REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA [SeleccioneFACSA

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INDICE

Introducción……………………………………………………………………………………………………………………2
Resumen…………………………………………………………………………………………………………………………3
Objetivos………………………………………………………………………………………………………………………..3
1. ¿En qué consiste? ……………………………………………………………………………………………………4
2. Conceptos Previos…………………………………………………………………………………………………….4
2.1 Endonucleasas de restricción………………………………………………………………………………4
2.2 Polimerasas………………………………………………………………………………………………………..5
2.3 Otras enzimas…………………………………………………………………………………………………….5
3. Un poco de historia………………………………………………………………………………………………….5
4. Antecedentes…………………………………………………………………………………………………………..6
5. Fundamento e Importancia……………………………………………………………………………………..7
6. ¿Cuál es el método para la reacción de cadena de la Polimerasa?............................8
7. Etapas de la Reacción en Cadena de la Polimerasa…………………………………………………..9
8. ¿Qué se requiere para su realización?.......................................................................12
8.1 Amortiguadores………………………………………………………………………………………………..13
8.2 Sales………………………………………………………………………………………………………………….13
9. ¿Cómo se prepara? ………………………………………………………………………………………………..14
9.1 ¿Qué materiales necesitamos a nivel práctico para preparar la reacción?.........14
9.2 ¿Cómo se suele trabajar en este caso?................................................................14
9.3 Ejemplo de la PCR……………………………………………………………………………………………..14
10. Tipos de Reacción en Cadena de la Polimerasa……………………………………………………….15
10.1 Anidada…………………………………………………………………………………………………………..15
10.2 Extensión solapada………………………………………………………………………………………….16
10.3 In Situ………………………………………………………………………………………………………………16
10.4 Múltiple……………………………………………………………………………………………………………16
10.5 Transcriptasa Inversa……………………………………………………………………………………….16
10.6 En tiempo real o Cualitativa……………………………………………………………………………..17
11. Aplicaciones……………………………………………………………………………………………………………..18
12. Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………….21
13. Bibliografía……………………………………………………………………………………………………………….22

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INTRODUCCIÓN

Para abordar de lleno el tema de la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa

(PCR) debemos hablar primero de Biología Molecular, esta es
una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares
que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de uno seres a otros y
se exprese en los nuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales
que existen entre las especies y "colocar" genes de un organismo otro llamado hospedero,
empleando técnicas de ingeniería genética. Gracias a este avance, se pueden producir fragmentos
de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo así las puertas a la secuenciación de los ácidos
nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la
obtención de organismos superiores recombinantes.
Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con hechos que contribuyeron en forma
decisiva en el desarrollo de la biología molecular, por ejemplo:
En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregación y
clasificación independiente de los genes.
En 1869 Frederick Miescher, científico suizo descubre en el núcleo de las células una sustancia
de carácter ácido a la que llamó nucleína.
En los años veinte el químico alemán Robert Feulgen, utilizando una tinción específica descubrió
que el DNA estaba situado en los cromosomas.
En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el ADN es el portador de la información
genética.
En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del ADN.
Este último hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos que conducirían a lo que se
llama tecnología del DNA Recombinante.
Hablando específicamente de DNA según el modelo de Watson y Crick, la molécula está
constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con polaridad opuesta, unidas entre sí
formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado por:
1.- Molécula de azúcar (desoxirribosa)
2.- Base orgánica nitrogenada: bases pirimídicas (Citosina, timina), bases púricas (Adenina,
Guanina).
3.- Grupos fosfato.
Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando cadenas muy largas,
quedando las bases nitrogenadas en la parte central unidas cada una al carbono 1 del azúcar
formando un ángulo recto con su eje.
Las cadenas de poli nucleótido que constituyen una molécula de ADN se mantienen unidas entre sí
gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de
ambas cadenas que quedan enfrentadas.

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RESUMEN

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombre en inglés Polymerase Chain

Reaction) permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN (ácido
desoxirribonucleico). El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de
fragmentos cortos de ADN de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a
amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que una enzima polimerasa sea capaz
de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Una vez completada la reacción la
cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante técnicas sencillas de separación de
fragmentos de ADN.

OBJETIVOS

El presente trabajo monográfico tiene como objetivo proporcionar toda la información

indispensable para el conocimiento adecuado de la Reacción en Cadena de la Polimerasa:
 Brindar conocimientos sobre la historia previa a la cadena y el proceso de su
descubrimiento así como las personas involucradas en el hallazgo para así tener una mejor
base para el entendimiento de este tema.
 Describir el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.
 Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.
 Describir las etapas y los métodos que son necesarios para llevar a cabo la reacción en
cadena de la polimerasa.
 Proporcionar la información necesaria sobre los requerimientos que se necesitan para
este procedimiento, tomando en cuenta el equipo con el que se realiza.
 Detallar las aplicaciones en las que el uso de la reacción en cadena de la polimerasa es
sumamente necesaria y como puede contribuir está en los diversos procesos en los que se
ve involucrada.

