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MÉTODOS QUÍMICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE EN FLAVONOIDES
Tovar S. B. A1, Varón P. A. P1
1
Estudiantes programa de Biología, Universidad del Tolima, grupo 2
25 de Septiembre de 2019
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RESUMEN
Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que protegen al
organismo del daño producido por agentes oxidantes, como los rayos ultravioletas, la
polución ambiental, sustancias químicas presentes en los alimentos, etc. [1] En el presente
artículo se exponen los diferentes métodos químicos (como Folin-Ciocalteu, DPPH y ABTS)
para la determinación de la actividad antioxidante en flavonoides.

INTRODUCCIÓN
El término flavonoides denota un grupo muy amplio de compuestos polifenólicos
caracterizados por una estructura benzo-γ-pirano, los cuales están ampliamente distribuidos
en el reino vegetal y se encuentran de forma universal en las plantas vasculares, en forma de
glicósidos. Son muy importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas, ya
que actúan como atrayentes de animales en la ovoposición, como agentes protectores contra
la luz UV o contra la infección por organismos fitopatógenos; además, estos compuestos
presentan propiedades relacionadas con la salud humana, lo cual está basado en su actividad
antioxidante [15]. Las antocianinas son glucósidos de antocianidinas, pertenecientes a la
familia de los flavonoides [14], representan el grupo más importante de pigmentos
hidrosolubles detectables en la región visible por el ojo humano. Estos pigmentos son
responsables de la gama de colores que abarcan desde el rojo hasta el azul en varias frutas,
vegetales y cereales, acumulados en las vacuolas de la célula [15].
El DPPH es un radical nitrogenado orgánico y estable, de un intenso color púrpura utilizado
para determinar la capacidad antioxidante con base en la disminución de color. En cuanto al
método de decoloración del radical ABTS es útil para capturar aniones radicales de larga
vida. Con el método de Folin–Ciocalteu (F–C), siendo el ácido gálico (AG) la molécula de
referencia. El reactivo de F–C es una solución acuosa de color amarillo que contiene
fosfotungstatos-molibdatos capaces de capturar uno o dos electrones en reacciones redox y
formar especies de color azul (por ejemplo, el (PMoW11O40) 4-), con un máximo de
absorción a 760 nm de longitud de onda. En el caso particular de los compuestos fenólicos,
el medio se ajusta con bicarbonato de sodio hasta un pH ≈ 10 para que los fenolatos formados
reduzcan el reactivo de F–C. Las especies coloreadas resultantes son independientes de la
estructura de los compuestos fenólicos [2].
PALABRAS CLAVES
DPPH, ABTS, Folin-Ciocalteu, Flavonoides, Antocianinas, Antociadidinas.
Estructura Química de Flavonoides
Químicamente, estas sustancias son de naturaleza fenólica y se caracterizan por poseer dos
anillos aromáticos bencénicos unidos por un puente de tres átomos de carbono, con la
estructura general C6 -C3 -C6, los cuales pueden formar o no un tercer anillo (Figura 1).

A C
V
B

Figura 1. Estructura básica de los flavonoides.


Los anillos son denominados A, B y C; los átomos de carbono individuales son referidos por
un sistema numérico, el cual utiliza números ordinarios para los anillos A y C y números
primos para el anillo B. Los flavonoides naturales suelen presentar al menos tres hidroxilos
fenólicos y se encuentran generalmente combinados con azúcares en forma de glicósidos,
aunque también se presentan con relativa frecuencia como agliconas libres. Varios subgrupos
de flavonoides son clasificados de acuerdo con la sustitución del anillo C. En esta
clasificación son de suma importancia el estado de oxidación del anillo heterocíclico y la
posición del anillo B [14]. Los flavonoides se subdividen en diferentes grupos como
flavonona, flavona, isoflavonoides, antocianidinas y auronas, como lo muetsra la tabla 1.
Tabla 1. Ejemplos de Flavonoides, su estructura y parte de sustitución
Estructura De Las Antocianinas y Color
Las antocianinas son glucósidos de antocianidinas, pertenecientes a la familia de los
flavonoides, compuestos por dos anillos aromáticos A y B unidos por una cadena de 3 C.
Variaciones estructurales del anillo B resultan en seis antocianidinas conocidas (Fig. 1) [14].

Figura 1. Estructura y sustituyentes de las antocianinas (Durst y Wrolstad, 2001).


