Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas

Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas

Profa. Elisabete José Vicente
bevicent@usp.br
3091.7350

2004
 MICROBIOLOGIA

NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE

MICROBIOLOGIA

1. É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de

mangas compridas e estar abotoado;
2. Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório;
3. O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido
longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material
necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para
anotações;
4. Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas,
ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o
técnico responsável pela aula prática;
5. Descarte de material:
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios,
existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias;
b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada;
c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as
bancadas;
d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes.

6. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes

7. Terminados os trabalhos práticos:
a) Esterilizar alças e fios de platina;
b) Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas;
c) Desligar lâmpadas e microscópios;
d) Limpar microscópios e cobri-los com a capa;
e) Tirar o avental e guardar;
f) Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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 Módulo II
Principais Grupos de Microrganismos

4
 Módulo II...........................................................................................................................4
Principais Grupos de Microrganismos..............................................................................4
PRÁTICA 11 – NOÇÕES DOS PROCEDIMENTOS EMPREGADOS PARA A
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS......................................................................................7
Identificação de Bactérias.............................................................................................7
OBJETIVO.....................................................................................................................7
MATERIAL.....................................................................................................................7
PROCEDIMENTO.........................................................................................................8
PRÁTICA 12 – NOÇÕES DE PROCEDIMENTOS EMPREGADOS PARA A
IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS............................................................9
INTRODUÇÃO..............................................................................................................9
MICÉLIO VEGETATIVO................................................................................................9
OBJETIVO...................................................................................................................10
Relatório......................................................................................................................10
QUESTIONÁRIO.........................................................................................................10
1. Descreva 2 tipos de fungos (com diferentes tipos de micelos vegetativos),
descrevendo também a sua relação com o homem (utilização, patogenicidade etc). Não
se esqueça de dizer gênero e espécie.(Máximo de 4 linhas para cada)..........................10
PRÁTICA 13 – NOÇÕES DOS PROCEDIMENTOS EMPREGADOS PARA A
IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS – AXANOGRAMA E ZIMOGRAMA..........................11
INTRODUÇÃO............................................................................................................11
OBJETIVO...................................................................................................................11
MATERIAL...................................................................................................................11
PROCEDIMENTO.......................................................................................................11
RESULTADOS............................................................................................................12
PRÁTICA 14 - ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO CORPO HUMANO...........13
INTRODUÇÃO............................................................................................................13
MICROBIOTA DA PELE ............................................................................................14
MICROBIOTA DA CONJUNTIVA ..............................................................................14
MICROBIOTA DA CAVIDADE ORAL.........................................................................15
MICROBIOTA DA NASOFARINGE ...........................................................................15
MICROBIOTA DO ESÔFAGO....................................................................................15
MICROBIOTA DO ESTÔMAGO.................................................................................15
MICROBIOTA DO TRATO INTESTINAL....................................................................15
EFEITO PROTETOR DA MICROBIOTA....................................................................16
OBJETIVO...................................................................................................................17

5
 MATERIAL...................................................................................................................17
PROCEDIMENTO.......................................................................................................17
RESULTADOS............................................................................................................18
QUESTIONÁRIO.........................................................................................................18
PRÁTICA 12 – ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO AR.....................................19
OBJETIVO...................................................................................................................19
MATERIAL...................................................................................................................19
PROCEDIMENTO.......................................................................................................19
RESULTADOS............................................................................................................19
QUESTIONÁRIO.........................................................................................................19

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 PRÁTICA 11 – NOÇÕES DOS PROCEDIMENTOS
EMPREGADOS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE
BACTÉRIAS

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS

Para a classificação de bactérias existe um manual de referência básica

internacional, o Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, que é resultado da
cooperação de diversos microbiologistas, cada qual com especialidade em um grupo de
bactérias.Este manual além de conter descrições de todos os gêneros e espécies de
bactérias, fornece uma organização prática para diferenciá-las e também classificá-las.
As bactérias podem ser divididas em, eubactéria e arqueobactéria, as diferenças
principais estão listadas na Tabela 1.

