroideos 59 – 154 1.3 – 3.1

Reference Range for Adults and children.

Preanalitical Conditions ELECSYS® Thyroid Tests
 EMBARAZO

• Evaluar cada trimestre en caso de

hipotiroidismo.
• Se deben reportar valores de
referencia para cada trimestre.

TSH uUI/ mL
< 2.5 1er Trim
<3 2do Trim
<3 3er Trim
 FASE PRE-ANALITICA EN SALA DE
PARTOS.
• Diligenciamiento de formato de Solicitud .
• Toma de muestra, secado, conservación.
• Control de calidad de muestras tomadas.
• Remisión o entrega de las muestras al
laboratorio.
 FASE PRE-ANALITICA EN SALA DE
PARTOS.
• Instrucciones de recolección de muestras.
• Estas instrucciones deben estar contenidas en
un manual de recolección de muestras donde
se incluirán instrucciones especificas para la
recolección y manejo apropiados de las
muestras. Este manual será puesto a
disposición de el personal responsable de la
recolección de muestras.
 FASE PRE-ANALITICA EN SALA DE
PARTOS.
• Manual de recolección de muestras:
• El tipo y cantidad de muestra primaria que va a ser
recolectada.( una gota de sangre caída libre en cada
circulo).
• Hora especial de recolección. (De cordón tomar antes de 20
minutos, en sangre sin coagular)
• Alguna condición especial de manipulación entre la hora de
recolección y la de recepción en el laboratorio. (3 horas de
secado, no exponer al calor ,a la luz solar, refrigeración,
transporte).
• Las muestras que carezcan de identificación apropiada NO
deben ser aceptadas NI procesadas por el laboratorio
 FASE PRE-ANALITICA EN EL
LABORATORIO.
• Conservación reactivos a la T° adecuada.
• Lectura del inserto del kit a utilizar
• Reactivos a temperaturas adecuadas para el
procesamiento.
• Lectura diaria de temperatura de refrigeradores,
incubadoras y medio ambiente.
• Revisión de inventarios de recursos y reactivos.
• Personal calificado: capacitación permanente.
• Manual de procedimientos.

Control de calidad de muestras tomadas.

 VARIABLES PREANALITICAS

FACTORES :
 La mayor parte de las variables pre-analíticas tienen poco
efecto en la determinación de TSH. (Anticuerpos heterófilos -
HAMA)
 La presencia de sustancias interferentes en la muestra,
pueden influir en la unión de las hormonas tiroideas a las
proteínas plasmáticas, y así disminuir la exactitud de un
diagnóstico basado en las determinaciones de hormonas
tiroideas totales y libres más que en las de TSH
 Estabilidad de la muestra
TSH -T4L -T3L
Refrigerada 2-8ºC: 7 días
Congelado -20ºC: 1 mes (una sola vez)
TSH
Intervalo de medición:
0.005 – 100 uUI/mL
Valores >100 dil 1/10 >1000 uUI/mL
V.R 0.27 – 4.20 uUI/mL
Limite inferior de detección: 0.005 uUI/mL
Sensibilidad funcional:0.014 uUI/mL
No reacciones cruzadas con LH- FSH-hGH-hCG.
TPO – AC. Tiroglobulina
Refrigerada 2-8ºC: 3 días
Congelada -20ºC: 1 mes
V.R < 34 UI/mL V-R <115 UI/mL
Tiroglobulina
Refrigerada 2-8ºC: 24 horas
Congelada -20ºC: 2 meses
V.R 3.5 -77 ng/mL
Calcitonina
Suero. AYUNO. Libre de lipemia.
Centrifugar, separar y congelar
inmediatamente en tubo plástico estéril.
Congelada -20ºC: 15 días
Valor de referencia:
Mujeres: No Detectable – 11.5 pg/mL
Hombres: No Detectable – 18.2 pg/mL
Anticuerpos Anti Receptor TSH
Suero. AYUNO. Libre de lipemia.
Refrigerada 2 - 8 °C: 3 días
Congelada -20ºC: 1 mes
 Fase Analítica

• Mantenimiento y control de los equipos

• Control de calidad interno de los resultados
obtenidos en el papel de filtro
• Participación en programas de control de calidad
nacionales e internacionales
• Procesamiento y medición de la muestra.
¬ Programa de evaluación externa del desempeño.
¬ Validación de datos
•
 INMUNOENSAYOS

Definición:
• Conjunto de técnicas analíticas que usan
anticuerpos para la determinación selectiva de
ciertos componentes de interés presentes en
muestras biológicas.
• Ensayos altamente selectivos, sensibles de
bajos límites de detección.
• Los IE constituyen los métodos de elección para
múltiples patologías endocrinas.
 INMUNOENSAYO
• Unión competitiva y especifica de un Ag presente en
la muestra del paciente, estándares o controles y un
Ag* marcado, compitiendo por los sitios de unión
con un Ac especifico, posteriormente una etapa de
incubación y separación de las fracciones libres y
ligadas

Antígeno Anticuerpo
 MARCADORES
Definición:

Sustancia conocida e identificable que puede

ser medida en el curso de un procedimiento
que implique una reacción biológica o
inmunoquímica.
 EVOLUCION- TECNOLOGIAS DE
INMUNOENSAYO

RIA: La base.