El color de las antocianinas depende del número y orientación de los grupos hidroxilo y
metoxilo de la molécula. Incrementos en la hidroxilación producen desplazamientos hacia
tonalidades azules mientras que incrementos en las metoxilaciones producen coloraciones
rojas. En la naturaleza, las antocianinas siempre presentan sustituciones glicosídicas en las
posiciones 3 y/o 5 con mono, di o trisacáridos que incrementan su solubilidad. Dentro de los
sacáridos glicosilantes se encuentran la glucosa, galactosa, xilosa, ramnosa, arabinosa,
rutinosa, soforosa, sambubiosa y gentobiosa. Otra posible variación en la estructura es la
acilación de los residuos de azúcares de la molécula con ácidos orgánicos. Los ácidos
orgánicos pueden ser alifáticos, tales como: malónico, acético, málico, succínico u oxálico;
o aromáticos: p-coumárico, caféico, ferúlico, sinápico, gálico, o p-hidroxibenzóico. Stintzing
et al., 2002, demostraron que el tipo de sustitución glicosídica y de acilación producen efectos
en el tono de las antocianinas; es así como sustituciones glicosídicas en la posición 5 al igual
que acilaciones aromáticas, producen un desplazamiento hacia las tonalidades púrpura.
Actividad antioxidante: Método de decoloración del radical DPPH
El método fue planteado por Brand-Williams [3], y sirve para determinar la capacidad
antioxidante con base en la disminución de color, medida a 517 nm, por acción de un
compuesto antioxidante. Dicha actividad también puede medirse por resonancia espín-
electrón [4]. Autores como Sánchez-Moreno [5], clasificaron el comportamiento de la
cinética en términos de tiempo, como: rápida (30min), e introdujeron un parámetro de
capacidad antioxidante llamado Eficiencia antirradical [6]. A continuación se describe la
reacción modelo de barrido entre el radical DPPH y el antioxidante (AH):
DPPH + AH _____________________DPPH – H + A
DPPH + A _______________________ DPPH – A
A+A _________________________ A – A
Un nuevo radical es formado durante la interacción del radical DPPH y el antioxidante, y las
reacciones secundarias conducen a compuestos estables [7]. El radical DPPH• se preparó al
disolver 2 mg en 100 ml de metanol; alícuotas de 500 μl de la solución metanólica de cada
muestra son añadidas a 1,5 ml de una solución metanólica de radicales libres DPPH•. La
reacción se estabiliza a los 5 min, luego de los cuales se mide la absorbancia a 517 nm y se
calcula el porcentaje de inhibición. Como control de referencia se utiliza quercetina y ácido
ascórbico.
Actividad antioxidante: Método de decoloración del radical ABTS
Este método fue propuesto en 1993 por Miller [8] y se basa en la capacidad antioxidante del
ABTS•+ para capturar aniones radicales de larga vida. En la prueba el ABTS•+ es oxidado
por radicales peróxido, por persulfato de potasio [9], por peróxido de hidrógeno [10],
peroxidasa de rábano [11]. u otro oxidante hasta formar el catión radical ABTS•+, el cual
presenta un intenso color verde-azul, y en la medición los compuestos con capacidad
antioxidante reaccionan directamente disminuyendo el color del catión radical ABTS•+. Los
resultados obtenidos se expresan como inhibición y se llevan a una concentración relativa de
trolox, por ello el método se conoce como Capacidad Antioxidante Equivalente al Trolox
(TEAC). El radical posee solubilidad en medios polares y apolares y no es afectado por la
fuerza iónica; por tanto, evalúa antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos de extractos de plantas
y fluidos biológicos [12] [13] [6]. Este método se basa en la capacidad de las moléculas
antioxidantes (trolox) para saciar la larga vida ABTS•+, un cromóforo azul-verde con un
máximo de absorción a una longitud de onda de 754 nm.