Características Eubactérias Arqueobactéria

Constituição da parede Peptideoglicano (ácido Proteínas ou
celular murâmico e D-aminoácidos) polissacarídeos
Fosfolipídeos da membrana Contém ácidos graxos de Contém álcoois de cadeia
citoplasmática cadeia longa longa ramificada (fitanóis)
Síntese protéica AA usado para para iniciar AA usado para para iniciar
a cadeia protéica é a a cadeia protéica é a
formilmetionina metionina
Produtos do metabolismo Comuns Incomuns (gás metano)

OBJETIVO
Identificar e classificar algumas entereobactérias.

MATERIAL
 4 tubos contendo Meio Tioglicolato contendo culturas bacterianas aeróbias,
aeróbias facultativa, microaerófilas, anaeróbias:Ex.1. Escherichia coli 2.
Staphylococus aureus;
 Culturas de enterobacterias esgotadas em placas contendo Ágar MacConkey:
Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Proteus (devem estar
todas no máximo em 2 placas);

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  Meios de cultura da Biobrás: “Meios de Cultura” empregados para identificação de
enterobactérias;
 6 tubos contendo Meio SIM;
 Outros meios empregados em identificação de enterobacterias (opcional);

PROCEDIMENTO

1°Dia
1.Observação das bactérias crescidas nos tubos contendo caldo tioglicolato
(bactérias com diferentes requerimentos de oxigênio)
2 2. A partir das culturas de E. coli, dos tubos recebidos inocular:
3 - por esgotamento nas placas contendo Ágar Mac-Conkey e Ágar BEM;
- com o fio de platina o tubo contendo o meio Meio SIM.
3. Incubar os tubos a 37ºC, por 16-24 horas.

2°Dia
Leitura dos resultados e comparar com a tabela de identificação das bactérias.

8
 PRÁTICA 12 – NOÇÕES DE PROCEDIMENTOS
EMPREGADOS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE
FUNGOS FILAMENTOSOS
INTRODUÇÃO
A identificação dos fungos é baseada quase que exclusivamente em sua
morfologia tanto macro como microscópica. Macroscopicamente os fungos podem
apresentar vários tipos morfológicos com colônias filamentosas, cotonosas,
pulverulentas e outras (bolores) e cremosas (leveduras) e com os mais diversos tipos de
pigmentos.
A unidade estrutural dos fungos é representada pela hifa e o conjunto desses
elementos é denominado micélio (Figura 1). O micélio pode ser diferenciado em
vegetativo, quando exerce as funções de assimilação de alimentos e fixação em
substratos, e de frutificação que serve à reprodução dos fungos. O micélio vegetativo
também pode se reproduzir.

Figura 1- Estrutura básica dos fungos

MICÉLIO VEGETATIVO

De acordo com a morfologia, apresenta 3 tipos:

 Unicelular: Células arredondadas, ovóides ou alongadas, podendo se
reproduzir por brotamento, cissiparidade ou por outro processo. Caracteriza as
leveduras (Figura 2 a).
 Filamentoso: Pode se apresentar com ou sem septos. As hifas podem se
diferenciar em estruturas variadas, recebendo denominações diversas: rizóides,
artrósporadas, anastomoses, etc. Caracteriza os bolores (Figura 2 b).

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  Pseudofilamentoso: Algumas leveduras em determinadas condições
formam, por brotamentos sucessivos, uma estrutura filamentosa conhecida com o nome
de pseudomicélio. Caracteriza as leveduras do gênero Candida. (Figura 2 c)

(a) (b) (c)

Figura 2 - Diferentes morfologias de micelos vegetativos: (a) Micelo vegetativo
unicelular; (b) Micelo vegetativo filamentoso; (c) Micelo vegetativo pseudofilamentoso.

OBJETIVO
Identificar diferentes tipos de fungos quanto ao tipo de micelo vegetativo.

