Tripsinizar células

1. Retirar medio.
2. Lavar con PBS (5 mL)
3. Retirar PBS.
4. Adicionar 2 mL de Tripsina y dejar reposar 5 minutos.
5. Sacar los tubos cónicos (15 mL) que se necesiten y rotular.
6. Adicionar a la suspensión celular 4 mL de medio completo o suplementado y resuspender.
7. Transferir los 6 mL a los tubos cónicos y centrifugar por 5 minutos.
8. Rotular nuevos matraces (*Tipo de célula *Pasaje *Fecha)
9. Al matraz de cultivo rotulado agregar 6 mL de medio de cultivo.
10. Al tubo cónico que solo contiene el pellet, agregar 4 mL y resuspender las células con el medio.
11. Colocar 200 µl de la suspensión en cada matraz de cultivo.
a. Dependiendo del tamaño del pellet se puede adicionar más o menos cantidad de células en
suspensión.

Congelar células

1. Preparar FBS 45% + DMSO 5%

a. FBS 45mL + DMSO (Ampolleta de 5 mL)
2. Retirar medio de cultivo del matraz
3. Lavar con PBS (5 mL)
4. Retirar PBS.
5. Lavar con PBS (5 mL)
6. Retirar PBS.
7. Adicionar 2 mL de tripsina, dejar reposar 5 minutos y sacar los tubos cónicos necesarios de 15 mL
(Rotular)
8. Adicionar 4 mL de medio libre y resuspender.
9. Transferir los 6 mL a los tubos cónicos eppendorf.
10. Centrifugar durante 5 minutos, preparar crioviales rotulados.
11. Retirar el sobrenadante.
12. Adicionar a cada tubo *9.5 mL de medio para congelar.
a. Varía según el número de placas y la concentración.
13. Resuspender el pellet.
14. Dispensar 1.5 mL en cada criovial.
15. Guardar en el congelador.
Descongelar células

1. Se coloca el criovial con las células congeladas durante 1:30 minutos a baño maría a 35°C.
2. Colocar el contenido del criovial en 1 mL de medio completo y resuspender
3. Colocar el contenido en un matraz con 4 mL de medio completo y resuspender. Dejar durante 3-4
horas, después de cambiar el medio colocando 6 mL de medio completo.

Preparar medio de cultivo (RDM1)

1. A la botella Advanced 500 mL agregar:

a. FBS (Suero fetal bovino) 20 mL
b. L-Glutamina 6 mL
c. Antibiótico – antimicótico 6 mL
2. Rotular, sellar y refrigerar.

Sembrar células en placas con pozos

1. Realizar tripsinización de las células.

a. Colocar 2 mL en cada pozo de la placa de 6 pozos.
b. Colocar 1 mL en cada pozo de la placa de 12 pozos.
2. La dilución de la suspensión celular puede variar según la confluencia que se requiera de las células.

Preparación de suspensión celular para sembrar en placas para MDA-MB-231

1. Seguir los pasos de la tripsinización hasta el paso 2.

2. Colocar 12 mL de medio de cultivo completo en un tubo cónico.
3. Añadir al tubo con medio 1 mL de la suspensión celular y dispersar para que la mezcla quede
homogénea.
4. Colocar 1 mL de la suspensión celular anterior a cada pozo.
5. Colocar a cada pozo 1 mL de medio de cultivo completo y mezclar
Etanol 70%

1. Agregar 700 mL de etanol a una probeta de 1 L

2. Agregar 300 mL de agua tridestilada
3. Mezclar.
4. Verter en el contenedor correspondiente

Esterilizar material

1. Lavar con dextran neutro.

2. Enjuagar con agua tridestilada.
3. Secar en la estufa durante 1 hora a 120°C
4. Sellar y meter en bolsas.
5. Autoclave por 1 hora.

Preparación de PBS 1x a partir de 20x

1. 50 mL de PBS 20x. + 950 mL de agua tridestilada.