𝐴𝐵𝑇𝑆 + 𝐾2 𝑆2 𝑂8 → 𝐴𝐵𝑇𝑆 °+
𝜆 𝑀𝑎𝑥 = 754 𝑛𝑚
𝐴𝐵𝑇𝑆 °+ + 𝐴𝑟𝑂𝐻 (𝐴𝑛𝑡𝑖𝑜𝑥) 𝐴𝐵𝑇𝑆 + 𝐴𝑟𝑂° + 𝐻 +
Asimismo, es un método de screening para la evaluación de la capacidad antioxidante de
distintas sustancias hidrofílicas y lipofílicas. El radical monocatiónico 2,2-azinobis-(ácido3-
etilbenzotialzolina–6-sulfónico) (ABTS•+) es producido por la reacción entre 50 mg de
ABTS en H2O y 2.45 mg de persulfato de potasio. Dicha reacción da un compuesto coloreado
que al cabo de 12 a 16 horas es estable, y luego es diluido con metanol hasta llegar a una
absorbancia de 0.7 medida a 754 nm.
Método Folin-Ciocalteu
El ensayo Folin-Ciocalteu se utiliza como medida del contenido en compuestos fenólicos
totales en productos vegetales. Se basa en que los compuestos fenólicos reaccionan con el
reactivo de Folin-Ciocalteu, a pH básico, dando lugar a una coloración azul susceptible de
ser determinada espectrofotométricamente a 765 nm. Este reactivo contiene una mezcla de
wolframato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico y reacciona con los compuestos
fenólicos presentes en la muestra. El ácido fosfomolibdotúngstico (formado por las dos sales
en el medio ácido), de color amarillo, al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un
complejo de color azul intenso, cuya intensidad es la que medimos para evaluar el contenido
en polifenoles.
Actividad antioxidante de antocianinas y polifenoles en cáscara de frutas
En la actualidad hay un interés creciente en los antioxidantes, en particular en aquellos que
previenen los efectos nocivos de los radicales libres en el cuerpo humano, existe preferencia
por los antioxidantes naturales y no de fuentes sintéticas[a].
Se han realizado estudios con el objetivo de determinar el contenido ácido ascórbico,
antocianinas y polifenoles totales de fenoles mediante métodos colorimétricos y
cromatográficos; así como, la actividad anti radical por el método de Folin-Ciocalteu, DPPH,
ABTS y en la cáscara de Hylocereus undatus (pitahaya), Myrciaria dubia (camu-camu).
La extracción de la antocianina en pitahaya se realizó mediante la utilización de metanol
acidificado al 0,01%. El extracto obtenido anteriormente contiene la antocianina de interés.
Para la actividad antioxidante por ensayo ABTS +, que se basa en la reducción de la
coloración verde/azul producida por la reacción de ABTS°+ (3,8 mg/mL) con 88 μL de
persulfato potásico (37.5 mg/mL) incubados a temperatura ambiente (±25ºC) y en la
oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta
obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0.70 + 0.1 a 754 nm. Las muestras
filtradas (0.1 mL de extracto) se diluyen con 3.9 mL del radical y se homogeniza por 1
minuto. La absorbancia se mide de forma continua transcurridos 7 minutos.
El porcentaje de capacidad antioxidante se calculó con la siguiente fórmula:
1−(𝐴2 − 𝐴3 )
%ABTS = [ ] × 100
𝐴1

Dónde: A1: Absorbancia del patrón de referencia (ABTS-Etanol). A2: Absorbancia de la


muestra a los 7 minutos. A3: Absorbancia del blanco de muestra.
Otro método utilizado para la determinación de antioxidantes en esta fruta fue: La actividad
antioxidante se determinó basándose del método del radical libre (Brand-­‐ Williams., 1995)
que se realizó de la siguiente forma: se preparó el DPPH a una concentración una solución
de concentración 0.1 mM. En metanol al 80%. Para la preparación de la muestra se tomó
0.2 ml del extracto de antocininas y se mezcló con 7.8 ml de la solución 0.1 mM de DPPH
se agitó vigorosamente, de forma inmediata se midió su absorbancia a una longitud de
onda de 517 nm, dicha lectura se llevó a cabo a diferentes tiempos de la reacción (0, 30 y 60
minutos).
Se leyó de la misma forma la absorbancia de la solución de DPPH 0.1 mM. El porcentaje
de DPPH reducido se obtuvo con ayuda de los datos obtenidos (%DPPH), durante la
reacción; para esto se uso la fórmula propuesta por Soler-­‐Rivas et al., (2000):

% DPPH = (absDPPH0 – abst) / absDPPH0


Donde absDPPH0 es la absorbancia de la solución de DPPH 0.1 mM y abst es la absorbancia
de las muestras a diferentes tiempos.
Por otro lado, en el camu camu La evaluación del método antioxidante de la antocianina
se realizó por el método del DPPH donde Se hizo reaccionar 50 μL de muestra con 950 μL
de DPPH (100 µM) en etanol al 96%, la absorbancia fue monitoreada a 515 nm, a
intervalos de 30 segundos durante 10 minutos. Para la determinación de la actividad
antioxidante, los resultados fueron expresados en términos de IC50, K2 y Poder
Antirradical