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

1. ¿En qué consiste?

La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como

PCR, es una técnica de Biología Molecular desarrollada en
1983 por Kary Mullis, que permite replicar entre cientos de
miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in
vitro, pequeñas cantidades de ADN.
Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la
investigación básica consiste, precisamente, en la rapidez y
eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes
requería largas y tediosas jornadas. El producto que se obtiene
al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento
génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los
investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos
sobre la estructura y función de los genes.
Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello,
una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible,
la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el
análisis de muestras del niño y de su abuela materna, virus o bacterias causantes de
una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el
ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en
una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para
llevarla a cabo.

2. Conceptos Previos:

La aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico

de Ingeniería genética y referidas indistintamente como clonación, ADN recombinante o
manipulación génica han sido la causa de pocas áreas de la biología molecular
permanezcan inalteradas. Antes del desarrollo de la ingeniería genética no era posible
aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el
de su producto.
Una de las sustancias más importantes y de participación decisiva en distintos procesos de
la Biología Molecular son las enzimas; existen varias que podemos destacar:

2.1 Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos
rompiendo enlaces internucleótidos del interior de la cadena. Son producidas
principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto del DNA de
doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas
de restricción de tipo II son las más útiles en
los métodos de DNA debido a su especificidad de
secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como
para la de ruptura. Estas enzimas se denominan con tres
o cuatro letras que corresponden a la primera letra
del género y a las dos o tres primeras letras e la especie

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del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento

de esa enzima en esa generación.

2.2 Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar ADN o ARN "in

Vitro". La mayoría de estas enzimas requieren un molde y
sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas
utilizadas con mayor frecuencia son: ADN polimerasa I de E. Coli, el
fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde
ARN para convertirlo en ADN), la ADN polimerasa del bacteriófago
T7, RNA polimerasa de los bacteriófagos SP6, T7 y T3 y la Taq
polimerasa. La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño
cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la
polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una
polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos
de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2.

2.3 Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), fosfatasas
(eliminan el fosfato de la región 5 de los ácidos nucleicos), quinasas (incorporan fosfatos
en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas).

3. Un poco de historia:

En 1971, un artículo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology describió
por primera vez un método que usaba enzimas para replicar una secuencia pequeña de
ADN con cebadores in vitro. Sin embargo, este temprano ejemplo del principio básico de
la PCR no recibió mucha atención, y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa
en 1983 es generalmente atribuida a Kary Mullis. Mullis ganó el Premio Nobel por su
trabajo en PCR.

El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq, eliminó los grandes inconvenientes del

método de la PCR. Este ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo
activa hasta después de la desnaturalización del ADN, eliminando la necesidad de añadir a
la reacción nueva polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permitió automatizar el
proceso, antes tan tedioso, acoplándolo al uso del termociclador.

Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba en

Emeryville, California (EE UU), para una de las primeras empresas biotecnológicas, Cetus
Corporation, donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis concibió
la idea para la PCR una noche mientras cruzaba la Autopista de la Costa Pacífica (EE UU) en
su coche. Estaba imaginando una nueva forma de analizar mutaciones en el ADN cuando
se percató de que, en lugar de eso, había inventado un método para amplificar regiones
específicas de ADN mediante ciclos de duplicación repetidos usando ADN polimerasas.
Mullis atribuye la invención de esta técnica a los efectos de la droga psicodélica y
alucinógena LSD

En la revista Scientific American, Mullis resumió el procedimiento: "Comenzando con una

única molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 billones de
moléculas iguales en una tarde. La reacción es fácil de hacer, no requiere más que un tubo

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de pruebas, unos pocos reactivos simples y una fuente de calor." Fue premiado con
el Premio Nobel de Química en 1993 por su invención, y siete años después, él y sus
colegas del Cetus llevaron a la práctica su propuesta. Sin embargo, han aparecido
controversias y diferentes versiones sobre las contribuciones intelectuales y prácticas de
otros científicos al trabajo de Mullis, y sobre si él fue el inventor único del principio de la
PCR.

