Artigos Médicos

Ácido-alcalino BALANCE: PAPEL NA CRÔNICA
DOENÇA e desintoxicação
Deanna M. Minich, PhD, FACN, CNS; Jeffrey S. Bland, PhD, FACN
Deanna M. Minich, PhD, FACN, CNS, é o diretor de
Information Integration e Inovação da Metagenics, Inc,
e uma nutricionista clínica na Medicina Funcional
Centro de Pesquisa em Gig Harbor, Wash. Jeffrey S. Bland, PhD,
FACN, serve como cer chefe ciência offi de Metagenics, Inc,
e é presidente da metaproteômica Nutrigenômica
Centro de Pesquisa.
everal pesquisadores notaram que o contemporâneo
Dieta ocidental tem aumentado na net carga ácida em relação ao
dietas dos ancestrais do Homo sapiens pré-agrícolas.
1-3
Muito possivelmente, essa mudança ocorreu por causa da agricultura
revolução e da onipresença de processados
grãos e produtos alimentares shelf-stable desprovidas de essencial nutricional
componentes. Em adição a esta fundamental subjacente
mudança na dieta, há a sobreposição de vários modismos nutricionais que
subiram e caíram ao longo das últimas décadas. Mais recentemente,
a última tendência dieta tem sido um interesse em alimentos de alta proteína
acompanhada por uma diminuição compensatória no fitoquímico
carregar a partir de frutas e vegetais frescos. Com efeito, dietas ricas em proteínas
aumentar a carga de ácido dieta líquida e acidificar a urina pH.2-5
Por outro lado, têm sido propostos dietas ricas em frutas e vegetais
para ser associado com um maior grau de alkalinity.4,6
Remer e Manz calculados os potenciais cargas de ácido renais de certa
grupos de alimentos e informou que os alimentos alcalinizantes foram

principalmente de vegetais e frutas, enquanto alimentos formadores de ácidos foram
derivados de queijo, carne, os peixes, e produtos de grão (Tabela 1) 0,4
Ao longo do tempo, a ingestão de uma carga elevada de ácido alimentar pode progredir
a um nível baixo grau de acidose metabólica crónica. a incidência
de acidose baixo grau resultante de nossa dieta moderna tem
sido bem documented.1-3,6 Uma carga ácida crónica pode causar um
número de condições de saúde, como a osteoporose, doença renal,
e músculo wasting.1,7 Sebastian et al articula esta causa
e efeito de forma eloquente: "A evidência crescente. . . sugere
tal que persiste, apesar de baixo grau, acidose, e o
operação implacável de responder mecanismos de homeostase,
resultado em inúmeros efeitos prejudiciais sobre o corpo, incluindo a dissolução
ao osso, perda de massa muscular, formação de pedra nos rins, e
danos no rim. "1 (p1308)
A fim de manter o equilíbrio ácido-alcalino durante todo o
vários sistemas do corpo, um sistema pode ser requerido para suportar
outro. Por exemplo, a matriz óssea contém uma substancial
reserva alcalina, tais como cálcio e magnésio que são catiões
libertado a partir do osso para equilibrar a carga dietética excessivamente ácido em
o caso de insuficiente capacidade de tamponamento no sangue. No entanto,
empréstimos repetida de reserva alcalina do corpo em resposta a
um aumento (dieta) carga consistente ácido pode ser potencialmente prejudicial.
Nos seres humanos, hipercalciúria e saldo negativo de cálcio
devido ao cálcio effl ux do osso pode levar à óssea metabólica
doença e cálcio nephrolithiasis.2,8,9 No capítulo intitulado
"Potássio" do seu relatório Dietary Reference Intakes para Água,
Potássio, sódio, cloreto e sulfato, o Instituto de Medicina
Food and Nutrition Board afirma o seguinte:
No cenário de uma ingestão inadequada de bicarbonato
precursores, buffers na matriz óssea neutralizar o

excesso de ácido derivado de dieta, e, no processo, osso
torna-se desmineralizada. O excesso de derivado de ácido titula-diet
óssea e provoca o aumento de cálcio na urina e
reduziu a excreção de citrato urinário. O resultante adverso
consequências clínicas são possivelmente maior osso
desmineralização e aumento do risco de calciumcontaining
stones.7 rim (P187)
Por outro lado, a modificação da dieta pode influenciar positivamente
metabolismo ósseo. A neutralização dieta favorecimento de endógeno net
aumenta a produção de ácido de cálcio e fosfato de retenção,
reduz marcadores de reabsorção óssea, e aumenta de marcadores
Ácido-alcalino BALANCE: PAPEL NA CRÔNICA
DOENÇA e desintoxicação
Deanna M. Minich, PhD, FACN, CNS; Jeffrey S. Bland, PhD, FACN
artigo de revisão
TABELA 1 Média de Cargas Ácido Renal Potenciais (PRAL) de Especifi ed Foods4
Food PRAL * (mEq)
Gorduras e óleos 0
peixe 7.9
Frutas e sucos de frutas -3.1
Grãos 3,5-7,0
A carne e os produtos 9.5
Leite e produtos lácteos 1,0-23,6
Legumes -2.8
* PRAL = mEq de Cl + PO4 + SO4 - Na - K - Ca - Mg) ácido-alcalino Equilíbrio Terapias

Alternativas, jul / ago 2007, VOL. 13, NO. 4 63
a formação óssea na pós-menopausa em mulheres.10 Além disso, estudos
têm demonstrado uma associação positiva entre um alto
ingestão de frutas alcalino-ricos e legumes com preservação da
density.6,11,12 mineral óssea

FISIOLOGIA DA ácido-alcalino BALANCE
Do ponto de vista fisiológico, o corpo tem compartimentado
sistemas de órgãos que operam dentro específi co faixas de pH
(Tabela 2) 0,13 O "potencial de hidrogénio," ou "pH", baseia-se numa
escala logarítmica, o que significa que há uma diferença de 10 vezes
entre cada número indo de 1 a 14. Os números mais baixos
(1-6,99) representam o ácido (ou doar H +) gama, e quanto maior
números (7,01-14) representam a alcalina (ou H + aceitar)
range. Para a maior parte, os tecidos do corpo permanecem dentro do neutro
pH de 7. Alguns sistemas do corpo, tais como o sangue (7,35-7,45) são
mais bem regulamentada do que outros (por exemplo, o pH da urina varia de 4.5-
8,0), e qualquer perturbação prorrogado em equilíbrio ácido-alcalino pode
funcionamento da célula virada através do seu transporte e sinalização processes.14-
16 O corpo humano tem vários meios através dos quais ela é capaz de regular
equilíbrio ácido-alcalino, incluindo o seguinte: (1) no
nível celular através de reacções químicas que geram ou que consomem H +;
(2) no sangue, com o auxílio de bicarbonato, aminoácidos,
albumina, globulina e hemoglobina; e (3) sistemicamente através
a libertação de dióxido de carbono dos pulmões e os iões de hidrogénio
do kidney.17
DETERMINAÇÃO DE CLÍNICA ácido-alcalino BALANCE
Embora não seja comum, os níveis de pH do sangue pode mudar para o
lado de acidez ou alcalinidade excessiva, no caso clínico que vários
sintomas aparecerão. Acidose pode levar a sintomas de letargia,
progredindo para estupor e coma, enquanto alcalose pode levar a
uma série de problemas nervosos como cãibras, espasmos musculares, irritabilidade,
e hiperexcitabilidade. Determinação clínica de um elevado
carga de ácido sistémica pode ser realizada por uma série de métodos,
incluindo uma avaliação da dieta diário durante pelo menos 3 a 7 dias para
avaliar o grau de ingestão de proteína de alimentos e animais transformadas

em relação ao consumo de frutas e vegetais e uma medida
do pH urinário utilizando papel indicador de faixa estreita. O pH urinário é um
bom indicador da carga ácida dietético líquido, conforme relatado por Remer
e Manz, que observou uma relação inversa entre o
dois variables.4
O compartimento de urina parece ser bem adaptada
para medir o efeito de factores agudas e crónicas. Em nossa clínica
experiência, temos notado que o pH da urina responde a uma
intervenção dietética em menos de duas horas. Além disso, o facto
que a faixa de pH da urina se estende por uma maior continuidade (4,5-8,0) indica
que tem mais potencial para refl etir mudanças de pH sistêmicas.
Do nosso ensaio, determinou-se que, devido à larga de pH
gama de urina, é importante ter uma amostra de urina em jejum
e para controlar a ingestão de água durante o período de jejum. intrae
a variabilidade inter-individual podem ser ainda mais reduzida se o
mesma pessoa é determinar as leituras de pH de forma consistente.
alcalinização urinária
O conceito de equilíbrio ácido-alcalino no campo da medicina
não é totalmente nova, uma vez que tem sido abraçada por vários grupos
dentro da comunidade médica. Medicina naturopata tem usado
o equilíbrio ácido-alcalino como um modelo teórico para explicar o
fundação de muitas doenças. A medicina alopática examinou
modulação do pH em sistemas de órgãos c Especifi tais como o rim
controlar a formação de cálculos e a eliminação de toxinas. para
exemplo, a alcalinização da urina tem sido parte do protocolo médico
para a gestão e prevenção de stones.18,19 ácido úrico
Outro aspecto do equilíbrio ácido-alcalino é o seu papel na
detoxifi catião, quer através da remoção aguda de uma droga ou veneno
por overdose como um protocolo nutricional para apoiar metabólica
detoxifi catião e diminuir toxinas dietéticas. Alcalinização do pH urinário

é um método utilizado em configurações médicas graves para a
reforçada eliminação de toxinas no caso de uma sobredosagem grave.
Por outro lado, acidifi cação urina também aumenta a eliminação
de especifi c toxinas, embora a um aparentemente menor degree.20,21 A
método pelo qual a alcalinização da urina trabalha para aumentar a toxina
eliminação é pelo processo reconhecido medicamente de "aprisionamento ion",
que é a capacidade de aumentar a excreção urinária de fraco
ácidos na urina alcalina, impedindo a reabsorção de xenobióticos
por tubules.22,23 renal Proudfoot et ai publicada uma posição
documento sobre a alcalinização da urina, aprovado pela American
Academia de Toxicologia Clínica, que descreve o uso de urina
alcalinização ≥7.5 a via de administração intravenosa de bicarbonato de sódio
de intoxicação aguda e toxicity.22 Nesta extensa
avaliação, o efeito de alcalinização urina sobre a excreção de várias
medicamentos e toxinas ambientais é elucidado.
Este relatório afirma que "a alcalinização da urina aumenta a urina
eliminação de clorpropamida, ácido 2,4-diclorofenoxiacético,
difl UNISAL, fl uoride, mecoprop, metotrexato, fenobarbital e
salicilato. "22 O potencial de alcalinização da urina para melhorar
excreção de toxinas é exemplifi ed pelo trabalho de branco e Wolffram,
em que eles modulada pH da urina em suínos com 2% de sódio na dieta
bicarbonato, alterando o pH da urina de 5,7 ± 0,2 e 8,3 ± 0,1,
e impactou favoravelmente a excreção de ocratoxina A, uma micotoxina,
de 9,3 ± 1,9% para 22,2 ± 4,3% do dose.24 Além disso, experimental
e estudos clínicos rm confi que a alcalinização da urina é
eficaz para salicilato poisoning.23,25,26 Garrettson e Geller
em seres humanos mostraram que um aumento no pH da urina 6,1-8,1
mudou a depuração renal de salicilato de 0,08 ± 0,08 L / h de
1,41 ± 0,82 L / h.23
Portanto, se a rápida remoção de toxinas podem ser alcançado para

em grande medida, com o aumento do pH da urina 2 pontos sobre o sca pH
(que corresponde a uma redução de 100 vezes em iões H +), que seria
siga que quantidades mais pequenas de toxinas podem ser removidos em uma prolongada
base se não houvesse um aumento de pH da urina subtil no
direcção alcalina. Devido à escala logarítmica de pH, um pequeno
variação do pH da urina poderia ter um efeito desproporcionadamente grande
em drogas e xenobióticos clearance.22 O conceito de "progressista"
contra alcalinização rápida de urina pode ser útil como um adjuvante
abordagens para a saúde integrativa empregando detoxifi metabólica -
cação usando específi co protocolos (nutricionais). Tradicionalmente, funcional
medicina abordou cação detoxifi ou a remoção de
substâncias endo- ou exógenos nocivos, desde o aspecto de
hepática de fase I e fase de regulação alta enzimas II para permitir que o
biotransformação química de toxinas em metabolitos solúveis em água
para excreção na urina. Com o procedimento clínico adicional
de alcalinização da urina, a remoção destes compostos a partir da
corpo é acelerada. Há muitos agentes dietéticos para auxiliar na
alcalinização progressiva. Os alimentos que são ricos em potássio são
digno de nota (Tabela 3) .27 Uma abordagem para implementar clinicamente
estas estratégias para detoxifi metabólica cação envolve iniciar
o paciente em uma dieta de eliminação rica em frutas inteiras e crucíferos
vegetais e pobre em proteína animal. Para além de potássio,
vegetais crucíferos contêm fitoquímicos inumeráveis,
tais como indol-3-carbinol e sulforafano, que são essenciais
para facilitar a toxina biotransformation.28-30 Além disso, estes
legumes podem alkalize favoravelmente o pH da urina. Em um estudo piloto com 5
voluntários, descobrimos que um 200 g porção de brócolis cozido, cenoura,
e caulifl ower (com brócolis como o vegetal predominante)
resultou num aumento na urina por alcalinização até 4
horas depois (pH = 6,20 ± baseline 0,51; depois de legumes =

6,91 ± 0,45; P = 0,01). Assim, a instrução simples de alterar a dieta
incluem vegetais crucíferos podem promover a desintoxicação por
fase II de regulação alta enzimas e por alcalinizantes urina, resultando
na excreção de toxinas melhorada.
Além disso, durante a desintoxicação alcalinização metabólica
podem ser particularmente úteis, pois acredita-se que o pH e celular
a mudança de sistema de tamponamento do sangue para o lado ácido de pH ideal
reserva durante detoxifi cação devido ao aumento da circulação de xenobióticos
e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido glucurónico). Além disso,
transportadores de catiões orgânicos que são responsáveis pelo transporte
de xenobióticos dentro e fora da célula são pH-sensitive.31,32
agentes alcalinizantes
Além de mudanças na dieta, suplementação nutricional
para um curso de curto prazo de 3 a 4 semanas com seleccione botânicos pode
facilitar metabólica cação detoxifi. Seria oportuno
c incluem agentes alcalinizantes específi cos, como o potássio, dentro deste
regime nutricional (Tabela 3). Infelizmente, o mainstream
Dieta americana é pobre em potássio, já que muitas vezes carece de sufi ciente
frutas e legumes. A ingestão adequada (AI), criada pelo
Conselho de Administração do Instituto de Medicina de Alimentação e Nutrição
de potássio, 4,7 g por dia, 7
que é a mesma quantidade que é
encorajada pelas aproximações dietéticas para parar a hipertensão
(DASH) dieta para manter os níveis de pressão arterial, diminuir
os efeitos da ingestão de sal, diminuir o risco de pedras nos rins, e
possivelmente reduzir a incidência de perda óssea. mediana atual
ingestão de potássio nos Estados Unidos são aproximadamente 35% e
50% abaixo da AI para homens e mulheres, respectivamente7
africano
Americanos seria particularmente benéfica à t do aumento de potássio

ingestão devido aos seus consumos relativamente baixos de potássio e altas
prevalência de pressão arterial elevada e sensitivity.7 sal
pela
população saudável, a ingestão de potássio em níveis mais elevados do que o
AI não de risco particularmente elevado é devido à capacidade dos rins de
excretar o excesso de amounts.7
No entanto, a ingestão de potássio devem ser
monitorados de perto para pacientes com insuficiência renal aguda ou crônica
e doença cardíaca pré-existente e para aqueles em uso de medicações que
aumentar as reservas de potássio no corpo, tais como potassiumsparing
medications.7
Vários sais de potássio estão disponíveis para alterar o pH da urina.
Estudos utilizando a administração de bicarbonato de sódio revelam pouco
efeito sobre a excreção urinária de cálcio em contraste com os estudos que
bicarbonato de potássio usado ou citrato de potássio suplementação
e encontrou significativa citrato de potássio reductions.33,34, uma
regime terapêutico para prevenir pedras nos rins, pode efetivamente
alkalize urina. As doses de 4 a 8 g por dia, durante 2 semanas em doentes com
cystinuria homozigotos têm urine.35 efetivamente Alcalinizado
Além disso, há um certo número de estudos sobre a utilização de potássio
citrato de contrariar a reabsorção óssea causada pela acidemia crônica
de diets.36-38 rica em proteínas
Os efeitos de potássio depender da sua acompanhante
anion.7
O cloreto de potássio, comumente utilizado em alimentos processados
produtos, não parece ter a mesma capacidade alcalinizante como
citrate.7 potássio
Em um estudo recente, Jehle et al demonstraram
que o citrato de potássio efi foi mais do que o cloreto de potássio cacious
no aumento da densidade mineral óssea em pós-menopausa

mulheres com osteopenia.39 Além disso, o cloreto de potássio conduziu
a diminuição da densidade mineral óssea da coluna lombar.
Suplementação de citrato de potássio nestes indivíduos resultou em uma
redução de escala sustentado e signifi na excreção urinária de cálcio
e um aumento na excreção urinária de citrato, indicando que a alcalinização
teve occurred.39,40
Além disso, o anião citrato pode ser especialmente relevante para
detoxifi catião, uma vez que é um intermediário do ciclo de Krebs e
podem potencialmente desempenhar um papel na produção de energia. Como muitos clínicos
reconhecer a partir de sua experiência, falta de energia é comum
efeito colateral das fases primeiras de metabólica cação detoxifi.
TABELA Content 3 Potássio do Foods27 Selecionado
Servir alimentos de potássio (mg)
Batata, cozida com pele 1 médio 721
Prunes, seco ½ xícara 633
Passas ½ xícara 598
Prune suco de 6 fl oz 530
Feijão, cozido ½ xícara 478
Banana 1 médio 467
Acorn squash, cozidos ½ xícara (cubos) 448
Suco de tomate 6 fl oz 400
Laranja 1 médias 237Acid-alcalinas Equilíbrio Terapias Alternativas, jul / ago 2007, vol. 13, NO.
4 65
Portanto, comer alimentos que são ricos em citrato, como certa
frutas e legumes, pode ser cial benefi. Também é digno de nota
que o citrato é metabolizado e bicarbonato no corpo, assim
adicionando mais potential.7 tamponamento
RESUMO
Em conclusão, a carga de ácido alimentar crescente no contemporâneo

dieta pode levar a uma ruptura na homeostase ácido-alcalino
em vários compartimentos do corpo e, eventualmente, resultar numa
doença crônica através de empréstimos repetida de alcalino do corpo
reservas. Ajuste de alcalinidade tecido, particularmente dentro
os túbulos proximais do rim, pode levar à excreção mais eficaz
de toxinas do corpo. Catião detoxifi metabólica utilizando um
dieta rica em vegetais, em conjunto com a suplementação de um
composto eficaz alcalinizante, tal como o citrato de potássio, pode
deslocar as reservas do corpo para se tornar mais alcalino.
Agradecimentos
Agradecimentos especiais para aqueles indivíduos que comentou este manuscrito, incluindo
Gary Darland,
PhD; Bhaskar Shenai, PhD; Robert Lerman, MD, PhD; e Barbara Schiltz, MS, RN, CN.
Referências
1. Sebastian A, Frassetto LA, Sellmeyer DE, Merriam RL, RC Morris Jr. Estimativa da
carga ácida líquida da dieta de ancestrais do Homo sapiens pré-agrícola e sua hominídeo
antepassados. Am J Clin Nutr. 2002; 76 (6): 1308-1316.
2. Maurer M, Riesen W, Muser J, Hulter HN, Krapf R. Neutralização dieta ocidental
inibe a reabsorção óssea, independentemente da ingestão de K e reduz a secreção de cortisol
seres humanos. Am J Physiol Renal Physiol. 2003; 284 (1): F32-40.
3. Frassetto LA, Todd KM, Morris RC Jr, Sebastian A. Estimativa de noncarbonic endógena net
produção de ácido em humanos a partir de dieta de potássio e proteína. Am J
Clin Nutr. 1998; 68 (3): 576-583.
4. Remer T, Manz F. carga ácida renal Potencial de alimentos e sua infl uência sobre o pH da
urina. J Am
Assoc Diet. 1995; 95 (7): 791-797.
5. Reddy ST, Wang CY, Sakhaee K, L Brinkley, Pak CYC. Efeito da highprotein de baixo
carboidrato
dietas sobre o equilíbrio ácido-base, a propensão de formação de pedra, e metabolismo do

cálcio.
Am J Kidney Dis. 2002; 40 (2): 265-274.
6. Tucker KL, Hannan MT, Kiel DP. O ácido-base hipótese: dieta e osso na
Framingham Osteoporosis Study. Eur J Nutr. 2001; 40 (5): 231-237.
7. Instituto de Medicina da Academia Nacional de Ciências. De potássio. In: Dietary
Doses de referência para água, potássio, sódio, cloreto e sulfato. Washington, DC:
National Academies Press; 1994: 186-268.
8. verde J, Kleeman CR. Papel do osso na regulação do equilíbrio ácido-base sistêmica. rim
Int. 1991; 39: 9-26.
9. Brenner RJ, Primavera DB, Sebastian A, et al. Incidência de osso radiograficamente evidente
doença, nefrocalcinose e nefrolitíase em vários tipos de acidose tubular renal.
N Engl J Med. 1982; 307 (4): 217-221.
10. Sebastian A, Harris ST, Ottaway JH, Todd KM, Morris RC Jr. equilíbrio mineral melhorado
e metabolismo do esqueleto em mulheres pós-menopausa tratadas com bicarbonato de

potássio.
N Engl J Med. 1994; 330 (25): 1776-1781.
11. Tucker KL, Hannan MT, Chen H, Cupples LA, Wilson PW, Kiel DP. De potássio, de magnésio
e ingestão de frutas e vegetais estão associados com maior densidade mineral óssea
em homens e mulheres idosos. Am J Clin Nutr. 1999; 69 (4): 727-736.
12. Sellmeyer DE, Stone, KL, Sebastian A, Cummings SR. Uma elevada proporção de animais
dietético
a proteína vegetal aumenta a taxa de perda de massa óssea e risco de fractura na pós-
menopausa
mulheres. Estudo das fraturas osteoporóticas Group. Am J Clin Nutr.
2001; 73 (1): 118-122.
13. AL Lehninger. Bioquímica: A Base Molecular da Estrutura e função celular. 2nd ed.
New York: Worth Publishers, Inc; 1977.
14. Charoenphandhu N, Tudpor K, Pulsook N, Krishnamra N. acidose metabólica crónica
estimulou a transcelular e transporte de cálcio induzida por arrasto solvente no duodeno
ratos do sexo feminino. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006; 291 (3): G446-455. Epub
2006 04 de maio.
15. Nijenhuis t, Renkema KY, Hoenderop JG, Bindels RJ. Equilíbrio ácido-básico determina a
expressão renal de proteínas de transporte de Ca2 + e Mg2 +. J Am Soc Nephrol.
2006; 17 (3): 617-626.

16. Bailey JL, Zheng B, Hu Z, Preço SR, Mitch WE. A doença renal crônica causa defeitos no
sinalização através do substrato do receptor da insulina / fosfatidilinositol 3-quinase / Akt
via: implicações para a atrofia muscular. J Am Soc Nephrol. 2006; 17 (5): 1388-1394.
17. Thomas L ed. Clinical Laboratory Diagnostics: Use e Avaliação do Laboratório de Análises
Clínicas
Resultados. 1ª ed. Frankfurt, Alemanha: TH-Books; 1998.
18. Preminger GM, Harvey JA, Pak CY. Comparada cacy efi de citrato de potássio "specifi c"
terapia contra o tratamento conservador em litíase renal de leve a moderada
severidade. J Urol. 1985; 134 (4): 658-661.
19. Pak CY, Sakhaee K, Fuller CJ. Correção e prevenção fisiológico e físico-química
de formação de cálculos de cálcio por terapia de citrato de potássio. Trans Am Assoc
Physicians. 1983; 96: 294-305.
20. Simpson GM, Khajawall AM. Acidificantes urinários em fenciclidina desintoxicação.
Hillside J Clin Psychiatry. 1983; 5 (2): 161-168.
21. Nahata MC, Cummins BA, McLeod DC, Schondelmeyer SW, Butler R. Efeito da urinária
ers acidifi sobre a concentração de formaldeído e efi cácia com terapia methenamine. Eur
J Clin Pharmacol. 1982; 22 (3): 281-284.
22. Proudfoot AT, Krenzelok EP, Vale JA. Documento de Posição sobre a alcalinização da urina.
J Toxicol
Clin Toxicol. 2004; 42 (1): 1-26.
23. Garrettson LK, Geller RJ. Ácido e diurese alcalina: Quando eles são de valor no
tratamento de envenenamento? Saf Drogas. 1990; 5 (3): 220-232.
24. Em branco R, Wolffram S. alcalinização do pH urinário acelera a excreção renal de

ocratoxina
A em porcos. J Nutr. 2004; 134 (9): 2355-2358.
25. Vree TB, Van Ewijk-Beneken Kolmer EW, Verwey-Van Wissen CP, Hekster YA. efeito de
pH urinário sobre a farmacocinética do ácido salicílico, glicina e com a sua glucuronido
conjuga em humano. Int J Clin Pharmacol Ther. 1994; 32 (10): 550-558.
26. Proudfoot AT, Krenzelok EP, Brent J, Vale JA. Faz aumentar a alcalinização da urina
salicilato
eliminação? Se sim, por quê? Rev. Toxicol 2003; 22 (3): 129-136.

27. Banco de Dados USDA / ARS Nutrient Dados Food Laboratory. Disponível em: http:
//www.nal.
usda.gov/fnic/foodcomp/search/. Acessado em 01 de junho de 2007.
28. Nho CW, Jeffery E. A regulação positiva sinérgica de fase II enzimas detoxifi cátions por
produtos de degradação em glucosinolatos em vegetais crucíferos. Toxicol Appl Pharmacol.
2001; 174 (2): 146-152.
29. Steinkellner H, Rabot S, Freywald C, et ai. Efeitos de vegetais crucíferos e os seus
constituintes sobre as enzimas que metabolizam drogas envolvidas na bioactivação de

DNAreactive
carcinógenos alimentares. Mutat Res. 2001; 480-481: 285-297.
30. JW Fahey, Talalay P. enzimas antioxidantes do sulforafano: um potente indutor da Fase II
enzimas cátions detoxifi. Food Chem Toxicol. 1999; 37 (9-10): 973-979.
31. Doce DH, Pritchard JB. rOCT2 é portadora-driven potencial basolateral, não um orgânica
resina de permuta catiónica / protão. Am J Physiol. 1999; 277 (6 Pt 2): F890-F898.
32. Fujita T, TJ Urban, Leabman MK, Fujita K, Giacomini KM. Transporte de drogas no
rim pelo cátion transportador orgânico humano, OCT2 e suas variantes genéticas. J
Pharm Sci. 2006; 95 (1): 25-36.
33. Lemann J Jr, Cinza RW, Pleuss JA. O bicarbonato de potássio, mas não o bicarbonato de
sódio,
reduz a excreção urinária de cálcio e melhora o equilíbrio de cálcio em média saudável.
Kidney Int. 1989; 35 (2): 688-695.
34. Sakhaee K, Nicar M, Encosta K, Pak CY. Efeitos contrastantes de citrato de potássio e de
sódio
terapias químicas sobre citrato urinário e cristalização de sais formadores de pedra.
Kidney Int. 1983; 24 (3): 348-352.
35. Fjellstedt E, Denneberg T, Jeppsson JO, Tiselius HG. Uma comparação dos efeitos de
citrato de potássio e bicarbonato de sódio na alcalinização de urina em homozigotos
cystinuria. Urol Res. 2001; 29 (5): 295-302.
36. MARANGELLA M, Di Stefano M, Casalis S, S Berutti, D'Amelio P, Isaia GC. efeitos de
citrato de suplementação de potássio sobre o metabolismo ósseo. Calcif Tissue Int.
2004; 74 (4): 330-335.
37. Sakhaee K, Maalouf NM, Abrams SA, Pak CY. Efeitos de potássio alcalino e cálcio
suplementação sobre a remodelação óssea em mulheres na pós-menopausa. J Clin Endocrinol
Metab. 2005; 90 (6): 3528-3533.
38. Sellmeyer DE, Schloetter M, citrato de potássio Sebastian A. evita aumento de urina
a excreção de cálcio e a reabsorção óssea induzida por uma dieta de cloreto de sódio alta. J
Clin
Endocrinol Metab. 2002; 87 (5): 2008-2012.
39. Jehle S, Zanetti A, J Muser, HN Hulter, Krapf R. A neutralização parcial do acidogênico
Dieta ocidental com citrato de potássio aumenta a massa óssea em mulheres na pós-
menopausa
com osteopenia. J Am Soc Nephrol. 2006; 17 (11): 3.213-3.222.
40. Trivedi B, Tannen RL. Efeito da acidose respiratória no pH intracelular do proximal
túbulo. Am J Physiol. 1986; 250 (6 Pt 2): F1039-1045.
Em conclusão, a carga de ácido alimentar crescente no contemporâneo
dieta pode levar a uma ruptura na homeostase ácido-alcalino
em vários compartimentos do corpo e, eventualmente, resultar numa
doença crônica através de empréstimos repetida de alcalino do corpo
reservas. Ajuste de alcalinidade tecido, particularmente dentro
os túbulos proximais do rim, pode levar à excreção mais eficaz
de toxinas do corpo. Cação detoxifi Metabólica usando um efeito anticâncer de água alcalina
reduzida
Kyu-Jae LEE1,2, Seung-Kyu PARK1,2, Jae-Won KIM1
, Gwang-Young KIM1
, Young-Suk RYANG5
, Geun-Ha
KIM 1, Hyun-Cheol CHO3
, Soo-Kie KIM2,3, e Hyun-Won KIM2,4
1 Departamento de Parasitologia, 2 Instituto de Ciências Médicas Básicas, 3 Departamento de

Microbiologia, 4 Departamento de Bioquímica da Faculdade de Wonju
Medicina, Yonsei Univ. (Wonju, Coreia do Sul)
5Dept. of Biomedical Science Laboratory e do Instituto de Ciências da Saúde da Faculdade de

Ciências da Saúde, Yonsei Univ. (Wonju, Coreia do Sul)
Resumo: Alguns minerais podem produzir alcalina reduzida água com pH elevado e de
oxidação-redução baixo
potencial (ORP) quando dissolvido em água. Alkaline água reduzido (ARW) mostrou efeito
significativo anticancerígeno.
Quando as células de melanoma B16 foram inoculadas por via subcutânea e intra-
peritonealmente, C56BL / 6 ratos alimentados com
ARW mostrou tumor atraso de crescimento e da margem de sobrevivência foi alongado de

forma significativa. ARW também mostrou a
inibição de metástases através da redução do número de colónias de melanoma B16 quando

injectado através da veia da cauda.
A quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi muito reduzida quando alimentados
com ARW exceto para baço,
que é um órgão importante para a imunidade. Mesmo para os ratos normais, a ingestão de
ARW invocado citocinas sistêmicas, tais
como, do tipo Th1 (IFN-γ, IL-12) e Th2 (IL-4, IL-5), sugerindo uma forte efeito de imuno-
modulação. ambos ROS
efeito e efeito imuno-modulação limpeza pode ser responsável por efeito anticancerígeno de
alcalino
água reduzida.
Palavra-chave: alcalina reduzida água, efeito anticancerígeno, antioxidante, imuno-modulação
1. Introdução
Espécies reativas de oxigênio (ROS) ou radicais livres são
um dos grandes criminosos de tornar o dano oxidativo ao
macromoléculas biológicas. Estes ROS são instáveis
conhecido por causar ou agravar uma variedade de incurável
doenças como o cancro, doenças cardiovasculares, neurodegenerativas
doenças, bem como o envelhecimento de 1, 2)
Os radiais-catadores celulares, tais como superóxido
dismutase, catalase, glutationa peroxidase são naturais
sistema de defesa contra ROS. Fonte externa de
proteção antioxidante incluem vitaminas antioxidantes C
e E, caroteno e carotenóides, bem como sais minerais tais
como selênio e zinco. Grandes esforços têm sido feitos em um

tentar encontrar antioxidantes naturais seguras e potentes.
Água consiste de 70% de corpo humano. alcances de água
todos os tecidos do corpo humano dentro de 30 minutos após
beber. Ele ainda flui através barreira hematoencefálica com
nenhum obstáculo, e não tem quase nenhum efeito colateral. Se a própria água
poderia funcionar como um captador de radicais, que seria ideal
antioxidante 3)
Recentemente, electrolisado-reduzida de água com pH elevado
e significativo potencial redox negativo (ORP) foi
demonstrado que têm atividade SOD-like e catalase-like
actividade, e portanto, limpar as espécies de oxigénio activas e
protegem o ADN contra danos por radicais livres de oxigénio in vitro 4)
Nós desenvolvemos uma combinação mineral para produzir
alcalina reduzida água (ARW) com pH elevado e baixo
ORP similar à água electrolyzed-reduzida. o mineral
combinação era fácil de realizar e menos dispendioso do que
o sistema de produção de água electrolyzed-reduzida.
Presente artigo demonstra efeito anticancerígeno de
alcalina reduzida de água em modelo animal.
Hyun-Won KIM, Ph.D., Departamento de Bioquímica da Faculdade Wonju
de Medicina, Yonsei Univ., Wonju 220-701, Coréia.
Telefone + 82-33-741-0283, Fax. + 82-33-743-0411
E-mail kimhwbio@wonju.yonsei.ac.kr
2. Materiais e Métodos
Alkaline Redução da Água (ARW)
ARW foi feita colocando combinações minerais
em garrafa de água. O pH da água foi aumentada até
10,5 e ORP foi diminuída até -200mv. o mineral

conteúdo de ARW foram também aumentadas tempo dependente.
Animais e Células
Murganhos C57BL / 6 (4-5 semanas de idade) foram obtidos a partir de
a Daehan Bio link Co., Ltd. (Chungbuk, Coreia do Sul), e
mantido em ração padrão e água da torneira até assumir
ARW. Rato linhas celulares de melanoma B16 foram mantidas
em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)
suplementado com 5% de bovino fetal inactivado pelo calor
soro (FBS) numa atmosfera humidificada de 95% de ar-5%
CO2 a 37 ° C. A linha celular B16 de alta metastático era
isolado a partir do pulmão de murganhos C57BL / 6 de rato, que tinha
foram inoculados por via intraperitoneal com células B16. células
foram clonadas por métodos de diluição limitantes e
seleccionado clonado foram inoculados em ratinhos. este método
Repetiu-se três vezes, e o clone final com elevado
potencial metastático foi obtido como B16-BL6
células de melanoma.
In Vivo Avaliação do Efeito anti-metastática
Células de melanoma B16-BL6 em cultura foram colhidas
com 2 mM de EDTA em PBS, e depois lavou-se três vezes
com PBS. 1 × 106
Células de melanoma B16-BL6 foram
injectados intravenosamente na veia da cauda de controlo e ARWadministered
Murganhos C57BL / 6. Após 20 dias, os ratos foram
sacrificados e os pulmões foram recolhidos para contagem do
colônias de células de melanoma B16-BL6 metástases.
Em Suppression Vivo de Crescimento do Tumor
Células de melanoma B16-BL6 em cultura foram colhidas
com 2 mM de EDTA em PBS, em seguida, lavada três vezes com
PBS. 1 × 106
Células de melanoma B16-BL6 foram
subcutaneouly injectada na parte de trás de C57BL / 6 mouse.
O comprimento do eixo longo e curto do tumor eram
medida todos os dias e os volumes foram calculados
utilizando a fórmula AB2
/ 2, onde a é o comprimento de longo
b eixo e o comprimento do eixo menor. Curva de sobrevida foi
plotados utilizando o método de Kaplan-Meier.
Alkaline água reduzido (ARW) mostrou efeito significativo anticancerígeno.
Quando as células de melanoma B16 foram inoculadas por via subcutânea e intra-
peritonealmente, C56BL / 6 ratos alimentados com
ARW mostrou tumor atraso de crescimento e da margem de sobrevivência foi alongado de

