Cromatografía líquida

de alta resolución

La cromatografía líquida de alta resolución se ha

vuelto una herramienta analítica indispensable.
La técnica es utilizada por científicos para separar y determinar
especies en una variedad de materiales orgánicos, inorgánicos y
biológicos. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un
disolvente líquido que contiene a la muestra en la forma de una
mezcla de solutos.
Los tipos de cromatografía líquida de alta resolución suelen clasificarse con base en
su mecanismo de separación o según el tipo de fase estacionaria:

1) cromatografía de partición, o cromatografía líquido-líquido

2) cromatografía de adsorción o cromatografía líquido sólido
3) cromatografía de intercambio iónico o cromatografía iónica
4) cromatografía de exclusión
molecular
5) cromatografía de afinidad
6) cromatografía quiral.
La cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, es un tipo de cromatografía que
combina una fase móvil líquida y una fase estacionaria finamente dividida. Con el fin de
obtener velocidades de flujo satisfactorias, el líquido debe ser presurizado a varios cientos
o más de libras por pulgada cuadrada.
 El nombre cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en
inglés) suele utilizarse para diferenciar esta tecnología de los
procedimientos cromatográficos en columna simples que le precedieron.
 Aplicaciones de la cromatografía líquida.
 Los métodos se pueden escoger con base en la solubilidad y la masa
molecular. En muchos casos, los métodos de fase invertida son apropiados
para las moléculas pequeñas. Las técnicas hacia la parte baja del
diagrama son más adecuadas para estudiar moléculas de alta masa
molecular
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un típico aparato para HPLC .
Reservorios de fase móvil y sistemas de
tratamiento de disolventes

Los instrumentos modernos de HPLC están equipados con uno o más

reservorios de vidrio, cada uno de los cuales contiene un mínimo de 500
mL de disolvente. Generalmente se toman precauciones para remover los
gases disueltos y el polvo de los líquidos.
 Los gases disueltos pueden producir velocidades de flujo no reproducibles y
ensanchamiento de banda. Los instrumentos para eliminar gases pueden consistir en un
sistema de bombeo de vacío, un sistema de destilación, un dispositivo para agitar o
calentar.
 un sistema de burbujeo en el que los gases disueltos se eliminan de la disolución por
medio de pequeñas burbujas de un gas inerte que no es soluble en la fase móvil.
 Una elución con un solo disolvente o una mezcla de disolventes de composición constante se
denomina elución isocrática. En la elución en gradiente, se utilizan dos (y a veces más)
sistemas de disolventes que difieren de manera significativa en polaridad y cuya composición es
variada durante la separación.
 El burbujeo es un proceso en el que los gases disueltos se eliminan de un
disolvente por medio de burbujas de un gas inerte e insoluble.
 La elución isocrática en HPLC es aquella en la cual la composición de
disolvente permanece constante.
 La elución en gradiente en HPLC es aquella en la cual la composición de
disolvente se cambia de manera continua o en una serie de pasos (de manera
escalonada).
Mejora en la eficiencia de separación mediante el uso de elución en gradiente
 Sistemas de bombeo

 Los requerimientos para las bombas utilizadas en cromatografía líquida incluyen:

 1) la generación de presiones de más de 6000 psi (lb/in2)
 2) salida libre de pulsos
 3) velocidades de flujo de 0.1 a 10 mL/min
 4) reproducibilidades de flujo relativas de 0.5% o mejores
 5) resistencia a la corrosión por una variedad de disolventes.
 Las altas presiones generadas por las bombas de cromatografía líquida no
presentan el riesgo de explosión debido a que los líquidos no son
altamente compresibles.
Se utilizan dos tipos principales de bombas en los instrumentos de HPLC:
 las bombas tipo jeringa impulsadas por tornillos y las bombas de tipo
émbolo. Las bombas de tipo oscilante se utilizan en casi todos los
instrumentos comerciales.
 Las bombas tipo jeringa producen una salida libre de pulsos cuya
velocidad se controla con facilidad. Sin embargo, tienen una capacidad
relativamente baja (alrededor de 250 mL) y son poco prácticas cuando se
deben cambiar los disolventes.
 Este dispositivo consiste en una pequeña cámara cilíndrica que se llena y se vacía
mediante el movimiento hacia atrás y hacia delante de un pistón. El bombeo
produce un flujo pulsado que debe ser atenuado después debido a que los pulsos
aparecen como ruido basal en el cronograma.
 Los instrumentos modernos de HPLC utilizan una bomba de doble cabeza o
cámaras elípticas para minimizar estas pulsaciones. Las ventajas de las bombas
de émbolo incluyen su pequeño volumen interno (de 35 a 400 𝜇L), su alta presión
de salida (de hasta 10,000 psi), su facilidad para adaptarlas a la elución en
gradiente y sus velocidades de flujo contantes, las cuales son en gran medida
independientes de la contrapresión de la columna y la viscosidad del disolvente.
 Sistemas de inyección de muestras