2. Aforar
3. Colocare en recipiente y rotular con fecha.

Preparación de PBS 1x

1. NaCl 8g
2. KCl .29 g
3. KH2PO4 .24 g
4. Na2HPO4 1.44 g
a. Seguir los pasos de PBS 20x

Preparación de PBS 20x

1. Disolver en agua destilada/desionizada lo siguiente

a. NaCl 160 g
b. KCl 5.8 g
c. KH2PO4 28.8 g
d. Na2HPO4 28.8 g
2. Aforar a 1 litro.
3. Verificar pH de 7.4
4. Filtrar la solución en la campana de flujo.
5. Rotular: PBS 20x *Fecha * 1/? (Fecha de elaboración si con más de 1)
 6. Colocar parafilm.
7. Refrigerar.

Preparación de solución para lavar la incubadora

1. Preparar una Solución con las siguientes concentraciones:

a. 70% de etanol
b. 1% de formaldehido
2. Para 500 mL se preparan
a. 1 mL de formaldehido/100 mL 1x5 mL= 5 mL
b. 70 mL de etanol/100 mL 70x5 mL= 350 mL
c. 29 mL de agua desionizada 29x5= 145 mL

Uso de SEPTER

1. Agregar 1 mL de suspensión celular en un tubo eppendorf.

2. Resuspender la solución celular con cuidado sin hacer burbujas.
3. Encender con el botón trasero (Oprimir hasta encender)
4. Colocar punta en el SEPTER (Attach sensor/segunda leyenda)
5. Oprimir el botón rosa y meter la punta al tubo sin soltar el botón.
6. Soltar el botón lentamente sin jalar aire.
7. Esperar señal y sacar la punta del tubo.
8. Apuntar datos obtenidos en la libreta de registro, fecha, cantidad medida y número de registro
a. (Revisar que la batería este cargada previamente a realizar el ensayo)
Protocolo de extracción de RNA para placa de 6 pozos (Kit Favorgen)

1. Retirar el medio de cultivo.

2. Lavar 2 veces con PBS al 1x (2 mL por pozo)
3. Agregar 500 µL de tripsina por cada pozo (para un mayor rendimiento/Tripsina no estéril)
4. Agitar 5 minutos en el bamboleador.
5. Preparar tubos eppendorf de 1.5 mL para células (Rotular)
6. Agregar 750 µL de medio de cultivo en cada pozo para neutralizar la tripsina.
7. Con la micropipeta 1000 µL raspar las células todavía adheridas a la placa.
8. Pasar la suspensión celular (trpsina/medio de cultivo/células) a los tubos eppendorf (1.5 µL) previamente
rotulados.
9. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm. (Con la bisagra hacia afuera).
10. Preparar buffer de lisis (FARB) suplementado con β-Mercaptoetanol al 1% en un tubo cónico.
a. 350 µL de buffer FARB + 3.5µL de β-Mercaptoetanol.
i. Por 6 condiciones: 2100 µL FARB (Tomar mas 100 µL por el error).
ii. 2200 µL FARB + 22 µL FARB.
11. Retirar medio de cultivo y quitar con micropipeta de 200 µL todo el medio de cultivo restante. (Se conserva el
pellet).
12. Agregar el tubo que tiene la pastilla 350 µL de buffer de lisis previamente preparado y vortexear cada tubo.
13. Tomar las columnas blancas del kit de extracción y rotular, estos se colocarán dentro de tubos de 2 mL
igualmente rotulados.
14. Pasar el contenido del tubo eppendorf a la columna blanca.
15. Centrifugar a 13000 rpm. Por 2 minutos
16. Tirar la columna blanca y al liquido que quede en el tubo de 2 mL se le agregaran 350 µL de etanol al 70% (en
cada condición) y vortexear.
a. Preparar previamente alcohol al 70% en un tubo cónico naranja y tener almacenado en congelación.
17. Colocar en otra columna los filtros rojos rotulados para cada condición (ahí se retiene el ARN) y pasar el
contenido del tubo eppendorf (previamente adicionado con etanol)
18. Centrifugar a 13200 rpm. Por 2 minutos.
19. Retirar el sobrenadante (El ARN se queda en la membrana del filtro rojo) y reusar el tubo colector.
20. Agregar 500 µL de buffer de lavado 1
21. Centrifugar por 2 minutos a 13200 rpm.
22. Rotular nuevos tubos eppendorf (bolsa dentro del kit de extracción).
23. Decantar lo que quedo en la columna y mantener el filtro rojo (Rehusar el tubo colector)
24. Agregar 400 µL de buffer de lavado 2 en cada tubo.
25. Centrifugar a 13200 rpm. por 2 minutos.
26. Hacer el segundo lavado, agregar 400 µL de buffer de lavado en c/condición (centrifugar a 13200 rpm por 2
minutos).
27. Transferir el filtro rojo al tubo eppendorf previamente rotulado y desechar el sobrenadante.
 28. Agregar 30 µL de agua libre de RNAsas cerca de la membrana del tubo rojo y dejar reposar por 3 minutos.
29. Centrifugar por 4 minutos a 13200 rpm. Y tirar la columna roja.
30. Preparar tubos para la determinación de RNA (tubos pequeños) y a cada uno agregar 4 µL de muestra de
RNA y 196 µL de agua inyectable.
31. Leer concentración en el espectrofotómetro y registrar lecturas (Almacenar en congelación RNA)