forma significativa. Cytokine ELISA
As concentrações de citocinas a partir de ratinhos foram soros
medida pelo método de ELISA sanduíche convencional. A
anticorpo de revestimento e de captura biotinilado foi comprado
formar Pharmingen (EUA): clones JES5-2A5 e JES5-
16E3 para IL-4, e clones R4-6A2 e XMG1-2 para IL5,
respectivamente. Revestimento em 96 poços de placas de microtitulação foi
realizado com 250 g de anticorpo de revestimento. Amostra Sera,
anticorpo de captura biotinilado, o anticorpo secundário e
então streptavidinylated HRP foi adicionado sequencialmente,
incubadas e lavadas. o-fenilenodiamina solução foi
adicionado para o desenvolvimento e ácido sulfúrico 2N para parar a
desenvolvimento. A absorvância a 490 nm foi medido
com leitor de ELISA a 490 nm.
ROS Assay
A quantificação de citosólica ROS foi medida por
método de oxidação do 2 ', 7'-dichlorofluroscein-diacetato
(DCF-DA), tal como descrito em elsewhere5). 12,5 M DCFDA
foi incubada com o fígado, baço, pulmão, cérebro ou

homogeneizado e alteração de fluorescência foi medida a
485 nm de comprimento de onda de excitação e 585 nm de emissão
comprimento de onda. A unidade de fluorescência relativa (RFU) foi
calculado para 1 mg de proteína em homogeneizado.
3. Resultados
Efeito de ARW no crescimento do tumor e o tempo de sobrevivência
O crescimento do tumor foi significativamente reduzida em ARW Fed
grupo. Depois de 10 dias a partir da injeção subcutânea de
Células de melanoma B16 em flanco de ratinhos C57BL / 6, tumor
massa era palpável e, posteriormente, em série medido. em
10 dias o tamanho do tumor era de 0,27 cm3
para ARW alimentados grupo,
enquanto que a de torneira de água tratada grupo foi de 0,48 cm3
. em
O tamanho do tumor dia 19 era 3,32 cm3
para ARW alimentados grupo,
e 6,02 cm3
para o grupo controle, mostrando 54% de inibição
A taxa de sobrevivência também foi monitorada após intraperitoneal
injecção de células de melanoma B16 de ratinhos C57BL / 6. ARW
alongou tempo médio de sobrevida de 36 dias para controle
grupo de 44 dias para ARW grupo alimentado.
Avaliação da atividade antimetastática de ARW em
metástases pulmonares de B16
Após a injecção intravenosa de células de melanoma B16 de
Murganhos C57BL / 6 por meio da veia da cauda, a actividade anti-metastática
de ARW foi avaliada. 15 dias após a injecção, os ratos
foram sacrificados. Os tecidos do pulmão foram removidos, e
as lesões metastáticas foram comparados. ARW grupo Fed
tinham menos lesões metastáticas. 257 colônias negras eram

contou com os pulmões de grupo ARW e 145 pontos negros
foram mostrados no grupo controle, indicando 44%
inibição contra a metástase de células de melanoma.
Como é conhecido de células de melanoma para expor aumentada
estresse oxidativo que pode apoiar a progressão da
metástase, concentração de ROS também foi medida para
cada órgão do mesmo melanoma B16 ratinhos injectados
usando DCFH-DA (Fig. 1). Quantidade de ROS para o pulmão,
fígado e rins eram muito baixos em ARW alimentados ratos
em comparação com a de controlo. No entanto, o baço, o que
é um órgão importante para a imunidade, mostra muito alto ROS em
ARW grupo alimentado. Isto pode sugerir o imune
impulsionar efeito de ARW.
Figo. 1. Efeito das ARW em ROS limpeza em camundongos.
Avaliação do efeito de imuno-regulação de ARW
Ingestão ARW invocado citocinas sistêmicas, tais como,
Th1 (IFN-y! IL-12), citocinas para a imunidade celular e
Th2 (IL-4, IL-5), citocinas para a imunidade humoral (Fig.
2). Isto sugere que ARW e estimula tanto celular
imunidade humoral. Th1 e Th2 atingiu pico máximo
após duas semanas de alimentação ARW e voltou para
linha de base. Os níveis de citocinas da água alimentados controle torneira
permaneceu na linha de base.
20
40
06
80
100
120
140
0123456
W eek
C o n cen tratio n p g / m l
IN F -r
IL -1 2
IN F -r co n tro l
IL -1 2 co m tro l
50
100
150
200
250
0123456
W e ek
C o n c e n tra ç ã p g / m l
IL -4
IL -5
IL -4 con trolo
IL -5 con trolo
Figo. 2. cinética horário em concentrações séricas de Th1
e citocinas Th2 em ratinhos de controlo ou ARW injectado
com B16-BL6 de melanoma cells.4. DISCUSSÃO
Recentemente, electrolisado-reduzida de água com pH elevado
e potencial redox negativo significativo mostrou-
têm atividade SOD-like e atividade catalase-like, e
assim, ROS limpar e proteger o ADN de danos pela
radicais de oxigênio in vitro. Se ARW está realmente na qualidade de
antioxidantes e protege o ADN contra danos, que pode ser

a hipótese de que a ingestão de ARW seria possível
mostrar efeito anticancerígeno.
O presente inquérito demonstra a anticâncer
efeito de ARW. Ingestão ARW retardou o crescimento do tumor,
e inibiu a metástase intravenosa, levando a
período prolongado de sobrevivência em camundongos injetados melanoma B16.
De células de melanoma B16 é um dos tumores mais frequentes em
seres humanos e é caracterizado pela sua elevada capacidade de
invasão e metastasis6, 7). Eles escapar imune
vigilância e espalhou mais rapidamente do que qualquer outra
tumores utilizando vários mecanismos, incluindo a regulação negativa do MHC,
crescentes espécies reativas de oxigênio (ROS)
níveis, e assim, acelerar a progressão da metastasis8)
Nosso estudo demonstrou que ARW não só atua como um
antioxidante, mas também actua como um forte immnuo-moduator,
ambos os quais podem ser responsáveis para a anticancerígeno
efeito. Assim, ARW está prevista para ser eficaz para o
várias doenças resultantes da baixa imunidade e / ou
espécies reactivas de oxigénio elevadas, bem como para o
prevenção do cancro.
ARW não só tem um pH elevado e baixo ORP, mas também
conter alguns ião magnésio. Recentemente, foi o magnésio
demonstrou ser eficaz para a prevenção de diversos
diseases8). Não podemos excluir a possibilidade de que o
magnésio em ARW pode ter contribuído para o
efeito anti-cancro.
Água atinge todos os tecidos do corpo humano dentro de 30
minutos depois de beber. Ele ainda flui através do cérebro do sangue
barreira com nenhum obstáculo, e não tem quase nenhum efeito colateral.
Tomando ARW poderia ser uma maneira ideal para manter a saúde.
referências
1) Feig, DI, Reid, TM, e Loeb, LA: Reactive Oxygen
Espécies em Tumorigênese, Cancer Res., 54: 1890-1894,
De 1994.
2) Reid, TM e Loeb, LA: Especificidade de mutagênicos
Radicais oxigênio produzido por leucemia humana células.
Cancer Res., 53: 1082-1086, 1992.
3) Kim, HW: The Reason of todas as doenças, Definição de
Oxigênio Ativo, "a melhor água para o corpo humano", 60-62,
Seul, Seojiwon Press, 2002.
4) Shirahata, S., Kabayama, S., Nakano, M., Miura, T.,
Kusumoto, K., Gotoh, M., Hayashi, H., Otsubo, K.,
Morisawa, S., e Katakura, Y .:-electrolyzed reduzida Água
Scavenges espécies ativas de oxigênio e protege o DNA de
O dano oxidativo. Biochem. Biophys. Res. Commun, 234.:
269-274, 1997.
5) Kim, SH, HJ, C., Kang, DH, Song, GA, Cho, M.,
Yang, US, Kim, HJ, e Chung, obrigatório HY NF-kB
actividade de ciclo-oxigenase-2 e expressão em persistente
Tratadas com CCL4 lesão de fígado de rato. J Med Sci Kor, 17: 193-200,
De 2002.
6) Hofmann, UB, Westphal, JR, Van MUIJEN, GN, e
Ruiter, DJ das metaloproteinases da matriz em melanoma humano.
J Invest Dermatol, 115: 337-344, 2000.
7) Shah, AH, Tabayoyong, WB, Kundu, SD, Kim, SJ,
Paris, LV, Liu, VC, Kwon, E., Greenberg, NM, e
Lee, C. Supressão da metástase tumoral por bloqueio de
factor de crescimento transformante de sinalização em células de medula óssea
através de um vector retroviral mediada. Cancer Res, 62: 7135-7138,

De 2002.
8) Sander, CS, Hamm, F., Elsner, P., e Thiele, JJ
O estresse oxidativo em pacientes com melanoma e não-Melanom
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
Efeito da Água em Electrolyzed

cicatrização
Órgãos Artificiais 2000; 24: 984-987
* Naoki Yahagi, * Masashi Kono, * Masaki Kitahara,
* Akito Ohmura, † Osao Sumita,
‡ Toshimasa Hashimoto, ‡ Katsuaki Hori,
‡ Chen Ning-Juan, §Paul Woodson, ¶Shoji Kubota,
** Arata Murakami, e ** Shinichi Takamoto,
* Departamento de Anestesiologia da Universidade Teikyo
Hospital Mizonokuchi; † Coherent Technology Inc .;
‡ Faculdade de Engenharia, Tokyo Institute of
tecnologia; Ciências §Basic Department, Kenmore
Universidade Bastyr; ¶Water projeto Laboratories, e
** Serviço de Cirurgia Torácica da Universidade de
Tóquio, Tóquio, Japão
Resumo: água Electrolyzed acelerar a cicatrização de feridas cutâneas de espessura total
em ratos, mas a água só ânodo câmara (pH ácido ou neutralizada) foi eficaz.
O ácido hipocloroso (HOCl), também produzido por eletrólise, foi ineficaz, sugerindo
que estes tipos de água electrolisada melhorar a cicatrização da ferida por um mecanismo não
relacionado
para a acção anti-bacteriana bem conhecida de HOCl. Uma possibilidade é que o oxigénio
reactivo
espécies, mostraram-se os espectros de ressonância de spin de elétrons presentes na água

câmara do ânodo,
pode desencadear a cura de feridas precoce através da migração de fibroblastos e
proliferação.
Palavras-chave: Ferida healing- Electrolyzed Abastecimento de água-água ânodo-cátodo
O ácido hipocloroso.
Água electrólise, em uma variedade de formas e feita por uma variedade de diferentes
processos, é amplamente utilizado em
Resumo: água Electrolyzed acelerar a cicatrização de feridas cutâneas de espessura total
em ratos, mas a água só ânodo câmara (pH ácido ou neutralizada) foi eficaz.
O ácido hipocloroso (HOCl), também produzido por eletrólise, foi ineficaz,

suggestingTHOUGHTS E PROGRESSO 985
Japão como um desinfectante tópica (1,2). Nós descrevemos
Aqui os nossos achados de que alguns tipos de eletrolisadas
água parecem acelerar a cicatrização de espessura total
feridas cutâneas em ratos.
Materiais e métodos
Seis diferentes tipos de água foram preparados e testados.
A primeira, a água ultrapura (resistividade. 18 MV? Cm),
foi produzida por uma sequência de tratamentos aplicados aos
cidade torneira de água: filtração de carvão, osmose reversa,
e troca iônica. Um grupo de animais experimentais
foi tratada com esta ultrapura, nonelectrolyzed
água. Foram feitas quatro tipos de água electrolyzed
desta água ultrapura. Em cada caso, a água
foi electrolyzed (gradiente de tensão de 13 V e aparente
densidade de corrente de 200 mA / cm2
) Sendo
bombeado (500 ml / min) através de um dispositivo 3 de câmara
(Coherent Tecnologia, Tóquio, Japão) (3). um
câmara continha um ânodo de titânio banhado a platina.
Normalmente, a câmara média foi preenchida com um
solução saturada de cloreto de sódio feitas com o

água ultrapura. A terceira câmara continha o
cátodo, também feito de titânio revestido com platina.
Membranas de troca iônica de propriedade separada do
Chambers. Os seguintes três tipos de água electrolyzed
foram feitas utilizando o dispositivo Coherent Tecnologia
nesta configuração (todas as medições feitas em
25 ° C). O primeiro pH da água, de ácido, Ac (+), foi feita
a partir da câmara de ânodo [pH 2,50-2,63, oxidationreduction
potencial (ORP) 1104-1191 mV, concentração
de cloro residual (determinada pela
método da o-toluidina) de 80 a 100 ppm]. pH neutro
(7,40) água câmara do ânodo, N (+), foi feita por
adição de NaOH (1 N) para a tomada de água electrolisada
a partir da câmara de ânodo [pH 7,4, ORP 749-784 mV,
concentração de cloro residual quase a mesma
como na solução Ac (+)]. Alkaline água pH, Al (-),
foi feita a partir da câmara do cátodo (pH 10.65-
10,85, ORP 212-297 mV, o cloro residual apenas alguns
ppm). Substituindo o cátodo de platina no Coherent
Dispositivo Tecnologia por um feito de carbono e
substituição da solução de centro-câmara por 5 M citrato
(ácido orgânico; ácido cítrico) em água ultrapura permitido
-nos para fazer um quarto tipo de água eletrólise. este
água ácida [Ac (-)] foi feita a partir do cátodo
câmara (pH 3,86-3,87, ORP 212-297 mV, não residual
cloro). Finalmente, o ácido hipocloroso (HOCl)
solução foi feita por electrólise de 0,45% de NaCl numa
dispositivo de câmara única (Omuko Co. Ltd., Tóquio, Japão)
(Gradiente de tensão, densidade de corrente aparente,
e a taxa de bombagem foram os mesmos que para o Coherent

Dispositivo Technology.). O pH e ORP desta solução
foram 7,45 e 780 mV, respectivamente. quando
armazenado em garrafas PET, o pH e ORP de todos os tipos 6
da água manteve-se estável durante pelo menos um mês.
Quarenta e dois ratos Wistar (8 semanas de idade) foram aleatoriamente
divididos em 6 grupos experimentais, alojado
gaiolas metabólicas individuais a 25 ° C, e de roedores alimentados
ração e água ad libitum. Sob anestesia com pentobarbital,
a parte de trás foi raspada e dois 1,0 centímetro quadrado,
feridas cutâneas de espessura total foram feitas, um atrás
o outro e 1,5 cm uma da outra, na parte de trás de cada
animal. Em cada rato, uma ferida (escolhidos aleatoriamente)
foi tratada duas vezes por dia durante 7 dias com 1 a 6 de
tipos de água descrito anteriormente; a outra ferida
foi deixada sem tratamento. O rato foi observado com cuidado
até que a água foi absorvida pela ferida para assegurar
que não haja derramamento ocorreu. O primeiro tratamento foi
administrado imediatamente após a cirurgia. todas as feridas
foram autorizados a curar sem curativos. Por 17 dias
após a cirurgia, áreas das feridas foram medidos diariamente por
planimetria, usando imagens de câmeras digitais de vídeo exibida
através de um computador pessoal.
Foram estudados ácido e águas de ânodo neutralizados
por espectroscopia de ressonância de spin (ESR; JEOL-JES-RE2X;
Nihon Denshi, Tóquio, Japão) com a adição de um
agente de spin trapping [5,5-dimetil-1-pirrolina-Noxide
(DMPO, Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.)] usando
uma célula plana de largura de 1 mm (4). Este foi realizado 24
h após a preparação da água electrolisada.
A duração da incubação da electrolisada

água com DMPO foi de 2 min. O campo magnético era
de 335 ± 5 mt. A intensidade do sinal foi comparado com
o sinal obtido a partir de Mn2 + (como um controlo).
Todos os protocolos foram aprovados pela Pesquisa Animal
Review Committee da Universidade Teikyo
Faculdade de Medicina.
Para cada grupo, os resultados são apresentados como média
área ferida ± DP. A comparação entre as áreas
de ferimentos tratados com água e não tratados era
realizada através do teste t de Student pareado. as comparações
entre os grupos experimentais foram feitas
usando uma análise de variância. quando estatística
Foi detectada significativa, foi utilizado o teste de Dunnett
para determinar quais os valores diferem significativamente de
aqueles obtidos utilizando o ultrapura nonelectrolyzed
água. Valores de p <0,05 foram considerados significativos.
resultados
Como mostrado na Tabela 1, ambos os tipos de câmara de ânodo
água [ácida e neutra: Ac (+) e N (+), respectivamente]
acelerou a cicatrização de feridas (quando comparado
para o efeito de água ultrapura nonelectrolyzed) (p <
0,05). Esta aceleração da cicatrização de feridas era evidente
já a partir de dia pós-operatório (POD) 1 em
Ac (+) ou POD 2 em N (+). A água alcalina a partir de
a câmara de cátodo [Al (-)] apresentou uma ligeira, mas
Artif Órgãos, vol. 24, No. 12, 2000 986 PENSAMENTOS E PROGRESSO
TABELA 1. Comparação entre as áreas das feridas tratadas e não tratadas com água, e a
comparação entre
grupos experimentais
POD 0 1 2 3 4 5 7 9 11 14 17
bbbbbbbbb
Água (n 4 7)
A média de 1,0399 1,3117 1,3082 1,1325 1,0894 0,8760 0,6588 0,3165 0,2280 0,1525 0,0839
SD 0,0777 0,1889 0,1559 0,2135 0,1194 0,1133 0,1203 0,0348 0,0801 0,0159 0,0202
NT
A média de 1,0931 1,1958 1,1007 1,0242 0,9849 0,8509 0,6558 0,3208 0,2000 0,1685 0,0795
SD 0,0839 0,2697 0,2186 0,2407 0,1832 0,1154 0,1554 0,1189 0,0664 0,0609 0,0416
Ac (+) (n 4 9), c a a a, c, c, c, c, c, c, c
A média de 1,0347 0,9213 1,0904 0,9001 0,7937 0,6248 0,3709 0,1597 0,0878 0,0225 0,0040
SD 0,1105 0,2005 0,2187 0,1868 0,1832 0,1578 0,1783 0,0868 0,0330 0,0225 0,0083
NT
A média de 1,0876 1,1913 1,3229 1,2836 1,1969 1,0530 0,7255 0,3509 0,2114 0,1225 0,0430
SD 0,1815 0,2506 0,3939 0,3362 0,3535 0,2524 0,2738 0,1552 0,0967 0,0399 0,0351
N (+) (n 4 6) a a a a, c, c, c, c, c, c, c
A média de 1,0457 1,1577 0,9918 0,8878 0,7846 0,6214 0,3754 0,1960 0,1122 0,0230 0,0151
SD 0,1076 0,2757 0,1751 0,1926 0,1775 0,1438 0,1273 0,0957 0,0700 0,0239 0,0371
NT
A média de 1,0972 1,4260 1,3473 1,3465 1,2990 1,1729 0,8549 0,4755 0,3371 0,1447 0,0811
SD 0,0494 0,2773 0,1889 0,1699 0,1379 0,1614 0,2917 0,1421 0,1781 0,1191 0,0719
Al (-) (n 4 6) c a a c c
A média de 1,0151 0,9611 0,9970 0,8861 0,8052 0,7372 0,4776 0,2692 0,1221 0,0368 0,0305
SD 0,0595 0,1277 0,0876 0,1099 0,1335 0,1400 0,1461 0,1524 0,0280 0,0227 0,0251
NT
A média de 1,0488 1,0272 1,1619 1,0939 1,0963 0,9781 0,7044 0,3958 0,2025 0,1406 0,0720
SD 0,0643 0,1376 0,3234 0,3316 0,2564 0,2191 0,2431 0,1335 0,0843 0,0510 0,0442
Ac (-) (n 4 6) c
A média de 0,9723 1,1173 0,9656 0,9082 0,8789 0,7429 0,5517 0,2316 0,1471 0,0979 0,0763
SD 0,0642 0,2219 0,3055 0,2881 0,2423 0,2130 0,2021 0,0842 0,0584 0,0482 0,0311
NT
A média de 0,9374 1,0732 1,0655 1,0394 1,0151 0,8215 0,6636 0,3369 0,1941 0,1110 0,0795
SD 0,0682 0,1278 0,1326 0,1958 0,2027 0,1632 0,1818 0,1109 0,0440 0,0487 0,0318
HOCl (n 4 8) c
A média de 1,1368 1,1986 1,2423 1,1403 0,9823 0,8702 0,6797 0,3585 0,1802 0,0961 0,0509
SD 0,1941 0,2300 0,3154 0,2580 0,2814 0,2474 0,2628 0,1830 0,1005 0,0563 0,0407
NT
A média de 1,1909 1,1885 1,3253 1,3231 1,2036 1,1455 0,8468 0,3892 0,1901 0,1488 0,0660
SD 0,2448 0,3144 0,3970 0,3555 0,3412 0,2983 0,2766 0,1555 0,1103 0,1155 0,0559
p <0,05 vs a área da ferida NT (teste t emparelhado de Student).
b p <0,05 entre os grupos (ANOVA unidireccional).
c p <0,05 em relação água (Dunnett).
Os valores são cm2
. POD: dia de pós-operatório (feridas foram feitas no dia 0), Água: nonelectrolyzed água pura,
NT: feridas não tratadas,
Ac (+): água ânodo pH ácido, N (+): neutro água ânodo pH, Al (-): água alcalina cátodo pH, Ac (-
): ácido pH cátodo água, HOCl:
ácido hipoclorito.
insignificantes, tendência a aumentar a cura (em comparação
com a água ultrapura), mas a água ácida
a partir da câmara do cátodo [Ac (-)] e o HOCl
solução foram ineficazes. Todas as feridas de todos
animais estavam livres de sinais de infecção.
Como mostrado na Fig. 1, no espectro ESR significativa
Observou-se não tratada para câmara de ânodo ácida
água. No entanto, quando nós adicionamos uma pequena quantidade de
sal férrico para a água de ânodo (5) para imitar o desenvolvimento in vivo
experimento, 4 linhas sugestivo de radicais hidroxila
foram observados no espectro. ESR espectros Similar
foram observados por água câmara do ânodo neutralizado
(na ausência ou na presença de um sal férrico, respectivamente).
discussão
A acção bactericida dos diferentes tipos de ânodo
câmara de água no passado tem sido atribuída a
o seu teor de HOCl (1). Desde a nossa solução HOCl
foi sem efeito sobre a cicatrização de feridas, sugerimos que
as águas câmara de ânodo testadas aqui podem ter uma
modo de ação alheio a qualquer HOCl antibacteriano
produzido pela electrólise. Uma possibilidade é que
os radicais livres, gerados nas águas câmara do ânodo
por contacto com a ferida (Fig. 1), pode ser responsável
para o efeito muito cedo na cicatrização de feridas visto
neste modelo. Esta interpretação é apoiada pelo
efeitos conhecidos dos radicais livres sobre a inflamação como
bem como com o que é conhecido do papel da inflamação
Artif Órgãos, vol. 24, # 12, 2000 PENSAMENTOS E PROGRESSO 987
FIGO. 1. São mostrados os espectros electromagnética de ânodo ácida
água câmara. A linha superior é para ânodo ácida não tratada
água câmara. Não houve espectro de ESR significativa. nota
que a linha inferior, o espectro da mesma água com sal férrico
acrescentou, mostra quatro linhas sugestivas de radicais hidroxila.
no início da cura (6), neste modelo. no nosso
estudo, as diferenças de pH não pode ser responsável pela
diferença significativa na aceleração da ferida
cura entre ácido (pH cerca de 2,5) e neutralizou
(pH 7,4) águas câmara de ânodo, de um
lado, e água câmara de cátodo ácido (pH sobre
3,8), por outro. Além disso, não houve diferença
no pH ou ORP entre ânodo neutralizado
água câmara (pH 7,4, ORP 749-784 mV) e
HOCl (pH 7,45, ORP 780 mV). Assim, presumivelmente ORP
não afectou substancialmente a cura de feridas em nosso

experimento.
Espécies reativas de oxigênio foram mostrados para afetar
A síntese de DNA e proliferação de fibroblastos. A
baixo nível destas espécies estimula a síntese de DNA
e divisão celular, enquanto um nível elevado inibe a DNA
síntese (a citotoxicidade induzida ser proporcional
ao nível de espécies reactivas de oxigénio) (7-9).
Além disso, em pequenas quantidades, espécies reativas de oxigênio
foram mostradas para ser envolvido no mecanismo subjacente
fibroblastos de quimiotaxia em locais de lesão ou inflamação
(10).
Para nosso conhecimento, não há relato explicando claramente
o efeito benéfico directo de HOCl sobre
cicatrização de feridas. HOCl gera não só o cloro
gás, que é a principal causa do efeito bactericida
de HOCl, mas também de oxigénio singleto, que é um reactivo
espécies de oxigênio, cujo efeito fisiológico ainda é desconhecida
(11). Kozol et al. demonstraram que o sódio
hipoclorito teve efeitos tóxicos sobre os módulos enrolados
(por exemplo, nos neutrófilos, fibroblastos, e endotelial
células a concentrações diluídas de 2,5 × 10-2% a
2,5 × 1-4% (12). Além disso, as feridas criadas em
orelhas de rato e tratada com hipoclorito de sódio a 0,25%
mostrou epithelialization atrasado e neovascularização
(13). Esta pode ser a razão que
HOCl foi sem efeito no nosso modelo de cicatrização de feridas.
Em conclusão, o ácido e neutro câmara do ânodo
águas de acelerar a cicatrização cutânea de toda a espessura
feridas em ratos. Este efeito pode ser causado pela
a geração de espécies reactivas de oxigénio; no entanto,

estudo adicional é necessário para a elucidação da
mecanismo subjacente os efeitos da electrolyzed
água na cicatrização de feridas.
Agradecimentos: Os autores têm os seus agradecimentos a
Dr. Yuko Nishimoto para discussão valiosa.
referências
1. Tanaka H, Y Hirakata, Kaku M, Yoshida I, Takemura H,
Mizukane R, Ishida K, K Tomono, Koga H, Kohno S, Kamihara
S. Atividade antimicrobiana de água superoxidized. J Hosp
Inf 1996; 34: 43-9.
2. Hayashi H, K Kumon, Yahagi N, Haruna M, Watanabe Y,
Matoui J, Hattori R. O sucesso do tratamento de mediastinite após
cirurgia cardiovascular utilizando ácido forte electrolyzed
solução aquosa. Artif Órgãos 1997; 21: 39-42.
3. Sumida N, H. Hashimoto Publicação da Patente Japonesa No.
07-000966. Líquido de iões hidrogénio coexistentes ou ião hidróxido
com oxidação-redução de material por eletrólise da água pura
e a sua produção. 1991.
4. Harbour JR, Chow V, Bolton JR. Uma ressonância de spin do elétron
estudo dos adutos de spin de radicais OH e HO2 com nitronas
no ultravioleta. Fotólise de peróxido de hidrogénio aquoso
soluções. Can J Chem 1974; 52: 3549-54.
5. Cohen G, Sinet PM. A reação Fenton entre ferrousdiethylenetriamine-pentaacetic
ácido e peróxido de hidrogénio.
FEBS Lett 1982; 138: 258-60.
6. Asmussen PD, Sollner B. Mecanismo de cicatrização de feridas. em:
Wound Care. Tutorial Series Medical. Stuttgart: Hipócrates
Company, 1993.
7. Murrell GA, Francis MJ, Bromley L. Modulação de fibroblastos
proliferação de radicais livres de oxigênio. Biochem J 1990; 265:

659-65.
8. Nicotera TM, Privalle C, Wang TC, Oshimura M, Barrett JC.
Respostas proliferativas diferenciais da Síria embrião hamster
fibroblastos para os radicais superóxido gerados por paraquat dependendo
em função de gene supressor de tumor. Câncer Res
1994; 54: 3884-8.
9. Subirade I, Fernandez Y, Periquet A, Mitjavila S. Catechin
proteção de células 3T3 suíços em cultura sob oxidativo
stress. Biol Traço Elem Res 1995; 47: 313-9.
10. Wach F, Hein R, Adelmann-Grill BC, Kreig T. A inibição da
fibroblastos quimiotaxia pela superóxido dismutase. Eur J celular
Biol 1987; 44: 124-7.
11. Oosthuizen MM, Greyling D. Antioxidantes adequado para uso
com quimiluminescência para identificar as espécies oxiradicais. redox
Rep 1999; 4: 277-90.
12. Kozol RA, Gillies C, Elgabaly SA. Efeitos de hipoclorito de sódio
(Solução de Dakin) em células do módulo ferida.
Arch Surg 1988; 123: 420-3.
13. Kjolseth D, Frank JM, Barker JH, Anderson GL, Rosenthal
AI, Acland RD, Schuschke D, Campbell FR, Tobin GR,
Weiner LJ. Comparação dos efeitos de comumente utilizados
agentes de feridas na epitelização e neovascularização. J
Am Coll Surg 1994; 179: 305-12.
Artif Órgãos, vol. 24, N ° 12, 2000 a angiogénese tumoral, a formação de novos vasos
sanguíneos capilares
por células endoteliais vasculares de navios existentes, é uma
mecanismo importante para o fornecimento de nutrientes, oxigénio,
factores de crescimento e outros para células tumorais. As células tumorais desencadear
angiogênese através da secreção de fatores angiogênicos, especialmente vascular
factor de crescimento endotelial (VEGF-A), 1), que desempenha um

papel importante na regulação da angiogenesis.2 normal e anormal)
O VEGF-A (vulgarmente conhecido como VEGF) foi relatada pela primeira vez
como um factor de indução de permeabilidade vascular segregados por tumores
células, e referido como fator de permeabilidade vascular (VPF) .3)
A expressão do gene VEGF é iniciada por sinais extracelulares, incluindo
fatores de crescimento, mitógenos, éster de forbol, citocinas
e tensões extracelular. Os três primeiros desses exógena
sinais de activar a via de Ras-Raf-MEK-ERK que transduz
sinais mitogénicos que regulam a proliferação celular ou diferenciação.
Os outros sinais extracelulares activar o
JNK / SAPK p38 e vias que regulam inflamatória celular
ou stress responses.4) de VEGF é super-expresso em ambos
níveis de mRNA e proteína em uma alta porcentagem de maligno
animais e os tumores humanos, bem como em muitos imortalizada
e lines.5-7 célula transformada) O VEGF-A transcrição do gene
sofre splicing alternativo para produzir as isoformas de maduros
121, 165, 189, e 206 aminoácidos, com FCEV165 aparecendo
para ser quantitativamente e funcionalmente mais predominante em angiogénico
estados.8) VEGF121 e VEGF165 secretado como são solúveis
compostos, enquanto VEGF189 e VEGF206 permanecer celular
superfície associada ou são depositados principalmente na extracelular
matrix.9)
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são sugeridos para desempenhar um
papel importante na angiogenesis.10) Além disso, há cada vez mais
evidência do envolvimento de H2O2
na regulação
de angiogenesis.9,11-13) Assim, uma variedade de linhas celulares
derivadas de tumores humanos foi mostrado para produzir grande
quantidades de H2O2
.
14) A vigilância Constitutivo para celular
proteção contra o estresse oxidativo é conferida por intracelular
agents.15 antioxidante) Quantidades excessivas de ROS são tóxicos
e causar uma redução de intracelular levels.16 antioxidante) É
Tem sido relatado que o pré-tratamento do coração com exógena
antioxidantes melhorou a sua condição como um resultado da redução
ROS production.17) O gene de VEGF-A é um que tem a sua
expressão regulada por ROS, especialmente pelo H2O2
. adicional
dados confirmam que o VEGF-A mRNA é up-regulada por H2O2
em
uma dose e dependente do tempo manner.18,19) Tomados em conjunto,
estes sugerem que alguns endógena, bem como antioxidante exógeno
os agentes podem ser usados para regular a expressão do VEGF-A gene
e / ou produção de H2O2 para fins terapêuticos.
Água reduzida electrolyzed (ERW) tem atraído muita atenção
devido ao seu potencial antioxidante. água electrólise
normalmente produz dois tipos de água: redução ou alcalino
(pH elevado) de água perto do cátodo e um oxidado ou ácido
(pH baixo) água perto do ânodo. Aplicações de oxidado
19 jan 2008
Efeito inibitório do Electrolyzed água, reduziu em Tumor angiogênese
Jun Ye,
a, b Yuping LI,
a, c Takeki HAMASAKI,
d Noboru NAKAMICHI,
e Takaaki KOMATSU,
Taichi KASHIWAGI,
d Kiichiro Teruya,
a, d Ryuhei NISHIKAWA,
d Takeshi Kawahara,
d Kazuhiro OSADA,
Kazuko TOH,
d Masumi ABE,
d Huaize TIAN,
d Shigeru Kabayama,
f Kazumichi Otsubo,
Shinkatsu MORISAWA,
f Yoshinori Katakura,
a, d
e Sanetaka Shirahata *
, a, d
uma Escola de Pós-Graduação em Sistemas de Ciências Biológicas, Universidade Kyushu; d

Departamento de Recursos Genéticos Tecnologia, Faculdade de
Agricultura, da Universidade Kyushu; 6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-8581, Japan:

BKEY Laboratório do
Ministério da Educação de Biologia Celular e Engenharia de células tumorais, da Escola de

Ciências da Vida, Universidade de Xiamen; Fujian,
361005 P.R. China: c
Escola de Ciências da Vida, Nanchang Universidade de Ciência e Tecnologia; Nanchang 330006,

P.R.
China: e funcional celular Água Analysis Center Co., Ltd .; Fukuoka 812-0053, Japan: e fNihon
guarnição Co., Ltd .; 1-8-34
Oyodonaka, Kita-ku, Osaka 531-0076, Japão.
Recebido 09 de junho de 2007; aceito 16 de outubro de 2007; publicado on-line 17 de outubro

de 2007
Factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um mediador chave da angiogénese

tumoral. As células tumorais são expostas
a maior estresse oxidativo em comparação com células normais. Numerosos estudos

demonstraram que o intracelular
redox (oxidação / redução) estado está intimamente associada com o padrão de expressão de
VEGF. electrolyzed
água reduzido (ERW) produzido perto do catodo durante a eletrólise da água eliminado H2O2
intracelular
e diminuiu a libertação de H2O2
a partir de uma linha celular de adenocarcinoma do pulmão humano, A549, e regulada para
baixo tanto
Transcrição de VEGF e a secreção de proteínas de uma forma dependente do tempo. Para

investigar a transdução de sinal
via envolvida na regulação da expressão de VEGF, quinase activada por mitogénio (MAPK)
inibidores específicos,
SB203580 (p38 MAPK inibidor), PD98059 (ERK1 / 2 inibidor) e JNKI (c-Jun N-terminal de
inibidor de proteína-quinase)
Foram aplicados. Os resultados mostraram que a expressão de VEGF bloqueia apenas

PD98059, sugerindo uma importante
papel para ERK1 / 2 na regulação da expressão de VEGF em células A549. Assim, ERW inibiu a
activação de extracelular
quinase regulada por sinal (ERK) de um modo dependente do tempo. Experimentos de co-
cultura para analisar in vitro
ensaio de formação de túbulos revelou que A549 meio condicionado derivado de células
estimuladas de forma significativa a formação
dos túbulos vasculares em todos os parâmetros analisados; túbulo área total, junção tubular,
número de túbulos, e
comprimento total túbulo. ERW contrariado o efeito de meio condicionado de células A549 e
diminuição do total de tubo
comprimento (p, 0,01). O presente estudo demonstrou que ERW regulada transcrição do gene
e da proteína VEGF
secreção através de inativação de ERK.
Palavras-chave electrolyzed água reduzida; angiogênese; estresse oxidativo; factor de

crescimento endotelial vascular; sinal extracelular
água têm sido frequentemente reported.20-22) No Japão, ERW
produzido a partir de água da torneira na casa de uso electrolyzing purificadores
é popular, pois é pensado para ter benefícios para a saúde. ERW tem
demonstrou ser clinicamente eficazes no tratamento de pacientes
com síndrome do intestino irritável ou não ulcerosa dyspepsia.23)
Shirahata et ai. demonstrou pela primeira vez que não só ERW

pH elevado exibiu, baixo oxigênio dissolvido, extremamente elevado dissolvido
hidrogénio molecular, mas o mais importante, mostraram
Atividade captadora de ROS e efeitos protetores contra oxidativo
danos a DNA.24) Posteriormente, os efeitos inibidores de
ERW induzida por aloxano em damage25 célula pancreática) e sobre
estresse oxidativo induzido por hemodiálise na doença renal em estágio final
(DRT) patients26,27) foram relatados. Kim e Kim relataram
que ERW derivado de água da torneira exibiu um protótipo
2 diabética efeito em animais experiments.28)
Embora os dados acumulados até agora sugerem que ERW
poderia ser um agente antioxidante útil, são necessários mais estudos
para elucidar os mecanismos de suas ações nas células. para
Nesse sentido, a hipótese de que ERW poderia regular VEGF-A
a expressão do gene para exercer efeitos anti-angiogénicos via de eliminação
ROS, em particular H2O2
. Realizamos uma série de experimentos
como um primeiro passo para desvendar os mecanismos envolvidos.
Aqui apresentamos provas de que ERW atenua tanto o lançamento
de H2O2
e a secreção de VEGF. Isto leva a
a supressão da angiogénese induzida por células de tumor.
MATERIAIS E MÉTODOS
Preparação de Electrolyzed água reduzido (ERW)
ERW (potencial de oxidação redução, 2600 mV; pH 11) foi
preparado pela eletrólise da água ultra-pura contendo 0,002 M
NaOH a 100 V durante 60 minutos utilizando um dispositivo de electrólise
equipado com eletrodos de titânio revestido de platina (TI-200,
Nihon guarnição Co., Osaka, Japão), e contém tipicamente
0,2 ppb Pt Nps quando ensaiado com ICP-MS espectrômetro (inédito
dados). Foi utilizado um tipo de lote dispositivo eletrólise.