 Buena sensibilidad
 Largos tiempos para la determinación
 Problemas por la radiación
 Imposibilidad de automatizar completamente.
 RADIOINMUNOANALISIS (RIA)

El antigeno se marca
con radioisótopos I125

INMUNORRADIOMETRIA (IRMA)
El anticuerpo se
marca con I125
radioisótopos
 Evolución en técnicas de Inmunoensayo

FIA / LIA ECLIA

RIA EIA Fluorescence / Electro-
Radioimmunoassay Enzyme Immunoassay Luminescence chemiluminescence
Immunoassay Immunoassay
 CLASIFICACION INMUNOANALISIS
TECNICA MARCADOR - SUSTRATO DETECTOR

RIA  Ag – I-125 CONTADOR DE RAYOS

GAMA

IRMA AC – I-125 CONTADOR DE RAYOS

GAMA

Ag o AC- ENZIMAS LECTOR DE MICROELISA

FOSFATASA ALCALINA -
ELISA PEROXIDASA DE RABANO
 CLASIFICACION INMUNOANALISIS
TECNICA MARCADOR - SUSTRATO DETECTOR

Fluroinmunoanálisis
IFD  Ag – Fluoresceina Microscopio F
IFI  AC – Fluoresceina Microscopio F
FIA  Ag o Ac – Europio Fluorómetro
MEIA  Ac – FAL
⇨ 4 metil umbeliferil fosfato Lámpara de Mercurio

FPIA Ag - fluoresceina Lámpara halógena de

tungsteno
(luz – polarizada)

Luminoinmunoanálisis Ag o AC Luminol Luminómetro

LIA Isoluminol
Esterés de acridino

Quimioluminiscencia Ag o Ac – FAL Luminómetro

QLIA ⇨ Dioxetano - P
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA Rutenio,Osmio,Renio Analizador
EQLIA Microparticulas inmunoensayos
magneticas ECL
 METODOS
• Los ensayos para el screening del HC requieren que se determine la TSH en
pequeñas gotas de sangre de entre 3 y 4 mm de diámetro.
• Los métodos de “tercera generación” IMA para determinar TSH con
sensibilidad funcional de 0,02 mUI/L son adecuados para este objetivo.
• No todos los fabricantes han desarrollado ensayos de TSH para gota de
sangre, ya que se lo considera un mercado especializado y limitado.
• Los ensayos en microplacas que utilizan señales no isotópicas, como el de
fluorescencia de tiempo resuelto, son adecuados para muestras de gotas
de sangre y su uso se encuentra generalizado.
• Una ventaja de estos sistemas es que a medida que se realiza la elución de
la gota de sangre en microplaca, la TSH de la muestra está disponible para
unirse al anticuerpo monoclonal que recubre la pared del pocillo de la
placa.
 FASE ANALITICA
• Ponchado adecuado.
• Pipeteo estandarizado.
• Agitación uniforme.
• Reactivos a temperatura adecuada.
• Procesamiento adecuado.
• Procedimientos debidamente documentados
disponibles en el lugar de trabajo.
• Interpretación del laboratorio.
 FASE ANALITICA
• Fase sólida revestida con anticuerpos
monoclonales anti-cadena B de la TSH.
• Agrega muestra sangre seca para el elución.
• Formación Anticuerpo/TSH/Anticuerpo
• enzima
• Lavado de componentes no fijados.
• Adición de sustrato dando una reacción
proporcional a la concentración de TSH en la
muestra.
 ELISA

+ + Conjugado Ac
Ac anti-TSH Ag Ac-Ag-Ac
ANTI TSH
(control, MARCADO
ENZIMAS
muestra)

INCUBACION
+ LAVADO
INCUBACION SOLUCION STOP O
LAVADO Sustrato FLUORESCENCIA
INTENSIFICADORA
fluorigénico
cromogénico *Marcación mas estable
*Rangos amplios de medida
*Automatización
Características de un analizador
automatizado de inmunoensayo
• Acceso continuo al azar
• Fácil operación
• Capacidad de procesar urgencias
• Curvas standard estables
• Alto número de pruebas por hora
• Fácil sistema de eliminación de desechos
• Capacidad para comunicación con una
interfase bidireccional
 Qué es Quimioluminiscencia?