Espectrofotómetro

1. Encender y seleccionar el programa 9 (RNA)

2. Establecer dilución
a. Sample: 4 µL de muestra de RNA
b. Diluyente: 196 µL de agua inyectable
3. Presionar “Enter”
4. Calibrar
a. Agregar 200 µL de agua inyectable en la columna.
b. Presionar “Blank” para calibrar, el lector debe indicar 0
5. Colocar muestra en la columna y presionar “Sample”
a. Cociente de estar en el intervalo: 260 – 280
b. Rango de muestra aceptable de RNA: 1.6 – 2
6. Al finalizar todas las muestras, pasar nuevamente el blanco.

Protocolo de RT – PCR

1. Se requiere un volumen final de 20 µL en cada tubo.

a. 7.5 µL del mix
i. Buffer RT 4 µL
ii. dNTPs 1 µL
iii. Ramdoms 2 µL
iv. Mull (RT.) .5 µL
v. MIX 7.5 µL (Por cada tubo)
b. 12.5 µL de ARN + H2O
i. Cantidad de ARN = (¿?) (H2O) + (¿?)(ARN)
1. Alcanzar una concentración de 4 µg/µL
ii. Concentración inicial ARN (muestra) ----------1000 µL
iii. Concentración deseada: 4µ ---------------------- (X) µL
iv. Cantidad de agua = 12.5 µL – (X) ARN = (X) Agua
2. Vorterxear y centrifugar todas las muestras.
3. Termociclador => Files, Enter => Load, Enter
 a. Buscar “STANDAR 2”
i. 10 min – 25°C
ii. 2 h – 37°C
iii. 5 min – 85°C
iv. Estacionario a 4°C
4. Guardar productos de RT – PCR en refrigeración.

Protocolo PCR

1. Rotular tubos de PCR (capacidad 200 µL) para cada condición.

a. Considerar tubos para el mix de cada condición.
2. Hacer el mix del kit PCR
a. Dream Taq 10 µL
b. Primer Forward 1 µL
c. Primer Reverse 1 µL
d. Agua Kit 6 µL
e. MIX 18 µL
f. + 2 µL de cDNA por condición
g. Volumen final: 20 µL
i. Si se va a aumentar la cantidad de cDNA se tiene que disminuir la cantidad de agua.
3. Agregar 18 µL del mix a cada tubo de reacción.
4. Vortexear y centrifugar.
5. Programar el Termociclador y colocar tubos de reacción.