Ela consistia de uma embarcação de 4 l (190 milímetros length3210 mm width3
140 milímetros de altura), dividida por uma membrana semi-permeável
(Altura mm 190 milímetros width3130, 0,22 mm de espessura, pore
tamanho não é divulgado, Yuasa Membrane System Co., Osaka
Japão). Dois eléctrodos (70 mm Comprimento mm) foram width3110
colocado a uma distância de 55 mm a partir de cada lado da semipermeável
membrana.
Cultura de Células e Reagentes Todos alcalina electrolyzed
ERW foi neutralizada pela adição de 1 ml de 103 mínimo
Meio de Eagle (MEM) (pH 7) e 0,2 ml de 1 M de 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico
ácido tampão (HEPES)
(pH 5,3) a 9 ml de RGE (pH 11) antes da utilização. pulmão humano
adenocarcinoma, células A549 e embrionário humano diplóides
fibroblastos de pulmão, TIG-1 foram obtidos a partir da Saúde
Ciência Research Resources Bank e mantidas em MEM
suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) designado
como 10% de FBS / MEM (Biowest, França). Durante as experiências,
As células A549 foram cultivadas com MEM (sem FBS) preparado
por diluição de 103 MEM com água Milli Q, que
designado como MEM sem soro / Milli Q ou cultivadas com
MEM (sem FBS), preparada por diluição de 103 MEM com
ERW que designou como MEM sem soro / ERW. Em uma preliminar
experimento feito no passado, nós tínhamos comparados dois
Meios MEM preparado quer com solução aquosa de NaOH 0,002 M
ou com água Milli Q examinar se media do MAM
com a adição de NaOH poderia varrer intracelular ou ROS
não, e tal efeito não foi observado. Além disso, estes MEM
meios foram aplicados a células de fibrossarcoma humano HT1080
e medida de metaloproteinases da matriz (MMP) expressões gênicas.
Não foi observada nenhuma diferença nos níveis de

Expressão de MMP entre as células HT1080 em cultura com o
dois meios de MEM (observação não publicada). juntamente com
essas observações e os conhecimentos que tanto MMP e
VEGF são genes redox-sensíveis, julgamos que uma adição
de NaOH em meios de cultura não tem efeito sobre intracelular
estado redox e expressão de genes relacionados. Por conseguinte, utilizados
Mídia MEM preparadas com água Milli Q como um controle em subsequente
experimentos.
As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram
comprado de Cambrex e cultivadas em meio EGM-2
(Cambrex, MD, E.U.A.). Ácido homovanílico (HVA) e
peroxidase de rábano tipo VI foram adquiridos de Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, E.U.A.). SB203580, PD98059
e inibidor de proteína-quinases c-Jun N-terminal (JNKI) eram
adquirido de Calbiochem (CA, E.U.A.). o Quantikine
kit (VEGF humano Imuno, Número de catálogo DVE00)
foi obtida de R & D Systems, Inc. (Minneapolis, MN,
EUA.). O kit Quantikine VEGF Imuno é concebido
para medir os níveis VEGF165 em sobrenadante de cultura de células. um angiogênese
Coloração túbulo Kit (para coloração CD31) foi obtido
da TCS Cellworks (Buckingham, Reino Unido). total e
fosfo-ERK activada por mitógeno proteína quinase (MAPK)
anticorpo foi adquirido a Cell Signaling Technology
(Danvers, MA, U.S.A.). 29,79-diclorofluoresceína diacetate
(DCFH-DA) foi adquirido a partir de Molecular Probes, Inc.
(Eugene, OR, E.U.A.).
Medição do intracelular H2O2 atividade sequestradora
por ERW H2O2
produzido em células A549 foi medido
usando DCFH-DA. As células A549 foram pré-tratadas com meio isento de soro
MEM / ERW durante 30 min, e, em seguida, incubadas com 5 mM
DCFH-DA, durante 30 min a 37 ° C. DCFH-DA difundido livremente
em células e, em seguida, foi hidrolisado por esterases celulares às
DCFH, que foi aprisionado no interior da célula. Esta não fluorescente
molécula foi então oxidado a fluorescente diclorofluoresceína
(DCF) por acção de H2O2 intracelular
. As células foram
lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) para remover
o DCFH-DA. H2O2
níveis foram medidos usando fluxo
citometria (EPICS XL System II; Beckman Coulter, EUA)
através da determinação da intensidade da fluorescência em relação ao
das células de controlo.
Medição de H2O2 de lançamento H2O2
liberação de
As células A549 para o meio de cultura foi determinada por um publicado
method.29) Resumidamente, as células A549 foram cultivadas em um 24-
bem placa com MEM sem soro / Milli Q ou sem soro
MEM / ERW durante 24 h. As células foram lavadas com PBS e
em seguida, incubadas com um tampão de reacção de 800 ml (100 mM de HVA,
5 unidades / ml horseradish peroxidase tipo VI, e HEPES 1 mM
em solução salina equilibrada de Hanks sem vermelho de fenol, pH 7,4).
O tampão de reacção, sem células foi tratado da mesma
Assim, como um controlo. Esta solução foi então recolhida, após incubação
durante 30 min, o pH foi ajustado a 10,0 com 0,1 M
tampão de glicina-NaOH, e a fluorescência foi então medida
utilizando um espectrofotómetro de fluorescência (F-2500, Hitachi,
Japão) com excitação e emissão de comprimentos de onda de 321 nm e
421 nm, respectivamente.
Semiquantitativa transcrição reversa da Polimerase

20 Vol. 31, N ° 1Chain Reacção (RT-PCR) O ARN total foi isolado utilizando
um kit de isolamento de ARN total GenEluteTM mamíferos (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) e seguindo o protocolo
fornecida pelo fornecedor. As sequências dos iniciadores para
gliceraldeído-39-fosfato (GAPDH) são
59ACCACAGTCCATGCCATCAC39 (avançar) e 59TCCACCACCCTGTTGCTGTA-39
(reverso), que amplificam um
512 segmento bp (NCBI Prec #: NM 002046). o comum
sequências iniciadoras para transcrições de VEGF são 59GGGCCTCCGAAACCATGAAC39
(avançar) e 59CTGGTTCCCGAAACCCTGAG39
(reverso), que se diferenciam em alternativa
splicing VEGF165 e VEGF121 por gerar transcrições
Fragmentos de 625 pb e 495 pb, respectively.8,30) PCR amplificação
catião para o VEGF foi realizada a 94 ° C durante 45 s de desnaturação,
recozimento durante 45 s a 60 ° C e extensão durante 1 min a
72 ° C durante 35 ciclos utilizando polimerase Taq (Takara). Da mesma forma,
A amplificação por PCR para GAPDH foi realizada a 94 ° C durante
3,5 min de desnaturação, emparelhamento durante 30 segundos a 58 ° C, e extensão
durante 1 min a 72 ° C durante 30 ciclos. O semi-quantitativa
Os produtos de RT-PCR não foi saturada sob as condições
utilizado nas presentes experiências. Os produtos amplificados foram resolvidos
por electroforese em gel de agarose e em seguida fotografou
com uma câmera digital (ATTO, Tokyo). para densitometria
análise de imagens gravadas, foram analisadas por uma imagem NIH
programa analisador (1.62f imagem) usando um computador pessoal.
Os valores abaixo do painel foram normalizados definindo arbitrariamente
a densidade das bandas de VEGF165 e VEGF121 não tratada
As células A549 a 1,0. Transcritos de GAPDH foram utilizados como um interno
controle para a atividade celular.
Medição de VEGF segregada para o Cultura

As células A549 Médio (53104
células / poço) foram semeadas em 24-
bem placas com 10% FBS / MEM e cultivadas durante a noite. o
o meio foi substituído com MEM isento de soro / ERW e incubadas
durante mais 24 h. O meio condicionado foi recolhido
para medir a VEGF segregada, a qual foi medida de acordo
com o protocolo do fabricante.
Preparação do meio condicionado e formação de túbulos
As células A549 Análise (13106
células) foram semeadas numa
90 milímetros prato com 10% de FBS / MEM e incubou-se durante a noite.
O meio foi substituído com MEM isento de soro / Milli Q ou
MEM / ERW e cultivadas durante 24 h sem soro. o condicionada
o meio foi colhido e filtrado com um filtro de 0,2 mm.
As alíquotas foram armazenados em um 280 ° C-congelador. formação de túbulos
ensaio foi realizado com um sistema de co-cultura.
As HUVEC foram misturados com TIG-1 em células de 1: 40, semeadas em 24-
bem placas, e cultivadas em EGM-2 durante a noite médio. o
o meio foi removido e uma mistura de células A549 condicionado
e EGM-2 media misturados a 2: 1 foi adicionado. o condicionada
meio foi trocado a cada 2 d. Palhinha formado
foram detectados com diferentes meios de comunicação com HUVEC-specific
marcadores CD31 (PECAM-1). Resumidamente, no dia 11, o meio
foi completamente removido, e a placa de co-cultura foi fixada
durante 30 min com solução de etanol a 70%. Após incubação com
PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), a co-cultura
placa foi incubada com um rato de CD31 anti-humano
de anticorpos (1: 4000) durante 60 min, seguido por outros 60 min
incubação com um anticorpo IgG anti-ratinho de cabra secundário
conjugado com fosfatase alcalina (ambos os anticorpos eram

incluídos no túbulo Coloração Kit). Após lavagem da cultura
placa, 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato toluidina
sal / cloreto de tetrazólio nitro-azul (/ NBT BCIP) substrato
foi adicionado até túbulos desenvolveu uma cor roxo escuro. co-culturas
Foram, em seguida, seco e analisado. Formações túbulo em
o sistema de co-cultura foram observadas por microscopia de contraste de fase
e microfotografias foram documentados com um
câmera digital (Olympus, Japão). As imagens gravadas foram analisados
A angiogênese por Análise de Imagem de Software (AngioSys
1.0, TCS, Cellworks, Reino Unido). Doze campos aleatórios por poço
foram fotografadas para avaliação formação de túbulos.
Ocidental análise de transferência de células tratadas adequadamente foram
lavou-se com PBS, e incubadas com tampão de extracção
(50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, 1%
NP-40, 0,1% de SDS, 10 mg / ml de aprotinina e EDTA 10 mM) sobre
gelo. As células foram recolhidas com um raspador. O lisado foi em seguida
centrifugado a 120003g durante 5 min. Trinta microgramas de proteína
As amostras foram fervidas em uma proporção de 3: 1 com tampão de amostra
(250 mM Tris-HCl pH 6,8, 40% de glicerol, 20% de b-mercaptoetanol,
8% de SDS e 0,04% de azul de bromofenol), e submetidas a electroforese
em SDS-PAGE. Proteínas resolvidas foram então
transferidos para membranas Hybond-ECL (Amersham Bioscience,
U.K.), que foram bloqueados com 0,05% de Tween 20
PBS (PBS-T) contendo 10% de leite desnatado em pó (Wako,
Osaka, Japão) e sondadas com anticorpos primários e secundários
juntamente com peroxidase. Depois de lavar três vezes
com PBS-T, o anticorpo ligado foi desenvolvido usando um
ECL mais Western Blotting Detection System (Amersham
Biosciences, Reino Unido).
RESULTADOS
ERW scavenges H2O2 intracelular
e diminui a
Liberação de H2O2
A partir de células A549 Foi relatado
que as células cancerosas produzem grandes quantidades de ROS, incluindo
H2O2
14) e que exógeno estimula a indução de ROS
VEGF em vários types.18,31 célula) ERW demonstrou efectivamente
limpar intracelular em células ROS HIT-T15 (uma
hamster linha de células do pâncreas) 0,25) Estes dados em conjunto sugerem
ERW que pode regular a expressão de VEGF por meio de ROS.
Para testar essa idéia, e que verifique se a atividade captadora de ROS
de ERW é aplicável a outros tipos de células, que começou por analisar
o efeito de eliminação de ERW em células A549. A549
As células foram tratadas com MEM contendo RGE e, em seguida, incubadas
com DCFH-DA. H2O2 intracelular
níveis foram medidos
utilizando citometria de fluxo através da determinação da intensidade do
de fluorescência relativamente ao de células de controlo, tal como detalhado no
Materiais e métodos. Os resultados mostraram uma redução de intracelular
H2O2
, Como a curva do sinal obtido a partir ERWtreated
As células A549 (designadas como "RGE") foi transferida para o
esquerda em comparação com células A549 não tratadas (designadas como
"Controlo") (Fig. 1A). Este deslocamento da curva de sinal seria
indicar a eliminação do H2O2
. Assim ERW foi sugerido
limpar H2O2 intracelular
em células A549. Para testar a ROS

atividade de ERW limpeza, que examinou o efeito de ERW
sobre a liberação de H2O2
a partir de células A549. O nosso método de ensaio foi
baseado na conversão do ácido homovanílico, um substituído
fenol, para o seu dímero fluorescente na presença de H2O2
peroxidase de rábano. Como mostrado na Fig. 1B, quando A549
As células foram pré-tratadas com ERW durante 24 h, a libertação de H2O2
a partir de células A549 diminuiu para cerca de 40% em comparação
para o controlo não tratado (p, 0,05). Assim, os resultados confirmaram
um report.25 anterior)
Os presentes resultados de dois ensaios diferentes, capazes de
sal / cloreto de tetrazólio nitro-azul (/ NBT BCIP) substrato
foi adicionado até túbulos desenvolveu uma cor roxo escuro. co-culturas
Foram, em seguida, seco e analisado. Formações túbulo em
o sistema de co-cultura foram observadas por microscopia de contraste de fase
e microfotografias foram documentados com um
câmera digital (Olympus, Japão). As imagens gravadas foram analisados
A angiogênese por Análise de Imagem de Software (AngioSys
1.0, TCS, Cellworks, Reino Unido). Doze campos aleatórios por poço
foram fotografadas para avaliação formação de túbulos.
Ocidental análise de transferência de células tratadas adequadamente foram
lavou-se com PBS, e incubadas com tampão de extracção
(50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, 1%
NP-40, 0,1% de SDS, 10 mg / ml de aprotinina e EDTA 10 mM) sobre
gelo. As células foram recolhidas com um raspador. O lisado foi em seguida
centrifugado a 120003g durante 5 min. Trinta microgramas de proteína
As amostras foram fervidas em uma proporção de 3: 1 com tampão de amostra
(250 mM Tris-HCl pH 6,8, 40% de glicerol, 20% de b-mercaptoetanol,
8% de SDS e 0,04% de azul de bromofenol), e submetidas a electroforese

em SDS-PAGE. Proteínas resolvidas foram então
transferidos para membranas Hybond-ECL (Amersham Bioscience,
U.K.), que foram bloqueados com 0,05% de Tween 20
PBS (PBS-T) contendo 10% de leite desnatado em pó (Wako,
Osaka, Japão) e sondadas com anticorpos primários e secundários
juntamente com peroxidase. Depois de lavar três vezes
com PBS-T, o anticorpo ligado foi desenvolvido usando um
ECL mais Western Blotting Detection System (Amersham
Biosciences, Reino Unido).
RESULTADOS
ERW scavenges H2O2 intracelular
e diminui a
Liberação de H2O2
A partir de células A549 Foi relatado
que as células cancerosas produzem grandes quantidades de ROS, incluindo
H2O2
14) e que exógeno estimula a indução de ROS
VEGF em vários types.18,31 célula) ERW demonstrou efectivamente
limpar intracelular em células ROS HIT-T15 (uma
hamster linha de células do pâncreas) 0,25) Estes dados em conjunto sugerem
ERW que pode regular a expressão de VEGF por meio de ROS.
Para testar essa idéia, e que verifique se a atividade captadora de ROS
de ERW é aplicável a outros tipos de células, que começou por analisar
o efeito de eliminação de ERW em células A549. A549
As células foram tratadas com MEM contendo RGE e, em seguida, incubadas
com DCFH-DA. H2O2 intracelular
níveis foram medidos
utilizando citometria de fluxo através da determinação da intensidade do
de fluorescência relativamente ao de células de controlo, tal como detalhado no

Materiais e métodos. Os resultados mostraram uma redução de intracelular
H2O2
, Como a curva do sinal obtido a partir ERWtreated
As células A549 (designadas como "RGE") foi transferida para o
esquerda em comparação com células A549 não tratadas (designadas como
"Controlo") (Fig. 1A). Este deslocamento da curva de sinal seria
indicar a eliminação do H2O2
. Assim ERW foi sugerido
limpar H2O2 intracelular
em células A549. Para testar a ROS
atividade de ERW limpeza, que examinou o efeito de ERW
sobre a liberação de H2O2
a partir de células A549. O nosso método de ensaio foi
baseado na conversão do ácido homovanílico, um substituído
fenol, para o seu dímero fluorescente na presença de H2O2
peroxidase de rábano. Como mostrado na Fig. 1B, quando A549
As células foram pré-tratadas com ERW durante 24 h, a libertação de H2O2
a partir de células A549 diminuiu para cerca de 40% em comparação
para o controlo não tratado (p, 0,05). Assim, os resultados confirmaram
um report.25 anterior)
Os presentes resultados de dois ensaios diferentes, capazes de
Janeiro 2008 endógeno 21measuring e H2O2 exógeno
níveis claramente
demonstraram que ERW tem o potencial para reduzir e / ou
limpar H2O2
ERW inibe tanto VEGF Expressão Gênica e extracelular
A secreção em células A549 Como havíamos confirmado
ERW que reduz a produção de H2O2 a partir de células A549, investigamos

utilizando um método de RT-PCR para determinar se H2O2
e os níveis de VEGF são coordenadamente regulada por ERW em A549
células.
Os iniciadores foram concebidos para amplificar um produto de 495 pb para o
VEGF121 transcrito e um produto de 625 pb para o VEGF165
transcrito. Electroforese em gel de agarose foi realizado para dissolver
Produtos de RT-PCR (Fig. 2A). Relações entre a intensidade da banda
entre os diferentes períodos de incubação para GAPDH e aqueles
para os dois produtos de isoformas de VEGF foram usadas para comparar
os níveis de transcrição dependentes do tempo (Fig. 2). os resultados
mostrou que o tratamento ERW transcrições de regulada para baixo
VEGF165 e VEGF121 de um modo dependente do tempo. notavelmente,
quando as células foram tratadas com ERW durante 24 h, a transcrição de VEGF
foi suprimida de forma significativa, enquanto que de GAPDH
pouco mudou; indicando que os resultados não eram devidas à
efeitos citotóxicos de RGE (Fig. 2A).
O VEGF é conhecido por ser segregado fora das células tumorais para exercer
o seu efeito angiogénico por estimular a proliferação e migração
de cells.18 endotelial) Portanto, o efeito de ERW em
a secreção de VEGF em células A549 foi testado. a secreção
de VEGF a partir de células de controle aumentou em um tempo-dependente
forma, ao passo que ERW suprimidos, gradativamente o aumento
na secreção de VEGF (Fig. 2B). Uma diferença significativa
nas acumulações de VEGF segregadas entre o controle
(1217.94661.83 pg / ml) e amostras tratadas (1095,536
21,50 pg / ml) só foi observada quando as células A549 foram
22 Vol. 31, N ° 1
Figo. 1. intracelular H2O2 Scavenging Atividade de ERW (A) e Supressão
de H2O2 lançamento de células A549 por ERW (B)

(A) As células A549 cultivadas foram pré-tratadas durante 30 min com 10% de FBS / MEM /
ERW, então
incubadas com 5 mM de DCFH-DA, durante 30 min a 37 ° C. A intensidade da fluorescência
DCFH foi medida com um citómetro de fluxo. A intensidade de fluorescência relativa a esse
de células de controlo é apresentada como curvas. A curva designada por "controlo" é a

fluorescência
intensidade obtido a partir de células A549 controlo. A curva designada como "RGE" é
a intensidade de fluorescência obtidos a partir de células A549 tratadas com RGE. H2O2
eliminação
actividade foi considerada positiva, como a curva ERW-tratamento (RGE) foi deslocado para a
esquerda
em comparação com a curva de controlo (Controlo). Mn X nos painéis de ERW e Controle
significa a média da intensidade de fluorescência. Um resultado representativo é mostrado a

partir de três
experimentos independentes. (B) ERW foi adicionado às células A549 em cultura, seguida de
outra
24 h de incubação. H2O2 lançado
no meio de cultura foi medida como descrito em
Materiais e métodos. As diferenças foram analisados pelo teste t de Student (os valores são a
mean6S.D., n53). Um asterisco representa uma diferença significativa em comparação com os

controles
(* P, 0,05) e os valores de p, 0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Figo. 2. ERW-regulação da transcrição VEGF e secreção
(A) Quatro conjuntos de células A549 foram tratadas com ERW para 0,5, 4 e 24 h. As células
A549
tratadas por períodos de tempo designados foram usados para isolar os ARN totais. VEGF e
Transcritos de GAPDH foram detectados por RT-PCR com um conjunto adequado de

iniciadores, conforme
mostrado em Materiais e Métodos. Os valores acima do painel foram normalizados por

arbitrariamente
definindo a densitometria de VEGF165 e VEGF121 bandas no tempo zero para 1,0. A GAPDH
transcrito foi usado como um controle interno para a atividade celular. (B) A549 (53105
células)
células / poço foram semeadas em placas de 24 poços com 10% de FBS / MEM para 0,5, 4 e 24
h. o
o meio foi substituído com MEM isento de soro / ERW para os períodos de tempo indicados. o
meio foi colhido para medir uma quantidade de VEGF segregada por células A549, conforme
descrito
em Materiais e Métodos. Colunas cheias (j), controla cultivadas em sem soro
MEM / Milli Q; colunas abertas (h), testa cultivadas em MEM sem soro / ERW. os resultados
de 3 experimentos independentes foram analisadas pelo teste t de Student (valores são os
mean6S.D., n53). Um asterisco representa uma diferença significativa em comparação com o
controlo (* p, 0,05) e os valores de p de 0,05 são considerados estatisticamente

significant.treated com ERW durante 24 h (p, 0,05, Fig. 2B). Isso atrasou
resposta de secreção de VEGF em comparação com a proteína VEGF
O nível de transcrição do gene, que, após 4 horas de tratamento para redução
cerca de 30-40%, pode ser atribuível ao ponto de ensaio
diferenças, ou seja, os níveis de proteína acumulados transcrição e
porque RT-PCR detecta transcritos específicos diretamente em específico
total de pontos de tempo, enquanto o VEGF ensaio detecta acumulada
VEGF165 proteína durante os períodos de incubação indicados.
ERW Inativa transcrição do gene ERK1 / 2 VEGF
foi demonstrada a ser regulado por ERW, sugerindo que a sua
ponto de acção é a um nível de transcrição do gene e / ou pelo sinal
níveis da via de transdução a montante para iniciação da transcrição
complexos. Como passo inicial, o sinal de transdução
via envolvida na regulação da expressão do gene de VEGF foi
investigou o uso de inibidores específicos MAPK, SB203580 (p38
Inibidor de MAPK), PD98059 (inibidor de MEK, que é uma a montante
quinase da via ERK) e JNKI (inibidor de JNK).
Para esta finalidade, o mesmo sistema de ensaio de RT-PCR
e meios de análise, como na Fig. 2A, foram utilizados para quantificar
Transcrições de VEGF (Fig. 3A). Os resultados mostraram que apenas
PD98059 bloqueada a expressão do VEGF, sugerindo uma importante

papel para o caminho de Ras-Raf-MEK-ERK, particularmente
ERK1 / fator de 2, na regulação da expressão de VEGF em células A549
(Fig. 3A). Outros inibidores, SB203580 e JNKI, não fez
mostrar qualquer efeito inibidor significativo sobre a transcrição do gene de VEGF,
indicando que a JNK / o stress activated protein quinase
(SAPK) e p38 vias não estavam diretamente envolvidos na
Transcrição do gene VEGF.
Outras experiências foram realizadas para determinar se
ERW-induzida infra-regulação da expressão de VEGF é devido
a supressão de ERK1 / 2 fosforilação. western blot
As análises mostraram que a fosforilação de ERK diminuiu num
maneira dependente do tempo a 0,5 a 4 h. Após 4 h, a fosfo-ERK
nível manteve-se baixa por até 24 h, mesmo depois estendida
Tratamento ERW. A quantidade total de ERK MAPK
proteína não foi afectada pelo tratamento ERW (Fig. 3B). estes
resultados reforçaram ainda mais os resultados mostrados na Fig. 3A.
Eles também sugeriram que MEK está envolvido na regulação
de transcrição VEGF via ERK.
Efeito sobre a Formação de ERW Vascular Induzida Tubule
As células A549 por ROS exógena é conhecido por estimular
VEGF production18) e promover a morfogênese tubular
em cells.32 endotelial) Para avaliar o efeito de ERW em
formação de túbulos, quatro parâmetros; túbulo área, número de
entroncamentos, número de túbulos, e comprimento total do tubo, eram
medido. Para isso, uma co-cultura de células HUVEC e TIG
Incubou-se com misturas de meio EGM-2 e nonconditioned
MEM (Fig. 4A, Control), A549 condicionado
MEM (Fig. 4B, A549 CM), e A549 tratadas com ERW condicionado
MEM (Fig. 4C, ERW-A549 CM) a uma razão de 1: 2, respectivamente.
Co-culturas tratadas com o A549 condicionado

MEM aumentou significativamente a formação de lesões vasculares
túbulos em todos os parâmetros analisados, em comparação com o controle;
isto é, um aumento de 76% sobre as áreas totais dos túbulos, um aumento de 200%
do número de junções tubulares, um aumento de 179%
23 jan 2008
Figo. 3. VEGF expressão é regulada através de Inactivação da ERK
caminho
(A) As células A549 foram tratadas com MEM isento de soro contendo SB203580 (10 mM),
PD98059 (20 mM) ou inibidor da JNK II (40 nM) durante 24 h e RNAs totais isolados. total
Os ARN foram utilizados para amplificar VEGF165 e VEGF121 transcritos por RT-PCR com o
respectivo
conjuntos de iniciadores. Os produtos amplificados foram resolvidos num gel de agarose e

electroforese
bandas foram fotografadas e documentadas através de uma câmera digital. As imagens

gravadas
foram analisados por um programa analisador de imagens NIH (1.62f imagem), utilizando um
computador pessoal.
Os valores acima do painel foram normalizados por forma arbitrária definindo a densitometria
de
VEGF165 e VEGF121 bandas no tempo zero para 1,0. Um transcrito de GAPDH foi usada como
um
de controlo interno para a atividade celular. Controlo: sem inibidor, SB: SB203580 (p38 MAPK
inibidor), PD: PD98059 (inibidor de MEK), JNKI: inibidor JNK. (B) As células A549 foram
incubadas em MEM sem soro / ERW para os períodos indicados. Os lisados celulares foram
preparada e 30 mg de proteínas a partir de cada lisado foram resolvidas por SDS-PAGE e usada
para
Análise de Western-Blot como descrito em Materiais e Métodos. C- total e fosfo-ERK
foram detectados utilizando anticorpos MAPK e total- fosfo-ERK. Os valores acima do
painel foram normalizados pela arbitrariamente definir a densitometria de banda fosfo-ERK

para
1.0. Total de ERK foi usado para monitorar a atividade celular.
Figo. 4. Efeitos da ERW no A549 celular condicionado Medium-Induced Vascular
formação de túbulos
HUVEC / TIG-1 co-cultura de uma placa de 24 poços foi desafiado com misturas de EGM-
2 e MEM meio condicionado não (A. Controlo), A549 condicionado de células MEM (B.
A549 CM) e MEM condicionado de células A549 tratadas com ERW (C. ERW-A549 CM)
misturado
a 1: 2, respectivamente. Os meios foram trocadas a cada 2 d. No dia 11, as formações

tubulares foram
detectadas com um kit de coloração Tubule e visualizadas por microscopia de contraste de

fase. Fotomicrografias
a partir de uma câmera digital foram utilizados para caracterizar túbulos. As imagens gravadas
foram analisados pelo software angiogénese quantificação (D). Doze campos aleatórios
por poço foram fotografados para a avaliação de formação de túbulos. Os dados são expressos
como uma percentagem
da área total, o número de junções, o número de túbulos e do total
Comprimento do tubo em células de controlo não tratadas (mean6S.E.). Os asteriscos

representam uma significativa
diferença em relação aos controles (** p, 0,01). valores de p, 0,05 foram considerados
estatisticamente
significant.the número de túbulos, e um aumento de 65% do total de túbulo
comprimento, respectivamente (Figura 4D:. compara controlo e A549
CM). Tomando estes resultados em consideração, condicionada
meio derivado de células A549 cultivadas com ERW (ERWA549
CM) foi usado para ver como ERW influencia o túbulo
parâmetros de formação. Os resultados mostraram que o tratamento ERW
afectado apenas o comprimento total dos túbulos, diminuindo-a numa
estatisticamente significativa em relação ao nível A549 CM tratados
células (. p, 0,01, Fig 4D: veja comprimento total dos túbulos). embora,
o parâmetro de comprimento total dos túbulos é comumente usado para quantitativa
Análise de formação de túbulos, outros parâmetros eram
também medido. ERW foi mostrado para exercer a sua influência por
supressão marginalmente as três outros parâmetros, embora
não a um nível estatisticamente significativo (Fig. 4D). estes resultados
fortemente sugerido que ERW exerce um efeito inibidor sobre

angiogénese induzida por tumores por meio de regulação para baixo-H2O2
e libertar VEGF secreção a partir de células A549 (Fig. 4).
DISCUSSÃO
Nossos resultados sugerem que ERW reduz H2O2
induzido
A expressão de VEGF em uma linha de células de adenocarcinoma do pulmão humano,
A549. Como as células cancerosas produzem ROS, incluindo H2O2
, A liberação
de H2O2
poderia ser um gatilho para o processo angiogénico
aqueles câncer cells.9,11,12,14) Como assim, H2O2
Também tem sido demonstrado
para induzir a expressão do VEGF significativo em várias células
types.33-35) Além disso, a vascularização do tumor tem sido mostrado para ser
diretamente relacionada com a produção de VEGF por tumors.36-41)
O bloqueio dos tumores VEGF segregada por um anticorpo anti-VEGF
causou danos significativos em cells.42 endotelial) Estes
resultados, juntamente apoiam fortemente a hipótese de que o
bloqueio de H2O2
liberação e secreção de VEGF de câncer
células tem valor terapêutico, conferindo um antiangiogênico
efeito. Ao longo desta linha, antioxidantes, tais como N-acetilcisteína,
vitamina E, catequinas, polifenóis e naturais de vinho tinto
foram avaliados quanto à sua eficácia, com results.42-47 positivo)
A via de transdução de sinal para a expressão de VEGF é
altamente divergentes e é tipo de célula dependente. envolvimento de
tanto fosfatidilinositol 39-quinase e MAPK / ERK-cinase
1/2 na regulação da expressão do VEGF é relatado em astrocytomas48)
e carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas, 49)
enquanto via fosfatidilinositol 39-quinase, mas não ERK