• Es la generación de radiación
electromagnética en forma de luz
como liberación de energía a partir de
una reacción química.
• La luz puede ser emitida en la región
infrarroja, visible o ultravioleta.
 Pruebas en Sistemas IMMULITE

Principio de la
prueba Centrifugación
sobre el eje vertical
LAVADO
Anticuerpo Monoclonal
Anti TSH
TSH B
B Luminescencia

SUBSTRATO
anti-IgG Humanos/
+ + Fosfatasa Alcalina

ciclo de incubación de
30 minutos
Fosfatasa alcalina ( Emisión de luz prolongada )
Mayor sensibilidad
 Ensayos deTSH

 Primera generación: 1 - 2 uIU/mL

 Segunda generación: 0.1 - 0.2 uIU/mL
 Tercera generación: 0.01- 0.02 uIU/mL
 ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECL- ECLIA)

 Reactivos altamente estables

 Rápidos tiempos de reacción
 Alta sensibilidad
 Amplio rango de medida
 Gran variedad de analitos a
determinar
 No utiliza enzimas
 Marcación no isotópica

 Sensibilidad TSH
incrementada 0.005 uUI/mL

r
 EVOLUCION- TECNOLOGIAS DE
INMUNOENSAYO

ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECL)
Definición:
 Proceso en el cual se generan especies
altamente reactivas a partir de precursores
estables, en la superficie de un electrodo
(CLIA inducida por un proceso eléctrico)
MARCADOR RUTENIO

r
Electroquimioluminiscencia
 TENER en cuenta………
Discordantes
TSH  TSH T4 T3
T3
Heparina

Dopamina Amiodarona

Glucorticoides Medicamentos y Aines-

Dosis elevadas condiciones Furosemida

Anticonvulsivantes Anticonceptivos

Hipoferritinemia Macro TSH

INTERFERENTES
 FASE POST-ANALITICA

• Entrega de resultados.
Localización del paciente.
Hacer rellamado para pruebas confirmatorias.
• Inicio del tratamiento.
PROCEDIMIENTOS POST- ANALÍTICOS.
• El laboratorio de tamizaje resultados a la EPSs
(ARS) ó EPS del niño con copia al laboratorio
clínico donde se atendió́ el parto, si no hay
laboratorio al gerente o director de la IPS.
• La ARS Y EPS debe entregar los resultados al
responsable de promoción y prevención, de la
ARS, EPS ó Salud Pública del servicio seccional de
salud, secretaria de salud departamental o
municipal con el fin de localizar todos los casos
probables para el retamizaje con las pruebas
confirmatorias.
PROCEDIMIENTOS POST- ANALÍTICOS.

• Las ARS Y EPS deben verificar que los recién

nacidos tengan el resultado de TSH, que todos
los casos probables sean retamizados ,y los
casos confirmados sean dirigidos a la consulta
especializada.
• Depende de la oportunidad del resultado el
inicio del tratamiento y evitar las secuelas del
hipotiroidismo no tratado
Pruebas Diagnóstico y Seguimiento

Tamización Ac
T4 total TPO - Tg
AntiTSHr

T4 Libre TSH T3 Total-L

Hipotiroidismo Hipertiroidismo
 Exámenes confirmatorios
• Las mediciones realizadas en eluídos de
papel de filtro no son diagnósticas sino
que tienen valor de screening
solamente son semicuantitativas y los
resultados anormales se deben
confirmar con métodos de rutina
cuantitativos en suero.
• Las muestras de sangre para ensayos
confirmatorios se deben extraer por
punción venosa.
• Algunos programas en Europa
proponen el seguimiento con T4L, TSH
y TPOAb en la madre y en el recién
nacido. TBAb/TSBAb
 Exámenes confirmatorios

• En algunos países se recoge al mismo tiempo una muestra de

sangre de la madre para evaluar la función tiroidea materna.
• Específicamente, los anticuerpos bloqueantes del receptor de
TSH (TBAb/TSBAb) presentes en las madres con hipotiroidismo
(aún cuando estén recibiendo un tratamiento de reemplazo
adecuado con L-T4) pueden provocar hipotiroidismo transitorio
en los recién nacidos (en 1:180.000 neonatos).
 Exámenes confirmatorios