4. Antecedentes:

Los genes son porciones de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tienen la información
necesaria para la fabricación de los ácidos ribonucleicos (ARN) y, en última instancia, a
través de éstos, de las proteínas: el ARN "copia" el mensaje contenido en el ADN y a partir
de él da lugar a la correcta formación de la cadena o secuencia de aminoácidos que
constituyen las proteínas.
Todos los genes están compuestos por la misma
materia prima: una sucesión de nucleótidos.
Cada nucleótido está formado por un grupo
fosfato, un azúcar con cinco carbonos (la
desoxirribosa) y una de las siguientes bases
nitrogenadas: adenina, timina, guanina o
citosina. Los genes no se distinguen unos de
otros por tener una composición fisicoquímica
muy diferente, sino por el orden o secuencia en
la que estas cuatro bases se disponen a lo largo
de la molécula de ADN. El hecho de que los genes
no se distingan por su composición fisicoquímica
hace prácticamente imposible aislarlos mediante
el empleo de métodos bioquímicos de
fraccionamiento del tipo de los usados para purificar proteínas como son, por ejemplo, la
cromatografía, la electroforesis o la ultracentrifugación.

Por otra parte, cada gen es una unidad de información sin solución de continuidad
respecto del resto del ADN en el que está inmerso. Esto significa que a todo gen lo
preceden y suceden otras secuencias de ADN que, en general, no tienen relación con él. El
gen que codifica para la insulina, por ejemplo, tiene una "longitud" de 1.700 bases y su
masa representa sólo la dos millonésima parte del ADN contenido en el núcleo de una
célula humana.

Hasta mediados de la década del ochenta, la única estrategia posible para aislar un gen y
obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". Este
método se basa en la introducción de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendrá el
gen de interés, en vectores. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN de
bacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original
como de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeño tramo de la
secuencia de aminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se
pueden diseñar métodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta
dicho gen. Este reconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo
contra la proteína resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la

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bacteria portadora porque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés, la

cual se une específicamente al anticuerpo.

Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de
bases o analizar en detalle la información de la que es portador, sino que también se
puede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteína
correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en células en
cultivo o en animales de experimentación, etcétera. Estas técnicas, ya clásicas, han
permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de
microrganismos, animales y plantas, lo que provocó un cambio cualitativo en la
comprensión del funcionamiento de la célula.

En 1986, K. Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un método para lograr

la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los
vectores y su replicación en bacterias. Este método revolucionaría en corto tiempo el
conjunto de técnicas de la biología molecular. Su uso se extendió rápidamente a miles de
laboratorios, no sólo de investigación básica, sino también de diagnóstico clínico. Se trata
de la reacción en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes
del inglés Polymerase Chain Reaction.

5. Fundamento e Importancia:

Esta técnica se fundamenta en la propiedad

natural de los ADN polimerasas para replicar
hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de
altas y bajas temperaturas alternadas para separar
las hebras de ADN recién formadas entre sí tras
cada fase de replicación y, a continuación, dejar
que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder
duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de
la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis en
la década de 1980.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los
cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto
que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la
inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas,
restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos,
generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus
furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente
se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer
corrección de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato

llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar
la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores
modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos

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simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una
pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se
alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un
sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos
de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el
problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de
reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios

de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se
incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis
funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas
genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico
de enfermedades infecciosas.

6. ¿Cuál es el método para la reacción de cadena de la Polimerasa?

El método se basa en las características de la estructura

química del ADN y su replicación semiconservativa. Es
decir de acuerdo al modelo de Watson y Crick, el ADN es
un polímero formado por dos cadenas complementarias
(cadenas anti paralelas), constituido por unidades de
desoxirribonucleotidos de cuatro bases nitrogenadas
adenina, guanina, citosina y timina unidas al azúcar
desoxirribosa. La parte que no varía en la molécula del
ADN consiste en desoxirribosas unidas por grupos fosfato.
Específicamente el hidroxilo 3’ del azúcar de un
desoxirribonucleotido se une al hidroxilo 5’ del siguiente
azúcar a través del puente fosfodiester.
Para duplicarse el ADN se separa en sus dos cadenas
complementarias así cada una de ellas sirve de molde o
plantilla. Al final del proceso se obtendrán dos moléculas
de ADN, cada una de ellas formada por una cadena
original y una cadena complementaria que ha sido
sintetizado “de novo”. La enzima que realiza este proceso
se denomina ADN polimerasa.
Esta enzima añade los nucleótidos en el hidroxilo 3’
terminal de la cadena de DNA paterna. En otras palabras,
se requiere de una cadena con un grupo 3’ OH disponible,
el cual es el iniciador, para formar el enlace fosfodiester
3’-5’.
La reacción de alargamiento, catalizada por la ADN polimerasa, consiste en un ataque
nucleofilico del átomo de fósforo del desoxirribonucleotido (Dntp) al 3’ OH del iniciador,
para formar la unión covalente fosfodiester.
El aspecto más importante de la doble hélice de ADN se separa fácilmente cuando las
uniones de hidrógeno de las bases se rompen. Esto se realiza cuando una solución de DNA
es calentada entre 77 y 100 °C.
Las bases complementarias se re asocian espontáneamente para formar la doble hélice