 El método más utilizado para introducir las muestras en cromatografía

líquida se basa en un asa de muestras.
 Estos dispositivos suelen ser parte integral de los equipos para
cromatografía líquida y tienen asas intercambiables capaces de permitir la
elección del tamaño de muestra en un intervalo que va de 1 a 100 𝜇L o
más.
 La reproducibilidad de las inyecciones con un asa de muestreo típica es
de unas cuantas décimas de un por ciento relativo.
 Estos inyectores introducen volúmenes variables de manera continua a
partir de contenedores en el sistema de muestreo automatizado.

Figura 33.5. Bomba de émbolo

Para HPLC.
 Columnas para HPLC

 Las columnas para

cromatografía líquida
suelen construirse de
tubería de acero
inoxidable, aunque en
ocasiones también se
utiliza tubería de vidrio o
de polímeros, tales como
la polieteretercetona
(PEEK). Además, también
hay columnas de acero
inoxidable recubiertas
con vidrio o PEEK
disponibles.
 PRECOLUMNAS

 Se utiliza una precolumna entre el reservorio de fase móvil y el inyector para

acondicionar la fase móvil y se le denomina columna “de desperdicios”.
 Se utiliza una columna “de desperdicios” entre el contenedor de la fase
móvil y el inyector para acondicionar la fase móvil.
 Un segundo tipo de precolumna es la columna de protección,
posicionada entre el inyector y la columna analítica. Una columna de
protección es una columna corta empacada con una fase estacionaria
similar a la de la columna analítica.
 La columna de protección se reemplaza de manera regular y sirve para
incrementar la vida
 Una columna de protección entre el
inyector y la columna analítica
remueve partículas y otras impurezas
del disolvente.
Control de temperatura
de la columna

• Se obtienen cromatogramas mejores y más reproducibles cuando la temperatura

de la columna se mantiene constante.
• Los instrumentos comerciales más modernos están equipados con calentadores
que controlan la temperatura de las columnas en un intervalo que va desde unas
décimas de grado con respecto a la temperatura ambiente hasta los 150 ºC.
• También se pueden adaptar las columnas con sobrecubiertas de agua que son alimentadas
desde un baño a temperatura constante para producir un control preciso de la temperatura.
Para muchos cromatógrafos es esencial el control de la temperatura para obtener
separaciones reproducibles.
 Empacamientos de columna

 Se utilizan dos tipos de empacamientos en la HPLC: partículas peliculares y

partículas porosas.
 Las partículas peliculares originales eran perlas de vidrio o de polímero
esférico, no poroso, con diámetros de entre 30 y 40 𝜇m.
 Una capa delgada, porosa, de sílice, alúmina, de una resina sintética de
poliestireno divinil benceno, o una resina de intercambio iónico se
depositaba en la superficie de estas perlas.
 Las micropartículas porosas pequeñas han reemplazado por completa a
estas partículas peliculares pequeños (≈5 𝜇m) para la separación de
proteínas y biomoléculas grandes.
 El empacamiento de partículas porosas para cromatografía líquida
consiste en micropartículas porosas que tienen diámetros que van de los 3
a los 10 𝜇m; generalmente se desea una distribución muy estrecha del
tamaño de las partículas para un tamaño de partícula dado.
 Las partículas están compuestas de sílice, alúmina, la resina sintética de
poliestireno-divinil benceno, o una resina de intercambio iónico. La sílice es
por mucho el empacamiento más común para cromatografía líquida. Las
partículas de sílice suelen estar recubiertas de películas orgánicas, las
cuales están unidas química o físicamente a la superficie.
 Detectores para HPLC