Para un solo para de primers

1. Calcular Tm.
2. Tm = (Tm primer Fwd) + (Tm primer Rev) / 2
3. Termociclador colocar los tubos en orificios para tubos de .2
4. Perilla en tubos de .2 µL => Pequeños
5. Programar POLLO G9
6. Ajustar Tm y ciclos (30, 35, 40)
7. Parámetros del Termociclador
a. 94°C 5 min
b. 94°C 5 min
c. Tm (Según el primer) 30 s
 d. 72°C 1 min
e. GOTO 2 REP
f. 72°C 10 min
g. 4°C Hold

Para gradiente

Programa: POLLO G87

Calcular Tm

Tm1 = (Tm primer Fwd) + (Tm primer Rev) / 2

Tm2 = (Tm primer Fwd) + (Tm primer Rev) / 2

A partir de la Tm menor y mayor

Tm min ------------------------------I-------------------------------- Tm max

ΔG

ΔG = (Tm max - Tm min) / 2

Tm = Tm min + ΔG o Tm max – ΔG

Termociclador

1. Encender => Files => Enter

2. Load => Enter
3. Buscar “POLLO G87” => Enter
4. Revisar temperaturas: Tm, ΔG, #ciclos (30, 35, 40)
5. Exit => Save => Seleccionar “YES” => Enter

Protocolo de electroforesis

GEL DE AGAROSA 1.2%

1. Pesar .6 g de agarosa.
2. Disolver en 50 mL de buffer TAE 1x
3. Colocar el tapón y calentar por 60 segundos
4. Agitar y calentar 30 s más.
5. Montar la cámara con los gaskets
6. Agregar 4 µL de Bromuro de etidio
7. Disolver perfectamente y verter en la cámara
a. Asegurarse de que no haya burbujas e impurezas
8. Colocar el peine correctamente
 9. Dejar gelificar por 30 min.

Buffer TAE 1x

1. A partir de TAE 20x

2. 20 mL de TAE 50x + 980 mL de agua Desionizada

Buffer de carga 1x

1. 200 µL de Buffer de carga 6x + 800 µL de agua para PCR.

Marcador de peso molecular

100 µL de marcador + 100 µL de Buffer de carga y 400 µL de agua

Preparar muestra para cargar

1. Ya gelificado agregar TAE 1x a la cámara (No utilizar la solución más de 5 veces)

2. Producto de PCR
a. Vortexear y centrifugar
3. Buffer de carga y marcador de peso molecular
a. Vortexear y centrifugar
b. Marcador
i. Para 1 pozo
ii. 8 µL buffer de carga
iii. + 4 µL Marcador de peso molecular
iv. 12 µL Cargar 10 µL de mix en el pozo
c. Para 2 pozos
i. 16 µL de buffer de carga
ii. +8 µL Marcador de peso molecular
iii. 24 µL Cargar 10 µL por pozo
4. Cargar 9 µL de producto de PCR por pozo
5. Correr el gel a 65 voltios durante 80 min (1.20 h)
a. checar que la tapa este bien cerrada

Fotodocumentador

1. Encender el Fotodocumentador y la Tablet.

2. Colocar el gel perfectamente centrado.
3. Asegurarse que no tenga TAE para evitar que se mueva.
4. Abrir el programa Axigen
5. Seleccionar “Darkroom”.
6. Presionar White light
7. Acomodar gel y alinear
8. Seleccionar botón de luz UV
9. Capturar imagen. (Tomar 3 fotografías, 2 normales y 1 invertida)
 10. Ajustar valores de la imagen.
11. Guardar en la carpeta correspondiente.

Ensayo de proliferación

Una vez terminado el tiempo de tratamiento

1. A la placa de 6 pozos retirar el medio de cultivo

2. Hacer 2 lavados con PBS 1x (2 ml) Retirar PBS
3. Añadir 500 µL de tripsina y colocar de 10 a 15 minutos en el bamboleador
4. No retirar tripsina y añadir 1.5 ml de PBS (1500µL)
5. Resuspender bien el pozo sin hacer burbujas
6. Encender el septer con el botón de la parte de atrás (mantener oprimido hasta que encienda)
7. Colocar la punta en el septer (Attach sensor)
8. Oprimir botón rosa y meter la punta en el septer
9. Una vez sumergido ir soltando el botón rosa hasta que haga ruido
10. Esperar la señal y quitar la punta
11. Anotar resultado