RELATÓRIO
Faça um relatório simplificado sobre esta prática (objetivo, material, procedimento,
conclusões e questionário)

QUESTIONÁRIO

1. Descreva 2 tipos de fungos (com diferentes tipos de micelos vegetativos),

descrevendo também a sua relação com o homem (utilização, patogenicidade etc).
Não se esqueça de dizer gênero e espécie.(Máximo de 4 linhas para cada)

10
PRÁTICA 13 – NOÇÕES DOS PROCEDIMENTOS
EMPREGADOS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE
LEVEDURAS – AXANOGRAMA E ZIMOGRAMA

INTRODUÇÃO

O método clássico empregado para a identificação das leveduras, baseia-se na

identificação das fontes de carbono e das fontes de nitrogênio que a levedura é capaz
de assimilar (auxanograma), e dos diferentes açúcares que a levedura é capaz de
fermentar (zimograma)

OBJETIVO
Identificar e classificar diferentes leveduras por auxanograma e zimograma

MATERIAL
 placas contendo as leveduras isoladas a serem analisadas (serão oferecidas
cepas já isoladas pela equipe da USP-SP);
 2 placas com meio Mínimo;
 2 placas com meio Mínimo + 0,5% Glicose;
 1 tubo Durham com 2%Glicose ;
 1 tubo Durham com 2%Sacarose;
 1 tubo Durham com 2%Amido;
 1 tubo Durham com 2%Maltose;

*OBS.:
Meio Mínimo: Bacto Agar Base W/ aminoacids and amonion sulfate (0,67%)
Para os tubos Durham: 1% extrato de levedura + o açúcar desejado

PROCEDIMENTO

1° Dia
AUXANAGRAMA
A. Pesquisa da fonte de Carbono.
Numa placa contendo meio mínimo + peptona:
 espalhar 0,1 ml da cultura de levedura, em suspensão em salina, a ser
pesquisada;

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  adicionar pequenas quantidades de diferentes açúcares (sacarose, lactose,
manose, amido, etc.);
 Incubar a placa a 28ºC por 24-48 horas.

B. Pesquisa da fonte de Nitrogênio

Numa placa contendo meio mínimo + glicose:
 espalhar 0,1 ml da cultura de levedura, em suspensão em salina, a ser
pesquisada;
 adicionar pequenas quantidades de diferentes fontes de nitrogênio (nitrito, nitrato,
uréia, amônio, peptona)
 Incubar a placa a 28ºC por 24-48 horas.

ZIMOGRAMA

C. Inocular a levedura em tubos Durham contendo meio YP+2% dos diferentes

açúcares (glicose, sacarose, amido, maltose, lactose, etc.):
 Incubar em estufa a 28ºC por 24-48 horas.

2° Dia
RESULTADOS
Leitura dos resultados:
 Análise do crescimento da levedura nas placas;
 Análise do desprendimento de bolhas nos tubos.

Classificar e identificar as leveduras que foram analisadas.