• Importante observar que los niveles de T4L y T4T son más altos
en el período neonatal, los resultados dudosos en niños con
hipotiroidismo leve se deberían interpretar usando intervalos de
referencia relacionados con la edad para cada ensayo específico.
 Casos no Detectados
• Ningún ensayo bioquímico proporciona el 100% de
exactitud diagnóstica y técnica.
• Un estudio en los que el screening se realizó después
de las dos semanas de vida reveló que no se detectó
3% de los casos con las determinaciones de TSH
• Se necesitan recomendaciones para manejar las
implicaciones clínicas, económicas y legales de los
resultados de screening falsos negativos, y considerar
si fuera conveniente realizar un segundo control
obligatorio a las 2 semanas como se hace en algunos
programas.
•
Detección de hipotiroidismo congénito
transitorio (HC)
• Debido a que el HC puede ser transitorio como resultado del
paso transplacentario de los anticuerpos bloqueantes del
receptor de TSH, se recomienda que el diagnóstico se vuelva
a evaluar en todos los casos a los 2 años de edad.
• A los 2 años de edad se debería obtener una muestra de
sangre para T4L Y TSH
• Suspender el tratamiento con L-T4 y volver a evaluar la T4L y
la TSH después de 2 semanas.
• Una tercera evaluación debería efectuarse después de 3
semanas.
• Prácticamente el 100% de los niños con HC verdadero
presentan valores elevados de TSH, después de 2 semanas
de la interrupción del tratamiento.
 Garantía de Calidad
• Todos los programas de screening deberían contar
con un sistema continuo de auditoría y publicar un
informe anual del resultado de esa auditoría.
• De esta forma, se podría realizar una evaluación de
cada aspecto del screening en relación con patrones
de calidad acordados nacionalmente.
• En general los laboratorios cumplen con los
estándares de calidad participan rutinariamente en
programas de control de calidad, las fases pre-y
post-analíticas del screening son las que
habitualmente reciben menos atención.
 VARIABLES POSANALITICAS

 Error de valores de referencia.

 Transcripción y validación de resultados.
 Interpretación de lo medido.
 Tiempo de respuesta.
 No reportados.
Efectos de la edad cronológica sobre
los rangos de referencia de los
ensayos tiroideos
NEONATOS – INFANTES – NIÑOS:
 El eje hipotálamo-hipófisis-tiroideo madura durante la infancia hasta
el final de la pubertad.
 Las concentraciones de TSH y T4L son más altas en niños,
especialmente en la primera semana de vida y durante el primer año.
 No reconocer esto podría provocar la pérdida del diagnóstico o el
subtratamiento de casos de hipotiroidismo congénito.
 Deberían usarse valores de referencia ajustados por edad para todos
los ensayos.

ADULTOS:
 A pesar de que ciertos estudios muestran diferencias leves entre
individuos jóvenes y de mayor edad, no es necesario desarrollar
rangos de referencia ajustados por edad en adultos, para hormonas
tiroideas ni para TSH.
 Diagnóstico: Pruebas Tiroideas

TSH
Hipotiroidismo
Alto

T4 L
T3 T-L
TSH
Hipertiroidismo
Bajo
 Hipotiroidismo Subclínico
TSH
Hipotiroidismo
Alto

T4 y T3 “Normales”
Si sólo se modifica la TSH es subclínico
Falla tiroidea leve o compensada
Am Fam Physician. 2005 Oct 15;72(8):1517-24. Subclinical thyroid disease.
 CONCEPTOS DE CALIDAD
Validación de métodos
 Control de calidad interno
(3ra opinión/independiente)
 Muestras de pacientes: con concentraciones que evalúen parte
baja, media y alta de la curva de calibración. Mayor interés rango de
decisión clínica.
 Calibradores o estándares de concentración conocida.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO (Precisión)
CONTROL DE CALIDAD EXTERNO(Exactitud)
Reactividad cruzada – Falta de paralelismo.
ERROR TOTAL
SEIS SIGMA
 MATRIZ DE CALIDAD ANALITICA 1

SATIS.= SATISFACTORIO
EXCELE.= EXCELENTE
 MATRIZ DE CALIDAD ANALITICA 2

SATIS.= SATISFACTORIO
EXCELE.= EXCELENTE
 Posibles consecuencias de ensayos
RESUMEN tiroideos erróneos.
 Recomendación

 La importancia de la relación entre el laboratorio y los

médicos. Actuar en forma conjunta y eficaz

 Informar introducción o cambio de método.

 Resultado discordante con la clínica del paciente

 Los laboratorios, a su vez, debemos definir, a partir de

nuestros métodos, un perfil de eficiencia óptimo.

 Es importante solicitar a los fabricantes toda la

información necesaria sobre sus productos para poder
elegir el IE con el criterio más adecuado.
 Recomendaciones
• El programa de screening debería asegurar que se
realice un seguimiento de los neonatos con
screening positivo y disponer de mecanismos de
accesibilidad a un diagnóstico experimentado.
• Los laboratorios deberían controlar
cuidadosamente la proporción de resultados
falsos negativos y positivos y se debería contar
con un endocrinólogo pediatra para los controles
de seguimiento que aseguren que se ha realizado
un diagnóstico y un tratamiento correctos.