MAPK expressão de VEGF regulado está envolvida na hepatocelular
carcinoma.50) Assim, a p38 MAPK é relatado para afectar
A expressão de VEGF no músculo liso vascular, 43) e da mama
cancer51) células, enquanto que a ERK MAPK fá-lo em fibroblastos, 52)
e carcinoma.53 cólon) No presente estudo, pelo menos ERK
Foi provado estar envolvido na regulação da expressão de VEGF
em células de adenocarcinoma do pulmão A549, porque só PD98059
bloqueados expressão de VEGF nas células (Fig. 3).
Activação de ERK é sensível a redox stress.54-58) Assim, o
redução do stress redox induzida em células ou a neutralização
do estresse oxidativo exógeno pode bloquear a ativação de
ERK MAPK, o que pode levar a uma alteração do alvo
a expressão do gene. Epigalocatequina galato, um antioxidante
contida no chá verde, inibiu a expressão de VEGF através da
supressão da ativação ERK no câncer de cólon humano HT29
cells.59) No estudo atual, ERW inativado ERK em um timedependent
forma, no prazo de 4 h, após o que ERW não mostraram
Outro efeito da ativação ERK. Isto indicou que a efi-
cácia de ERW na ativação ERK é apenas de curto prazo. a inibição
de expressão de VEGF constitutiva em células A549 pode
ser parcialmente atribuído ao bloqueio da activação de ERK pela
ERW. Além disso, considerou-se possível fator (s) de transcrição envolvido
na regulação da transcrição do gene de VEGF em relação aos
ROS. Estimulação exógena de células cultivadas por hidrogênio
peróxido (H2O2
) Foi mostrado para regular do mRNA de VEGF numa
dose e modo dependente do tempo. Activação de VEGF mRNA
Também se demonstrou que se correlacionam com uma ligação melhorada de AP-
1 e NF-kB.60) NF-kB reside no citoplasma complexado
com o inibidor de proteína I-kB mascarando a localização nuclear

sinal de NF-kB. NF-kB é activado pelo H2O2
tratamento
através de fosforilação I-kB para liberar NF-kB para nuclear
translocação através de Ras activada por mitogénio proteína cinase
(MAPK) pathway.61) Nossos resultados atuais com inibidores específicos
mostraram que a via de MAPK (p38 e JNK) não está
envolvido (Fig. 3) e, portanto, do mRNA de VEGF por activação de NFkB
são excluídos. Por outro lado, AP-1 é considerada como um
redox-sensível factor62 transcrição) e, portanto, do mRNA de VEGF
aumento da regulação por H2O2
é susceptível de envolver AP-1. outro
fator de transcrição, ETS-1, é-regulada por H2O2
via HIF-
1a que é estabilizada por H2O2
63,64) O HIF-1a (120 kDa)
é complexado com HIF-1-B (94 kDa) subunidade que forma funcional
HIF-1 (hipoxia-inducible factor-1). HIF-1a é a taxa
limitando subunidade que determina a actividade do HIF-1
complex.65) HIF-1-A é uma proteína curto viveu que é mantida
em níveis baixos e frequentemente em condições de normóxia indetectáveis, ao passo que ela
é fortemente induzido em cells.66 hipóxica) Mostramos que ERW
scavenges endógena, bem como H2O2 exógeno
(Fig. 1)
sugerindo que o HIF-1 regulado ETS-1 é menos envolvimento
provável. No entanto, tem sido demonstrado que ETS-1 contém o promotor
vários locais de ligação de factor de transcrição, incluindo AP
67) e AP-1 é considerada como uma transcrição redox-sensível
factor.62) Tomando todas estas informações em considerações,

deduzida AP-1 como o principal candidato para up-regulação
Transcrição de VEGF.
Apresentar os resultados descobriram que os níveis de mRNA foram dramaticamente
diminuiu nas células tratadas por ERW enquanto segregada
Os níveis de proteína diminuiu muito lentamente. MRNA declínio drástico
Pode ser interpretada como que a meia-vida de VEGF mRNA é
42 min68) e 4366 min69) em condições de normóxia, enquanto
a meia-vida média de ARNm eucariota é h.70 10-12) Além disso,
o mRNA VEGF contém elementos desestabilizadores
na sua 59UTR, a região de codificação e 39UTR, e três elementos
actuar aditivamente para executar uma rápida degradação sob normóxica
conditions.71) Nossos experimentos foram realizados sob normóxica
condições e, portanto, o ARNm é considerado
de curta duração. Além disso, as actividades de peróxido de hidrogénio
(H2O2
) Os factores de transcrição regulados também seria reduzido
devido ao reduzido H2O2
níveis de atividade de eliminação de
ERW. Considerando-se os tempos de incubação (0,5, 4,0, 24 h) utilizados e
de curta meia vida de VEGF mRNA, bem como a transcrição reduzido
fator (s), juntamente explicaria a diminuição drástica de
Os níveis de mRNA de VEGF nas presentes condições experimentais
(Fig. 3A). Proteína de VEGF segregada no meio não é drasticamente
diminuiu como ARNm faz. Nossa interpretação é que
os níveis de proteína de VEGF testadas são cumulativas em vez de
níveis de pontos de tempo. Assim, a quantidade de proteína irá ser acumulado
medida que o tempo de incubação é prolongada até 24 h. Aos 24 h
ponto, médio controle contém 1217.94661.83 pg / ml, enquanto
ERW tratada meio contém 1095.53621.50 pg / ml e
24 Vol. 31, No. 1thus ERW meio tratado ainda contém ca. 85% de VEGF
proteína (Fig. 2B). Então, seria de esperar que mais VEGF
proteína existem no meio condicionado, a formação de mais túbulo
vai resultar. ERW poderia ter reduzido ca. 15% de VEGF
proteína quando comparado ao controle após 24 h de incubação e assim
a formação de túbulos é exercida por ca. 85% da proteína VEGF.
Três critérios mostram as tendências embora não supressoras
níveis estatisticamente significantes, e mostrou redução significativa
no comprimento total túbulo apenas (Fig. 4D). Portanto, vascular
ensaio de formação de túbulos está em conformidade com a proteína
níveis detectados na Fig. 2B (Fig. 4D).
O mecanismo subjacente como ERW elimina efetivamente
H2O2 intracelular
Fica por esclarecer mais detalhadamente.
ERW contém uma elevada concentração de moléculas de hidrogénio,
no entanto, molécula de hidrogênio é quimicamente inerte no quarto
temperatura. Numa tentativa para ultrapassar este desafio
problema, Shirahata et ai. propôs uma hipótese de hidrogênio ativo
de água reduzido em que o hidrogénio activo com um
elevado potencial de redução foi produzido por electrólise em ERW
e desempenhou um papel fundamental na eliminação ROS.24,72) hidrogénio Ativo
pode ser produzido a partir da molécula de hidrogénio por catálise
ação de nanopartículas de metal nobre como nanoparticles.73 platina)
Nanopartículas de metais de transição, tais como Pd, Pt, Ni, e
Cu são produzidos durante o processo de electrolysis.74) platina
nanopartículas também foram demonstradas para adsorver
ativas hydrogen.75) nanopartículas de platina sintéticos foram
mostrado para eliminar superóxido radicals.76) Existe a possibilidade
que as nanopartículas de platina derivados de platina revestida
eléctrodo de titânio utilizado aqui durante a electrólise e metal
nanoparticls de 1-10 nm tamanho pode estavelmente existir em solução para

um longo time.74) Tomados em conjunto, aqui propomos uma nova hipótese
de água reduzida contendo nanopartículas metálicas e
molécula de hidrogénio da seguinte forma: (1) A electrólise produz activa
hidrogênio no eletrodo de platina catódica e hypersaturated
molécula de hidrogênio em ERW. (2) Os íons metálicos na
solução são reduzidos a nanopartículas metálicas no eléctrodo
ou em ERW rico em hidrogênio. (3) as nanopartículas de metais de transição
com baixas tendências iônicos adsorvido ou absorvido de hidrogênio ativo
podem existir estavelmente em ERW mas outros nanopartículas metálicas
com forte propensão iónicos, tais como sódio e potássio desaparecer em
ERW em breve. (4) a molécula de hidrogénio é convertido para constantemente
hidrogénio activo, que pode limpar de ROS, pela catálise de
nanopartículas metálicas. Alguns tipos de nanopartículas de metal, como
nanopartículas de platina também pode limpar diretamente ROS sem
molécula de hidrogênio.
Por outro lado, Kikuchi et ai. a hipótese de, na tentativa
para elucidar a substância eliminadora de ROS (s) no ERW
que o hidrogênio ou hidrogênio nanobubbles moleculares activados
são responsáveis pela reducibilidade de ERW.77-81) Recentemente,
hidrogénio molecular foi demonstrado que agem como um selectiva
antioxidante contra os radicais de oxigênio citotóxico como hidroxila
radical e peroxynitrite.82) Hiraoka et al. relataram que ERW
e várias águas minerais naturais também possuem atividades redutoras
e a hipótese de que é devido ao hidrogênio molecular
e / ou redutora ions.83,84 vanádio) Hanaoka et al. sugerido
que o reforço do ânion superóxido dismutation radical
a actividade pode ser explicada pelas alterações na iónico
produto de água em ERW.85,86)
As principais desvantagens da quimioterapia do cancro são os vários
os efeitos secundários dos fármacos utilizados e a resistência que pode ser

em desenvolvimento para estes fármacos. Para resolver estes problemas, a compreensão
das diferenças biológicas entre câncer e
é necessário as células normais. Também será necessário buscar
out agentes terapêuticos adequados, que podem bloquear o biológico
eventos críticos para as células cancerosas, mas não aqueles para o normal
células. As células cancerosas, em comparação com as normais, são expostos
a estresses oxidativos mais altos associados com a transformação oncogênico,
alterações na actividade metabólica, e aumentou
geração de ROS. ERW possui uma vantagem sobre muitos
outros antioxidantes em que as células cancerosas com maior oxidativo
estresse são mais susceptíveis de serem afectadas por ERW, enquanto que o normal
As células não são.
Tomados em conjunto, demonstramos aqui pela primeira vez que
ERW pode suprimir a angiogénese induzida por células A549
através de down-regulação dos processos de H2O2
e libertar a expressão de VEGF.
Além disso, nosso estudo sugere que a ERK MAPK
desempenha um papel crítico na regulação da expressão de VEGF em A549
As células, e que a inibição do VEGF por ERW parcialmente correlacionada
com a inactivação de ERK MAPK.
Embora os resultados atuais têm apontado o intracelular
locais-alvo regulados por ERW, qual componente (s) em ERW
H2O2 intracelular realmente eliminado
continua a ser elucidados.
Futuras investigações precisam ser direcionados para esclarecer
o agente redutor (es) em ERW. Além disso, nossos estudos futuros podem
ser direcionado para realizar experimentos semelhantes no âmbito normóxica
e condições de hipóxia para aprender efeitos ERW na expressão gênica
níveis que incluem confirmação de AP-1 envolvimento.
Referências
1) Hicklin D. J., L. M. Ellis, J. Clin. Oncol., 23, 1011-1027 (2005).
2) Ferrara N., Trends Cardiovasc. Med., 3, 244-250 (1993).
3) Senger DR, Perruzzi CA, Feder J., Dvorak HF, Cancer Res., 46,
5629-5632 (1986).
4) Kunz M., Ibrahim S. M., Mol. Câncer, 2, 23-35 (2003).
5) Berse B., Brown LF, Van de Water L., Dvorak HF, Senger DR,
Mol. Biol. Cell, 3, 211-220 (1992).
6) Brown LF, Berse B., Jackman RW, Tognazzi K., Guidi AJ, Dvorak
HF, Senger DR, Connolly JL, Schnitt SJ, Am. J. Pathol.,
143, 1255-1262 (1993).
7) K. Sato, K. Terada, T. Sugiyama, S. Takahashi, M. Saito, Moriyama
M., Kakinuma H., Suzuki Y., M. Kato, Kato T., Tohoku J. Exp. Med.,
173, 355-360 (1994).
8) H. Takahashi, Shibuya M., Clin. Sci., 109, 227-241 (2005).
9) Monte M., Davel L. E., S. De Lustig, Eur. J. Câncer, 33, 676-682
(1997).
10) Nilanjana M., Dipak K. D., gratuito Radic. Biol. Med., 33, 1047-1060
(2002).
11) de pedra JR, T. Collins, endotélio, 9, 231-238 (2002).
12) Qian Y., Luo J., Leonard SS, Harris GK, Millecchia L., Flynn D.
C., X. Shi, J. Biol. Chem., 278, 16.189-16.197 (2003).
13) Ushio-Fuaki M., Cardiovasc. Res., 71, 226-235 (2006).
14) Szatrowski TP, Nathan CF, Câncer Res., 51, 794-798 (1991).
15) Yoshida T., Maulik N., Engelman RM, Ho Y.-S., Magnenat J.-L.,
Rousou JA, Flack JE, III, D. Deaton, Das DK, Circulation, 96,
216-220 (1997).
16) Das DK, Engelman RM, Rousou JA, Breyer RH, Otani H.,
Lemeshow S., Res Basic. Cardiol., 81, 155-166 (1986).
17) Tosaki A., Droy-Lefaix MT, Pali T., Das DK, gratuito Radic. Biol.
Med., 14, 361-370 (1993).

18) Chua CC, Handy RC, Chua BHL, gratuito Radic. Biol. Med., 25,
891-897 (1998).
19) Inoue M., Itoh, H., Tanaka, T., Chun-T. H., K. Doi, Y. Fukunaga,
N. Sawada, Yamshita J., Masatsugu K., Saito T., S. Sakaguchi, Sone
M., Yamahara K., Yurugi T., K. Nakao, Arterioscler Thromb. Vasc.
Biol., 21, 560-566 (2001).
20) Nakae H., Inaba H., J. Trauma, 49, 511-514 (2000).
25 jan 2008
Tomados em conjunto, demonstramos aqui pela primeira vez que
ERW pode suprimir a angiogénese induzida por células A549
através de down-regulação dos processos de liberação de HO e VEGF ex- 2 2
pression. Além disso, nosso estudo sugere que a ERK MAPK
desempenha um papel crítico na regulação da expressão de VEGF em A549
As células, e que a inibição do VEGF por ERW parcialmente correlacionada
com a inactivação de ERK MAPK.21) Koseki S., Itoh, K., J. Food Prot., 64, 1935-1942 (2001).
22) Vorobjeva NV, Vorobjeva LI, Khodjaev EY, Artif. Órgãos, 28,
590-592 (2004).
23) Fujiyama Y., S. Koyama, bamba T., Tashiro H., Ono H., T. Kitahora,
7ª Funcional Água Simpósio Abstract, 2000, pp. 74-75.
24) S. Shirahata, Kabayama S., Nakano, M., Miura T., K. Kusumoto,
Gotoh, M., Hayashi H., Otsubo K., Morisawa S., Katakura Y.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 234, 269-274 (1997).
25) Li YP, Nishimura T., Teruya K., Tei M., Komatsu T., Hamasaki T.,
Kashiwagi T., Kabayama S., S. Shim-Y., Katakura Y., Osada K.,
Kawahara T., K. Otsubo, Morisawa S., Ishii, Y., Gadek Z., Shirahata S.,
Cytotechnology, 40, 139-140 (2002).
26) Huang K.-C., Yang C.-C., Lee K.-T., Chien C.-T., Kidney Int., 64,
704-714 (2003).
27) Huang K.-C., Yang C.-C, Hsu S.-P., Lee K.-T., Kiu HW, Morisawa
S., Otsubo K., Chen C.-T., Kidney Int., 70, 391-398 (2006).
28) Kim, M.-J., Kim HK, Life Sei., 79, 2288-2292 (2006).
29) Ruch W., Cooper PH, Baggiolini M., J. Immunol. Methods, 63,
347-357 (1983).
30) Tischer E., Mitchell R., T. Hartman, M. Silva, Gospodarowicz D., Fiddes
C. J., Abraham J. A., J. Biol. Chem., 286, 11947-11954 (1991).
31) Ruef J., Hu ZY, Yin L.-Y., Wu Y., Hanson SR, Kelly AB, Harker
LA, Rao GN, Runge MS, Patterson C., Circ. Res., 81, 24-33
(1997).
32) Shono T., M. Ono, Izumi H., Jimi S.-I., Matsushima K., Okamoto T.,
K. Kohno, Kuwano M., Mol. Biol., 16, 4231-4239 (1996).
33) Brauchle M., Oliver FJ, Kind P., Werner S., J. Biol. Chem., 271,
21.793-21.797 (1996).
34) Cho M., Hunt T. K., Hussain M. Z., Am. J. Physiol. Circ Coração. Physiol.,
280, H2357-H2363 (2001).
35) Zhu J.-W., Yu B.-M., Ji-Y. B., M.-H. Zheng, Li H.-D., World J. Gastroenterol.,
8, 153-157 (2002).
36) Berkman RA, Merrill MJ, Reinhold WC, Monacci WT, Saxena
A., Clark WC, Robertson JT, Ali IU, Oldfield EH, J. Clin. Invest.,
91, 153-159 (1993).
37) Wizigmann-Voss S., G. Breier, W. Risau, Câncer Res., 55, 1358-
1364 (1994).
38) Guidi AJ, Abu-Jawdeh G., Berse B., Jackman RW, Tognazzi K.,
Dvorak H. F., Brown L. F., J. Natl. Câncer Inst., 87, 12.137-12.145
(1995).
39) Mattern J., Koomagi R., Volm M., Br. J. Câncer, 73, 931-934 (1996).
40) Suzuki K., N. Hayashi, Y. Miyamoto, M. Yamamoto, K. Ohkawa, Ito
Y., Sasaki, Y., Yamaguchi Y., Nakase H., K. Noda, Enomoto N., Arai
K., Yamada Y., Yoshihara H., T. Tujimura, Kawano K., Yoshikawa, K.,
Kamada T., Câncer Res., 56, 3.004-3.009 (1996).
41) Balsari A., Maier JA, Colnaghi MI, Menard S., Lab. Invest., 79,
897-902 (1999).
42) Malafa MP, Fokum FD, Smith L., Louis A., Ann. Surg. Oncol., 9,
1023-1032 (2002).
43) Oak M.-H., Chataigneau M., Keravis T., Chataigneau T., Beretz, A.,
Andriantsitohaina R., Stoclet J.-C., Chang S.-J., Schini-Kerth VB, Arterioscler.
Thromb. Vasc. Biol., 23, 1001-1007 (2003).
44) Agarwal A., Munoz-Najar U., Klueh U., S. Shih-C., Claffey KP, Am.
J. Pathol., 164, 1683-1696 (2004).
45) Castilla MA, Neria F., Renedo G., Pereira DS, Gonzalez-Pacheco
FR, Jimenez S., Tramon P., Deudero JJP, Arroyo MVA, Yaguee
S., Caramelo C., Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 286, C1170-C1176
(2004).
46) Tang F.-Y., Chiang E.-P. I., Shih C.-J., J. Nutr. Biochem., 18, 391-399
(2007).
47) Sadowska AM, Manuel-y-Keenoy B., De Backer WA, Pulm. Pharmacol.
Ther., 20, 9-22 (2007).
48) Madeiras SA, McGlade CJ, Guha A., Neuro-Oncologia, 4, 242-252
(2002).
49) Dong G., Chen Z., Li ZY, Yeh NT, Bancroft CC, Van Waes C.,
Câncer Res., 61, 5911-5918 (2001).
50) Huang GW, Yang LY, Lu WQ, World J. Gastroenterol., 10, 809-
812 (2004).
51) Xiong S., Grijalva R., Zhang L., Nguyen NT, Pisters PW, Pollock
RE, Yu D., Cancer Res., 61, 1727-1732 (2001).
52) Milanini J., Vinals F., J. Pouyssegur, Páginas G., J. Biol. Chem., 273,
18.165-18.172 (1998).
53) Jung YD, Nakano K., Liu W., Gallick GE, Ellis LM, Cancer Res.,
59, 4804-4807 (1999).
54) Guyton KZ, Liu Y., Gorospe M., Xu Q., Holbrook NJ, J. Biol.
Chem., 271, 4138-4142 (1996).

55) R. Aikawa, Komuro, I., Yamazaki T., Y. Zou, Kudoh S., Tanaka, M., Shiojima
I., Hiroi Y., Yazaki Y., J. Clin. Invest., 100, 1813-1821 (1997).
56) Abe M. K., Kartha S., A. Karpova Y., Li. J., Liu T. P., L. W. Kuo, Hershenson
M. B., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 18, 562-569 (1998).
57) Wang X., Martindale JL, Liu Y., Holbrook NJ, Biochem. J., 333,
291-300 (1998).
58) Gaitanaki C., Konstantina S., Chrysa S., Beis I., J. Exp. Biol., 206,
2759-2769 (2003).
59) Jung YD, Kim MS, Shin BA, Chay KO, Ahn BW, Liu W., Bucana
C. D., Gallick G. E., Ellis L. M., Br. J. Câncer, 84, 844-850
(2001).
60) Chua CC, Handy RC, Chua BHL, gratuito Radic. Biol. Med., 25,
891-897 (1998).
61) eyries M., Collins T., Khachigian LM, endotélio, 11, 133-139
(2004).
62) ordway J. M., D. Eberhart, Curraqn T., Mol. Cell. Biol., 23, 4257-
4266 (2003).
63) Wilson LA, Gemin A., R. Espiritu, Singh G., FASEB J., artigo expressa
10,1096 / fj.05-4401fje (2005).
64) Oikawa M., M. Abe, Kurosawa H., Hida W., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 289, 39-43 (2001).
65) Huang LE, Arany Z., Livingston DM, Bunn HF, J. Biol. Chem.,
271, 32253-32259 (1996).
66) Berra E., Pages G., J. Pouyssegur, Cancer Metástase Rev., 19, 139-
145 (2000).
67) Chen JH, Wright CD, Oncogene, 8, 3375-3383 (1993).
68) Liu LX, Lu H., Luo Y., Data T., Belanger AJ, Vincent KA, Akita
GY, Goldberg M., Cheng SH, Gregory RJ, Jiang C., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 291, 908-914 (2002).
69) Levy AP, Levy NS, Goldberg MA, J. Biol. Chem., 271, 2746-
2753 (1996).
70) Yoo PS, Mulkeen AL, Cha CH, World J. Gastroenterol., 12,
4937-4942 (2006).
71) Dibbens JA, Miller DL, Damert A., Risau W., Vadas MA,
Goodall G. J., Mol. Biol. Cell., 10, 907-919 (1999).
72) Shirahata S., "Tecnologia de Células Animais: Aspectos Básicos e Aplicadas,"
Anais da Reunião JAACT 13, 16-21 novembro de 2000, ed.
por Shirahata S., Teruya K., Katakura Y., Kluwer, Fukuoka-Karatsu,
Japão, 2002, pp. 25-30.
73) Minaev B., Ågren H., J. Mol. Catai. A, 149, 179-195 (1999).
74) Roucoux A., J. Schulz, Patin H., Chem. Rev., 102, 3757-3778 (2002).
75) Isobe Y., Yamauchi M., Ikeda R., Kitagawa H., Synthetic Metals,
135-136, 757-758 (2003).
76) Ayumi T., Kashiwagi T., Aramaki S., T. Imada, T. Komatsu, Y. Li,
Teruya K., Katakura Y., Kabayama S., Otubo K., S. Morisawa, Shirahata
S., "Tecnologia de Células Animais Atende Genomics," Proceedings
Na reunião de 18 ESACT, 11-14 de maio de 2003, ed. por Godia F.,
Fussenegger M., Springer, Granada, Espanha, 2005, pp. 249-251.
77) Kikuchi K., Takeda H., Rabolt B., Okaya T., Ogumi Z., Saihara Y.,
Noguchi, H., J. Electroanal. Chem., 506, 22-27 (2001).
78) Kikuchi K., Takeda H., Rabolt B., Okaya T., Ogumi Z., Saihara Y.,
Noguchi, H., J. Appl. Electrochem., 31, 1301-1306 (2001).
79) Kikuchi K., Tanaka Y., Saihara Y., M. Maeda, M. Kawamura, Ogumi
Z., J. Colloid Interface Sei., 298, 914-919 (2006).
80) Kikuchi K., Tanaka Y., Y. Saihara, Ogumi Z., Electrochim. Acta, 52,
904-913 (2006).
81) Kikuchi K., Nagata, S., Tanaka, Y., Y. Saihara, Ogumi Z., J. Electroanal.
Chem., 600, 303-310 (2007).
82) Ohsawa I., M. Ishikawa, K. Takahashi, M. Watanabe, K. Nishimaki,
Yamagata K., Katsura K.-I., Katayama Y., Asoh S., Ohta S., Nat. Med.,
13, 688-694 (2007).
83) Hiraoka A., Takemoto M., T. Suzuki, A. Shinohara, Chiba M., Shirao
M., Yoshimura, Y., J. Saúde Sci., 50, 456-465 (2004).
84) Hiraoka A., Sasaki S., T. Yamada, Shinohara A., Chiba M., J. Saúde
Sci., 52, 817-820 (2006).
85) Hanaoka K., J. Appl. Electrochem., 31, 1307-1313 (2001).
86) Hanaoka K., D. Sun, Lawrence R., Kamitani Y., Fernandes G., Biophys.
Chem., 107, 71-82 (2004).
26 Vol. 31, No. 1APPLIED E AMBIENTAL microbiologia,
0099-2240 / 99 / $ 04.0010
Setembro 1999, p. 4276-4279 Vol. 65, No. 9
Copyright © 1999, a Sociedade Americana de Microbiologia. Todos Os Direitos Reservados.
Eficácia de Electrolyzed Oxidante Água para Inactivating

Escherichia coli O157: H7, Salmonella enteritidis,
e Listeria monocytogenes
KUMAR S. VENKITANARAYANAN, 1 GABRIEL O. EZEIKE, 2 Yen-CON Hung,
2
E MICHAEL P. DOYLE2
*
Departamento de Zootecnia da Universidade de Connecticut, em Storrs, Connecticut 06269,1
e Centro de Segurança Alimentar e Melhoria de Qualidade, College of Agricultural e
Ciências Ambientais, Universidade da Geórgia, Griffin, Georgia 30223-17972
Recebido 14 de dezembro de 1998 / Aceito 18 junho de 1999
A eficácia da água oxidante electrolisado para a inactivação de Escherichia coli O157: H7,
Salmonella enteritidis,
e Listeria monocytogenes foi avaliada. Uma mistura de cinco cepa de E. coli O157: H7, S.
enteritidis, ou L. monocytogenes
de aproximadamente 108 CFU / ml foi inoculado em 9 ml de electrólise de oxidação água

(tratamento) ou 9
ml de água estéril, desionizada (controlo) e incubou-se a 4 ou 23 ° C durante 0, 5, 10, e 15 min;

a 35 ° C durante 0, 2, 4,
e 6 min; ou a 45 ° C durante 0, 1, 3, e 5 min. A população sobrevivente de cada patógeno em

cada tempo de amostragem
foi determinada em agar de soja tríptica. No 4 ou 23 ° C, um tempo de exposição de 5 minutos

reduziu as populações de todos os três
patógenos nas amostras de tratamento por cerca de 7 log UFC / ml, com inativação completa
por 10 min de
exposição. Uma redução de> 7 log UFC / ml nos níveis dos três agentes patogénicos ocorreu
nas amostras de tratamento
incubou-se durante 1 min a 45 ° C ou durante 2 min a 35 ° C. As contagens bacterianas de

todos os três agentes patogénicos em amostras de controlo
permaneceu a mesma durante toda a incubação em todos os quatro temperaturas. Os

resultados indicam que electrolisada
oxidação da água pode ser um desinfetante útil, mas os aplicativos apropriados precisam ser
validados.
Enterohemorrágica Escherichia coli O157: H7, Salmonella
enteritidis, e Listeria monocytogenes são patógenos de origem alimentar
uma grande preocupação de saúde pública nos Estados Unidos. A
variedade de alimentos, incluindo aves, ovos, carne, leite, frutas e
vegetais, têm sido implicados como veículos de um ou mais de
esses patógenos em surtos de doenças transmitidas por alimentos (2, 4, 5).
O programa de Redução de Patógenos do Departamento de US
Agricultura Segurança Alimentar e Serviço de Inspeção recomenda
tratamentos antimicrobianos como um método para a redução ou inactivação
bactérias patogênicas em alimentos (13). Métodos efectivos de
redução ou eliminação de patógenos em alimentos são importantes para
a implementação bem sucedida de Análise de Perigos e Pontos Críticos
Ponto de Controle (HACCP) programas pela indústria de alimentos e de
o estabelecimento de pontos críticos de controle em restaurantes, casas,

e outras unidades de serviço de alimentação. A lavagem dos produtos agrícolas crus
com água é praticada na indústria; no entanto, a lavagem
por si só não torne o produto completamente livre de patógenos.
Apesar de muitos produtos químicos geralmente reconhecido como seguro
(GRAS), incluindo os ácidos orgânicos, possuem actividade antimicrobiana
contra os agentes patogénicos de origem alimentar, ninguém pode eliminar altas populações
de agentes patogénicos quando eles são utilizados individualmente nas concentrações
aceitáveis em alimentos. Tratamentos de frutas e legumes
com água contendo desinfetantes, incluindo cloro,
pode reduzir, mas não eliminar agentes patogénicos na superfície de
produzir (2, 14). Deste modo, existe uma necessidade de, e no interesse,
desenvolvimento de tratamentos antimicrobianos práticas e eficazes para
a inativação de microrganismos patogênicos em alimentos.
Electrolisado oxidante água (EO) é o produto de um
novo conceito desenvolvido no Japão. Pesquisa realizada no Japão
revelou que a electrólise de água desionizada contendo uma
baixa concentração de cloreto de sódio (0,1%) numa electrólise
câmara onde ânodo e do cátodo eletrodos foram separados
por um diafragma transmitida forte bactericida e virucida
propriedades para a água coletada do ânodo (água EO).
Água a partir do ânodo tem normalmente um pH de 2,7 ou inferior, uma
potencial de oxidação-redução (ORP) superior a 1.100 mV,
e uma concentração livre de cloro de 10 a 80 ppm (10). EO
água já foi usada experimentalmente no Japão pela médica e
profissionais de odontologia para o tratamento de feridas ou desinfecção médica
equipamento. O objetivo deste estudo foi avaliar a
eficácia de água EO para matar E. coli O157: H7, S. enteritidis,
e L. monocytogenes, com vista à sua aplicação potencial para
alimentos e superfícies de contato com alimentos como um tratamento antimicrobiano.
Cultura bacteriana e mídia. Cinco amostras de cada E. coli

O157: H7, S. enteritidis, e L. monocytogenes foram utilizados para a
estudo. Os cinco cepas de E. coli O157: H7 (com origens em parênteses
seguintes designações de deformação) foram E06 (leite), E08
(carne), E10 (carne), E16 (carne) e E22 (fezes panturrilha). O S.
enteritidis isolados incluído SE180 (humano), SE457 (ovo), SE565
(salada), SE294 (ovo), e SE1697 (humano). Os cinco linhagens de
L. monocytogenes foram LM ATCC 19117 (ovelhas), LM101 (salame),
LM109 (pepperoni), LM116 (queijo), e LM201 (leite).
A E. coli O157: H7 e estirpes de L. monocytogenes, mas não
ATCC 19117, foram isoladas por um dos autores, ao passo que o
Isolados de S. Enteritidis foram obtidos a partir do Centers for Disease
Control and Prevention, Atlanta, Ga. As cepas de cada
patógeno foram cultivadas em separado em 100 ml de tríptica estéril
caldo de soja (TSB) (Disco Laboratories, Detroit, Mich.) em 250 ml
Frascos de Erlenmeyer a 37 ° C por 24 h com agitação (150 rpm).
Após a incubação, a 10 ml de cada cultura foi sedimentado pela
centrifugação (4000 g durante 3 20 minutos), lavadas e ressuspensas
em 10 ml de peptona a 0,1% de água (pH 7,1). a óptica
densidade da suspensão foi determinada e ajustada com
0,1% de água peptonada a 0,5 em 640 nm (representando aproximadamente
109 CFU / ml). A população bacteriana em cada cultura
foi confirmada por plaqueamento de porções de 0,1 ml de di- apropriadamente
* Autor correspondente. Endereço para correspondência: Centro de Segurança Alimentar
e Melhoria de Qualidade, Curso de Agricultura e Meio Ambiente
Ciências da Universidade de Georgia, 1109 Experiment St., Griffin, GA
30223-1797. Telefone: (770) 228-7284. Fax: (770) 229-3216. E-mail: mdoyle
@ cfsqe.griffin.peachnet.edu.
4276
1 min a 45 ° C ou durante 2 min a 35 ° C. As contagens bacterianas de todos os três agentes

patogénicos em amostras de controlo
permaneceu a mesma durante toda a incubação em todos os quatro temperaturas. Os
resultados indicam que electrolisada
oxidar a água pode ser um desinfectante útil, mas as aplicações apropriadas precisam ser
validated.luted cultura em agar de soja tríptica (TSA) (Disco Laboratories)
placas e incubar as placas a 37 ° C durante 48 h. para cada
patógeno, porções iguais de cada uma das cinco estirpes eram
combinado, e 1 ml da suspensão foi utilizada como inoculo
(109 CFU).
Água EO. Água EO foi gerado com um modelo ROX-
20TA EO gerador de água (Hoshizaki Electric Company Ltd.,
Toyoake, Aichi, Japão). A passagem de corrente através do OE
gerador de água e a tensão entre os eléctrodos eram
fixada em 19,8 A e 10 V, respectivamente. Uma solução a 12% de hidróxido de sódio
cloreto de (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) e água desionizada
água a partir da linha de fornecimento de laboratório foram simultaneamente
bombeada para o equipamento. O indicador de exibição foi ativado
e observado até que a máquina estabilizado em uma leitura de
19,8 A. O EO água foi coletada a partir do adequado
tomada em recipientes estéreis e foi usado no prazo de 5 min para o
estudo microbiana. As amostras para determinação do pH, ORP,
e concentração livre de cloro, também foram coletados simultaneamente.
Amostra inoculação e tratamentos. Um volume de 9 ml de OE
água (tratamento) ou estéril água deionizada (controle) foi
transferido para separar, estéreis tubos com tampa de rosca, e as tampas
foram bem fechado. Os tubos foram colocados num banho de água em
requisitar a Pré-aquecer as amostras de água até à temperatura desejada.
Para cada tubo contendo 9 mL de água desionizada ou OE
de água, 1 ml (equivalente a 109 CFU) da mistura de cinco estirpe
de E. coli O157: H7, S. enteritidis, ou L. monocytogenes foi
adicionado, e as amostras foram incubadas num banho de água (Pharmacia
LKB, Piscataway, NJ) a 4 ° C durante 0, 5, 10, e 15 min; em

23 ° C durante 0, 5, 10, e 15 min; a 35 ° C durante 0, 2, 4, e 6 min; e
a 45 ° C durante 0, 1, 3, e 5 min. Após cada incubação, a
número de células viáveis em cada amostra foi determinada por plaqueamento
Porções de 0,1 ml directamente ou depois de série (1:10) em diluições
0,1% de peptona de água em placas de TSA duplicados. Colônias do
patógeno inoculadas foram enumeradas em placas de TSA depois
de incubação a 37 ° C durante 48 h. Um volume de 1 ml de inoculado
solução (tratamento ou controlo) após a exposição a cada tempo-temperatura
combinação também foi transferida para separar 250-
frascos Erlenmeyer ml contendo 100 ml de TSB e estéril
incubada a 37 ° C durante 24 h. Após o enriquecimento em TSB, o
cultura foi riscada em agar ou MacConkey sorbitol não. 3
(Divisão Oxoid, Unipath Co., Ogdensburg, NY) (para E. coli
O157: H7), xilose lisina desoxicolato ágar (Gene-Trak, Framingham,
Mass.) (Para S. enteritidis), ou agar Oxford (GeneTrak)
(por L. monocytogenes), e as placas foram incubadas a
37 ° C durante 24 h. Colónias representativos de E. coli O157: H7 e
S. enteritidis a partir das respectivas placas foram confirmados pela
E. coli O157: H7 ensaio de aglutinação em látex (Remel Microbiologia
Produtos, Lenexa, Kansas.) E o teste de látex Salmonella (Oxoid),
respectivamente. As colônias de L. monocytogenes em ágar Oxford
foram confirmados pelo kit de teste de diagnóstico API-20E (Biomerieux,
Hazelwood, Missouri). Pelo menos em duplicado de amostras de tratamentos
e os controlos foram ensaiados em cada momento de amostragem, e
todo o estudo com cada patógeno foi replicado três vezes.
O pH e ORP de água a óxido de etileno foram medidas em duplicado
amostras imediatamente após a colheita, utilizando pH e ORP
eléctrodos (modelo 50, metros Accumet; Denver Instrumento
Company, Denver, Colorado.). A concentração livre de cloro
foi determinada por um método utilizando um titulador iodométrica digitais

(modelo 16900; Hach Company, Loveland, Colorado.). o ensaio
foi verificada periodicamente por um átomo de cloro utilizando 100 6 0,05 ppm
solução padrão (Orion Research Inc., Beverly, Mass.).
A análise estatística. Para cada tratamento, os dados do
ensaios replicados independentes foram reunidas e o valor médio
e desvio padrão foram determinados (11).
O pH, ORP, e concentração de cloro livre de OE
água a diferentes temperaturas são utilizados para o tratamento
apresentados nas Tabelas 1 a 3. O pH médio e ORP de
água deionizada estéril foram de 7,1 e 0,15 6 355 6 7,0 mV,
respectivamente. Sem cloro livre foi detectado em água deionizada.
TABELA 1. Inactivação de E. coli O157: H7, S. enteritidis, e L. monocytogenes por água EO em 4

ou 23 ° C
Bacteriana espécies Temp
(° C)
Sobrevivendo população bacteriana
(média log UFC / ml) após a exposição para: propriedade água EO
0 min 5 min 10 min 15 min ORP pH (mV) Cloro livre (ppm)
E. coli O157: H7 4 7,98 0,04 6, 1.0a
2,36 0,03 1,153 6 6 3 6 86.3 5.4
Controle 7,98 6 0,04 7,99 0,07 7,96 6 6 0,06 7,99 0,04 6
S. enteritidis 7,74 6 0,08 1,06 6 0,15 0b
2,48 0,03 1,153 6 6 2 6 83,5 7,8
Controle 7,74 6 0,08 7,68 0,09 7,61 6 6 0,11 7,60 0,12 6

L. monocytogenes 7,91 6 0,05 1,34 6 0,37 0b
2,63 0,03 1,160 6 6 4 6 43,0 4,6
Controle 7,91 6 0,05 7,88 0,06 7,87 6 6 0,06 7,91 0,03 6
E. coli O157: H7, 23 8,04 0,07 6, 1.0a
2,37 0,01 1,155 6 6 6 1 82,3 2,2
Controle 8,04 6 0,07 7,97 0,03 7,99 6 6 0,07 7,76 0,42 6
S. enteritidis 7,76 0,08 6, 1.0a
2,45 0,12 1,151 6 6 1 6 82,0 5,8
Controle 7,76 6 0,08 7,65 0,09 7,73 6 6 0,08 7,69 0,10 6
L. monocytogenes 7,89 6 0,10 1,25 6 0,33 0b
2,63 0,04 1,158 6 6 5 6 48.5 4.1
Controle 7,89 6 0,10 7,83 0,06 7,85 6 6 0,04 7,85 0,07 6
uma positiva por enriquecimento.
b negativo por enriquecimento e não há sobreviventes detectáveis por um processo de

plaqueamento direto.
VOL. 65, 1999 atividade antibacteriana de água eletrolítica COMBURENTE ÁGUA 4277EO teve
grande atividade antibacteriana em 4 e 23 ° C em
as misturas de cinco cepa de E. coli O157: H7, S. enteritidis, e
L. monocytogenes (Tabela 1). No tempo zero, e tanto o tratamento

amostras de controlo para os três patógenos teve média aproximada
contagem bacteriana de 8,0 log UFC / ml. Aos 5 min de exposição em
4 ° C, a E. coli O157: H7 em contar as amostras foi de tratamento
reduzido para menos do que 1,0 log UFC / ml (apenas detectados por enriquecimento
em TSB durante 24 h), enquanto que as populações de S. enteritidis
e L. monocytogenes foi ligeiramente maior do que 1,0 log UFC /
ml. Todos os três agentes patogénicos caiu para níveis não detectáveis (tal como
determinada tanto por procedimentos de enriquecimento e plaqueamento) depois
10 min de exposição a óxido de etileno água a 4 ° C. No entanto, não há diferenças
nas contagens bacterianas foram observadas nas amostras de controlo
ao longo do estudo. Ao fim de 5 minutos de exposição a 23 ° C, as populações
de E. coli O157: H7 e S. enteritidis no tratamento
amostras diminuiu para menos de 1,0 log UFC / ml, enquanto que o
L. monocytogenes contagem foi reduzida para 1,25 log UFC / ml. em
acordo com os resultados obtidos a 4 ° C, todos os três agentes patogénicos
eram indetectáveis após 10 min de contato com água na EO
23 ° C.
E. coli O157: H7, S. enteritidis, e L. monocytogenes foram
mais rapidamente inactivada por água OE a 35 ou 45 ° C (Tabelas 2
e 3) do que a 4 ou 23 ° C. A 35 ° C, as populações de E. coli
O157: H7 e L. monocytogenes em amostras tratadas diminuiu
a níveis indetectáveis dentro de 2 min de exposição a óxido de etileno
água, ao passo que S. enteritidis foi detectada apenas por enriquecimento da
a amostra tratada em TSB. Após 1 min de exposição a óxido de etileno
água a 45 ° C, a E. coli O157: H7, foi morto completamente (uma redução
de, aproximadamente, 8,0 log CFU / ml), enquanto que as populações
de S. enteritidis e L. monocytogenes foram reduzidas
por aproximadamente 7,0 log UFC / ml. As contagens bacterianas de todos
três agentes patogénicos em amostras de controlo continuou a ser a mesma
ao longo do estudo em ambos os 35 e 45 ° C.