12
 PRÁTICA 14 - ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
DO CORPO HUMANO

INTRODUÇÃO
No corpo humano há uma grande variedade de bactérias que são habitantes normais de
determinados sítios anatômicos, desempenhando funções benéficas para o organismo. Estas
bactérias são chamadas de bactérias da microbiota normal.
Todo ser humano nasce sem microrganismos. A microbiota normal humana
desenvolve-se por sucessões, desde o nascimento até as diversas fases da vida adulta,
resultando em comunidades bacterianas estáveis.
As diversas partes do corpo humano apresentam condições ambientais diversas
que oferecem certas vantagens e desvantagens para a vida microbiana. Diferentes
espécies de microrganismos adaptam-se aos distintos ambientes do corpo. Os fatores
que controlam a composição da microbiota em uma dada região do corpo estão
relacionados com a natureza do ambiente local, tais como temperatura, pH, água,
oxigenação, nutrientes e fatores mais complexos como a ação de componentes do
sistema imunológico.
Estima-se que o corpo humano que contém cerca de 10 trilhões de células seja
rotineiramente portador de aproximadamente 100 trilhões de bactérias. A composição da
microbiota bacteriana humana é relativamente estável com gêneros específicos
ocupando as diversas regiões do corpo durante períodos particulares na vida de um
indivíduo. A microbiota humana desempenha funções importantes na saúde e na
doença.
Os microrganismos membros da microbiota humana podem existir como (1)
mutualistas, quando protegem o hospedeiro competindo por micro-ambientes de forma
mais eficiente que patógenos comuns (resistência à colonização), produzindo nutrientes
importantes e contribuindo para o desenvolvimento do sistema imunológico; (2)
comensais, quando mantêm associações aparentemente neutras sem benefícios ou
malefícios detectáveis e (3) oportunistas, quando causam doenças em indivíduos
imunocomprometidos devido à infecção pelo vírus HIV, terapia imunossupressora de
transplantados, radioterapia, quimioterapia anticâncer, queimaduras extensas ou
perfurações das mucosas.
A microbiota humana constitui um dos mecanismos de defesa contra a
patogênese bacteriana, mas ainda que a maioria dos componentes da microbiota normal
seja inofensiva a indivíduos sadios, esta pode constituir um reservatório de bactérias

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potencialmente patogênicas. Muitas bactérias da microbiota normal podem agir como
oportunistas. Nestas condições a microbiota residente pode ser incapaz de suprimir
patógenos transitórios, ou mesmo, alguns membros da microbiota podem invadir os
tecidos do hospedeiro causando doenças muitas vezes graves. Em indivíduos sadios,
algumas espécies de bactérias da microbiota oral causam cáries em 80% da população.
Microrganismos essencialmente parasitas não são considerados como membros da
microbiota normal uma vez que unicamente prejudicam o hospedeiro.

MICROBIOTA DA PELE
A superfície da pele apresenta diversos tipos de micro-ambientes, em áreas mais
secas ou mais úmidas, que apresentam populações bacterianas mais esparsas ou mais
densas, respectivamente. Nas regiões mais úmidas, como axilas, virilhas, espaço entre
os dedos dos pés, genitália e períneo, predominam organismos Gram-positivos como
Staphylococcus aureus e Corinebacterium sp. Nessas áreas, condições como umidade,
maior temperatura corporal e maior concentração de lipídios cutâneos de superfície
favorecem o crescimento bacteriano. Nas áreas secas predominam as bactérias
Staphylococcus epidermidis e Propionibacterium acnes.
De modo geral, organismos Gram-positivos são os membros predominantes da
superfície corporal. Um alto grau de especificidade está envolvido na aderência de
bactérias nas superfícies epiteliais. Nem todas as bactérias são capazes de se aderirem
à pele.

MICROBIOTA DA CONJUNTIVA
Por causa de sua constante exposição ao meio externo, a conjuntiva está sujeita
a intensa contaminação microbiana. Contudo, a conjuntiva apresenta um sistema de
proteção bastante eficaz. A ação enxaguatória da lágrima através dos movimentos das
pálpebras remove a sujeira e os microrganismos que entram em contato com a
conjuntiva.
Em adição ao fato de a lágrima ser um meio de cultura pobre, na sua composição
encontram-se imunoglobulinas, lactoferrina e lisozima. As imunoglobulinas (IgG)
inativam inúmeras bactérias, a lactoferrina atua como seqüestrante de ferro que é um
nutriente mineral essencial para o metabolismo bacteriano e a lisozima é uma enzima
que impede a formação de paredes celulares bacterianas
Quando algum fator rompe o equilíbrio entre a microbiota residente e a transitória,
pode haver o desenvolvimento de doenças. Dentre estes fatores encontram-se o
desequilíbrio imunológico, o uso indiscriminado de colírios contendo agentes