Sigma Plot

1. Rotular en las pestañas las condiciones del experimento

2. Anotar en las columnas los resultados obtenidos
3. Para normalizar resultados
4. Usar comando
a. F10= Col(8)= Col(2)/Col (1)
b. El primero debe ser control/control = 1° control/control*100
5. Comendo
a. F3= Graficar
b. F4= ver hoja de calculo
c. F6= Estadística
d. F7= Ver gráfica
e. F9= Titulo columna
f. F10= Operaciones
6. Tomar Promedio (Mean) y Error estándar ( Std error)
7. Pegar en la hoja de cálculo
8. Etiquetar en columnas finales
a. Condicion Promedio Error
b. CN 𝑥̅ SE
c. Tx1 𝑥̅ SE
d. Tx2 𝑥̅ SE
e. Tx3 𝑥̅ SE
9. F3: GRAFICAR
a. Vertical Bar chart => Next
b. Sample error Bars => Next
c. Worksheet Columnes => Next
d. XY pair => Next
i. Data for X: condición Data for Bar: Mean
 ii. Data for Error: Error Finalizar

Protocolo de fijación y tinción (Metanol – acetona 1:1)

Placa de 6 pozos

1. Retirar medio de cultivo

2. Realizar dos lavados en PBS 1x (2 ml en cada pozo)
3. Agregar 1 ml de metanol-acetona a cada pozo
4. Incubar 30 m en refrigeración
5. Retirar el metanol-acetona
6. Agregar 1 ml de cristal violeta por pozo
7. Esperar 20 m a temperatura ambiente
8. Retirar colorante
9. Realizar 2 de a 3 lavados con 2 ml de agua tridestilada para eliminar el exceso de colorante
10. Dejar en cada pozo en 1 ml de agua tridestilada

Glutaraldehido 2% (disolver en PBS 1x)

Cristal violeta (0.57 cv 25% metanol)

Para placas de 5 pozos

1. Retirar medio de cultivo

2. Realizar 2 lavados con PBS 1x (2 ml en cada pozo)
3. Agregar 1ml de glutaraldehido 2% en cada pozo y esperar 30 minutos a temperatura ambiente
4. Retirar glutaraldehido
5. Realizar 2 lavados con PBS 1x (2ml en cada pozo
6. Agregar 1 ml de cristal violeta por pozo, esperar 20 m a temperatura ambiente
7. Dejar cada pozo con 1 ml de agua tridestilada

Extracción de Proteínas

1. Retirar el medio de cultivo del matraz

2. Realizar 2 lavados con PBS al 1x agregar 5 ml
3. Añadir 2 ml de tripsina no estéril al matraz
4. Dejar reposar por 5 minutos
5. Preparar tubos cónicos para cada condición
6. Agregar medio de cultivo al matraz que tiene tripsina – agregar 4 ml
7. Pasar los 6 ml del matraz al tubo cónico que previamente se rotulo
8. Centrifugar 15 m a 1800 rpm (Centrifugar en el cuarto de cultivo)
9. Eliminar el sobrenadante, quitar la mayor cantidad posible con la pipeta, quedarse con la pastilla
10. Agregar a la pastilla 1 ml de PBS al 1x y resuspender cuidadosamente
11. Transferir todo a un tubo eppendorf
12. Volver a agregar 1 ml de PBS al tubo cónico para disolver la pastilla, transferir todo nuevamente al
tubo eppendorf que ya tenía el otro ml
13. Centrifugar 8 m a 1800 rpm – Centrifuga normal
 14. Retirar PBS
15. Agregar 120 µL de buffer de lisis RIPA a cada condición
16. Deshacer la pastilla, resuspender vigorosamente
17. Centrifugar 30 m a 10000 rpm a 4°C
18. Obtener el sobrenadante y desechar el pellet
19. Pasar el sobrenadante a un nuevo eppendorf bien rotulado y desechar la pastilla
 Coctel inhibidor de proteasas – Refrigerador pequeño
 Buffer de lisis – Refrigerador gris, congelación

Preparación de Buffer RIPA

 Para prepara 1 ml de buffer RIPA se requiere:

200 μl de SDLB 5%

790 μl de H2O

10 μl de coctel inhibidor

1000 μl de volumen total

 Placa de 6 pozos (3 condiciones) Agregar 350 μl de Buffer RIPA a cada pozo

300 μl de SDLB 5%

1185 μl de H2O

15 μl de coctel inhibidor

1500 μl de volumen total

Ensayo MTT

En un ensayo colorimetrico que se utiliza para proliferación o medida por el complemento de ensayos de
citotoxicidad

 Se basa en la reducción de metabolitos de MTT realizado por la enzima mitocondrial succinato-

deshidrogenasa en un compuesto azul (formazan) La cantidad de células vivas es proporcional a la
cantidad de formazan producido
 MTT Cell Growth Assay Kit
o Reagent A: MMT 50 mg/vial
o Solución B: PBS pH 7.4 15 ml
 Preparar reactivo MTT, adicionar 10 ml de la solución B en el vial del Reagen A. Mezclar bien, utilizar
un filtro estéril, mantener a 4°C en la oscuridad
o En una placa de 96 pozos agregar un volumen de 0.1 ml (100 µL) de supencion celular y
medio de cultivo completo
o Al final del ensayo agregar 0.01 ml de solución AB (MTT) en cada uno de los pozos. Mezclar
bien
o Incubar a 37°C por 4 horas
 o Después de una hora se mide la absorbancia en un lector de placas ELISA con una longitud e
onda de ensayo 570nm y una longitud de referencia de 630 nm
 Se necesita agregar 0.1 ml de isopropanol con 0.04 N HCl

 Se tiene una botella de HCl

o HCL 37% PUREZA PM= 36.46 g/mol

o Densidad= 1.2 g/ml *calcular la normalidad

V= Masa/Densidad = g/D = 36.46 g/ 1.2 (g/m) = 30.38 ml HCl => tiene 1 equivalente

1L = 1000 mL

0.03038L = 30.38 mL

N= Equivalentes / L si´n N= 1 / 0.03038 L = 32.91

Si 32.9 = > 100% pureza

X => 37% pureza

X = 12.17 N

EN cada pozo necesita 0.1 ml => 96 pozos => 9.6 ml 10 ml de isopropanol + 33 μl de HCl 12 N

Preparar 10 ml (10 ml) => (12 N)

X => (0.04 N)

X => 0.033 ml

1 ml = 1000 μl

0.033 ml = x = 33 μl

Calculo para Normalidad

 N = # equi / V N = (g/PM) / V N = g / PM (V)

Se requiere HCl a 0.04 N en 10 ml de isopropanol

0.04 N = g / (36.46) (0.01L) g = (0.04 N) (36.46 g/mol) (0.01 L)

g = 0.014584

Ahora convertimos la concentración de HCl inicial de 37% p/p y la densidad = 1.2 g/ml a concentración %
p/v
 % p/v = (% p/p) (d)

% p/v = (37) (1.2) = 44.4 1ml = 1000 μl

Entonces HCl 44.4% p/v 0.0328 ml = 32.84 μl

44.4 g están disueltos en 100ml sl´n

0.01458 g -------------------------------- > X ml

X = 0.0328 ml
Ensayo de Invasión

Preparación de matrigel

1. Pasar el frasco de Matrigel un día antes del ensayo al refrigerador, así como puntas, tubos de .5 mL.
a. El frasco de Matrigel (10 mL) tiene una concentración de entre 8 – 11 mg/mL
b. Para su correcta gelificación se debe trabajar a una concentración de entre 4 – 5 mg/mL
2. Una vez que el Matrigel se encuentre en solución liquida (color rosado) se mantiene en hielo durante
el periodo que trabaje con él.
3. Se toman 400 μl de Matrigel con las puntas de micropipetas refrigeradas y se depositan en los tubos
igualmente refrigerados con anterioridad, para hacer alícuotas. Entre cada toma de muestra se
cambia de punta

4. y los incertos de cámara transwell y su correspondiente placa de 24 pozos.