A sequência teórica de reacções químicas envolvidas na
a produção de água de etileno pode ser resumido como se segue (1).
Durante a electrólise, cloreto de sódio dissolvido em água desionizada
água na câmara de electrólise se dissocia em negativamente
cloreto carregada (Cl2
) E hidroxi (OH2
) Íons e positivamente
de sódio carregada (Na1
) E hidrogênio (H1
Íons). o cloreto de
e iões de hidroxilo são adsorvidos para o ânodo, com cada ião
liberar um elétron (e2
) Para se tornar um radical. O clorídrico e
radicais hidroxi se combinam, formando o ácido hipocloroso (HOCl),
que separa a partir do ânodo. Dois radicais clorídricos também pode
se combinam para produzir gás de cloro. Na secção de cátodo, cada
de iões de sódio carregados positivamente recebe um electrão e se torna
de sódio metálico. O combina-se com sódio metálico
moléculas de água, formando hidróxido de sódio e hidrogénio gasoso.
Uma membrana bipolar separa os eléctrodos aumenta a
electrólise da água para produzir fortes águas ácidas e alcalinas
a partir do ânodo e do cátodo, respectivamente.
Os efeitos antagônicos de cloro e pH baixo sobre microrganismos
estão bem documentados. Embora os ácidos orgânicos (com
pH baixo) e solução de hipoclorito (com cloro livre) tem
sido amplamente utilizados em tratamentos para matar as bactérias de origem alimentar
TABELA 2. A inativação de E. coli O157: H7, S. enteritidis, e L. monocytogenes por água EO a 35

°C
As espécies bacterianas

E. coli O157: H7 7,97 0,03 6 0b
2,38 0,00 1,154 6 6 6 1 84,3 4,6
Controle 7,97 6 0,03 7,94 0,04 7,96 6 6 0,03 7,94 0,04 6
S. enteritidis 7,68 6 0,14, 1.0a
2,44 0,04 1,153 6 6 6 1 79,8 3,3
Controle 7,68 6 0,14 7,63 0,06 7,59 6 6 0,11 7,64 0,11 6
L. monocytogenes 7,91 6 0,10 0b
2,48 0,05 1,159 6 6 4 6 73,3 1,8
Controle 7,91 6 0,10 7,88 0,11 7,86 6 6 0,08 7,81 0,12 6

TABELA 3. Inactivação de E. coli O157: H7, S. enteritidis, e L. monocytogenes por água EO a 45 °

C
As espécies bacterianas

E. coli O157: H7 7,96 0,03 6 0b
2,39 0,02 1,153 6 6 4 6 85,8 2,7
Controle 7,96 6 0,03 7,89 0,03 7,87 6 6 0,03 7,86 0,11 6
S. enteritidis 7,70 6 0,12 1,13 6 0,33 0b
2,44 0,03 1,155 6 6 1 6 79.33 3.0
Controle 7,70 6 0,12 7,63 0,12 7,67 6 6 0,15 7,61 0,14 6
L. monocytogenes 7,91 6 0,10, 1.0a
2,48 0,05 1,159 6 6 4 6 73,3 1,8
Controle 7,91 6 0,10 7,88 0,10 7,88 6 6 0,08 7,83 0,12 6

4278 VENKITANARAYANAN ET AL. APPL. ENVIRON. MICROBIOL.in indústria de alimentos,

sistemas que envolvem altos valores de ORP,
maior do que 1.000 mV, normalmente não foram utilizados. o ORP
de uma solução é um indicador da sua capacidade para oxidar ou reduzir,
com valores positivos e mais elevados correlacionados com maior ORP
força oxidante (6, 8, 9). Um ORP de 1200-1800 mV é
ideal para o crescimento de microrganismos aeróbios, enquanto que um
ótima gama de 2200-2400 mV é favorecido para o crescimento de

microrganismos anaeróbios (6). Desde o ORP de água EO em
este estudo foi maior do que 1.100 mV, o ORP provavelmente desempenhou um
papel influente, em combinação com um pH baixo e de cloro livre,
em matar microorganismos. Uma possível explicação para a alta
ORP de água EO é o oxigênio liberado pela ruptura do
elo fraco e instável entre radicais hidroxi e clorídricos
(1). Se a hipótese de que o baixo pH em água EO sensibiliza
as membranas exteriores das células bacterianas, permitindo deste modo que hipocloroso
ácido para introduzir as células bacterianas mais eficientemente.
Ácido células adaptadas de Salmonella typhimurium foram relatados para
ser mais sensível à inactivação pelo ácido hipocloroso de
células nonadapted, devido ao aumento da sensibilidade da membrana externa
de ácido hipocloroso em células adaptado-ácido (7). experiências para
identificar as contribuições das diferentes componentes do OE
água para a sua atividade antimicrobiana estão em andamento em nosso laboratório.
Os efeitos da água sobre as três OE patógeno foram avaliadas
em temperaturas baixas a moderadas, no interesse da
desenvolvimento de potenciais tratamentos dip antibacterianos para não transformados
alimentos agrícolas. Não houve diferença na inactivação
Foram observadas taxas de entre os três agentes patogénicos tratamento
a 4 ° C e tratamento a 23 ° C. No entanto, a 35 e 45 ° C, muito mais
Foram observadas maiores taxas de inativação para os três patógenos.
Uma vez que o cloro é um dos componentes antimicrobianos de OE
água, avaliou-se a sobrevivência de E. coli O157: H7 e
L. monocytogenes em água deionizada estéril contendo um freechlorine
concentração de 70 a 80 ppm, o que era semelhante ao
que está presente na água EO. Os resultados revelaram reduções no
contagem bacteriana de ambos os patógenos semelhantes aos observados
OE com água, o que indica que a concentração de cloro livre
presente na água EO é suficiente para provocar as reduções

nas contagens bacterianas obtidos por água OE. embora o cloro
é altamente eficaz para matar os microrganismos patogénicos em
sistemas aquosos simples, o seu efeito antibacteriano sobre microrganismos
em alimentos é mínimo, especialmente na presença de compostos orgânicos
materiais que convertem em formas inactivas de cloro (3). para
exemplo, o tratamento de produtos frescos com 200 ppm de cloro
resulta numa redução nas L. monocytogenes contagem de menos
de 2 log UFC / g (15). Estudos comparando as eficácias de
água clorada e água EO para inativação de E. coli
O157: H7 em maçãs estão em andamento em nosso laboratório.
Os resultados revelaram que a água EO é altamente eficaz para matar
E. coli O157: H7, S. enteritidis, e L. monocytogenes, indicando
sua potencial aplicação para a descontaminação de alimentos e food
superfícies de contato. Uma vantagem de água OE é que ele pode ser
produzido com água da torneira, sem que outros produtos químicos adicionados
cloreto de sódio.
Referências
1. Anonymous. 1997. Princípio da formação de água eletrolítica. Hoshizaki
Electric Co. Ltd., Sakae, Toyoake, Aichi, Japão.
2. Beuchat, LR 1995. Os microorganismos patogênicos associados com produtos frescos.
J. Food Prot. 59: 204-216.
3. Beuchat, LR, BV Prego, BB Adler, e MRS Clavero. 1998. Eficácia
de spray de aplicação de água clorada para matar bactérias patogênicas em
raw maçãs, tomates e alface. J. Food Prot. 61: 1305-1311.
4. D'Aoust, J. 1997. espécies de Salmonella, p. 135-137. Em M. P. Doyle, R. L.
Beuchat, e TJ Montville (ed.), Microbiologia de alimentos: fundamentos e
fronteiras. American Society for Microbiology, Washington, DC
5. Doyle, M. P., T. Zhao, J. Meng, e S. Zhao. 1997. Escherichia coli O157: H7,
p. 175-178. Na MP Doyle, LR Beuchat, e TJ Montville (ed.), Food
Microbiologia: fundamentos e fronteiras. Sociedade Americana de Microbiologia,

Washington, D.C.
6. Jay, JM 1996. microbiologia de alimentos Moderno, 5ª ed., P. 48-49. Aspen Publishers,
Gaithersburg, Maryland.
7. Leyer, G. J., e E. A. Johnson. 1997. adaptação ácido sensibiliza Salmonella
typhimurium de ácido hipocloroso. Appl. Environ. Microbiol. 63: 461-467.
8. McPherson, LL 1993. Entendendo ORP de no processo de desinfecção.
Eng água. Gestão 140 (11): 29-31.
9. Robbs, PG, JA Bartz, JK Brecht, e SA Sargent. 1995. Oxidationreduction
potencial de soluções de cloro e a sua toxicidade para Erwinia caratovora
subsp. caratovora e Geotrichum candidum. Planta Dis. 79: 158-162.
10. Shimizu, Y., e T. Hurusawa. 1992. antiviral, antibacteriano, antifúngico e
acções de água oxidante electrolyzed através de eletrólise. Dental J. 37:
1055-1062.
11. Steel, R. G. D., e J. H. Torrie. 1980. Princípios e procedimentos de estatística.
McGraw-Hill, New York, N.Y.
12. Tryland, I., M. Pommepuy, e L. Fiksdal. 1998. Efeito da cloração em
atividade BD-galactosidase de bactérias de esgoto e Escherichia coli. J. Appl.
Bacteriol. 85: 51-60.
13. Departamento de Agricultura dos EUA Segurança Alimentar e Serviço de Inspeção. De

1995.
Redução Pathogen: Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (HACCP)
sistemas. Proposta de códigos de faturamento 3410-DM-P. Súmula no. 93-016P.

Departamento EUA
da Agricultura, Beltsville, Md.
14. EUA Food and Drug Administration. 1997. Guia para minimizar microbiana
riscos de segurança alimentar para frutas e legumes frescos. Centro de Segurança Alimentar
e Nutrição Aplicada, US Food and Drug Administration, Washington,
DC
15. Zhang, S., J. M. e Farber. 1996. Os efeitos das várias desinfectantes contra
Listeria monocytogenes em recém-colhidas legumes. Food Microbiol. 13: 311-321.
VOL. 65, 1999 atividade antibacteriana de electrolyzed COMBURENTE ÁGUA 4279

O157: H7 em maçãs estão em andamento em nosso laboratório.
Os resultados revelaram que a água EO é altamente eficaz para matar
E. coli O157: H7, S. enteritidis, e L. monocytogenes, indicando
sua potencial aplicação para a descontaminação de alimentos e food
superfícies de contato. Uma vantagem de água OE é que ele pode ser
produzido com água da torneira, sem outros produtos químicos adicionados que produziu com
a TAP
sódio chloride.Biophysical Chemistry 107 (2004) 71-82
0301-4622 / 04 / $ - ver matéria frente Q 2003 Elsevier BV Todos os direitos reservados.
doi: 10.1016 / j.bpc.2003.08.007
O mecanismo dos efeitos antioxidantes reforçadas contra
radicais ânion superóxido de água reduzida produzido por
eletrólise
Kokichi Hanaoka *, Dongxu Sun, Richard Lawrence, Yoshinori Kamitani, um CCB
Gabriel Fernandesc
Bio-REDOX Laboratory Inc. 1187-4, Oaza-Ueda, Ueda-shi, Nagano-ken 386-0001, Japão um
Hoshizaki Electric Company, Limited 16/03 Minamiyakata, Toyoake, Aichi-ken 470-1194, Japão
b
Divison de Imunologia Clínica do Departamento de Medicina da Universidade do Texas Health

Science Center em San Antonio, c
San Antonio, TX 78229, EUA
Recebido 08 de julho de 2003; recebido na forma revisão em 22 de Agosto de 2003; aceito 22

de agosto de 2003
resumo
Nós relataram que a água reduzida produzido por eletrólise reforçado o efeito antioxidante de
doadores de prótons como
ácido ascórbico (ASA) em um artigo anterior. Também demonstramos que a água reduzida
produzido por eletrólise de 2 mM
Soluções de NaCl não mostraram efeitos antioxidantes por si só. Pensamos que o reforço do
efeito antioxidante pode ser devido ao aumento do produto iónico de água como solvente. O
produto iónico de água (pKw) foi estimada
por meio de medições de pH e por um método de titulação com neutralização. Como um

indicador de danos oxidativos, Reactive
Oxigênio de espécies (ROS) mediadas quebras no DNA foram medidos pela conversão de
superenrolado FX-174 RF
I DNA de fita dupla para abrir e formas lineares. Água reduzido tinha uma tendência a suprimir
a quebra de um único fio de
ADN induzida por espécies de oxigénio reactivo produzidas por HO YCU (II) e HQyCu sistemas
(II). O aumento de 2 2
anião actividade dismutação do radical superóxido pode ser explicada pelas alterações no
produto iónico de água na reduzida
água.
Q 2003 Elsevier B.V. Todos os direitos reservados.
Palavras-chave: água reduzida; antioxidante; Produto iônico da água; danos no DNA
1. Introdução
Recentemente, uma nova tecnologia que envolve a electrólise
de água tem sido proposta para o clínico
melhoria de várias doenças. água reduzido
produzido por eletrólise da água da torneira tem uma maior
pH (9,0-10,0), o potencial de redução menor oxidação
* Autor correspondente. Tel .: q81-268-25-1736; fax: q81-
268-24-0050.
Endereço de E-mail: hanak@rapid.ocn.ne.jp (K. Hanaoka).
(ORP), menor de oxigênio dissolvido (OD) e superior
hidrogênio dissolvido (DH) do que os não-electrolyzed
água. Redução w1-3x água, que tem tais parâmetros,
é usado extensivamente como água potável
que para além da sua utilização como um puro filtrada
água potável também pode atuar como um antioxidante
contra o estresse oxidativo. Em contraste, a água
recolhidas a partir do compartimento do ânodo é oxidado
água e tem sido amplamente utilizado como um anti-séptico
w4-6x.
Nós relataram que a água reduzida produzido por eletrólise reforçado o efeito antioxidante de
doadores de prótons como
Recentemente, uma nova tecnologia que envolve a electrólise
de água tem sido proposta para o clínico
produzido por eletrólise da água da torneira tem uma maior
pH (9,0-10,0 9,0), o potencial de redução menor oxidação
ysis de água tem sido proposto para clínica
(, Diminuir o oxigênio dissolvido
água. água reduzido
que os não-electrolyzed
(ORP) (DO) e superior
hidrogênio dissolvido (DH) do que os não-electrolyzed72 K. Hanaoka et al. / Química Biofísica

107 (2004) 71-82
Figo. 1. células de eletrólise feitas de uma acrilonitrila-butadien-
estireno montado na resina de cloreto de polivinilo. (A) do ânodo, (C)
chathode, soluções eletrolíticas membrana (M) não cobrados, (ES),
(ECS) soluções catódicos electrolyzed (o reduzido
água), (EAS) soluções ânodo electrolyzed (o oxidado
água), (PS) fonte de energia elétrica e (p) da bomba.
W7-12x estresse oxidativo no corpo humano é
provavelmente devido ao excesso de espécies reactivas de oxigénio
ou radicais livres, incluindo os radicais ânion superóxido
(O •), radicais hidroxila (• OH), y Rad- hydroperoxyl
produtos (• OOH), radicais de monóxido de azoto (NO •),
oxigénio singuleto (O) e peróxido de hidrogénio 1 molar
ecules (H 2 O 2). Entre estes, ânion superóxido
Os radicais são os mais conhecidos. Considera-se que
a atividade dismutation para os radicais ânion superóxido

é o indicador mais importante de antioxidante
efeitos. Temos estudado o efeito antioxidante de
água reduzida produzido por eletrólise w13x. o
parâmetros comumente reportados de água reduzida
que são pH, ORP, OD e DH, não explicam
o mecanismo dos efeitos antioxidantes melhoradas mas
eles são parâmetros úteis para a determinação do
energia de eletrólise, se medido imediatamente
após eletrólise. Eles são os parâmetros da
solutos na água reduzida. Nós investigamos
os parâmetros da água como solvente. o parâmetro
de solvente, a qual está directamente relacionada com o
aumento da atividade dismutation pela redução
água é o produto iônico da água. poderíamos
se obter o produto iónico de água (pKw) usando
pH e o método de titulação com neutralização. nós
definiu o produto iônico da água (pKw) como PIP
para a água eletrolítica. A água passou através do
sistema de eletrólise com nenhuma corrente aplicada foi
utilizado como controlo. Neste estudo, a PIP e do aumento
de entropia foram estimadas a partir da experimental
resultados. Nós demonstramos que o reduzido
água protege o DNA contra danos por oxigênio
radicais com base no PIP da água reduzida.
O mecanismo dos efeitos antioxidantes observados
é discutida em relação a estes parâmetros.
2. Materiais e Métodos
2.1. célula de electrólise
Meia células-Two eletrólise, feitas de butadieno-estireno-acrilonitrila
montado em cloreto de polivinilo

resina, foram preparados como mostrado na Fig. 1. Um
membrana não-carregada, (YUMICRON Y9201-T,
YUASA CORPORATION), com uma área efetiva
de 100 cm com 0,12 mm de espessura foi montado 2
entre as duas meias-células. A electrólise foi realizada
para fora através da membrana não carregado entre
estas duas meias-células equipadas com platina revestido
eléctrodos de titânio tendo uma área efectiva de 100
cm no cátodo. 2
2.2. Produtos químicos e reagentes
Os reagentes utilizados para este estudo foram specialgrade
NaCl, KCl, MgCl, CaCl, ácido 2 2 L-ascórbico
(Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.), e
como um solvente, a água, a qual foi destilada e desionizada
com uma resina de permuta iónica abaixo de 0,3 ms
cm. Para medir a y1 superóxido dismutation
actividade, um tampão de fosfato de sódio contendo 2
mM hipoxantina (Sigma Chemical Company), um
tampão de fosfato de sódio contendo, 5,5-dimetil-
1-pirrolina-óxido de (DMPO, Labotec Co., Ltd.),
superóxido dismutase (Boehringer Manheim), 0,4
unidade ml de xantina-oxidase na y1 fosfato de sódio
tampão (Merck e Co., Inc.) e ácido L-ascórbico
(ASA) foram usadas. DNA de plasmídeo FX-174RF1
(New England Biolabs, Beverly, MA), H O, 2 2
CuSO, hidroquinona, base Tris, acetato de sódio, 4
EDTA, e brometo de etídio (Sigma ChemicalK. Hanaoka et al. / Biophysical Chemistry 107
(2004) 71-82 73
Co., St. Louis, MO) e agarose (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA) foram utilizados para o ADN

medições danos.
2.3. A electrólise de cloreto de sódio 2 mM, KCl, 1 mM
MgCl 2 e CaCl 2
20 soluções L de amostra, contendo NaCl 2 mm,
KCl 2 mM, MgCl 1 mM ou 1 CaCl mM foram 2 2
preparado. Estas amostras foram bombeadas a partir da
solução recipiente através de um par de electrólise
As meias-células com uma membrana não-carregada montado
entre eles. As soluções de amostra foram sujeitas
a eletrólise em condições preestabelecidas de 0-0,8
A e 25 8C utilizando uma corrente eléctrica constante
source. A electrólise foi realizada com uma constante
taxa de 1000 "50 ml min fluir no y1 cátodo
compartimento e, 2000 "100 ml min no y1
compartimento do ânodo. A solução produzida cátodo
por eletrólise, que foi chamado reduzida
água, foi usada para as experiências no presente estudo.
2.4. As medições do pH, oxidação e redução
potencial (ORP) e oxigênio dissolvido (OD)
Os parâmetros que foram medidos para caracterizar
a água reduzida produzida por electrólise
de NaCl e 2 mM de KCl, 1 mM e MgCl 2 e
CaCl foram potencial elétrico (V) a partir do poder 2
fonte, condutividade elétrica (CE) por um CE
metro (TOA CE METER CM-14P), pH por um pH
metro (TOA ION METER IM-4OS), a oxidação
potencial de redução (ORP) por um medidor de ORP (TOA
ION METER IM-4OS) e oxigênio dissolvido
(OD) por um medidor de OD (HORIBA OM-12) a 25
8C.
2.5. Medição de iões OH y
A concentração de iões OH foi obtido y
a partir da medição do pH e por uma neutralização
método de titulação utilizando um titulador automático.
Neste estudo, o pH foi medido utilizando um medidor de pH
(TOA ION METER LM-40S, Toa Electronics Ltd.)
em amostras produzidas a cada um dos seguintes níveis
da corrente eléctrica, 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6,
0,7 e 0,8 A. titulações neutralização com 20
HCl mM foram realizadas utilizando um COMITE-550
titulador (Hiranuma Industry Co.) para o reduzido
água produzida em cada um dos mesmos níveis de
corrente eléctrica como as medições de pH.
2.6. Medição de dismutação de superóxido
atividade
1 ml de 10 mM de ácido L-ascórbico foi adicionado a
50 ml de amostras de água e reduzida para 50 ml
de NaC1 2 mM e KCl e MgCl 2 1 mM e
Soluções de CaCl, respectivamente. Superoxide dismu- 2
tação atividade foi medida utilizando um spin do elétron
ressonância (ESR) espectrômetro (ES-10, Nikkiso
Co. Ltd.). Cada mistura de reacção continha 50
2 mm de hipoxantina mM em fosfato de sódio a 3
buffer, 50 mm de amostra, 16 mm de DMPO e 3 3
50 milímetros xantina oxidase num fosfato de sódio 3
tampão. Estas misturas reaccionais foram vertidos para
uma célula plana especial para realizar as medições de ESR.
Este método ESR foi levada a cabo usando 3,7
mW de potência de microondas, 339,1 "mT 5,5 magnética
campo, a frequência de 100 kHz, 0,1 mT modulação,

0,12 s tempo de resposta e 1 min de tempo de varredura. como
a unidade para a atividade de superóxido dismutation, nós
usou a mesma unidade, tal como adoptadas Friedovich et al.
w14x. A actividade de dismutação do superóxido
amostras foi estimada por meio de interpolação
com base numa curva padrão de 0 a 30 unidades por ml
de superóxido dismutase.
2.7. A proporção de concentração de catiões de que
de aniões no compartimento do cátodo
Quando eletrólise de soluções eletrolíticas diluídas
realiza-se a concentração de iões, tanto no
cátodo e o ânodo será alterada comparado
para as soluções iniciais. A concentração dos resíduos transportados
iões no lado do cátodo foi medido pela
um sistema de cromatografia de íons (TOA ICA-5000
Sistema) e a razão de catiões e aniões por
cada solução da amostra foi estimado.
2.8. A titulação da água reduzida e o controlo
por 10 mM de soluções de AA
A quantidade de 10 soluções de AA mM consumida
pela titulação de neutralização para a água reduzida
e a solução de controlo foi medido. Non-elec-74 K. Hanaoka et al. / Química Biofísica 107
(2004) 71-82
trolyzed água trazida para o mesmo pH que o
água electrolisada por adição de NaOH foi usada
como controlo. O pH da água foi reduzido
mudado 10,1-10,94 e o do controlo
foi alterado 10,05-10,94.
2.9. A estimativa da iônica produto p (IP) de RW
água reduzida e a entropia de água reduzido

Quando a electrólise é levada a cabo com 2 mM
NaCl e soluções de KCl e MgCl 1 mm e 2
Soluções de CaCl, as seguintes reacções serão 2
observada no compartimento do cátodo,
y y 2H O2 2 q2e z2OH qH (1)
e designando eletrólitos monovalentes como MA e
electrólitos bivalentes em MB, para NaCl ou KCl, e
MgCl ou CaCl, respectivamente, 2 2
Mq y
A A qOH ™ M OH (2)
M2
BB2
q y q2OH ™ M (OH) (3)
Em geral, mesmo se a água pura é usado CO H 2 3
(para além de 1,1 mM a 10 = 258) está presente numa y2
sistema aberto. Portanto, a maioria dos solutos são dissolvidas
como carbonatos, como mostrado na Eq. (4) - (6).
y q H O 2 2 2 3 3 qCO zH CO zH qHCO (4)
MA 2 3 A 2 3 2 OHqH CO ™ (M) CO q2H O (5)
MB 2 2 3 3 2 B (OH) qH CO ™ M CO q2H O (6)
O pH da água reduzido é mostrada como o
resultante da hidrólise dos sais de carbonato. em
geral, a hidrólise de sais será representado por
as seguintes equações,
HA | q y H qA (7)
Onde HA é um ácido fraco.
A constante de dissociação na presente hidrólise é
dada pela Eq. (8),
2 Kasca y (1ya) (8)
Onde Ka, e C são uma constante de dissociação,

grau de dissociação e a concentração inicial,
respectivamente. Se um é muito menor do que 1, a Eq. (9)
pode ser obtido a partir da Eq. (8). Eq. (10) pode ser
obtida a partir da Eq. (9).
1Y2 um ((KayC) (9)
Eq. (10) pode ser obtido a partir da Eq. (8).
q 1Y2
w x H SCA ((KayC) (10)
Assim, o pH irá ser descrito como se segue:
pHs (1Y2) (pKaylogC) (11)
No caso de Kws10, o pH usado será Y14
mostrado como Eq. (12).
pHs7q (1Y2) (pKaqlogC) (12)
No entanto, a dissociação de água será
mostrado como Eq. (13),
q y H O2 2 3 qH O | H O qOH (13)
Produto iônico da água, Kw e IP será mostrado
Eq. (14).
q y w xw x H O OH 3 w SK SIP (14)
IP onde irá ser descrita como a Eq. (15) sob o
condições de 25 8C e 1 atm,
Y14 2 (IP) WS10 (molyl) (15)
Portanto, p (IP) w é mostrado como Eq. (16),
ylog (pKw w w) spK sp (PI) (16)
A titulação para 1-1 carbonatos com soluções de HCl
será efectuado como se segue,
M CO 2 3 3 qHCl ™ MClqMHCO (17)
MHCO3 2 2 qHCl ™ MClqH OqCO (18) K. Hanaoka et al. / Química Biofísica 107 (2004) 71-82 75
H 2 CO 3 2 2 q2HCl ™ 2MClqH OqCO (19)
Se a titulação de neutralização é efectuada com

HCl 20 mM, dois picos de valores diferenciais (Dey
DV) são observados, onde E e V são potenciais e
volume. A concentração de cada neutralização
ponto de titulação é mostrado como Eqs. (20) e (21).
ywxwxwx OH MOH Um ponto s ponto B HCl y HCl (20)
wxwxwx HCl B ponto 2 3 3 dissociação total de s2 MHCO M CO s
(21)
y ylog OH w xM CO M CO s14y (pH) (22) 2 2 3 3
yyywxwxwx OH total de MOH M CO s (OH OH q (23) 2 3
p (IP) RW RW sylogK s14
y y qlog (w x w x OH total de pH y OH) (24)
onde wOHyx é a concentração de wOHyx
pH
calculado a partir do valor de pH da água reduzida.
A mudança de energia livre DG para a reacção é de 0
relacionado com a constante de equilíbrio K, DH entalpia,
entropia e DS em equilíbrio, como mostrado na seguinte
equações.
0 0 0 DG SDH yTDS syRTln K (25)
0 0 DS SDH yTqR ln K (26)
em que R, T e K são a constante dos gases (1,987 cal
K mol), a temperatura absoluta e y1 y1
constante de equilíbrio que é o produto iónico de
água, KRW na água reduzida produzido por
electrólise. Aos 25 8C e 1 atm.
0 DS sy68.3y298q1.9872 = ln KRW (27)
A partir da Eq. (27), a diferença de entropia, DS de 0
o solvente na água reduzida será estimado
usando KRW RW que é definida como (IP).
2.10. Medição de ruptura cadeia de DNA sob

estresse oxidativo
As quebras no DNA mediada por ROS foram
medido pela conversão de super-enrolado FX-
174 RF I DNA de fita dupla para abrir e linear
formas, de acordo com o método descrito por Li
w15x e Win w16x. Resumidamente, 0,2 mg de DNA foi
incubadas com a concentração indicada de
E H O, 25 2 2 mM CuSO4 em 20 ml de 20 mM
tampão de fosfato de sódio (pH 7,5) contendo 17
ml de água, reduziu ou, de uma solução de NaOH a
mesmo pH que a água reduzida a 37 durante 30 8C
min. Para o hydroquinoneycopper II (HQyCu (II))
quebras induzidas, 0,2 mg de DNA foi incubado
com as concentrações indicadas de HQ e Cu
(II) em PBS a 37 8C para um volume final de 20 ml
contendo 17 ml de água reduzido. seguinte
de incubação, as amostras foram imediatamente carregado
em um gel de agarose a 1% contendo 40 mM de Tris, 20
mM de acetato de sódio e EDTA 2 mM, e sujeitou
a electroforese em gel tampão Trisyacetate.
Após a electroforese, os géis foram corados com uma
0,5 mgyml solução de brometo de etídio durante 30
min, seguido por outros 30 min de descoloração em
água. Os géis foram então fotografados sob UV
luz.
3. Resultados
Quando soluções de eletrólitos são electrolyzed
através da membrana, a redução ocorre na
cátodo e oxidação no ânodo. oxidação de
moléculas de água produz H e O no ânodo, q

2
e OH e H no cátodo. Portanto, y cathod-
água alcalina ic (água reduzida) é abundante em
hidrogênio dissolvido (DH), enquanto anodic ácida
água (oxidado) é abundante no DO. DH
e NÃO produzido por eletrólise tem especial
características w2x. Os resultados da medição de
potencial elétrico (V), condutividade elétrica (CE),
pH, ORP e DO em diferentes correntes elétricas são
mostrada nas Figs. 2-6. O potencial de electrólise
varia linearmente com a corrente eléctrica entre 0,1 A
e 0,8 A, tal como mostrado na Fig. 2. As encostas, Vya
aumentada na ordem de KCl, -CaCl, -MgCl, 2 2
Soluções -NaCl. Figo. 3 mostra os resultados de elétrica
as medições de condutividade. A condutividade elétrica
por um aumento da corrente eléctrica fixada no
ordem de MgCl, 2 2 -NaCl, -CaCl, -KCl. o
condutividade de soluções de KCl foi muito elevado em comparação
com as outras soluções de electrólitos. pH
aumentou 9,9-10,96 em soluções de NaCl, 76 K. Hanaoka et al. / Química Biofísica 107 (2004)
71-82
Figo. 2. A relação entre o potencial elétrico (V) e energia elétrica
corrente (A) através de várias soluções de electrólitos. (d) de NaCl,
(m) KCl, (l) e MgCl (j), CaCl. 2 2
Figo. 4. A relação entre o pH e corrente eléctrica (A)
utilizando várias soluções de electrólitos. (d) de NaCl, (m) KCl, (l)
MgCl e (j), CaCl. 2 2
Figo. 3. A relação entre a condutividade elétrica (MS por
m) e corrente elétrica (A) utilizando várias soluções eletrolíticas.

(d) de NaCl, (m) KCl, (l) e MgCl (j), CaCl. 2 2
Figo. 5. A relação entre o potencial redox (mV) e
corrente elétrica (A) utilizando várias soluções eletrolíticas. (d)
De NaCl, (m) KCl, (l) e MgCl (j), CaCl. 2 2
9,91-10,77 em soluções de KCl, 9,46-10,6 em
Soluções e MgCl 9,96-10,77 em CaCl 2 2
soluções quando a corrente foi aumentada de 0,1
a 0,8 A. ORP diminuiu de Y50 mV a y170
mV em soluções de NaCl, Y51 mV para Y179 mV em
Soluções de KCl, Y70 mV para mV y176 em MgCl2
soluções e Y73 mV a Y137 mV em CaCl2
soluções quando a corrente foi aumentada de 0,1
a 0,8 A. DO diminuiu de 6,97 para 6,28 mg l y1
l mg em soluções de NaCl, 6,9 mg a 6,2 mg de l y1 y1
l em soluções de KCl, 6,63 mg a 6,03 mg de l l y1 y1 y1
em soluções de MgCl e 6,61 mg a 6,18 mg de l y1
l em soluções de CaCl, respectivamente. y1
Figo. 7 mostra a actividade de dismutação de superóxido
do ácido L-ascórbico na água reduzida de NaCl,
Soluções de KCl, MgCl e CaCl, eo controle 2 2
soluções ajustadas para o mesmo pH e concentração,
respectivamente. Os resultados foram obtidos
através de medições ESR realizados utilizando 10
mM de ácido L-ascórbico como doador de protões. eletrólise
de NaCl e KCl 2 mM, MgCl e 1 mM e 2K. Hanaoka et al. / Química Biofísica 107 (2004) 71-82 77
Figo. 6. A relação entre a OD e corrente eléctrica (A)
utilizando várias soluções de electrólitos. (d) de NaCl, (m) KCl, (l)
MgCl e (j), CaCl. 2 2

Figo. 7. superóxido actividade de dismutação o ácido L-ascórbico para
as reduzidas soluções de água e de controlo ajustados para a mesma
pH e concentração inicial de soluções de eletrólitos (2 mM
NaCl e KCl e MgCl 1 mM e CaCl2 2), (RW-Na) a
água reduzida de 2 soluções de NaCl mM, (RW-K) a
água reduzida de 2 soluções de KCl mM, (RW-Mg) a
água reduzida de 1 soluções MgCl mM e 2 (RW-Ca)
água reduzida de CaCl 1 mM, 2 (PW-Na) a 2 mM controle
Soluções de NaCl e (PW-K) o controle de duas soluções de KCl mM,
e (PW-Mg) do controle 1 soluções MgCl mM e 2 (PW-
Ca) a solução de controlo 1 CaCl mM. 2
Figo. 8. A relação entre a concentração de catiões e aniões em
o compartimento do cátodo correspondente à corrente eléctrica (A).
(d) de NaCl, (m) KCl, (l) e MgCl (j), CaCl. 2 2
Soluções de CaCl aumentou a superóxido 2 dismu-
atividade tação 119-173 unidades por 20 ml,
115-154,3 unidades por 20 ml, 105-140 unidades por
20 ml, e 128-165 unidades por 20 ml para Lascorbic
ácido, respectivamente, em comparação com a mesma
soluções sem electrólise ajustados para a mesma
pH como a água reduzida,. No documento anterior,
demonstrou-se que a água não reduzida
mostrar qualquer actividade de dismutação sem adicionou
ácido ascórbico. Estes resultados mostram a melhoria
actividade de dismutação do superóxido através de electrólise
compararam as soluções de controlo.
Figo. 8 mostra os resultados do rácio de concentração
de catiões para aniões, que de wcationsx
cathodey
wanionsx
cátodo. A proporção de wcationsx
cathodey
wanionsx aumentada na ordem de CaCl, 2 cátodo
-MgCl, 2 -KCl, -NaCl. O valor foi de CaCl 2
negativa entre 0,1 e 0,8 A de corrente eléctrica.
Para KCl e MgCl a proporção foi de cerca de 1. O 2
Solução de NaCl, apresentou o maior valor (entre
3,848 e 4,151).
A fim de confirmar a diferença em consumida
montante para a titulação de neutralização entre o
água reduzida e a solução da amostra, as soluções
foram tituladas utilizando uma solução 10 mM de AA
de pH 10,05-10,95. Como resultado, o consumida
quantidade de 10 mM de solução de AA para o
água reduzida era menor do que a amostra
As soluções em todos os níveis de pH, como mostrado na Fig. 9,78 K. Hanaoka et al. / Química
Biofísica 107 (2004) 71-82
Figo. 9. A quantidade de consumida ASA para a água reduzido
e as soluções de controle através da titulação de neutralização correspondente
para pH. (d) as soluções de NaOH e (m) de controlo da
água reduzida.
tabela 1
O aumento, (DS) y (DS), de entropia entre 0 oo
A50.8 AS0
e 0,8 A de corrente eléctrica para a água reduzido feito a partir de
Soluções de NaCl, KCl, MgCl 2 e CaCl 2
NaCl atual KCl CaCl2 MgCl2
Um mM 2 mM 1 mM 1 mM 2
00000
0,8 2,4 1,6 1,6 1,1