El determinación del 3-etilenbenzotiazolino-6 ácido sulfónico, se realizó de acuerdo al


método reportado por Pelligrini et al., (1999), 100 μL de las diluciones de los extractos
acuosos de cáscara de camu-camu seco en tres estados de madurez y a diferentes
concentraciones, se hizo reaccionar con 900 μL de ABTS+ por un tiempo de 10 minutos,
registrándose la absorbancia a 734 nm a intervalos de 30 segundos. La actividad antioxidante
fue expresada como IC50, y en términos de Ácido Ascórbico Equivalente (AAE)
Para la cuantificación de polifenoles se basaron en la reducción de los iones Fe3+ a Fe2+,
por los polifenoles mostrando una coloración azul, formando el complejo ferrocianuro-
ferroso, registrándose una máxima absorbancia a 720 nm teniendo como ventaja: a) La
rapidez y simplicidad de la prueba debido a la formación del color azul, lo que ofrece
sensibilidad y versatilidad para la determinación espectrofotométrica, b) Los resultados son
directamente medidos del contenido de polifenoles solubles (PRICE; BUTLER, 1977),
obteniéndose en el extracto acuoso de la cáscara seca pintón de camu-camu, mayor contenido
de polifenoles. Se realizó mediante el método de Azul de Prussian, reportado por Price y
Butler (1977). Se tomó 1 mL del extracto acuoso y se adicionó 3 mL de FeCl3 0,1M en HCl
0,1N, y 3 mL de 0,008 M K3 Fe(CN)6 la absorbancia fue registrada a 720 nm. Los resultados
se expresaron en mg Ac. Gálico.g-1 cáscara sec. }
Luego de realizar estos métodos, se obtuvo que el proceso de extracción es afectado por
factores como: temperatura, velocidad de agitación, polaridad del solvente y tamaño de la
partícula, los que permiten lograr un buen contacto del sólido con el solvente, incrementando
el proceso de difusión, mejorando la transferencia de los diversos componentes sólidos y
disminuyendo el tiempo de extracción. Luego del secado, las antocianinas no son detectadas,
debido a que sufrieron degradación, básicamente al reaccionar con el ácido ascórbico, así
como también con el peróxido de hidrógeno, que se forma a partir de la reacción del ácido
ascórbico con el agua y las enzimas presentes en la cáscara de la fruta. Además, de acuerdo
a resultados por Kahkome et al (1999), la cáscara de camu-camu, presenta mayor contenido
de polifenoles que la cáscara de papa, remolacha, tomate, lupinus azul y trébol rojo, siendo
superado sólo por las muestras de tomillo y romero. Los resultados de la actividad
antioxidante de la cáscara de camu-camu, muestran que el extracto acuoso de la cáscara
pintón tuvo mayor eficiencia para inhibir el radical DPPH con 92,89 ± 0,44%; seguido con
90,17 ± 3,02% y 82,62 ± 8,54%; para la cáscara del fruto maduro y verde respectivamente,
datos expresados en media ± SD, n = 3, p < 0,05.
Para la pitahaya, utilizando la ecuación descrita en la metodología del radical DPPH y las
absorbancias se obtuvo una capacidad antioxidante media de 31,5157 % de reducción ó
inhibición del radical DPPH. Para el método de ABTS la decoloración del radical como
efecto de la reacción con la muestra se realizó tomando ocho lecturas, al tiempo cero y cada
minuto durante los primeros 7 minutos de reacción, se observó una disminución de las
absorbancias, obteniendo que el extracto de antocianinas posee una capacidad antioxidante
media de 12,17 % de reducción ó inhibición del radical ABTS.
Para concluir, los resultados obtenidos en el trabajo muestran que la cáscara de pitahaya
(Hylocereus undatus)es una fuente natural de antocianinas con capacidad antioxidantes, las
cuales tendrían una aplicación potencial en alimentos o la industria farmacéutica, dada la
actividad encontrada en los extractos de antocianinas bajo los dos métodos (DPPH, ABTS)
evaluados, por otro lado el trabajo realizado en el camu camu, muestran la correlación de la
actividad antioxidante, con el contenido de ácido ascórbico y polifenoles totales de la cáscara
seca pintón respecto al radical DPPH fue de r = 0,999 y r = 0,999; para el catión ABTS+ r =
0,994 y r = 0,993, y para el radical Peroxilo r = 0,926 y r = 0,923, respectivamente;
disminuyendo el coeficiente de correlación del ácido ascórbico y polifenoles totales para el
catión ABTS+ y radical peroxilo, suponiendo que la inhibición estaría influenciada por la
acción de otros componentes no evaluados en este experimento.

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