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antimicrobianos ou corticóides.
MICROBIOTA DA CAVIDADE ORAL
As características ambientais da cavidade oral, tais como alta umidade,
temperatura relativamente constante (34 a 36°C), pH próximo da neutralidade e
disponibilidade de nutrientes, permitem o estabelecimento de uma microbiota altamente
complexa composta por cerca de 500 grupos bacterianos que habitam as diversas áreas
da boca. Muitas dessas bactérias estão associadas à formação da placa bacteriana
sobre a superfície dos dentes com conseqüente formação de cáries e ocorrência de
doenças periodontais.
A composição da microbiota oral varia com a idade, hábitos alimentares,
hormônios, fluxo salivar, condições imunológicas e outros fatores como higienização e
alcoolismo.
X
MICROBIOTA DA NASOFARINGE
A faringe aprisiona a maioria das bactérias que são inaladas. O trato respiratório
superior é a porta de entrada para a colonização inicial por muitos patógenosjá o trato
respiratório inferior (brônquios e alvéolos), são normalmente estéreis porque partículas
do tamanho de bactérias não os atingem prontamente.

MICROBIOTA DO ESÔFAGO
O esôfago sadio e anatomicamente normal é um órgão praticamente estéril e
bactérias se presentes são apenas transitórias. Contudo, condições patológicas podem
alterar a anatomia do esôfago e predispor o órgão ao estabelecimento de uma
microbiota residente, constituída de microrganismos potencialmente patogênicos.

MICROBIOTA DO ESTÔMAGO
No estômago os microrganismos são geralmente transitórios e sua densidade
populacional é mantida baixa devido às severas condições ambientais. A quantidade de
bactérias logo após as refeições, é estimada em cerca de 10 3 a 106 bactérias por grama
de conteúdo estomacal, sendo praticamente indetectável após a digestão.

MICROBIOTA DO TRATO INTESTINAL

A quantidade de bactérias e o número de espécies presentes em dado segmento
do trato gastrointestinal são afetados pelo pH e tempo de retenção de seu conteúdo. O
baixo pH do conteúdo estomacal e o fluxo rápido de conteúdo do intestino delgado tende
a inibir o crescimento de muitas bactérias. Por outro lado, o pH relativamente neutro e a

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prolongada retenção de conteúdo no intestino grosso permitem o desenvolvimento de
comunidades microbianas complexas compostas por centenas de distintas espécies de
bactérias.
As bactérias residentes do trato gastrintestinal contribuem para a dieta
fermentando carboidratos indigeríveis como a celulose em ácidos graxos que são fontes
de energia para as células do epitélio intestinal e facilitam a absorção de sódio e água,
além de sintetizarem proteínas e vitaminas do complexo B.

MICROBIOTA DA VAGINA
As comunidades bacterianas que colonizam a vagina consistem de uma mistura
complexa, multi-específica, de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, com
predominância de espécies anaeróbicas. A composição da microbiota vaginal varia de
pessoa a pessoa, com a idade, pH to trato vaginal e níveis hormonais. As maiores
alterações ocorrem nas infecções bacterianas da vagina.
No primeiro mês de vida, bactérias do gênero Lactobacillus predominam, o que mantém o pH
vaginal em torno de 5. A partir do primeiro mês até a puberdade predominam S. epidermidis,
Streptococcus spp e E. coli e pH vaginal eleva-se em torno de 7. Entre a puberdade e a
menopausa, devido à ação do estrogênio, ocorre secreção de glicogênio no trato reprodutivo
feminino e os membros predominantes da microbiota passam a ser membros dos gêneros
Lactobacillus, Corinebacterium, Staphylococcus, Streptococcus e Bacteroides. Devido à
prevalência da espécie Lactobacillus acidophilus, o pH do trato vaginal decresce e se estabiliza
em torno de 5.
Após a menopausa, com a diminuição da produção de estrogênio, a secreção de
glicogênio diminui, o pH vaginal se eleva em torno de 7 e a composição da microbiota
volta a ser aquela característica da pré-puberdade.