Figo. 10. A relação entre PIP (KW ylog) e pH para
a água reduzido feito a partir de NaCl, KCl, MgCl e CaCl, 2 2
e soluções de controle de NaCl e KCl. (d) de NaCl, (m) KCl,
(l) e MgCl 2 2 (j) para a água de CaCl reduzida, e (%)
E NaCl (Σ) KCl para as soluções de controlo.
Figo. 11. Efeito de electrólise em água peróxido de hidrogénio
dano ao DNA induzido. Pista 1: controlo negativo; Pista 2: Controle;
Pista 3: H 2 O 2 2 2 qCu (II); Pista 4: H O qCu (II) qKOH
solução; Pista 5: H O qCu (II) q2 solução mM de KCl (0 A), 2 2
pH 6,30; Pista 6: HO qCu (II) qelectrolyzed água 2 2 reduzida
(0,4 A), pH 10,47; e pista 7: H O2 2qCu (II) qelectrolyzed
água reduzido (0,8 A), pH 10,74.
Figo. 10 mostra os resultados dos valores p (IP) para RW
a água reduzida de NaCl, KCl, MgCl 2 e
Soluções CaCl e soluções de NaCl e 2 de controlo
KCl. p (IP) diminuiu em RW reduzida de NaCl, KCl,
Soluções MgCl e CaCl proporcionalmente ao 2 2
aumento do pH, mas as soluções de controlo e de NaCl
KCl não mostrou nenhuma mudança de p (IP) RW entre pH: 9,8
e pH: 10,96. Os valores de p (IP) RW do reduzido
água das soluções de electrólitos diminuiu de
14,058-13,474. No entanto, não havia quase nenhuma
mudar em p (IP) CS entre pH: 9,8 e pH: 10,96
nas soluções de controlo.
Eq. (27) mostra a entropia de p (IP) RW. pudermos
estimar o aumento da entropia utilizando a Eq. (27).
A Tabela 1 mostra o aumento da entropia na estimativa
a água reduzida a partir das soluções de amostra. o
água reduzido com solução NaCl 2 mM mostrou
o maior aumento de entropia (2,4 Kcalymol). Por outro lado,

a água reduzida de MgCl 2 mostrou a
menor aumento de entropia (1,1 Kcalymol).
Os efeitos de água reduzida em DNA oxidativo
danos são apresentados nas Figs. 11 e 12. No
presente estudo, dano oxidativo ao DNA é clearlyK. Hanaoka et al. / Química Biofísica 107
(2004) 71-82 79
Figo. 12. Efeito da água electrolyzed em hidroquinona (HQ)
dano ao DNA induzido. Pista 1: controlo negativo; Pista 2: Controle;
Pista 3: HQqCu (II); Pista 4: HQqCu solução (II) qKOH;
Pista 5: HQqCu solução q2 (II) mM de KCl (0 A), pH
6,30; Pista 6: HQqCu (II) qelectrolyzed água (0,4 reduzida
A), pH 10,47; e pista 7: HQqCu (II) qelectrolyzed reduzida
água (0.8 A), pH 10,74.
evidente na O2 H 2 YCU (II) e o HQyCu (II)
sistemas (pista 3). Resultados de densitometria óssea, expressa
como a fracção de ADN circular convertido para abrir
e formas lineares, mostrou claramente que reduzida
água estresse oxidativo inibiu significativamente
danos no ADN induzida em ambos H O2 2yCu (II) e
Sistemas HQyCu (II) (pistas 6 e 7) comparado com
a solução de controlo passaram através do aparelho
sem tensão aplicada (pista 5).
4. Discussão
4.1. A caracterização dos solutos na reduzida
água
Os parâmetros relacionados com solutos na água
reduzida por eletrólise são pH, ORP, DO, e DH
CE. pH é o indicador que mostra o hidrogénio
concentração de iões. Quando a electrólise é efectuada
em soluções de electrólitos, tais como NaCl, KCl,

MgCl ou CaCl o pH da água reduzida 2 2
produzida no compartimento catódico será
medido como a hidrólise de carbonatos daqueles
electrólitos. Portanto, o valor do pH depende
a concentração inicial dos carbonatos e o
parâmetros de hidrólise. Por exemplo, Na 2 CO 3
mostra pH: 9,2-10,6 entre 10 mol L e -6 y1
10 mol L e em NaHCO, pH: 7,2-8,7 y3 y1
entre 10 mol L e 10 mol L, respec- y6 y1 y3 y1
pectivamente, w17x. Aos 25 8C, 1,15 = 10 mM de carbono y2
dióxido é dissolvido em água pura. como mencionado
acima, quando suficientemente diluir soluções de eletrólitos
são utilizados para os água reduzidas, carbonatos
não pode ser negligenciado. ORP é a redução de oxidação
potencial e pode ser estimado a partir da
Equação de Nernst como se segue,
0 EV V sE q2.303RTynFlog (boi) y (vermelho) (28)
Onde, E, E, R, T, N, M, (boi) e (vermelha) são o 0
VV
potencial de oxidação-redução, potencial padrão,
constante dos gases, a temperatura absoluta, o número de
electrões transferidos na reacção, constante de Faraday,
produto das actividades da oxidado
espécies e produto de actividades de espécies reduzidas,
respectivamente. Assim, no caso de reduzida
água, como a oxidação e redução são incluídos para
oxigênio na água original e hidrogênio no
água reduzida, a equação ORP será mostrado como
Eq. (29)
0 EV V 5E q (n) QSP (m) O 2 H 2 log Ow xwxq (m) log H
(29)
Onde, (n), (m) OH e (m) são os coeficientes relativos
para pH, O e H 2 2 W18x. Portanto, é o ORP
parâmetro que indica as concentrações de oxigénio
e hidrogénio dissolvido na água reduzida. como
DO e DH são as concentrações de oxigênio e
hidrogénio na água reduzida, que são parâmetros
em relação a solutos nele. Estes solutos será
gerado pelo processo de electrólise.
O potencial elétrico em cada nível de elétrica
corrente foi maior do que em solução de NaCl em que
KCl, MgCl e soluções, que foi maior do que 2
em solução de CaCl como mostrado na Fig. 2. Presume-se 2
que a diferença na mobilidade iónica entre catiões
e aniões será proporcional à elétrico
potencial. Por exemplo, a proporção de iões Cl a y
Íons Na é 0,767, o de íons Cl a K íons é qyq
0,987, e que de íons Cl para íons Mg é de 0,713 2T
e íons Cl para Ca é 0,799. É altamente y 2T
sugerido que quanto maior a razão de aniões de
catiões, quanto menor o potencial eléctrico gradient.80 K. Hanaoka et al. / Química Biofísica
107 (2004) 71-82
Resultados para condutividade elétrica eram contrários ao
aqueles para potencial eléctrico como mencionado acima.
Este é um resultado razoável. Além disso, o pH, ORP
e fará também alterado conforme o esperado na proporção
a magnitude da energia do campo eléctrico.
4.2. O reforço da dismutation superóxido
atividade em água reduzida

Água reduzida preparado a partir de todo o eletrólito
soluções (NaCl, KCl, MgCl 2 e CaCl 2) tinha
aumento da actividade de dismutação de superóxido, quando medido
uso de AAS como um indicador antioxidante, que
as soluções de controle correspondentes ajustadas ao
mesmo pH (Fig. 7). De AA tem a estrutura de um 2,3
enediol que é um tipo de ácido sacárico, e ele
desempenha um papel na protecção contra o sistema
estresse oxidativo em animais e plantas w19,20x. o
OH no segundo grupo funcional tem pKas11.79
e em que o grupo funcional 3 tem pKas
4.25. Se AsA é adicionado à água reduzida e controle
As soluções que são ajustadas para o mesmo pH
a água reduzida, o protão do OH de a
Terceiro grupo funcional irá reagir com os iões OH
da água reduzida e os íons OH no controle
soluções, e irá ser neutralizada porque o OH
do grupo funcional 3 de ASA está dissociada
como mostrado na Eq. (30),
y q y OH ™ O qH (30)
Além disso, considera-se que o protão em OH
do terceiro grupo funcional do AA vai ser utilizada
para a neutralização da água alcalina reduzida
e em que o protão do grupo funcional de segunda
AsA que tem atividade muito baixa dissociação em um
pKas11.79 será usado para o radical superóxido
reação de dismutação w21,22x. Se ASA está misturado com
água reduzida, a atividade vai dissociação
aumentar devido à actividade mais elevada dissociação
da água reduzida. A maior dissociação

actividade da água reduzido aumenta a dissociação
atividade de substâncias com menor atividade.
Como mostrado na Fig. 9, quando a titulação de neutralização
foi realizado em diversos níveis de pH diferentes
em água reduzida e as soluções de 2 de controle
NaOH mM, houve diferenças significativas na
cada pH. Considera-se que o aumento da
dissociação de prótons no grupo funcional 3
de asa, dissolvido nos reduzidas contas de água
a diferença significativa entre a reduzida
soluções de água e de controle. Esta propriedade é
devido a moléculas de água como solvente e também um muito
estrutura molecular estável. Conforme descrito num anterior
papel, o aumento da actividade de dissociação
a água é reduzida, devido ao processo de electrólise
w10x. Quando um número suficiente de elétrica
campo é aplicado ao limite entre o
eléctrodo e as soluções a granel de electrólito, uma muito
um potencial eléctrico elevado irá ser gerado (supra
V 10 cm). Se uma quantidade suficiente de reduzida 7 y1
a água é absorvida para dentro do corpo, o que vai aumentar
actividade de dissociação para o antioxidante solúvel em água
substâncias de relativamente menor dissociação
actividade. Como um resultado disso, especula-se que o seu antioxidante
capacidade será aumentada. É bastante
possível que muitos fenômenos úteis relacionadas com
água reduzida será encontrado como sendo o resultado da
aumento da actividade de dissociação de água como solvente
através de electrólise. A melhoria da redução
água dependerá das propriedades iónicos do

solutos, tais como espécies e membrana ou iónico
mobilidade w23,24x. Quando uma membrana não-carregada
é usada para a produção de água reduzido um
maior diferença de mobilidade iônica entre cátions
e ânions produzirá atividade dissociação maior
como mostrado na Fig. 8. De um modo geral, a dissociação
actividade da água depende da temperatura e
pressão. O produto iônico da água p (Kw) tem
foi calculado em uma ampla gama de temperaturas
(0-600) e densidades de H. Sato et ai. w25x.
A diferença entre p (IP) RW para reduzida
água e p (IP) CS para soluções de controle é mostrado
na Eq. (31).
Dp (IP) sp (IP) CS RW yp (IP) (31)
Considera-se que o reforço de antioxidante
efeitos de radicais superóxido vai aumentar
na proporção do aumento de Pd (IP). Portanto,
Dp (IP) para a água como solvente é reduzida ao essencial
parameter.K. Hanaoka et al. / Química Biofísica 107 (2004) 71-82 81
4.3. A estimativa da PIP e da entropia produzida
por electrólise em NaCl, KCl, MgCl 2 e CaCl 2
soluções
Figo. 10 mostra estimativas de p (IP) RW para reduzida
água feito a partir de NaCl, KCl, MgCl CaCl, e 2, 2
soluções de controle utilizando NaCl e KCl. estes
resultados mostraram diferenças significativas entre
redução soluções de água e controle ajustados à
mesmo pH e concentração inicial como a reduzida
água antes de eletrólise. Em geral, está relacionada DG 0
para a constante de dissociação K e o eléctrico

E potencial no estado de equilíbrio, como mostrado em o
NQA. (25) e (27), pode ser mostrada como Eq. (32)
0 o DG synFE (32)
E e concentração iônica de hidrogênio pode ser mostrado o
Eq. (33).
E o q s (RTymnF) ln Hw x (33)
Onde m é o coeficiente de correcção do
relação entre E e K pH a s10. o Y14
q log IPs2.303 (RTymnF) log Hw xqC (34)
Assim, Pip é descrito como Eq. (35).
p (IP) RWs (0.0591ym) pHqC (35)
O enredo da p (IP) RW vs pH é uma linha reta
com um declive de (0.0591ym) e uma constante. o
constante C irá depender das propriedades de electrólitos
m e irá depender das propriedades de
a membrana e a interacção entre o
membrana e os iões ou solvente. A p (IP) de CS
as soluções de controle não se alterou com uma mudança
de pH 9,8-10,88 mas que de todas as amostras
soluções mudou de forma linear com uma mudança de pH
9,9-10,9. O p (IP) do RW reduzida
água diminui proporcionalmente ao aumento da
pH. Esta alteração irá depender da magnitude
da corrente eléctrica aplicada. Portanto, a dissociação
energia depende da corrente elétrica utilizada
durante a electrólise.
Entropia é estimada pela Eq. (31) usando IP
em vez de KW. A Tabela 1 mostra a diferença de entropia
de cada solução de electrólito em 0,8 A

(DS) y (DS)). O aumento na entropia o o
As0.8 AS0
proporção do aumento de Pd (IP) w. o aumento
de entropia significa que a água ficou reduzida
mais activo e oferecido um campo de reacção superior para
substâncias dissolvidas. Assim, se as substâncias de menor
actividade de dissociação são dissolvidos na reduzida
regar a atividade dissociação vai aumentar em relação
a água não electrolyzed.
4.4. O efeito inibidor de água reduzida no
quebra de cadeia simples de DNA usando H O2 2yCu
(II) e um sistema de HQyCu
No presente estudo, os efeitos da água reduzida
em lesões oxidativas do ADN, foram investigadas por
usando H O YCU (II) e sistemas HQyCu (II). 2 2
A indução de quebras de cadeia simples no superenrolado
FX174 plasmídeo de DNA de cadeia dupla leva a
formação de DNA circular aberto, enquanto que a formação
de uma forma linear de DNA é indicativo de
quebras de cadeia dupla w15x. Cu (II), H 2 O 2 é capaz
para causar quebras na cadeia de ADN isolado em. Como tal,
H O YCU (II) tem sido amplamente utilizada como um modelo 2 2
sistema para induzir danos no ADN w16,26x oxidativo.
Embora as espécies reactivas continuam a ser exactas
quimicamente definido, um radical hidroxilo ou ligado
seu equivalente derivado da reacção de H 2 O 2
e de cobre tem sido sugerido para participar
o dano oxidativo ao DNA w15,26x. a adição
de água reduzido a O2 2yCu H (II) resultou em
acentuada inibição da conversão de super-enrolado

DNA para abrir formas circulares, sugerindo que
água reduzida é capaz de proteger contra o
H O2 2yCu (II) de DNA mediada por quebras da cadeia. para
determinar ainda mais os efeitos inibidores da reduzida
Tem sido previamente
22
Assim, ele
Agradecimentos
encorajamento.
referências
31
Chem.
Clin.
Sci. 82
De 1985.
Pathol.
Biol. Med. 33
Appl.
J. Biol. Chem.
Res.
Biophys. Res. Commun.
Electrolyzed -Reduced Água scavenges Oxigênio Ativo

Espécies e protege o DNA do dano oxidativo
Sanetaka Shirahata, 1 Shigeru Kabayama, Mariko Nakano, Takumi Miura,
Kenichi Kusumoto, Miho Gotoh, Hidemitsu Hayashi, * Kazumichi Otsubo,
**
Shinkatsu Morisawa, ** e Yoshinori Katakura
Instituto do Regulamento Tecnologia Celular da Faculdade de Pós-
Graduação em Genética Tecnologia de Recursos, da Universidade
Kyushu, 6-10-1
Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-81, Japão; * Instituto da Água,
Nisshin Edifício 9F, 2-5-10 Shinjuku, Tokyo 160,
Japão; e ** Nihon guarnição Co. Ltd., Meiji Seimei Jusou Edifício 6F, 1-2-
13 Shinkitano, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japão
Recebeu 21 mar 1997
ácido ascórbico, pode limpar directamente H2O2. Água espécies ativas de oxigênio reduzida
ou radicais livres são considerados suprime a quebra de cadeia simples de DNA por causar
extensos danos oxidativos às espécies ativas Mac-biológicas de oxigênio produzidas pela Cu (II)
romolecules -cata-, que traz uma variedade de doenças lisadas oxidação de ácido ascórbico em
um envelhecimento bem como dependente da dose. O limpador ideal para maneira ativa de
oxigênio, o que sugere que a água reduzida pode limpar deve ser 'hidrogênio ativo ".
'Hidrogênio Ativa "pode ser não apenas O • 0
2 e H2O2, mas também 1O2 e • OH. q 1997 produzido em água reduzida perto do cátodo
durante Academic Press eletrólise da água. Água reduzida apresenta alto pH,
baixos níveis de oxigênio dissolvido (OD), extremamente elevado dissolvido
hidrogênio molecular (DH) e redox extremamente negativo
valores de potencial (RP). Fortemente electrolyzed -re- espécies ativas de oxigênio ou radicais
livres, como singlet
oxigênio (1O2), ânion superóxido radical (O • 0
duzido água, bem como o ácido ascórbico, (/) - catequina e 2), o hidrogénio
ácido tânico, completamente eliminado O • 0
2 produzido pelo peróxido (H2O2) e o radical hidroxilo (OH •) são considhypoxanthine-xantina
oxidase sistema (HX-XOD) em rado para causar grandes danos oxidativos a biológica
tampão de fosfato de sódio (pH 7,0). As macromoléculas dis- superóxido (ADN, membrana
poliinsaturados
mutase (SOD) -like actividade de água é reduzido de ácidos gordos de cadeias estáveis,
enzimas e assim por diante), que trazem a 47C durante mais de um mês e não foi perdido
mesmo depois de cerca de uma variedade de doenças, bem como o envelhecimento (1, 2 ).
Nós neutralização, congelamento e derretimento repetida, deflação acreditam que a
contramedida ideal contra ção activa com ultra-sons, uma mistura vigorosa, fervendo, o
oxigênio é re- 'hidrogênio ativo ". Eletrólise da água pro- repetidas filtração, ou autoclave
fechada, mas foi perdido duces reduzida e água oxidado perto do cátodo e em autoclave
aberta ou fechada em autoclave no ânodo, respectivamente. Exposições de água reduzida alta
pH, presença de trióxido de tungstênio que ad- eficiente baixa de oxigênio dissolvido (OD), alta
dissolvido sorbs hidrogênio hidrogênio atômico ativo. A água borbulhava com hiper- (DH) e
potencial redox negativo (RP) de gás va- drogen significativa exibiu baixa DO, extremamente
elevado DH e ues. Água mole no Japão, foi possível desenvolver valores extremamente baixos
de RP, como é que a água reduzida, mas os dispositivos nacionais para reformar água por
eletrólise sobre isso não tem nenhuma atividade SOD-like. Estes resultados sugerem que há
meio século. a atividade SOD-like de água reduzida não é devido à Até agora, as características
de nem reduzido de hidrogênio molecular água dissolvida, mas, devido à água dissolvida nem
oxidada foram bem esclarecidas. Com base em hidrogênio atômico (hidrogênio ativo). Embora
SOD ac- a melhoria clínica interessante de uma variedade de dis- H2O2 acumulado quando
adicionado ao sistema de HX-XOD,
água reduzida diminuiu a quantidade de H facilita através da ingestão de água reduzido desde
1985, Hayashi 2O2 produzido
por XOD. Água reduzida, bem como catalase e propôs a hipótese de 'Teoria Reguladora de
Água »(3).
Aqui, com base em sua teoria que primeiro demonstrar que
água reduzida scavenges espécies ativas de oxigênio e pro- 1 Para quem correspondência deve
ser endereçada. Fax: 81-92-642- tects DNA dos danos causados pelos radicais livres de
oxigênio. 3052. E-mail: sirahata@grt.kyushu-u.ac.jp.
Abreviaturas: AET, 2- (aminoetil) isotiurónio; Asa ascórbico
ácido; CL, quimiluminescência; CLA, Cypridina luciferina analógico; DO, MATERIAIS E MÉTODOS
de oxigénio dissolvido; DH, hidrogênio dissolvido, CE, condutância elétrica;
HX, hipoxantina; RP, potencial redox; SOD, superóxido dis- eletrólise da água. Água ultrapura
produzido por um ultrapura
mutase; XOD, xantina oxidase. sistema (Ultrapur LV-10T, Toray, Tóquio) foi adicionado 0,1 g / l
de NaCl
0006-291X / 97 $ 25,00
Direitos autorais q 1997 por Academic Press
Todos os direitos de reprodução em qualquer forma reservada.
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romolecules, o que provoca uma série de doenças
bem como o envelhecimento. O limpador ideal para oxigênio ativo
deve ser 'hidrogênio ativo ". 'Hidrogênio ativo "pode ser
produzido em água reduzida próxima do cátodo durante
electrólise da água. Água reduzida apresenta alto pH,
baixos níveis de oxigênio dissolvido (OD), extremamente elevado dissolvido
hidrogênio molecular (DH) e redox extremamente negativo
valores de potencial (RP). Fortemente electrolyzed -re-Vol. 234, No. 1, 1997 bioquímicas e
biofísicas Research Communications
para elevar a condutância eléctrica (CE) a cerca de 20 ms / m. a água
foi então electrolyzed com várias tensões por um dispositivo de electrólise
(Escreva TI-7000S e TI-7000SL, Nihon guarnição Co., Osaka)
equipado com um eléctrodo de titânio revestido com platina para produzir reduzida
água que exibiu vários RP. RP, CE, DO e DH foram
medido usando um medidor de RP (tipo, HM-14P), um medidor CE (CM-14P),
um FAZER metros (DO-14P) e um medidor de DH (DHDI-1) do Toa Eletrônica
Ltd. (Tóquio) a 257C. O pH foi medido utilizando um medidor de pH (Beckman,
Tipo pHI32) a 257C.
Ensaio da atividade de SOD-like de água reduzida, ácido ascórbico (ASA),
(/) - catequina, e ácido tânico. A mistura de reacção (1 ml) para medir
chemiluminiescence (CL) intensidade específica para O • 0

2 continha
500 mM de hipoxantina (HX), EDTA 200 mM, fosfato de sódio 40 mM
tampão (pH 7,0), 0,6 ml de água a uma solução de NaOH ou reduzida
do mesmo pH que a água reduzida, 2,5 mM de 2-metil-6-fenil-3,7-
hidroimidazo [1,2-a] pirazin-3-ona (Cypridina luciferina analógico
(CLA), Tóquio Kasei Industrial Co., Tóquio) e 0,5 U / l de xantina
oxidase (XOD) (Wako Purechemical Industries, Tokyo). A intensidade de CL
da mistura de reacção (0,85 mL), excepto para solução foi XOD
medido num tubo de vidro em um leitor de CL (Aloka, tipo BLR-301) a
26 7C. Em 18 segundo ponto de tempo, 0,15 ml de solução de XOD foi injectado
para dentro do tubo e a intensidade de CL foi medida continuamente durante
120 seg. A variação da intensidade de CL, na presença de reduzida
água, SOD derivada de eritrócitos bovina (Sigma), ácido acetilsalicílico (Wako),
(/) - catequina (Wako) ou ácido tânico (Wako) foi medida com o
HX-XOD sistema para avaliar a atividade de eliminação de O • 0
2. o
água fortemente reduzida (RP, 0820 mV; pH 11,0) foi diluído com um
Solução de NaOH (pH 11,0) para assegurar o mesmo pH final da reacção
mistura (pH 7,3) entre as amostras de teste. A taxa de extinção de
•0
2 (%) foi calculada dividindo a intensidade total do teste CL
por exemplo o do controlo.
Análise da atividade da catalase-like de água reduzida e Asa. o
mistura de reacção (100 ml) do sistema HX-XOD descrito acima em
a presença ou ausência de água ou SOD reduzida foi colocado em um 96-
microplaca e incubadas a 37 7C. Curso de tempo da mudança
na concentração de H2O2 foi medida pela adição de 200 ml
de substrato de peroxidase contendo (0,3 mg / ml 2,2 * -azino-di- (3-etil

benzthiazolin ácido sulfónico), tampão citrato 0,1 M, pH 4,0, estreptavidina-peroxidase de
rábano
conjugado com peroxidase (Amersham) diluída a 1000
vezes). A absorvência do produto de reacção foi medida a 405 nm
por um leitor de ELISA. A fim de examinar a actividade de catalase-like,
a solução de H2O2 foram directamente incubadas com solução de NaOH controle
(pH 11,0), água reduzido (pH 11,0), ASA ou catalase (Wako) em 40
mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,0) a 37 e a figura 7C concentração de H2O2. 1.

Relações de RP com pH (A), DO (B) e DH (C) em trações foram determinadas. água
electrolyzed-reduzida. Água ultrapura foi electrolyzed por um
Análise de quebra de cadeia simples de DNA causado por dispositivo ativo de oxigênio
eletrólise e RP, pH, OD e valores de DH foram immedispecies
produzido pelo Cu (II) oxidação catalisada do AA. Time-tamente medido. Os dados de água
antes da electrólise foi mostrado pela
Claro que a reacção de quebra de DNA de cadeia simples causada por Cu (II) - quadrados
escuros. As setas mostram a água reduzida, a qual exibiu a
oxidação catalisada de Asa foi examinada usando super-coil plasmática forte atividade SOD-
like.
meados de ADN. Um mg de DNA do plasmídeo pBluescript II (Stratagene, La
Jolla, CA) foi incubada com a mistura de 25 mM de AA e 25
CuSO4 mM em 20 ml de tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 7,5)
contendo 17 ml de água reduzida, uma solução de NaOH com o mesmo pH e o cátodo de

oxidação no ânodo. A dissociação de como a água reduzida, SOD, catalase, 2- (aminoetil)
isotiurónio produz H2O H /
e OH0
íons. No cátodo, H /
(AET) (Wako), KI (Wako), ou NaN3 (Wako) a 377C por vários íons peri ganhar elétrons para
trocar ods hidrocarbonetos atômicas activos do tempo. A reacção foi parada pela adição de 4
ml de 15 mM gen (H). Activo exposições hidrogénio atómico elevado reduzindo EDTA (pH 7,0).
DNA Super-coil, DNA open-circular e DNA linear
foram separadas por electroforese com gel de agarose a 1% e qualquer potencial. Em seguida,
é alterado para as moléculas de hidrogénio (H2)
alterações da quantidade de ADN super-bobina foram determinados a partir da qual são

quimicamente inerte à temperatura ambiente. Em imagens da foto por um software de
computador NIHimage. o ânodo, OH0
iões perder electrões para formar OH, que

resulta na produção de O2 e H2O. alkaRESULTS catódica
E água linha DISCUSSÃO (água reduzida) é abundante na DH, enquanto
anodic água ácida (água oxidado) é abundante no DO.
Características da água electrolyzed-reduzida. As As relações de RP com pH, DO, e DH em

reprinciple
de eletrólise foi fundada por Michael Fara- água produzida foram mostrados na FIG. 1.
Mudanças notáveis em
dia (1791-1867). Neste processo, a redução ocorre a estes valores de ocorrer na água após
electrólise. deveria
270
AID BBRC 6622 / 692a $$ 1,061 04-22-97 10:50:19 bbrcg AP: BBRCVol. 234, No. 1, 1997
bioquímicas e biofísicas Research Communications
de 0,0002 mg / l de 0,0001 mg / l; mas nenhuma mudança de pH.
Como mostrado na FIG. 2A, a água borbulhava com gás hidrogênio
(H2-água) e gás nitrogênio (N2-água) apresentaram diminuição
CL intensidade de cerca de 20% quando comparada com aquela
do controlo no estado estacionário, o que sugere que o
redução na intensidade CL em N2-água e H2-água foi
devido à baixa DO e H2-água não tinha atividade SOD-like.
A atividade de SOD-like de água reduzido seja mantido durante
armazenamento, embora a RP e exibem valores de DH
decadência. Estes resultados indicam claramente que dissolvido molecular
gás de hidrogênio em água reduzido foi responsável
para o valor RP negativa, mas não para a SOD-like
actividade.
Estabilidade da atividade de SOD-like de água reduzido.
A atividade de SOD-like de água reduzida era muito estável
num frasco de vidro fechado a 47C durante mais de um mês. o
atividade não foi perdido, mesmo após a neutralização, repetido
congelamento e derretimento, a deflação com ultra-sons durante 10
minutos, a filtração repetida com um filtro de 0,22 mm, de ponto de ebulição

por 10 minutos, ou autoclavagem em uma figura de vidro fechado. 2. Análise da atividade de
SOD-like de água reduzido.
(A) Efeitos de água reduzida, SOD, H na garrafa 1217C durante 20 minutos (FIG. 2B). No
entanto, 90% de 2-água e água-N2 sobre o
acumulação de O2
•0
gerado pelo sistema HX-XOD. O CL atividade SOD-like foi perdido por autoclavagem em um
intensidade foi determinada em tampão de fosfato (pH 7,0) na pressão abriu garrafa de vidro,
o que sugere que a cia sub-activo de água reduzido (RP 0820 mV, pH 11,0; IC50SO (18%)), uma
posição na água é reduzido volátil. Atomic solução NaOH hidrelétrica do mesmo pH da água
reduzida, SOD, H2-água, gen é volátil e pode reduzir o óxido metálico, como ou N2-água. h,
uma solução de NaOH de controlo; j, água reduzida; m, trióxido de tungstênio SOD, embora
hidrogênio molecular não pode (0,13 U / ml); s, SOD (66,7 U / ml); l, H2-água; n, N2-água. (B)
Estabilidade da atividade de SOD-like de água reduzido. h, controle facilmente fazer isso (5).
Um método de detecção sensível
Solução de NaOH. l, água e água reduzida reduzida, tratada com hidrogénio atómico é baseado
na mudança de cor de tung- repetido de congelação e fusão, a deflação com sonicação,
vigorosa trióxido sten por redução de (6). O autoclave fechado a mistura durante 10 minutos,
em ebulição durante 10 minutos, foi repetido filtração de água reduzida com trióxido de
tungsténio a 1217C com 0,22 milímetros de filtro, ou autoclave fechado a 1217C durante 20
minutos.
m, tratada com água reduzida autoclave aberto em 1217C durante 20 20 minutos resultou na
perda de 52% da SOD-like
minutos. n, água reduzida tratado com autoclave fechada na atividade (FIG. 2B). Estes
resultados sugerem fortemente que a presença de trióxido de tungsténio (0,5 g / 70 ml de
água reduzido) a 1217C a substância responsável pela actividade de SOD-like durante 20
minutos. (C) A atividade de SOD-like de água reduzida diluído. água reduzida é hidrogênio
atômico ativo. Montante hidrelétrica Ativo de água reduzida (%): h, 60%; /, 30%; *, 26%; m,
23%; h,
gen em fase gasosa está tomando bastante estável em considerável de 21%; G, 20%; l, 19%; ,,
15%; s, 7,5%; , 0% (controlo). (D) Inibição
da acumulação de O ção da taxa de colisão (7). Uma vez que dois átomos de hidro- • 0
2 por diversas vezes diluída de água reduzido.
Todas as experiências foram triplicado e os valores médios foram gen no estado fundamental
ter energia maior do que molec- mostrado nas figuras. Os erros de SD foram dentro de 5%.
hidrogênio ular em qualquer estado estável, a energia extra é
tenham de ser eliminado por uma terceira substância para produzir
uma molécula de hidrogênio a partir de dois átomos de hidrogênio se notar que o valor DH é
maior em água reduzido por colisão (8). Hidrogênio atômico pode existir de forma estável do
que na água original por duas ordens de magnitude. evitando o ataque do oxigénio em solução
e os cristais
A atividade de SOD-like de água reduzido. Oxidase XOD à temperatura ambiente durante um

período superior a um ano
dizes HX em xantina, acoplando a geração de O •
0 (9). O vapor de água é conhecida para evitar a recombinação
a partir de O de hidrogénio atómico sobre uma superfície de tungsténio (8). O char- 2. CLA
reage especificamente com O • 0
2 e 1O2 e
CL emite um (4). Como mostrado na FIG. 2A, reduziu terísticas de água em solução aquosa de
hydrocompletely atômica ativa
inibiu o CL, demonstrando a SOD- gen produzido por descarga eléctrica está sob investilike
atividade de água reduzido. Desde o CL foi gação com-.
pletamente inibida pela SOD, o CL foi específica para a solução XOD O Quando foi injectado na
reacção • 0
2.
Borbulhando de gás hidrogênio em uma solução de NaOH (pH mistura contendo água reduzida
diluída, forte
10,5) durante 5 minutos resultou em mudanças notáveis da CL foi emitido imediatamente

após a injecção (Fig. 2C),
RP de / 116 mV a 0842 mV; Fazer a partir de 7,66 mg / l para mas a intensidade do CL

rapidamente caiu abaixo do con-
1,98 mg / l; DH de 0,0002 mg / l de 0,938 mg / l; mas nenhum valor controle. A forte emissão

transiente inicial do CL
mudança do pH. Borbulhamento de gás nitrogênio em um NaOH em água reduzido diluída

pode ser inibida por SOD,
indicando que uma grande quantidade de O 0 •
solução (pH 10,5) resultou em alterações de RP de / 116 2 foi transitoriamente
mV a / 83 mV; Fazer a partir de 7,66 mg / l para 1,82 mg / l; DH gerado apenas após a adição
de XOD. ASA (/) -
271
catequina e ácido tânico, bem como a SOD, não mostraram

uma forte emissão transiente inicial como de CL (dados não
mostrado). A injecção do solvente sem enzima não fez
resultar em uma emissão de CL. Mais experiências detalhadas
serão necessários para esclarecer o mecanismo desse fenômeno.
O efeito inibitório de água reduzida na acumulação
de O • 0
2 foi aumentada de forma dose-dependente
forma como mostrado na FIG. 2D, o que sugere a estequiométrica
acção da substância activa em água reduzida.
Definição da atividade de SOD-like de água reduzido.
Uma vez que este trabalho relata a primeira • O 0
Atividade 2 eliminação
de água electrolyzed-reduzida, a padronização
de é necessária esta atividade para comparar a potência reduzindo
da água reduzida preparado cada vez. em ordem
para padronizar a potência redução da água reduzida,
definiu-se uma unidade IC50SO como uma redução de potência
o que reduziu a água pode limpar 50% de O • 0
2 gerado
por o sistema de HX-XOD sob as condições descritas
na seção de Materiais e Métodos
e um IC50SO (%) como a concentração (%) da redução
água em que a 50% de O 0 •
2 gerada pelo HXXOD
sistema é eliminado. Os valores IC50SO de SOD,
De AA, (/) - catequina, e ácido tânico foram 0,05 U / ml, 3
mM (0,53 mg / ml), 130 mM (38 mg / ml), e 33 mg / ml em
o sistema HX-XOD utilizado aqui.
A atividade da catalase-like de água reduzido. embora
água reduzida poderia varrer O • 0