 El detector ideal para HPLC debe tener todas las características del
detector ideal para CG en listadas en la sección 32A.4, con la excepción
de que no necesita tener un intervalo de temperaturas tan grande.
Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno pequeño
(volumen muerto) para minimizar el ensanchamiento de banda adicional
de columna.
 El detector debe ser pequeño y compatible con el flujo de líquido. Por
desgracia, no existe ningún sistema de detector universal altamente
sensible para cromatografía líquida de alta resolución, así que el detector
utilizado dependerá de la naturaleza de la muestra.
 Los detectores espectrofotométricos son mucho más versátiles que los fotómetros y,
por lo tanto, son ampliamente utilizados en los instrumentos de alta resolución. Los
instrumentos más modernos utilizan detectores basados en arreglos de diodos que
pueden desplegar un espectro completo mientras el analito sale de la columna.
 La combinación de HPLC y un detector de espectrometría de masas
produce una herramienta analítica muy poderosa.
 Otro detector que se aplica de manera considerable se basa en los
cambios en el índice de refracción del solvente que son causados por las
moléculas de analito.

Celda amperométrica de capa fina para

HPLC
 La desventaja de este detector es su sensibilidad un tanto limitada.
También se han desarrollado varios detectores electroquímicos que están
basados en mediciones potenciométricas, conductométricas y
voltamétricas.
 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

 El tipo de HPLC más utilizado es la cromatografía de partición, en la que la

fase estacionaria es un segundo líquido que es inmiscible en la fase móvil
líquida.
 La cromatografía de partición se puede subdividir en cromatografía
líquido-líquido y cromatografía líquidofase enlazada.
 La diferencia entre las dos radica en la manera en que la fase estacionaria
se mantiene en las partículas de soporte del empacamiento. El líquido
permanece en su lugar por medio de adsorción física en la cromatografía
líquido-líquido, mientras que en la cromatografía de fase enlazada se
mantiene en su lugar por medio de enlaces químicos
En la cromatografía de partición líquido-líquido la fase estacionaria
es un disolvente mantenido en su lugar mediante su adsorción
a la superficie de las partículas empacadas.
En la cromatografía líquido-fase enlazada, la fase estacionaria es
una especie orgánica que está unida a la superficie del empacamiento
por medio de enlaces químicos.
 Empacamientos de fase enlazada

 La mayoría de los empacamientos para cromatografía de fase enlazada

se preparan por medio de una reacción de un organoclorosilano con los
grupos –OH formados en la superficie de las partículas de sílice mediante
la hidrólisis de ácido clorhídrico diluido caliente.
 El producto es un organosiloxano. La reacción para un sitio SiOH en la
superficie de la partícula se puede escribir como donde R suele ser una
cadena recta de octilo o un grupo ocildecilo.
 Otros grupos funcionales orgánicos que se han unido a superficies de sílice
incluyen aminas alifáticas, éteres y nitrilos, así como hidrocarburos
aromáticos. Por lo tanto, están disponibles muchas polaridades diferentes
para la fase estacionaria enlazada
 Empacamientos en fase normal y en
fase inversa

 este tipo de cromatografía se llama ahora cromatografía en fase normal.

En la cromatografía en fase inversa, la fase estacionaria es no polar,
generalmente un hidrocarburo, y la fase móvil es un disolvente
relativamente polar (como agua, metano, acetonitrilo o tetrahidrofurano).
 En la cromatografía en fase normal el componente menos polar eluye primero; aumentar
la polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de elución.
 En la cromatografía en fase inversa el componente más polar es el primero que eluye, y
aumentar la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.
En la cromatografía de partición en fase normal la fase estacionaria es polar y la
fase móvil es no polar.
En la cromatografía de partición en fase inversa la polaridad de estas fases se
invierte. En la cromatografía en fase normal el analito menos polar eluye primero.
En la cromatografía en fase inversa el analito menos polar eluye al final.