EFEITO PROTETOR DA MICROBIOTA

Microbiota das vias aéreas superiores
As vias aéreas superiores são protegidos por uma microbiota residente que evita
a colonização destas áreas por patógenos. Cocos Gram-positivos são componentes
proeminentes, mas muitos outros tipos de bactérias são também encontrados nestes
sítios.
Microbiota intestinal
O trato intestinal é protegido de patógenos de várias formas. O ambiente ácido do
estômago, e as enzimas proteolíticas secretadas pelas células gástricas matam muitas
das bactérias que são ingeridas.

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 A microbiota do cólon é um ecossistema complexo com a importante função de
controlar populações de muitos microrganismos patogênicos.
Em humanos, a antibioticoterapia pode suprimir a microbiota residente e permitir que
determinados anaeróbios tornem-se predominantes e causem doenças.
Apesar dessa função protetora, muitos dos membros dessa microbiota podem
causar doenças. Os anaeróbios do trato intestinal são agentes primários de abscessos
intra-abdominais e peritonites. Perfurações no intestino causadas por apendicites,
câncer, cirurgias e ferimentos quase sempre contaminam a cavidade peritonial e órgãos
adjacentes.

Microbiota vaginal
Existem evidências de que a microbiota bacteriana do trato vaginal reduz a
probabilidade de que patógenos tais como bactérias, protozoários parasitas, leveduras
ou vírus se estabeleçam na vagina.
Os lactobacilos vaginais produzem ácidos láticos que mantém baixo o pH das
secreções vaginais, inibindo o crescimento de muitas bactérias, competem por
receptores de aderência, no epitélio vaginal, produzem substâncias antimicrobianas
como peróxido de hidrogênio e bacteriocinas, se co-agregam com outras bactérias e
estimulam o sistema imune vaginal superficial incrementando os mecanismos de defesa
locais contra bactérias não-residentes.
A importância da microbiota vaginal normal na proteção contra patógenos pode
ser evidenciada no fato de que a terapia com antibióticos pode predispor mulheres à
aquisição de infecções genito-urinárias, como as causadas por fungos do gênero
Candida.

OBJETIVO
Isolar microrganismos presentes na microbiota normal do corpo humano

MATERIAL
 Zaragatoa;
 Placas com meio ágar-sangue ou ágar TSA.

PROCEDIMENTO
1. Coletar material da orofaringe ou outro sítio anatômico úmido do corpo humano,
utilizando uma zaragatoa;

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 2. Esgotar o material coletado na superfície do meio ágar-sangue, ou ágar TSA e espalhar
com a alça ou zaragatoa;
3. Incubar a as placas a 37°C, por 24h.

RESULTADOS
Anotar os resultados obtidos.Não se esqueça de anotar de qual sítio foi recolhido o
material.

QUESTIONÁRIO
Pesquise sobre o Triclosan, os produtos que o contem, e qual as vantagens e
desvantagens do seu uso.

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 PRÁTICA 12 – ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
DO AR

São muitos os microrganismos encontrados no ar. Para esta comprovação será

feita uma prática simples, para a verificação da variação de microrganismos encontrados
em diversos ambientes.

OBJETIVO
Isolar microrganismos presentes no ar em diversos ambientes.

MATERIAL
 Placas com meio ágar-sangue ou ágar TSA.

PROCEDIMENTO
1. Abra a placa de TSA em um ambiente e deixe aberta por 15 minutos;
(Tente abrir a sua placa em um ambiente diferente, dos outros grupos como por
exemplo: a lanchonete, o banheiro, o corredor etc)
2. Incubar a as placas a 37°C, por 24h.

RESULTADOS
Anotar os resultados obtidos.Não se esqueça de anotar onde foi aberto a placa, e o
tempo que permaneceu aberta.

QUESTIONÁRIO
Anote (de maneira simplificada) os resultados dos outros grupos: onde eles abriram as
placas, e quais os resultados que eles obtiveram.

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20