2, houve uma possibilidade
água reduzido que inibiram a actividade da enzima
de XOD ou inibiu a reacção entre o O 0 •
2 eo
reagente analógico luciferina. Para eliminar essa possibilidade,
a produção de H2O2 foi determinada na HX-XOD
sistema. XOD pode produzir não só • O 0
2, mas também H2O2
neste sistema HX-XOD. Como mostrado na FIG. 3A, XOD
H2O2 produzido mesmo na presença de água reduzida, a FIG. 3. A atividade de SOD-like e

catalase-like de água reduzida demonstrando nenhuma inibição da actividade da enzima por e
Asa. (A) Variação da quantidade de H2O2 no sistema HX-XOD reduzida água. Como esperado, a
adição de SOD à na presença de SOD ou de água reduzida. SOD (70 U / ml) ou sistema HX-XOD
reduzida resultou na acumulação de H2O2, água (12 IC50SO unidades) foram incubadas no
sistema HX-XOD em
indicando que ó • 0 37 7C. h, controlar NaOH; L, água reduzida; s, SOD. (B) 2 produzido por
degradação XOD foi alterado para
H de H2O2 por água reduzida, Asa e catalase. Água reduzido (12 2O2 por SOD. Hídrico reduziu
H2O2 primeiro acumulada
IC50SO unidades), ASA (100 mM) ou catalase (20 U / ml) e incubou-se então gradualmente
reduzido a concentração de H2O2, com H2O2 (70 mM) em tampão de fosfato de sódio 20 mM
(pH 7,5) o que sugere que a redução de água exposições não só SOD- 37 7C. h, controlo; L,
água reduzida; n, ASA; s, catalase. Todos expe- como atividade, mas também a atividade da
catalase-like. Os fatos foram mentos triplicou e os valores médios foram mostrados. a norma
erros foram mostradas por barras verticais. Em (B) mais o erro de SD, que reduziu água
estimulou a acumulação de barras são incorporados nos símbolos. H2O2 no sistema HX-XOD
nos primeiros 5 minutos
indicou que a intensidade de CL diminuiu na presença
de água reduzido não é devida à inibição de
a reacção entre o O 0 •
2 e luciferina analógico por re- catalisada oxidação do AA é conhecido por produzir O • 0
água duzido, mas devido à conversão de O • 0
2 em H2O2 e H2O2 que reagem para produzir • OH (12). A fim de por água reduzida. Para
demonstrar a ac- catalase-like demonstrar que a água reduzida possam limpar não só dade de
água reduzida, H2O2 foi diretamente incubados O
•0
2 e H2O2, mas também outras espécies ativas de oxigênio, nós com água reduzida. Como
mostrado na FIG. 3B, reduziu WA- examinaram o efeito de água reduzida em quebra de DNA
ter eliminado H2O2, bem como ASA e catalase. causada pela mistura do ácido acetilsalicílico e
de Cu (II). Super-coil
Efeito supressor de água reduzida no DNA plasmídeo único (Formulário I) mudanças para abrir-
circular DNA
quebra de cadeia de ADN causada pelo Cu (II) catalisada (Forma II) por uma quebra de cadeia
simples. Abrir-circular
oxidação do AA. A quebra de cadeia de DNA é causado mudanças no DNA ao DNA linear
(Forma III) por um doubleby
a mistura de ácido acetilsalicílico e de Cu (II) (10, 11). O Cu (II) - quebra de DNA vertente.
Quando o DNA de plasmídeo foi incu-
272
bated com a mistura de ácido acetilsalicílico e de Cu (II), a quantidade TABELA 1
de super-coil DNA diminuiu gradualmente (FIG. 4). Entretanto Efeito da Água reduzida, SOD,
catalase, e vários água nunca, reduziu significativamente inibido os varredores de radicais
single- no Single-Strand A quebra do DNA por
cadeia quebra pela mistura do ácido acetilsalicílico e de Cu (II). Como o Cu (II) oxidação
catalisada do AA
mostrado na Tabela 1, inibiram a água reduzida ADN Adição Concn Especificidade inibina,
reacção% de ruptura de uma forma dependente da dose. catalase
também inibiu a reação de quebra, mas SOD tinha água reduzido 3,7 IC50SO unidades 19
7.5 IC50SO unidades 38
15 IC50SO unidades 49
SOD 150 U / ml O • 0
22
Catalase 0,8 U / ml de H2O2 a 6
4 U / ml de H2O2 a 36
20 U / ml de H2O2 a 90
AETA
4 1 44 1005 M gereral
KI 1 1 1002 M • OH 18
5 1 1.002 H OH 53 •
NaN 3 1 1 1002 14 M 1O2
5 1 1002 M 1O2 43
um AET Å 2- (aminoetil) isothiuroium.
não, o que indica que o H2O2 participou na quebra
reação, mas • O 0
2 não fez. Ambos os eliminadores de radicais específico
para • OH ou 1O2 inibiu a reacção de ruptura.
Estes resultados indicaram que a água reduzida pode impedir
Danos no ADN causados por espécies de oxigénio activas, tais como
H2O2,
• OH, e 1O2 produzido pelo Cu (II) catalisada
oxidação do AA. Efeito sinergístico significante entre
água reduzida e os varredores de radicais usados aqui
não foi observada (dados não mostrados). É digno de nota
que a água reduzido pode impedir o dano ao DNA, mesmo em
a presença de iões metálicos que catalisam a auto-oxidação
antioxidantes e reverso de mais consagrados
seu efeito protetor contra as espécies ativas de oxigênio.
No entanto, a água deve ter uma capacidade maior redução
para o efeito de limpeza O • 0
2.
Apesar de organismos aeróbios ter evoluído por aquisição
da capacidade de utilizar o oxigênio, o oxigênio é principalmente
uma substância tóxica. Recentemente ativação biológica
de hidrogênio por hydrogenases foi relatada (13). hydrogenases,
que se encontram entre as enzimas em mais antigas (3,8
bilhão de anos de idade), pode dividir reversível de hidrogênio molecular
para produzir hidrogênio atômico ativo. FIG atômica ativa. 4. Efeito inibidor de água reduzida
em um único fio de hidrogênio Break pode ter participado na redox idade regulador de DNA
causados pelos radicais de oxigênio produzidas pela Cu (II) -cata- ção de funções celulares. A
água pode permear every- oxidação lisadas de Asa. (A) A electroforese do DNA plasmídeo
tratada
com a mistura de ácido acetilsalicílico e de Cu (II) na presença de 4,1 IC, em que no corpo e
penetra cada membrana in- 50SO
unidades de água reduzida (RP, 0659 mV, pH 10,5; IC50SO (18%)) ou cluindo a barreira sangue-
cérebro. Para neutralizar a solução de NaOH tóxico (pH 10,5). SC, o ADN super-bobina. OC,
ação open-circular de espécies ativas de oxigênio, DNA electrolyzed-reduzida. Pista 1,
marcador (l ADN-HindIII); pista 2, ADN de controlo (2 água pode ser um antioxidante muito
poderoso e ideal horas.); pista 3, ADN / Cu (II), (2 horas); pista 4, ADN / ASA (2 horas).
Lanes 5, 7, 9, 11 e 13 mostram a reação quebra DNA pela posterior investigação intensiva

sobre o efeito da redução
mistura de ácido acetilsalicílico e de Cu (II) na presença de uma solução de NaOH para 0, a

água em biologia celular, imunologia e oncologia devem 15, 30, 60 e 120 minutos,
respectivamente. Lanes 6, 8, 10, 12 e 14 de ser promovido. mostrar a reacção de quebra de
DNA pela mistura do ácido acetilsalicílico e de Cu (II)
na presença de água reduzido para 0, 15, 30, 60 e 120 minutos,
respectivamente. (B) Redução da quantidade relativa (%) de super-bobina AGRADECIMENTOS

ADN durante a incubação de DNA de plasmídeo com a mistura do AA
e Cu (II) na presença de água reduzido (s) ou de solução de NaOH
(l). Os valores médios de dois experimentos independentes (na2, cada) foram Estamos gratos
ao Dr. David Barnes, Universidade do Estado de Oregon,
mostrado. As barras verticais indicam os erros SD. e Mr. Mark Selby por sua leitura crítica do
manuscrito.
273
AID BBRC 6622 / 692a $$ 1,061 04-22-97 10:50:19 bbrcg AP: BBRC
onde no corpo e penetra cada membrana incluindo
a barreira sangue-cérebro. Para neutralizar o tóxico
ação de espécies ativas de oxigênio, electrolyzed reduzido
a água pode ser um antioxidant.Vol ideal e muito poderoso. 234, No. 1, 1997 bioquímicas e
biofísicas Research Communications
Referências 7. Tanaka, T. (1969) Química da Free Radical, Iwanami Shoten,
Tokyo.
8. Langmuir, I. (1927) Ind. Eng. Chem. 19, 667-674. 1. Sohal, RS, e Weindruch, R. (1996) Science
273, 59-63. 9. Sasamori, R., Okaue, Y., Isobe, T., e Matsuda, Y. (1994) sci-
2. Feig, DI, Reid, TM, e Loeb, LA (1994) Cancer Res. 54, cia 265, 1691-1693.
1890s-1894s. 10. Shinohara, K., Então, M., Nonaka, M., Nishiyama, K., Murakami,
H., e Omura, H. (1983) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 29, 481-488. 3. Hayashi, H. (1995) Explorar 6, 28-
31. 11. Chiou, S.-H. (1983) J. Biochem. 94, 1259-1267. 4. Nakano, M., Sugioka, K., Ushijima, Y.,
e Goto, T. (1986) Anal. 12. Scarpa, M., Stevanato, R., Viglino, P., e Rigo, A. (1983) J. Biochem.
159, 363-369. Biol. Chem. 258, 6695-6697. 5. Gadgil, K., e Gonzalez, RD (1975) J. Catal. 40, 190-
196. 13. Happe, RP, Roseboom, W., Plerik, AJ, Albracht, SPJ, um
Preservativo Efeito da Electrolyzed Redução da água no pâncreas b-Cell

Missa em Diabetic db db Ratos /
Mi-Ja KIM,
a, b Kyung Hee JUNG,
c Yoon Kyung UHM,
c Kang-Hyun LEEM,
e Hye Kyung KIM *
,e
um Departamento de Gestão de Obesidade, Graduate School of Obesity Ciências da

Universidade de Dongduk Mulheres; Seoul 136-714,
Coreia do Sul: b
Imaginem Instituto Obesidade, 117 Purynsol Mun Wa Gyun, Kyung Hee University; 1 Hoegi-
Dong,
Dongdaemun-Gu, Seoul 136-701, Coréia do Sul: c Departamento de Farmacologia da

Faculdade de Medicina, Kyung Hee
Universidade; 1 Hoegi-Dong, Dongdaemun-Gu, Seoul 136-701, Coréia do Sul: dCollege de

coreano Medicina, Semyung
Universidade; Jaechon, 370-711, Coréia do Sul: e e Departamento de Alimentos e

Biotecnologia, Universidade Hanseo; Seosan
356-706, Coréia do Sul. Recebido 27 de julho de 2006; aceita 10 de novembro de 2006
O stress oxidativo é produzido sob condições diabéticas e envolvido em progressão da

disfunção das células-b pancreáticas.
Tanto um aumento de espécies de oxigénio reactivas radicais livres (ROS) e uma diminuição na
defesa antioxidante
mecanismo de liderança para o aumento do estresse oxidativo em diabetes. Água reduzida

electrolyzed (ERW) com ROS eliminação
capacidade pode ter um efeito potencial em animais diabéticos, um modelo para o stress
oxidativo elevado. Portanto, o
presente estudo examinou o possível efeito anti-diabético de ERW em cepa geneticamente
diabético rato C57BL / 6Jdb / db
(db / db). ERW com ROS capacidade de eliminação reduziu a concentração de glicose no
sangue, aumento da insulina no sangue
nível, melhor tolerância à glicose e a massa de células b preservada em ratinhos db / db. Os

presentes dados sugerem que
ERW pode protege dano de células b e seria útil para o agente antidiabético.
Palavras-chave electrolyzed água reduzida; camundongos diabéticos; glicose no sangue;

insulina; tolerância à glicose; massa de células b pancreáticas
Todas as reacções oxidativas são uma fonte contínua de potencialmente
espécies reativas de oxigênio citotóxicos (ROS), que desempenham um
papel importante nos sistemas vivos tanto através da sua benéfica
e effects.1 prejudicial) Em condições fisiológicas,
ROS são totalmente inactivados por uma extracelular celular e elaborado
antioxidante system.2 defesa) No entanto, em certas
condições de aumento da geração de ROS e / ou redução de
a capacidade antioxidante conduz a actividade aumentada e ROS
estresse oxidativo.
A hiperglicemia, a principal manifestação clínica de diabetes,
é o fator mais responsável para o desenvolvimento de
vários complicações1 diabética crônica) A presença crônica
de níveis elevados de glucose aumenta a produção de ROS
glicação de proteínas e autoxidation.3 glicose) Diabetes
também perturba antioxidante natural defesa systems.4) Anterior
Estudos têm mostrado que os antioxidantes, tais como quercetina,
ascorbato e b-caroteno resultou numa melhoria da
capacidade antioxidante em rats.5,6 diabética)
Durante a progressão da diabetes de tipo 2, o desenvolvimento
tanto de resistência à insulina e disfunções a- e b-celulares
parecem ser as anormalidades metabólicas principais básicos
ao doença7 longo prazo) Uma vez que a hiperglicemia se torna aparente,

função b-cell deteriora progressivamente: induzida por glucose
a secreção de insulina se torna ainda mais comprometida e desgranulação
de células B torna-se evidente, muitas vezes acompanhada
por uma diminuição do número de b-cells.8) A manutenção de
massa de células b é um processo dinâmico, passando por ambos os aumentos
e diminui a glicemia manter dentro de um estreito fisiológico
range.9) A maioria dos pacientes com obesidade causando
resistência à insulina não é diabético, como a sua capacidade de células b
compensação é mantida, mas, 15-20% destes indivíduos
tornar-se diabético, quando as células perdem a sua b compensatório
ability.9) Portanto, uma abordagem para prevenir e
diabetes tratamento pode ser através do reforço das células b
massa.
A electrólise de soluções aquosas de NaCl ou KCl, de tipo diafragma
eletrólise dispositivos produz oxidado e
água reduzida no anódico e lado catódico, respectivamente.
Água reduzida electrolyzed (ERW) apresenta alta pH
(pH 10-12), baixo teor de oxigénio dissolvido (1,3-3,5 mg / l), de alta
hidrogênio dissolvido (0,3-0,6 mg / l), e negativo significativo
potencial redox (2400-2900 mV). O eliminador ideal para
ROS é "hidrogénio reactivo". Como o dano oxidativo tem
sido implicados na etiologia de complicação diabética,
ERW, um potente captador de ROS, pode ter um papel terapêutico no
diabetes mellitus. Portanto, o presente estudo analisou a
efeito benéfico de ERW em danos de células b e glicêmico
controle de tensão diabético rato de C57BL / 6J-db / db (db / db)
que exibe muitas das perturbações metabólicas do humano
diabetes tipo 2, incluindo hiperglicemia, obesidade e insulina
resistance.10)
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais O ERW foi produzido pela AK-3000 (Nexus,
Coreia do Sul). Esta água foi produzido por electrólise de água
a partir de um sistema de água municipal. O ERW utilizado neste estudo
tem as seguintes propriedades físicas: o pH e um 10.2460.03
-oxidativo redução potencial de 2400.2617.3 mV.
Animais geneticamente diabéticos macho db / db (C57BL / 6J
db / db) e seus irmãos de ninhada heterozigotos não-diabéticos
(db / 2) com 3 semanas de idade foram adquiridos a Jackson Laboratory
(Bar Harbor, ME, EUA). Os ratinhos foram alojados sob
temperatura (20-26 ° C) e luz (12 h de luz / escuridão)
condições controladas. Todos os animais tiveram livre acesso à norma
roedor pellet alimentos (NIH # 31M, Samtako, Coreia do Sul), com exceção
quando jejuou antes de experimentos. O estudo foi realizado
ao longo da "Princípios de laboratório cuidados com os animais" (WHO,
1985), e as "orientações do Comitê de Animal Care and Use"
da Universidade de Kyunghee. A db / db (D) e não diabéticos
camundongos controle (n) foram divididos aleatoriamente em cada 2
grupos (N58); água da torneira (DC, NC) ou ERW (DE, NE) grupo.
A glicose e insulina medições no final
de 4 semanas de período experimental, os ratos foram submetidos a jejum
dia para o outro e injectados com glucose (1 g / kg, ip). As amostras de sangue
foram coletados a partir da veia da cauda em vários momentos
234 Vol. 30, N ° 2
Preservativo Efeito da Electrolyzed Redução da água no pâncreas b-Cell
Missa em Diabetic db db Ratos /
Mi-Ja KIM,
a, b Kyung Hee JUNG,
c Yoon Kyung UHM,
c Kang-Hyun LEEM,
d
e Hye Kyung KIM *
,e
um Departamento de Gestão de Obesidade, Graduate School of Obesity Ciências da

Universidade de Dongduk Mulheres; Seoul 136-714,
Coreia do Sul: b
Imaginem Instituto Obesidade, 117 Purynsol Mun Wa Gyun, Kyung Hee University; 1 Hoegi-
Dong,
Dongdaemun-Gu, Seoul 136-701, Coréia do Sul: c Departamento de Farmacologia da

Faculdade de Medicina, Kyung Hee
Universidade; 1 Hoegi-Dong, Dongdaemun-Gu, Seoul 136-701, Coréia do Sul: dCollege de

coreano Medicina, Semyung
Universidade; Jaechon, 370-711, Coréia do Sul: e e Departamento de Alimentos e

Biotecnologia, Universidade Hanseo; Seosan
356-706, Coréia do Sul. Recebido 27 de julho de 2006; aceita 10 de novembro de 2006
O stress oxidativo é produzido sob condições diabéticas e envolvido em progressão da

disfunção das células-b pancreáticas.
Tanto um aumento de espécies de oxigénio reactivas radicais livres (ROS) e uma diminuição na
defesa antioxidante

presente estudo examinou o possível efeito anti-diabético de ERW em cepa geneticamente

diabético rato C57BL / 6Jdb / db
(db / db). ERW com ROS capacidade de eliminação reduziu a concentração de glicose no
sangue, aumento da insulina no sangue
nível, melhor tolerância à glicose e a massa de células b preservada em ratinhos db / db. Os

presentes dados sugerem que
Palavras-chave electrolyzed água reduzida; camundongos diabéticos; glicose no sangue;

insulina; tolerância à glicose; massa de células b pancreáticas
* Para quem correspondência deve ser endereçada. e-mail: hkkim111@hanseo.ac.kr;

mijakim@dongduck.ac.jp © 2007 Pharmaceutical Society of Japan
Biol. Pharm. Touro. 30 (2) 234-236 (2007)
nível sulin, melhor tolerância à glicose e ratos preservados. Os presentes dados sugerem que
-cell danos e seria útil para agente antidiabético. (0-120 min) após a carga de glicose e os níveis
de glicose no sangue
foram medidos por um toque de medição de glicose Básico
sistema (Vida de digitalização Inc., EUA). Os ratos foram mortos por decapitação
imediatamente após 120 min amostra de sangue foi retirada e
As amostras de sangue foram tomadas a partir da ferida cervical. plasma
As concentrações de glicose e insulina foram determinados com
kits disponíveis comercialmente (Sigma Co., E.U.A.).
A coloração imuno-histoquímica de celular dos ilhéus pancreáticos
Massa de ilhotas pancreáticas é um dos principais determinantes da insulina
capacidade secretora. Os quatro grupos foram utilizados para estudos histológicos
estudos. Os pâncreas foram removidos, e, em seguida, fixada com
10% de formalina. Coloração imuno-histoquímica de células B
utilizando um anticorpo anti-insulina (Dako, Santa Barbara, CA,
EUA) foi performed11) com 5 seções mm de formalina
fixo embebido em parafina e pâncreas.
Resultados das análises estatísticas foram apresentadas como mean6
SEM, e os dados foram analisados por ANOVA seguido
pelo teste post-hoc de Tukey HSD.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve diferença na ingestão de alimentos, ingestão de água, e do corpo
peso foram observadas pelo consumo ERW em db / db e
ratos de controlo não diabéticos (dados não mostrados). de glicose no sangue
níveis de ratos diabéticos (DC) foram significativamente superiores
camundongos de controle não-diabéticos (NC), e consumo de ERW significativamente
níveis reduzidos (41%) da glicose no sangue em hiperglicémico
db / db (DE) sem qualquer efeito em não-diabéticos

camundongos controle (NE, Tabela 1). Níveis de insulina plasmática de diabético
ratinhos eram mais de duas vezes maior do que os ratinhos de controlo, indicando
da resistência à insulina em diabetes do tipo 2. Curiosamente, ERW
administração também aumento do nível de insulina em ratos diabéticos
sem qualquer efeito em ratinhos de controlo, sugerindo insulina elevados
liberar em ratos diabéticos. Este aumento dos níveis de insulina em
ratinhos diabéticos resultou do aumento da massa de células-b pancreáticas
(Fig. 2).
Teste de tolerância à glucose intraperitoneal revelou que a glucose
tolerância em ratinhos diabéticos db / db exibiram significativamente
nível de glicose maior durante todos os períodos determinados (Fig.
1). Após a carga de glicose, o aumento das concentrações de glucose no soro
em murganhos diabéticos era muito lenta, enquanto que o normal
camundongos apresentaram um aumento acentuado no nível de glicose com pico de

concentração
aos 15 min, indicando a homeostase da glicose retardada
em ratinhos db / db. Administração ERW melhorou a tolerância à glicose
em db diabéticos / db ratos sem qualquer efeito no controle
ratinhos.
Diferenças histológicas significativas foram observadas entre
ratinhos db / db e seus companheiros de gaiola não-diabéticos. Quando as células-b
foram coradas com os anticorpos anti-insulina, fraca coloração de bcells
foram observados em ratinhos db / db (Fig. 2c), em comparação com
ratinhos de controlo (Fig. 2a). ERW suplementado camundongos db / db exibiram
coloração forte (Fig. 2d), como pode ser visto nos companheiros de ninhada magros
(Fig. 2b).
Este estudo demonstrou claramente que o tratamento com ERW
melhora a hiperglicemia e melhora o manuseio de glucose
capacidade em camundongos obesos diabéticos db / db. Em adição, imuno-histoquímica
exame revelou que o tratamento com ERW

pode prevenir a perda de massa de células b, resultando em aumento de insulina
capacidade secretora.
Recentemente, as células beta do pâncreas, emergiu como um alvo de oxidativo
mediada por estresse dano tecidual. Por causa da relativamente
baixa expressão de enzimas antioxidantes, células B 12) pancreáticas
pode ser bastante sensível ao ataque ROS quando eles são expostos
ao estresse oxidativo. Hiperglicemia crônica não é apenas uma
marcador de mau controle glicêmico em pacientes com diabetes, mas é em si um
causa de deficiência de secreção de insulina e biossíntese:
exposição prolongada de células beta do pâncreas, a glicose alta
níveis é conhecido por causar a disfunção das células b, chamado glicose
toxicity.13) Essas células B danificadas exibir muitas vezes extensa degranulação,
e são clinicamente associada com o desenvolvimento
de diabetes em alguns animais modelo para o tipo 2 diaFebruary
2007 235
Tabela 1. O jejum de glicose no sangue e os níveis de insulina
NC NE DC DE
A glucose no sangue (mg / dl) 129.066.8a
125.463.9a
490.1632.4b
287.9634.5c
Insulina no sangue (ng / ml) 0.7160.02a
0.6860.01a
1.5560.09b
5.7260.49c
Os valores são means6S.E.M. (N58); significa, na mesma matéria com diferentes expoentes são
significativamente diferentes (p, 0,05).
Figo. 1. Efeito da Água Electrolyzed reduzida (ERW) na tolerância à glicose
em Geneticamente Diabetic db db Ratos /

Db / 2 ratos alimentados com água da torneira Normal (NC); db normais / 2 ratos alimentados
com ERW (NE); db / db
camundongos alimentados com água da torneira (DC); camundongos db / db alimentado ERW

(DE). Os dados são expressos como
means6S.E.M.
Figo. 2. Imagens de pâncreas Immunohistochemical coloração para Insulina
Pancreases de controlo não diabéticos (a), não-diabéticos tratados com ERW (b), diabética
db / db controle (c), ou ERW tratados camundongos db / db (D) foram marcadas com

antiinsulina
anticorpo. (c) mostra a coloração fraca de células B com anticorpos anti-insulina, em
murganhos db / db, em comparação com o controlo não diabéticos (a). db / db consumido

ERW exibiram
coloração forte (d), como pode ser visto em controlo (a). A barra indica mm.betes.14 100)
Assim, é provável que o stress oxidativo desempenha um importante
papel na deterioração de células b na diabetes tipo 2. a restauração
de glicose induzida capacidade secretória após consumo ERW
Pensa-se que seja devido à eliminação da toxicidade da glucose resultando
na protecção contra os efeitos tóxicos de ROS. De Fato,
Consumo ERW massa aumentada de células b (Fig. 2) e insulina
nível (Tabela 1). Tanaka et al.15) relataram que a hiperglicemia crónica
prejudica a função das células-b ao nível de síntese de insulina
bem como da secreção de insulina, e todos estes adverso
consequências podem ser prevenidas por antioxidantes. ERW, contendo
hidrogênio atômico ativo com alta capacidade redução
que pode contribuir para ROS atividade sequestradora, 16) poderia reduzir
o stress oxidativo em ilhéus pancreáticos e de perda de células b
massa acabou por ser impedido. Portanto, a administração ERW
a função das células b ilhota melhorada, resultando em aumento da liberação
de insulina e melhorou a sensibilidade à insulina em circulação,
e, assim, melhorar a hiperglicemia e retardar o desenvolvimento
da diabetes nestes ratos diabéticos modelo.
Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que mostra protetora

efeito de ERW em massa de células b em modelos animais diabéticos.
Referências
1) Halliwell B., Gutteridge JMC, "Radicais Livres em Biologia e Medicina,"
Oxford University Press, New York, EUA, 1999, pp. 20-37.
2) Yu B. P., Physiol. Rev., 74, 139-162 (1994).
3) Feillet-Coudray C., Rocha E., Coudray C., Grzelkowska K., AzaisBraesco
V., Dardevet D., Mazur A., Clin. Chem. Acta, 284, 31-34
(1999).
4) Oeste I. C., Diabet. Med., 17, 171-180 (2000).
5) Mahesh T., Menon V. P., Phytother. Res., 18, 123-127 (2004).
6) Young é, Torney JJ, Trimble ER, Free Rad. Biol. Med., 12, 41-
46 (1992).
7) Saad MF, Knonwler WC, Pettitt DJ, Nelson RG, Charles MA,
Bonnett P. H., Am. J. Med., 90, 229-235 (1991).
8) Yki-Jarvinen H., Endocrine Rev., 13, 415-431 (1992).
9) Bonner-Weir S., Trends Endocrinol. Metab., 11, 375-378 (2000).
10) RS Surwit, Seldin MF, Kuhn CM, Cochrane C., Feinglos MN,
Diabetes, 40, 82-87 (1991).
11) Do que S., Ishida H., Inaba M., Fukuba Y., Seino Y., Adachi M., Imura
H., Ikehara S., J. Exp. Med., 176, 1233-1238 (1992).
12) Tiedge M., Lortz S., Drinkgern J., Lenzen S., Diabetes, 46, 1733-
1742 (1997).
13) Poitout V., Olson LK, Robertson RP, J. Clin. Invest., 97, 1041-
1046 (1996).
14) Kaneto H., Y. Kajimoto, Miyagawa, J., T. Matsuoka, Fujitani Y.,
Umayahara Y., Hanafusa T., Matsuzawa Y., Yamasaki Y., Hori M., Diabetes,
48, 2398-2406 (1999).
15) Y. Tanaka, Gleason CE, Tran POT, Harmon JS, Robertson RP,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, 10857-10862 (1999).
16) S. Shirahata, Kabayama S., Nakano, M., Miura T., K. Kusumoto,

Gotoh M., Hayashi H., Otsubo K., S. Morisawa, Katakura Y.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 234, 269-274 (1997)
A terapia de citrato de doença renal policística em ratos

GEORGE A. Tanner e JUDITH A. TANNER
Departamento de Fisiologia e Biofísica da Faculdade de Medicina da
Universidade de Indiana, Indianapolis, Indiana, EUA
A terapia de citrato de doença renal policística em ratos. autossômica

dominante PKD, o Han: estirpe SPRD, em um
Background. Poucos tratamentos estão disponíveis para retardar o
laboratório pro- biotério-breeding em Hanover, Gergression
a insuficiência renal em autossômica kid- policística dominante muitos
[2]. Animais homozigotos com genes alterados PKD doença ney (PKD).
Em um modelo animal de PKD, o macho
desenvolver rins císticos massivamente alargada e morrem em
heterozigotos Han: SPRD de rato, a ingestão de uma solução de potássio
citrato e ácido cítrico (KCitr) de idade um a três meses de cerca de três a
quatro semanas de idade. machos heterozigotos
impediu um declínio na taxa de filtração glomerular (TFG). O e fêmeas
desenvolvem uma doença cística lentamente progressiva,
presente estudo testou se esse efeito positivo é sustentado que é muito
mais grave no sexo masculino do que no feminino. e explorou
manipulação de citrato e amônia no normal e morte por insuficiência
renal em heterozigotos masculinos ocorre rins císticos.
Métodos. Os ratos foram fornecidos com água da torneira ou solução de

citrato em uma idade média de cerca de 6 [2] ou 17 meses [3], em
diversos
ções para beber, e estudos de eliminação e de sobrevivência foram
realizados. colônias. O heterozigoto Han: rat SPRD com PKD
Resultados. Os TFGs de ratos com PKD que consumiram KCitr pode ser
um modelo útil para autossômica dominante humana
a partir de um mês de idade eram normais aos seis meses de idade,
enquanto PKD [2-5], embora o gene anormal no rato os dos seus
homólogos na água foram cerca de um terço de [6] pode não
corresponder ao PKD- 1 ou PKD-2 genes normais. Tratamento KCitr longo
prazo estendido a vida média
espaço de ratos com PKD de 10 a 17 meses. Comparado com o que estão
com defeito, em quase todos os pacientes com doença renal policística
dominante.
ratos normais, ratos de água potável com PKD teve plasma maior
Recentemente, demonstrou que, se do sexo masculino heterozigotos
[citrato], renal cortical [citrato], e excreção fracionada de Han: ratos
SPRD com PKD foram fornecidos com uma solução
citrato, e menores taxas de consumo de citrato renal, amoníaco de
citrato de potássio / ácido cítrico (abreviado "KCitr") para a síntese, e a
excreção de amoníaco. Cortical PNH3 não foi elevado de bebidas, a
partir de um mês de idade, então o glomerular nos rins císticos. O
consumo de solução de citrato de Na3 / ácido cítrico ou K3
solução de citrato, citrato de amónio, mas não / solução de ácido cítrico,
a taxa de filtração (GFR) foi mantida em um nível normal e
impedido um declínio na taxa de filtração glomerular de ratos com três
meses de idade, com de PKD. os rins mostraram menos doenças cística
quando os ratos foram
Conclusões. Ratos com PKD mostrar manuseio renal anormal três meses
de idade [7]. Em contraste, os ratos da mesma ninhada com
de citrato e amoníaco. Sais de citrato que têm um PKD alcalinizante que
bebeu água da torneira tinha um GFR uma metade do normal, efeito
preservar GFR e prolongar a sobrevivência.
grandes cistos nos rins, e extensa doença intersticial renal.
O presente estudo teve dois objetivos: (1) para averiguar
se os benefícios da terapia KCitr seria doença renal policística
autossômica dominante sustentada além de três meses, e (2) para
examinar o (ADPKD) é uma doença hereditária que afeta mais de
mecanismo deste efeito benéfico. 500 mil pessoas nos Estados Unidos
sozinho e milhões Para avaliar a eficácia da administração KCitr mais em
todo o mundo. Esta doença é acompanhada pela for- além de três meses
de idade, nós tratamos Han: ratos SPRD da informação e da ampliação
de numerosos epitelial cheio de líquido com KCitr por tempos mais
longos em dois conjuntos de experimentos. sacos (quistos) em ambos os
rins e eventual desenvolvimento Primeiro, os ratos tratados, começando
na idade de um mês, de insuficiência renal. Atualmente, não há
tratamento específico ea função renal medida a seis meses de idade. Em
segundo para travar ou retardar a progressão da insuficiência renal em
doentes OND, que os ratos tratados a partir da idade de um mês até à
sua PKD com [1]. mortes para ver se este tratamento sobrevivência
prolongada. Em 1991, Kaspareit-Rittinghausen, Deerberg e Wcisło Para
ganhar alguns insights sobre o mecanismo de KCitr descobriu uma
estirpe mutante de ratos Sprague-Dawley com a terapia, examinamos
vários parâmetros. Em primeiro lugar, nós medimos
valores do sangue e do pH da urina para determinar se
Palavras-chave: consumo KCitr afetado essas variáveis. Em segundo
lugar, nós HY- doença renal policística autossômica dominante, potássio
citrato, citrato de sódio, ácido cítrico, amoníaco renal, Han: SPRD de
rato. pothesized que o manuseamento poderia ser citrato renal anormal
em ratos com PKD, com base em um relatório anterior que o citrato
Recebido para publicação 19 de outubro de 1999
e na forma revisada 12 de maio de 2000, a excreção é anormalmente
elevados nestes ratos [8]. nós
Aceito para publicação em 19 de maio de 2000 plasma, portanto,
medidos e os níveis de citrato de tecidos renais
2000 pela Sociedade Internacional de Nefrologia e reabsorção e

consumo de citrato renal; o
1859
com PKD mostrar anormal
de citrato e amoníaco. Sais de citrato que têm um alcalinizante
e prolongar a sobrevivência.
ratos com
efetuar preservar e GFR
com
e
um declínio na taxa de filtração glomerular de ratos com três meses de
idade, com de PKD.
Ratos com PKD mostrar manuseio renal anormal com PKD mostrar
manuseio renal anormal anormal
impedido um declínio na taxa de filtração glomerular de ratos com três
meses de idade, com de PKD.
Conclusões. ratos com
um declínio na taxa de filtração glomerular de ratos com três meses de
idade, com de PKD.
Rats1860 Tanner e Tanner: Citrato de tratamento em ratos PKD
efeitos de tratamento KCitr sobre estes parâmetros eram também de
uma solução contendo 3% polyfructosan (Laevosan Co.,
estudado. Em terceiro lugar, uma vez que Torres et ai sugeriram que
Linz, Áustria), 5,5 a 11 mg / mL de p-aminohipurato de sódio
o aumento dos níveis de amoníaco contribuir para danificar em cística
(HAP), 2 g / 100 mL de albumina de soro bovino, 24 mmol / L
Rins NaHCO3, determinou-se tecido cortical renal e PNH3, e 125 mmol /
L de NaCl. A artéria femoral foi
produção de amônia e excreção [9, 10]. Em quarto lugar, canulamos para
coleta de sangue e sangue para medir
testaram a ideia de que o efeito benéfico da KCitr é pressão dependente
com um transdutor (Gould-Statham, Hato Rey,
na interacção conhecida entre citrato e cal- Porto Rico). O abdómen foi
aberto através de uma linha média
íons Cium no corpo [11]. Por fim, substituído incisão ammo-. O ureter
esquerda foi canulada, e uma cânula
nio ou iões de sódio para os iões de potássio no citrato foi inserido na
bexiga para drenar a urina da
solução e também deu K rim direito. Um número 25 de agulha, ligada a
uma curta 3 de citrato (citrato tripotássico
sem ácido cítrico) para determinar se o comprimento benéfico da
tubagem Silastic, foi inserido no renal esquerda
efeito da solução KCitr foi relacionado com a sua veia potássio para
amostragem de sangue.
Medições de depuração renal foram feitas como se segue: o conteúdo
ou ao seu efeito de alcalinização.
Cerca de uma hora após o uréter esquerdo foi canulada,
foram coletadas duas amostras de urina de 30 minutos sob
MÉTODOS água equilibrada óleo mineral leve. O volume de urina foi
Animais e soluções determinada por pesagem, assumindo uma
densidade de um. urina
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o pH foi
medido imediatamente à temperatura ambiente usando
um eletrodo de combinação 9802BN micro-pH (Orion dos Institutos
Nacionais de Saúde Guia para o cuidado e
Uso de Animais de Laboratório. As experiências foram realizadas
Research, Beverly, MA, EUA). Arterial e venosa renal
amostras de sangue (,60-,85 mL) foram coletadas nos formados em
masculino heterozigotos Han: ratos SPRD com PKD
início e fim das colheitas de urina. Quando determinação e seus
companheiros de ninhada normais. O plantel foi
minations de níveis plasmáticos de amônia foram feitas, o sangue obtido
a partir do Programa de rim policístico no
As amostras foram coletadas em seringas gelado. Plasma e University of
Kansas. Todos os animais foram deixados acblood livre
As células foram separadas imediatamente. Plasma proteínas cesso para
uma dieta contendo proteína de 24% e 6% de gordura (Teklad foram
precipitados com ácido tricloroacético gelado a 10% 6% dieta ratinho /
rato 7002;. Harlan, Madison, WI, EUA). Os sobrenadantes foram
congelados e as análises foram concluídas Na maioria das experiências,
os ratos foram fornecidos com uma ou em poucas horas. Uma solução
(0,25 mL) de 55 mmol / L citrato tripotássico / 67 mmol / L de amostra
de sangue arterial também foi recolhido via anaeróbia para a medição
de ácido cítrico sangue (KCitr) ou água da torneira para beber
começando em uma estufa e do pH através de uma série IRMA 2000
sistema sanguíneo mês de idade, e eles foram estudados em seis meses
de (Diametrics médicos, St. Paul, MN, EUA) ou modelo 1400 idade ou a
longo prazo de sobrevivência foi seguido. Em outro analisador de
eletrólitos do gás de sangue experimental (mentos Instrumentation
Laboratories, ratos normais e ratos com PKD foram fornecidos com
tories, Lexington, MA, EUA). Em algumas experiências, as soluções de um
ou (1) de citrato de 82,5 mmol / L de diamónio / amostra de sangue
terminal (0,25 mL) foi recolhido para / L de ácido cítrico 39,5 mmol, (2)
55 mmol / L de cálcio no plasma trissódico de sódio e fosfato de
determinações. citrato / 67 mmol / L de ácido cítrico, ou (3) citrato 55
mmol / L K3 Os estudos de depuração em ratos com três meses de idade
foram beber de um mês de idade, e foram estudados feito exactamente
da mesma maneira como no nosso estudo anterior
aos três meses de idade. Os miliequivalentes de citrato em ratos desta
idade [7].
em todas as soluções de citrato eram os mesmos. soluções de Beber
foram compostos na água da torneira. Sobrevivência a longo prazo
Estudos de sobrevida foram realizadas em 18 estudos Liquidação
heterozy- ratos machos Gous com PKD que bebeu água e em seis do sexo
masculino
Antes de experimentos, ratos com seis meses de idade foram privados
ratos heterozigotos que beberam solução KCitr a partir de
durante a noite de alimentos, mas tiveram livre acesso à água ou citrato
de um mês de idade. Três ratos normais sobre o consumo KCitr desde
solução. Eles foram anestesiados com um mês de idade quando foram
sacrificados 21 meses de idade.
o tiobarbiturato Inactina (130 mg / kg de peso corporal; Byk
Gulden, Konstanz, Alemanha). Cada animal foi colocado recolha de
tecidos
sobre uma mesa aquecida, e de temperatura rectal (monitorizada No
final da maior parte das experiências de depuração, um rim
com uma sonda) foi mantida a 378C. A traqueia foi cannu- (usualmente a
esquerda) foi rapidamente removido. Cortex e melated,
e um fluxo lento de umedecido 35% O2
/ 65% N2 foi Dulla foram separadas, e peso úmido e seco (amostras
passou sobre a abertura da cânula. Uma veia femoral foi aquecido num
forno a 1208C durante 16 horas) foram deterwas
canulada para infusão. Um mililitro de 6 g / 100 ml extraído. Em outros
experimentos, amostras de tecido de cálcio
fracção V de albumina de soro bovino em 0,9% de NaCl foi ad- foram
obtidas após a separação do córtex renal e meministered
por via intravenosa durante a preparação cirúrgica. Dulla. As amostras
para o citrato de tecido foram obtidos pela rápida
Isto foi seguido por uma dose de inoculação (0,2 mL / 100 g de corpo
cortando fora uma parte do córtex, congelar-aperto em líquido
peso) e a infusão intravenosa constante de azoto em 3 ml / hora, e em
seguida homogeneizando a amostra em 10% gelado Tanner e Tanner:
Citrato de tratamento em ratos PKD 1861
ácido perclórico. As amostras foram centrifugadas, e os cálculos
Os sobrenadantes foram, em seguida, filtrada através de um 10.000
moléculas da A TFG foi calculada a partir da taxa de excreção
lar corte de peso filtro UltraFuge (Micron Separações, de polyfructosan
dividido pelo polyfructosan plasma
Westboro, MA, EUA). concentração. Fluxo plasmático renal (RPF) foi
calculado
da depuração de PAH dividido pelo rácio de extracção PAH Histologia
((arterial menos plasma venoso renal [PAH]) 4
O rim remanescente foi fixado pelo plasma arterial retrógrada da aorta
[PAH]). O fluxo sanguíneo renal (FSR) foi
perfusão com uma solução de paraformaldeído a 3%, 137 calculada a
partir desta fórmula: 5 RPF RBF / (1 2 hematommol / L
De NaCl, 2,7 mmol / L de KCl, 1,5 mmol / L de KH2PO4
, 4 crit). Consumo de citrato renal foi calculada a partir de
mmol / L Na2HPO4
, E 2 mmol / L de ácido pícrico. a um FPR 3 (plasma arterial perfusão
[citrato] 2 no plasma da veia renal
sion pressão de 150-170 mm Hg. O rim foi [citrato]) menos taxa de
excreção urinária de citrato. tubular
mantidos na mesma solução fixadora durante vários dias na reabsorção
foi calculada a partir da carga de menos filtrada
geladeira e depois pesados, cortada com uma lâmina de barbear, a taxa
de excreção. Absorção peritubular de citrato foi calimmersed
solução em 0,1 / mol L cacodilato (pH 7,25), culada a partir do consumo
de citrato renal menos o
e embebidos em parafina. Os cortes foram corados com taxa de
reabsorção tubular citrato. excreção fracionária
HE. O grau de doença cística (tamanho foi calculado a partir da taxa de
excreção dividida pela
de cistos, alargamento intersticial e fibrose, presença de carga filtrada. A
produção de amônia renal foi calculada células inflamatórias) foi
avaliada cegamente usando uma arbi- da RBF 3 (sangue venoso renal
[amônia] 2 artetrary
escala de 0 a 4, em que 0 representa o sangue normais rial [amônia])
mais a taxa de excreção urinária.
condição e 4 representa alterações graves. A pressão parcial de
amoníaco tecido cortical (PNH3)
foi estimada a partir da veia renal total de NH4
1 análises químicas concentrações
ção e pH do sangue arterial [16, 17] e esta fórmula: Polyfructosan (a
inulina sintético) no plasma e na urina
PNH3 5 (NH4 total de
1 22.09 3) / (10 foi determinada por um método de antrona [12]. HAP foi
pK2 um pH 3)
determinada pelo método de Bratton e Marshall [13]. Ci- onde o pK para
NH4
1 é 9,02. O pH do trado de venosa renal no plasma, urina e amostras de
tecido foi determinada e arterial são assumidas ser a mesma, e o
espectrofotometricamente usando um coeficiente de solubilidade
método citrato-liase (a) para amoníaco é de 0,91 [18]. (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN, EUA). recuperação
do citrato em plasma em média 99 6 6% (n 5 métodos estatísticos
11). Quando o tecido do rim foi analisado para o citrato, nós Os dados
apresentados são médias 6 SD. Eles foram analisados observou-se uma
(N 5 25) de recuperação de 100 6 5% de um interno por meio de análise
de duas vias de variância (ANOVA), depois de um padrão pré-citrato em
cinco minutos após a adição do teste liminar citrato de homogeneidade
das variâncias. Liase indivíduo, indicando a conclusão da reacção. os
absorgroups
foram comparados com o método de Bonferroni. Se as leituras Bance, no
entanto, continuou a deriva sensivelmente
desvios eram heterogéneos, o teste de Kruskal-Wallis, com o tempo,
provavelmente devido à presença de nicotinand
Foram utilizados o teste de Dunn para comparação das médias. AP valor
amida-adenina-dinucleótido (NADH) reduzido em actividade de oxidase
de menos do que 0,05 foi considerado significativo. extratos do córtex
renal. Para corrigir este "Creep", que
absorvância medida a cada 5 minutos para um total de 20
minutos após a adição do citrato liase e resultados extrapolados
a absorvência voltar ao tempo zero [14]. O amoníaco foi em função geral
ratos com seis meses de idade determinados usando um kit baseado em
glutamato desidrogenase
(Boehringer Mannheim). Recuperação de amônia acrescentou Os efeitos
do consumo KCitr em seis meses de idade
para o plasma em média 100 6 1,4% (N 5 4). Fosfato em ratos normais e
ratos com PKD estão resumidos na Tabela
no plasma foi determinada pelo método de Fiske-Subbarow. 1. A
descoberta mais notável é que GFR foi comPotassium
na urina e no plasma e de cálcio no plasma, pletamente normal em ratos
com PKD que tinham sido tratados
urina e tecido renal foram determinadas usando um atômica com KCitr,
enquanto GFR foi de apenas 37% do normal em
espectrofotômetro de absorção (modelo 951;. ratos instrumentação com
PKD que tinha consumido a água da torneira também RBF
ção Laboratory, Wilmington, MA, EUA). Tragem tecido foi normal em
ratos com PKD que tinham sido tratados
pios foram homogeneizados numa solução contendo 4% (vol / com KCitr
e foi cerca de metade do normal em não tratada
vol) de butanol, 0,2 mol / L de HCl, e 36 ratos mmol / L com lacL de PKD.
KCitr tratamento não teve efeito sobre o corpo 3 [15]
usando um homogeneizador Polytron (Brinkmann Instruments, peso ou
pressão arterial, de acordo com o nosso mais cedo
Westbury, NY, EUA). Recuperação de cálcio adicionado aos resultados de
três meses de idade [7].
amostras de tecido em média 103 6 3% (N 5 9). Uma comparação de
amostras de água potável ratos normais e waand
Foram preparados padrões sempre na mesma matriz ratos terc-beber
com PKD (Tabela 1) mostra que a
soluções. animais com a doença cística tinham rins mais pesados,
higher1862 Tanner e Tanner: tratamento de citrato em ratos PKD
Tabela 1. Efeitos do consumo KCitr em função em ratos normais seis
meses de idade e ratos com PKD
Ratos normais Ratos com PKD
A água da torneira KCitr Tap KCitr água
464,628 g de peso corporal (14) 446,625 (13) 462,629 (13) 464,610 (12)
Peso do rim g 1.5560.14 (14) 1.5960.15 (13) 2.6460.40 (13) c 2.8360.28
(12) e
Córtex do rim% H2O 78.960.4 (10) 80.260.6 (9) c 87.560.6 (9) c 84.460.5
(7) e, g
Kidney medula% H2O 83.060.6 (10) 84.060.6 (9) b 85.060.7 (9) c 83.960.5
(7) f
PSM mm Hg 10766 (14) 10667 (13) 116,610 (13) um 11966 (12) e
Células de hematócrito% 4761 (14) 4461 (13) 3964 um (13) b 4361 (12)
TFG IL / min por 100 g de peso corporal 392,631 (14) 448,643 (13) uma
146,667 (13) c 418637 (12) g
V lL / min por 100 g de peso corporal 6.861.7 (14) 6.761.7 (13) 8.463.6
(13) 9.362.4 (12) d
Extracção HAP 0.8860.02 (14) 0.8460.04 (13) 0.3760.17 (13) b 0.7260.05
(12)
O fluxo sanguíneo renal mL / min 18.562.5 (14) 18.562.3 (13) 9.762.3 (13)
c 17.061.4 (12) g
Os valores são médias 6 SD (Número de ratos). Renais são dados para o
rim esquerdo. Abreviações são: PKD, doença renal policística; KCitr,
citrato de potássio / ácido cítrico
solução de ácido; MABP, PA média arterial; v
, A taxa de fluxo de urina.
aP, 0,05, BP, 0,01, e cP, 0.001 em comparação com ratos normais em
água da torneira
dP, 0,05 e EP, 0.001 em comparação com ratos normais em KCitr
fP, 0,01 e GP, 0.001 em comparação com ratos com PKD na água da
torneira
teores de água do rim, aumento da pressão arterial, menor citrato Renal
ele-, amônia, e manuseio de eletrólitos no
matocrit e extração de PAH inferior. O aumento kid- ratos com seis
meses de idade
ney tamanho e teor de água refletem acúmulo de líquido do cisto.
Medições ácido-base são apresentados na Tabela 2.
Tratamento KCitr não impediu Rats alargamentos renais globais com
PKD que bebeu água da torneira mostrou evidências
mento em ratos com PKD (Tabela 1). A histologia cística de uma acidose
metabólica (pH médio de 7,30 e plasma
rins de ratos tratados e não tratados era, no entanto, bastante
concentração de bicarbonato de 19 mEq / l). KCitr treatdifferent
(Fig. 1). Na TAP ratos hídrica com PKD, ment aumentou o pH do sangue e
bicarbonato conthere plasma
foi a doença cística grave, com inúmeros cistos grandes, centração nos
ratos com PKD, mas não o fez de forma significativa
afetar essas variáveis em ratos normais. Tratamento KCitr alargamento
intersticial e fibrose, e numerosos inflamatória
células; a pontuação doença em média 4 6 aumentou significativamente
o pH da urina, por cerca de 0,5 unidade de pH, 0 (N 5 7).
tanto em ratos normais e ratos com PKD. Em KCitr-ratos tratados com
PKD, a pontuação doença averData
sobre o manuseio citrato renal em ratos normais e em idade 2.6 6 0.4 (N
5 7), e em nenhum caso foi a doença cística
ratos com PKD que haviam consumido qualquer torneira ou julgados
grave (pontuação 4). Solução KCitr são apresentados na Tabela 3. É
notável Em ratos normais, não teve nenhum tratamento KCitr
significativo que nos ratos normais, o citrato de plasma arterial efeito
concentração em qualquer das variáveis medidas (Tabela 1) ou na tração
e cortical renal concentração de citrato não eram
histologia renal, com exceção de um aumento de cerca de 10% na taxa
de filtração glomerular, afetado por aumento da ingestão de citrato. De
facto, a ingestão KCitr
um pequeno aumento no conteúdo de água do córtex e da medula, em
ratos normais não afecte nenhum dos parâmetros meaand
uma queda no hematócrito. Em ratos com PKD, KCitr tratamento sured
exceto para os aumentos esperados na urina citrato conment
geral tenderam a produzir mais centração função renal normal, citrato
excretada, e a fracção de filtrou
ção e estrutura (Tabela 1 e Fig. 1). citrato excretada na urina.
Ratos com PKD que estavam na água da torneira tinha uma elevada
Longo prazo concentração de citrato plasma sobrevivência arterial (cerca
de duas vezes norKCitr
tratamento prolongou significativamente a vida de ratos mal), citrato de
extracção e diminuiu o consumo, elewith
PKD (Fig. 2). O tempo de sobrevida médio dos ratos que motivou a
excreção urinária de citrato (cerca de 10 vezes normal),
e concentração cortical renal elevada citrato quando bebia água da
torneira foi de 288 6 39 dias (n 5 18). a média
comparados com ratos normais em água da torneira (Tabela 3). O tempo
de sobrevivência de ratos com PKD em KCitr era 506 6 33
maior taxa de excreção de citrato em ratos com PKD não é dia (N 5 6). Os
animais tratados com KCitr viveu bem en- devido a uma diferença na
urina pH [19, 20], uma vez que ambos os grupos além dela o tempo de
todos os ratos não tratados com PKD teve que bebeu água da torneira
tinha valores de pH da urina cerca de 5,9 morreram (Fig. 2). O exame
histológico de rins de (Tabela 2). A nova descoberta é que o citrato de
tecido cortical
ratos tratados com KCitr velho com PKD demonstrou acentuada
concentração também é elevado em ratos com PKD, embora
alterações císticas; Assim, este tratamento não pára pro- com extensão
variável. A Figura 3 ilustra que este variabilgression
da doença. Valores química plasmáticas normais dade está relacionada
com o grau de insuficiência renal em in-
(uréia, creatinina e potássio) foram encontrados em três ratos tratados
com PKD; tecido concentração de citrato foi
ratos normais que tinham consumido KCitr solução durante 20
inversamente relacionada com a taxa de filtração glomerular.
meses (dados não mostrados). O aumento da ingestão de citrato
paradoxalmente levou a uma lowerFig. 1. Fotomicrografias de
hematoxilina e-eosina
do córtex exterior de rins representativos de seis meses de idade (A)
ratos normais sobre a água, (B) ratos com doença renal policística (PKD)
em uma solução de citrato de potássio (KCitr), e (C) ratos com PKD sobre
água (3100). Ratos tratados com KCitr com PKD mostraram menos
alargamento cisto,
menos túbulos atrofiados, e menos alargamento intersticial e in-
flammation.1864 Tanner e Tanner: Citrato de tratamento em ratos PKD
Figo. 2. A sobrevivência dos ratos heterozigotos do sexo masculino com
PKD beber água da torneira
(s) ou em uma solução KCitr (d). A idade de morte é representada
graficamente como uma função fig. 3. relação inversa entre cortical
[citrato] glomerular e do tempo. O tratamento com KCitr começando na
idade de um mês levou a taxa de filtração (TFG) em ratos não tratados
com PKD (d). A equação de um aumento no tempo de sobrevivência de
288 6 39 dias (N 5 18) 33 6 a 506 da linha de mínimos quadrados é tecido
[citrato] TFG 5 20,00503 3 1 1,59 (r 5
dias (N 5 6). 20,77, P 0,05). Os valores médios para oito ratos normais
consumir água
são mostrados no lado direito (r).
concentração de citrato de plasma arterial e uma concentração mais
baixa
de citrato de tecido cortical de ratos com o consumo de com- PKD nos
ratos normais, mas não foi afectada
paração com ratos com PKD que beberam água da torneira (Tabela por
este tratamento nos ratos com PKD (Tabela 5). No
3). No geral, o tratamento de ratos com KCitr PKD levou a um diferenças
significativas na excreção de cálcio foram observados em
padrão mais normal de manuseio renal de citrato. os quatro grupos. Em
ratos não tratados, cálcio tecido cortical
Medições de manipulação renal de amoníaco são sumários níveis foram
mais elevados do que com PKD em indivíduos normais. potássio
marized na Tabela 4. tratamento KCitr em ratos normais levou
tratamento citrato realmente elevou os níveis de cálcio no tecido
a decréscimos significativos na produção de amoníaco renal e no córtex
e medula de ratos normais e na
excreção. Isto pode ser devido a dois efeitos: (1) oxidação de medula de
ratos com PKD. Concentraof fosfato de Plasma
citrato de bicarbonato e sua conseqüente ção alcalinizante foi elevada
em ratos com PKD sobre a água, mas
efeito, e (2) a inibição da ammoniagenesis por citrato foi trazido mais
próximos do normal em ratos com PKD que [21]. Ratos com PKD na água
da torneira tiveram menores taxas de ter sido tratado com KCitr. Estas
mudanças na produção e excreção de amônia que fez nível de fosfato
normais provavelmente plasma refletir retenção de ratos Fosfato na
água da torneira. Ratos tratados com KCitr com PKD teve a phate em
animais com doença renal (mesmas taxas não tratados de produção e
excreção de amônia como ratos com PKD) graves e descarte adequado
de fosfato em ani- ratos tratados com KCitr normais. mals com uma GFR
normal (KCitr-tratados ratos com PKD). Concentração de amônia Arterial
foi menor nos ratos
com PKD do que em ratos normais quando ambos beberam Efeitos
toque de diferentes bebendo composição do fluido
água. Caso contrário, não foram estatisticamente significativos
Efeitos de variar a composição das diferenças potável na concentração
de amoníaco arterial, vesolutions renais
foi determinada em estudos de limpeza nas três concentração de amônia
nous, ou cortical PNH3 entre os
ratos meses de idade. A Figura 4 mostra as medições de left quatro
grupos (Tabela 4).
Os dados sobre eletrólito manipulação em ratos normais e em ratos GFR
rim a partir desses novos experimentos, juntamente com
com PKD que bebeu água da torneira ou solução KCitr são resultados do
nosso estudo anterior sobre os efeitos da ingestão de
de água da torneira ou uma solução KCitr [7]. Os dados são normal-
mostrado na Tabela 5. Surpreendentemente, a concentração de potássio
no plasma
foi significativamente reduzida em ratos normais zados por 100 g de
peso corporal. Nenhum dos tratamentos teve
e em ratos com PKD que consumiu KCitr quando comum efeito
significativo no peso corporal, e nenhum impedido
paração com ratos de água potável. Excreção urinária de potássio
alargamento renal em ratos com PKD (dados não mostrados).
ção foi elevada com ingestão KCitr, como esperado. O A ingestão de uma
solução de citrato de amónio / ácido cítrico
excreção fracionada de potássio (FEK) foi aumentada não teve nenhum
efeito benéfico sobre a TFG em ratos com PKD; GFR
com a ingestão de potássio em ratos normais; nos ratos com uma média
de 6 261 22 mL / min, 100 g de peso corporal, cerca de metade
PKD tratada com KCitr, FE do normal, e foi o mesmo que em ratos-água
de beber K foram inferiores aos observados
em ratos não tratados, o mais provavelmente devido a uma maior taxa
de filtração glomerular, da mesma idade (Fig. 4). O pH da urina em ratos
consomem
e filtrou-se a carga de potássio em ratos tratados com KCitr. solução de
ácido citrato de amónio / ácido cítrico de 5,77 6 0,04
Cálcio no plasma diminuiu significativamente por KCitr (N 5 4) em ratos
normais e 5,60 6 0,09 (N 5 4) em ratsTanner e Tanner: tratamento de
citrato em PKD ratos 1865
Tabela 2. medições ácido-base em ratos normais de seis meses de idade
e ratos com PKD
(N 5 14) (5 N 13) (13 N 5) (5 N 12)
O pH arterial 7.3860.03 7.3960.06 7.3060.05b 7.3960.04d
Arterial PCO2 mm Hg 3764 4066 3965 3764
Plasma Arterial [HCO3
2] mEq / L 2262,5 2462,1 1961.9a 2262.5c
O pH urinário 5.9660.22 6.4360.25b 5.8960.22 6.3960.24d
Os valores são médias 6 SD.
aP, 0,01 e PA, 0.001 em comparação com ratos normais em água da
torneira
cP, 0,01 e dP, 0.001 em comparação com ratos com PKD na água da
torneira
Tabela 3. O manuseamento citrato renal em ratos normais seis meses de
idade e ratos com PKD
(5 N 9) (N 5 8) (8 N 5) (N 5 7)
Arterial [citrato] mmol / L 0.08660.018 0.08160.013 0.15460.038c
0.07760.015g
Extração Citrato 0.3460.08 0.3360.10 0.2160.08b 0.3360.09
Urina [citrato] mmol / L 0.0860.06 0.7060.54c 0.6560.33c 1.0460.57
Filtrou-citrato nmol / min 149631 158637 107618b 161639f
Excretado nmol citrato / min 2.362.1 13.468.6c 25.4616.9c 43.6620.3d
Reabsorvido citrato nmol / min 146630 145637 117624 82617c
FEcitrate% 1.461.0 8.865.7c 23.0612.8c 26.366.7e
Consumo nmol / min 257666 2676137 202668 141657b citrato
Peritubular absorção citrato nmol / min 110662 1226108 59641 85673
Cortical [citrato] mmol / kg de peso fresco a 0.27160.071g 0.26960.104
0.26460.069 0.82560.516c
Os valores são médias 6 SD. Renais são dados para o rim esquerdo.
aMeasurements nos quatro grupos foram realizadas em 8, 7, 9, 7 e ratos,
respectivamente
BP, a 0,05 e cP, 0.001 em comparação com ratos normais em água da
torneira
dP, 0,01 e EP, 0.001 em comparação com ratos normais em KCitr
fP, 0,05 e GP, 0.001 em comparação com ratos com PKD na água da
torneira
com PKD; ingestão desta solução foi associada com um mês de idade,
resulta na taxa de filtração glomerular renal normal e sangue
o pH da urina ácida. fluir em animais seis meses de idade (Tabela 1).
estes resultados
Em contraste, a substituição de sódio por potássio na estender nosso
estudo anterior, no qual um efeito benéfico de
a solução bebível produziu resultados semelhantes aos KCitr. KCitr
tratamento foi observada em ratos tratados de um a
TFG nos ratos com PKD, 532 6 96 mL / min-100 g corpo três meses de
idade [7]. Terapia KCitr longo prazo, começou
peso, era normal. O pH urinário média 6,57 6 0,23 (5 N, com a idade de
um mês, prolonga o tempo de sobrevivência de ratos
4) em ratos normais e 6,51 6 0,33 (N 5 4) em ratos com com PKD (Fig. 2).
Não sabemos se o início da
PKD. A histologia renal de ratos com PKD que tiveram o tratamento em
uma idade mais avançada, quando algum grau de insuficiência renal
consumido o sal de citrato de sódio (dados não mostrados) foi
insuficiência já está presente, também seria eficaz
idêntico ao observado nos ratos com a mesma idade que tinha em
retardar a progressão de PKD.
consumida KCitr [7]. Estes resultados indicam claramente que
é a ingestão de citrato ou ácido cítrico, não a disposição de tratamento
renal citrato
de potássio extra na dieta, que é responsável pela manipulação Foram
estudados renal de citrato numa tentativa de
efeito benéfico da KCitr. entender por que ele foi eficaz. Alguns dos
nossos resultados
Com a administração de citrato de K3 (potássio ci- não eram esperadas
concentrações (1) citrato de plasma,
trar mas sem ácido cítrico), a GFR foi mantida como com o tecido cortical
renal, e urina foram todos superiores norKCitr.
PH da urina dos ratos em solução de citrato de K3 foi mal em ratos não
tratados com PKD; e (2) tratamento KCitr
6,08 6 0,25 (N 5 2) em ratos normais e 5,83 6 0,35 (N 5 de ratos com PKD
levou à diminuição nos plasma e do tecido 5) em ratos com PKD. No
geral, os resultados demonstram níveis de citrato, provavelmente como
consequência de mais normal que sais de citrato alkalinizing evitar um
declínio da função renal GFR. em ratos com PKD. Citrato de Plasma. Dois
fatores podem explicar a elevada
concentração de citrato de plasma arterial em ratos não tratados
DISCUSSÃO com PKD (Tabela 3). Em primeiro lugar consumo, renal de
citrato
Este estudo demonstra que o tratamento crónico de ratos foi diminuída.
Os rins são o principal local de citrato
que PKD com uma solução KCitr, a partir de uma utilização no corpo [22].
Em segundo lugar, ratos ou pacientes with1866 Tanner e Tanner:
tratamento de citrato em ratos PKD
Tabela manipulação 4. A amônia em ratos normais de seis meses de
(N 5 5) (5 N 5) (5 5 N) (N 5 5)
Amônia Arterial lmol / L 4066 3763 3264
a 3564
Amônia veia renal lmol / L 84611 7766 79619 84617
Cortical PNH3 mm Hg 3 1026 4766 53615 3369 48612
Amônia excreção lmol / min 0.7460.12 0.4060.09b 0.2860.19c 0.3260.07
Amônia lmol produção / min 1.6760.23 1.1060.26a 0.7760.41c 1.1460.32
Os valores são médias 6 SD.
aP, 0,05, BP, 0,01, e cP, 0.001 em comparação com ratos normais em
água da torneira
Tabela 5. manipulação de eletrólitos em ratos normais de seis meses de
Plasma [K1] mEq / L 3.7060.30 (9) 2.9160.45 (8) b 4.0460.56 (8) 3.3460.17
(7) d
Excretado K1 LEQ / min 1.5960.16 (9) 2.9560.48 (8) c 1.7860.28 (8)
3.1660.29 (7) f
FEK% 2664 (9) 5166 (8) c 64616 (8) c 4768 (7) d
Plasma [cálcio] mg / 100 mL 8.6060.24 (6) 8.0160.37 (4) um 8.6460.24 (3)
8.4760.33 (4)
Excretado cálcio lg / min 0.6260.32 (9) 0.3660.12 (6) 1.1060.59 (6)
0.7460.26 (8)
Cortex [cálcio] mg / kg de peso molhado 9564 (6) 176689 (3) um 15368
(3) uma 181628 (3)
Medula [cálcio] mg / kg de peso molhado 156621 (6) 8.556.677 (3) c
222637 (3) 10016462 (3) e
Plasma [fosfato] mg / 100 mL 4.9760.34 (10) 5.3760.67 (9) 8.7061.45 (9) c
6.0460.61 (7) f
Os valores são médias 6 DP (Número de animais). Renais são dados para
o rim esquerdo.
(Tabela 3).
Figo.
Os dados a partir de
solução de ácido.
Nós limitado. Fig. 4). Sou
Efeito de esterilização de água electrolyzed em

alimentos arroz
Seiichiro Isobe, Chang-yong Lee, e Kyoichiro
Yoshida
Recentemente, uma série de alimentos instantâneos têm sido feitos a
partir de arroz. o
categorias principais são cookies de arroz e arroz embalados assépticas.
em
este processo de alimentação, o controlo de microrganismos,
especialmente
esporos a partir de matérias-primas para produtos resistentes ao calor, é a
mais
ponto importante para confirmar a segurança no fluxo do produto. Se o
resistente ao calor
esporos pode ser controlada por pré-tratamento antes do cozimento,
excesso de calor deve ser omitido para fazer arroz longa vida de prateleira
produtos, melhorando assim a qualidade dos produtos. vários
trabalhos têm demonstrado os efeitos de esterilização de electrolyzed
água em ingredientes alimentícios (Koseki et al, 2004a, b).
Neste trabalho, tentamos confirmar o efeito de esterilização em
arroz utilizando água electrolyzed e verificar a qualidade do arroz durante
pré-tratamento.
Efeito de esterilização de água electrolyzed em alimentos arroz
Seiichiro Isobe, Chang-yong Lee, e Kyoichiro Yoshida
Materiais e métodos
Água Electrolyzed é produzido por eletrólise de água da torneira com
a adição de uma pequena quantidade de NaCl. electrolyzed ácida
água (AcEW) criada no ânodo tem sido observado que tivesse
efeitos de esterilização sobre microorganismos e electrolyzed alcalina
água (AlEW) criado na tem sido observado o cátodo
para ter um efeito de lavagem em compostos orgânicos. No Japão, AcEW
já foi aprovado como um aditivo alimentar indireta em 2002.
O princípio de água electrolisada é mostrado na Figura 1.
Foi utilizado um tipo de fluxo de água produtor electrolyzed (Rox-
20TA: Hoshizaki Electric Co., Japão). Este aparelho gera
água electrolisado por electrólise de uma solução diluída (0,1%)
solução salina numa célula electrolítica separada num ânodo
e na região do cátodo com um diafragma. A passagem de corrente
água lisadas em ingredientes alimentícios (Koseki et al, 2004a, b).
Neste trabalho, tentamos confirmar o efeito de esterilização em
arroz utilizando água electrolyzed e verificar a qualidade do arroz durante
pré-tratamento.
Água Electrolyzed é produzido por eletrólise de água da torneira com
a adição de uma pequena quantidade de NaCl. electrolyzed ácida
água (AcEW) criada no ânodo tem sido observado que tivesse
efeitos de esterilização sobre microorganismos e electrolyzed alcalina
água (AlEW) criado na tem sido observado o cátodo
para ter um efeito de lavagem em compostos orgânicos. No Japão,
AcEWSession 9: Desenvolvimento de novos usos de arroz 271
através do aparelho de electrólise e tensão entre os eléctrodos
foram fixados em 14A e 18V, respectivamente. AcEW foi preparado
dentro da região do ânodo da célula electrolítica, e AlEW
foi preparado dentro da região do cátodo. o físico
propriedades da água electrolisada são como se segue:
O AcEW: pH 2.7, o potencial de redução de oxidação (ORP)
1481 mV, a concentração de cloro disponível 51,5 ppm.
O AlEW: pH 11,6, ORP -576 mV.
Usamos água destilada como uma solução de processamento de controle.
Arroz polido (Kinuhikari) foi comprada e utilizada como um
amostra. Bacillus subtilis PCI219 preparado foi utilizado como um
resistente ao calor
amostra de esporos.
Alguns 1 ml de solução de esporos (109 ufc mL) foi adicionada a
9 mL de AcEW e misturado. A amostra foi recolhida a partir do
solução mista a cada 1 minuto e contado o número de sobrevivência
em cada amostra após o cultivo.
Cerca de 100 g de arroz polido foram preparadas para cada
teste de preparação. Eu inventei um processo de preparação com 3 etapas
(lavagem: 5 min, imersão 1 ½ min, absorvendo 2 ½ min). Usamos
AcEW, AlEW, e água destilada, respectivamente, em cada fase
solução. pH e cor do arroz foram medidos por um convencional
medidor de pH e medidor de cor.
Para confirmar o efeito de controlo de microrganismos, foram adicionados
as B. subtillis esporos no arroz e temos a sobrevivência
número em cada amostra do teste de preparação.
Ácido-electrolizada
água para
esterilização
Alkalineelectrolyzed
água
torneira de água
com NaCl
separação
membrana
Cl2
H2
H
+ OH
HCl
HClO
NaOH
Cl Na +
NaCl NaCl
+
~ Reação química ~
<+ Part>:
2OH®H2O + 1 / 2O2 +
2e
2Cl®Cl2 + 2e
Cl2 + H2®HClO + HCl
(baixa condição pH)
HClO®H ++ ClO
(condição de alto pH)
<part>:
2H ++ 2e®H2
Figo. 1. Princípio da água eletrolítica ácida. Esquerda: processo
fluxo de aparelhos, a direita: reação química durante a eletrólise
processo.
5
4
3
2
1
0
ABCD
Número Survival (Log g1 ufc)
Figo. 2. Efeitos da combinação de esterilização
água electrolyzed na preparação de arroz. (A) Controlo
arroz, (B) lavagem com AlEW (5 min), (C)
imersão com AcEW (30 min) após o tratamento B,
(D) imersão com D / W (30 min) após o tratamento C.
Resultados e discussão
Foram examinados vários testes para provar a influência sobre o
microrganismo
e a mudança no arroz bruto.
AcEW e AlEW mudou a cor e pH de arroz rapidamente.
Mas, quando o arroz foi tratado com uma combinação de electrolisada
água (lavagem com AlEW, encharcando com AcEW, e
imersão com água destilada), pH e cor do arroz tratada
não foram diferentes de lavagem convencional e imersão com
água destilada.
AcEW mostrou um forte efeito sobre controle de microrganismos,
mesmo em esporos resistentes ao calor, in vitro. No entanto, no
teste de preparação de arroz, AcEW não podia matar B. subtillis esporos
no arroz completamente. Mas, após a lavagem por AlEW, AcEW
poderia matar completamente. Então, finalmente, vamos definir o melhor
método
de combinação de água electrolisada como se segue. para remover
farelo de arroz em pó e outros materiais estranhos que revestir a
superfície
do arroz cru, no primeiro, lavado o arroz com AlEW para
5 min e embebido com AcEW para esterilizar microorganismos
durante 30 min. Em seguida, para remover o odor de cloro e para reverter
o nível de pH, que resoaked o arroz com água destilada para 30
min. A Figura 2 mostra os efeitos contra microorganismos utilizando
o processo de combinação de cada água electrolyzed.
Nesta experiência, pudemos comprovar o efeito do
combinação de água electrolyzed no controle de microrganismos.
Este efeito pode ser considerada o resultado de cloro disponível
concentração e da rápida mudança no pH e levanta a sen-
Estudos clínicos e pesquisas sobre electrolise-

redução Água (página 75)

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Ácido-alcalino BALANCE: PAPEL NA CRÔNICA

Deanna M. Minich, PhD, FACN, CNS; Jeffrey S. Bland, PhD, FACN

Deanna M. Minich, PhD, FACN, CNS, é o diretor de

Information Integration e Inovação da Metagenics, Inc,

e uma nutricionista clínica na Medicina Funcional

Centro de Pesquisa em Gig Harbor, Wash. Jeffrey S. Bland, PhD,

FACN, serve como cer chefe ciência offi de Metagenics, Inc,

e é presidente da metaproteômica Nutrigenômica

everal pesquisadores notaram que o contemporâneo

Dieta ocidental tem aumentado na net carga ácida em relação ao

dietas dos ancestrais do Homo sapiens pré-agrícolas.

Muito possivelmente, essa mudança ocorreu por causa da agricultura

revolução e da onipresença de processados

grãos e produtos alimentares shelf-stable desprovidas de essencial nutricional

componentes. Em adição a esta fundamental subjacente

mudança na dieta, há a sobreposição de vários modismos nutricionais que

subiram e caíram ao longo das últimas décadas. Mais recentemente,

a última tendência dieta tem sido um interesse em alimentos de alta proteína

acompanhada por uma diminuição compensatória no fitoquímico

aumentar a carga de ácido dieta líquida e acidificar a urina pH.2-5

para ser associado com um maior grau de alkalinity.4,6

Remer e Manz calculados os potenciais cargas de ácido renais de certa

grupos de alimentos e informou que os alimentos alcalinizantes foram

derivados de queijo, carne, os peixes, e produtos de grão (Tabela 1) 0,4

a um nível baixo grau de acidose metabólica crónica. a incidência

de acidose baixo grau resultante de nossa dieta moderna tem

sido bem documented.1-3,6 Uma carga ácida crónica pode causar um

número de condições de saúde, como a osteoporose, doença renal,

e músculo wasting.1,7 Sebastian et al articula esta causa

e efeito de forma eloquente: "A evidência crescente. . . sugere

tal que persiste, apesar de baixo grau, acidose, e o

operação implacável de responder mecanismos de homeostase,

resultado em inúmeros efeitos prejudiciais sobre o corpo, incluindo a dissolução

ao osso, perda de massa muscular, formação de pedra nos rins, e

danos no rim. "1 (p1308)

A fim de manter o equilíbrio ácido-alcalino durante todo o

vários sistemas do corpo, um sistema pode ser requerido para suportar

outro. Por exemplo, a matriz óssea contém uma substancial

reserva alcalina, tais como cálcio e magnésio que são catiões

libertado a partir do osso para equilibrar a carga dietética excessivamente ácido em

o caso de insuficiente capacidade de tamponamento no sangue. No entanto,

empréstimos repetida de reserva alcalina do corpo em resposta a

um aumento (dieta) carga consistente ácido pode ser potencialmente prejudicial.

Nos seres humanos, hipercalciúria e saldo negativo de cálcio

devido ao cálcio effl ux do osso pode levar à óssea metabólica

doença e cálcio nephrolithiasis.2,8,9 No capítulo intitulado

"Potássio" do seu relatório Dietary Reference Intakes para Água,

Potássio, sódio, cloreto e sulfato, o Instituto de Medicina

Food and Nutrition Board afirma o seguinte:

No cenário de uma ingestão inadequada de bicarbonato

precursores, buffers na matriz óssea neutralizar o

torna-se desmineralizada. O excesso de derivado de ácido titula-diet

óssea e provoca o aumento de cálcio na urina e

reduziu a excreção de citrato urinário. O resultante adverso

consequências clínicas são possivelmente maior osso

desmineralização e aumento do risco de calciumcontaining

stones.7 rim (P187)

Por outro lado, a modificação da dieta pode influenciar positivamente

metabolismo ósseo. A neutralização dieta favorecimento de endógeno net

aumenta a produção de ácido de cálcio e fosfato de retenção,

reduz marcadores de reabsorção óssea, e aumenta de marcadores

Ácido-alcalino BALANCE: PAPEL NA CRÔNICA

Deanna M. Minich, PhD, FACN, CNS; Jeffrey S. Bland, PhD, FACN