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cuando la temperatura desciende

Este proceso de re naturalización se denomina alineamiento. La facilidad con la cual la
doble hélice puede separarse y re asociarse es crucial para las funciones biológicas del
ADN.
El método RCP emplea ciclos repetidos de síntesis in vitro del ADN dirigida por un
oligonucleótido iniciador. Las secuencias de los oligonucleótidos iniciadores se determinan
en base a una parte conocida de la secuencia del ADN molde, ya que deben ser
complementarias a cada una de las cadenas del ADN, dejando libres a los lados opuestos
para poder ser amplificados. Dichos oligonucleótidos sirven como iniciadores para la
síntesis in vitro del ADN, la cual es catalizada por la enzima ADN polimerasa, y ellos
también determinan los extremos del fragmento del ADN final que se obtiene.
La distancia entre los oligonucleótidos iniciadores es determinada empíricamente y
depende de muchos factores.
La longitud entre los oligonucleótidos iniciadores para ensayos de diagnóstico puede ser
entre 50 y 1500 bases de nucleótidos.

7. Etapas de la Reacción en Cadena de la Polimerasa:

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie

de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados
ciclos; cada ciclo suele consistir en 3-5 pasos a
diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con
ciclos que tienen cinco pasos de temperatura.

Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un

choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (>
90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para
la extensión de producto final o el breve almacenaje.
Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada
ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos
incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la
concentración de iones divalentes y de los dNTP en la
reacción, y la temperatura de unión de los cebadores,
así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

Básicamente cada ciclo de RCP consiste de 5 etapas:

a) INICIO, este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó
98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante
1-9 minutos. En la primera etapa el ADN molde es
incubado a alta temperatura (92-98°C, de 30-90 s), para
separar cadenas complementarias, desnaturalización del
ADN y así hacerlas accesibles al apareamiento con el
iniciador específico. Esto sólo es necesario para ADN
polimerasas que requieran activación por calor.
b) SE DESNATURALIZA EL ADN (se separan las dos
cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede
realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento

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(94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar
la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la cadena,
como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica
de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la
desnaturalización.
b) LA ETAPA DE ALINEAMIENTO O UNIÓN DEL CEBADOR, en la cual la mezcla de reacción
es enfriada para
permitir que los
oligonucleótidos
iniciadores se alineen o
hibriden las secuencias
complementarias del
ADN blanco.
O sea producirá
la hibridación del
cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde.
Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el
caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las
cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy
similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el
cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de
la molécula que va a ser amplificada.
c) LA REACCIÓN DE EXTENSIÓN, generalmente llevada a cabo a una temperatura
intermedia, en la cual la DNA
polimerasa copia el ADN entre
las secuencias correspondientes
a los oligonucleótidos
iniciadores.
En otras palabras, actúa la ADN
polimerasa, tomando el ADN
molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte
inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de
ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección
5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la
hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del
ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad
está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto del ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay
una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN
polimerizará mil bases en un minuto.
d) ELONGACIÓN FINAL a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último
ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea
totalmente ampliado.
e) CONSERVACION, por último se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para
conservar la reacción a corto plazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en pequeños

tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

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Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas
de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga,
esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño:
típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes;
en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada
a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.3 El/los tamaño/s de los productos de la
PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene
fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos
de PCR

Estas tres etapas de la reacción constituyen un ciclo térmico. Cuando cada ciclo térmico se
completa, los fragmentos recientemente sintetizados sirven como ADN blanco, y en unos
pocos ciclos más, el producto predominante será una única clase de fragmente de ADN
cuya longitud corresponde a la distancia entre los oligonucleótidos iniciadores. Así, la
repetición del ciclo origina una acumulación geométrica de las secuencias amplificadas.

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8. ¿Qué se requiere para su realización?

Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener muchas

copias de un fragmento de ADN, para después poder visualizar este fragmento y utilizarlo
en otras aplicaciones si es necesario. Para alcanzar este resultado, ¿qué es necesario
añadir a la reacción?
 El ADN a partir del cual queremos obtener una
copia de un fragmento, es decir, el ADN que
queremos amplificar. Este DNA se conoce como
ADN molde.
La concentración de ADN molde en la reacción
depende de la fuente utilizada, y se requieren
idealmente alrededor de 300 nanogramos a 1
microgramo de ADN genómico.
 Una enzima capaz de generar una copia de DNA a
partir del DNA molde: una ADN polimerasa. La
reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado
para el funcionamiento de la enzima polimerasa.
Además, como cofactores de la polimerasa se añaden cationes divalentes,
generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).
Inicialmente se empleó la ADN polimerasa de Escherichia coli como enzima
polimerizadora, pero debido a su inestabilidad térmica, era necesario agregarla en
cada ciclo, haciendo muy costosa la prueba. Tomando en cuenta los problemas
que se presentaban al usar enzimas que perdían su actividad por las altas
temperaturas, se purificó una enzima
termoestable a partir de bacterias Thermus
aquaticus que actualmente se conocen como Taq
ADN polimerasa, con un peso cercano a 93.910
Da y su temperatura óptima en la que se observa
su actividad máxima es entre 75 a 80 °C y su tasa
de incorporación de nucleótidos, Kcat, es de unos
150 nucleótidos/segundos/enzima.
 Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son capaces
de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de ADN. Son
necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de ADN de cadena
sencilla. Estas moléculas son los cebadores o primers de la reacción. Los cebadores
los que van a delimitar el fragmento a amplificar.
También se les llama oligonucleótidos sintéticos iniciadores, se deben seleccionar
dos que hibriden con regiones del ADN molde y que estén localizados en los
extremos de las regiones de interés. Su secuencia debe presentar la mayor
similitud posible con la del ADN blanco, ya que de ello depende el éxito y la
especificidad de la amplificación.
 Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena
complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al
extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucleótidos
se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs). Concentraciones
entre 20 y 200 μm proporcionan resultados óptimos, debiéndose iguala la

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concentración de cada uno de los cuatro dNTPs de concentraciones equimolares.

8.1 Amortiguadores de reacción:

Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente), 50 mM KCl,
0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2.
Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la
práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la
polimerasa. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10%
contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN (Anderson, 1990).
También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón
x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan
polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina bovina (BSA), etc, aunque no
son en ningún caso imprescindibles.

8.2 Sales:
Es de gran importancia la concentración de dos cationes que son añadidos en forma
de sales.
Cloruro potásico (KCl). Influye en la desnaturalización del ADN.
Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias
cortas de ADN. Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de
secuencias largas de ADN.
Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura de hibridación del DNA. La
concentración de este ion resulta fundamental para la optimización de la reacción.
Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la reacción.
Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción.

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9. ¿Cómo se prepara?

Se han detallado previamente los componentes

básicos que es necesario incorporar a la reacción
para completar una PCR. El equipo en el que se
lleva a cabo la reacción es el termociclador.
9.1 ¿Qué otros materiales necesitamos a nivel
práctico para preparar la reacción?
Pues necesitaremos utilizar micro tubos, placas de
PCR, un juego de micro pipetas y puntas para las
micro pipetas, además de hielo para mantener los
reactivos a baja temperatura.
Es frecuente que una PCR se prepare para obtener
producto de amplificación a partir de más de una
muestra, es decir, que se prepare más de una
reacción.
9.2 ¿Cómo se suele trabajar en este caso?
La forma habitual de trabajar consiste en preparar
la mezcla de reacción (en cantidad suficiente para
todas las muestras) que contenga todos los
componentes de la PCR, a excepción del DNA molde. Esta mezcla se distribuye en los
microtubos o en la placa de PCR y a continuación se añade a cada reacción el DNA molde.

9.3 Ejemplo de preparación de Reacción en cadena de la Polimerasa:

Los volúmenes y concentraciones son orientativos, siendo valores frecuentemente
empleados en la práctica.

Supongamos que los reactivos de la PCR se conservan a las concentraciones que se indican
en la tabla 1. Supongamos también que la mezcla de reacción debe contener cada uno de
los componentes a las concentraciones que se recogen en la misma tabla. ¿Cómo
determinamos el volumen a añadir a la reacción de cada uno de los componentes? Se
trata simplemente de saber que se debe cumplir la siguiente igualdad:
Vinicial X Cinicial= Vfinal X Cfinal
V representa el volumen y C la concentración.
Como ejemplo, si los cebadores se conservan a una concentración (concentración inicial)
de 10 µM y los queremos a una concentración 0,4µM (concentración final), sabiendo que
el volumen total de la reacción de 25 µl (volumen final), podremos aplicar la ecuación 1

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para determinar el volumen que es necesario tomar del tubo original (volumen inicial).
Trabajando de esta forma se calculan los volúmenes a añadir de cada uno de los
componentes.

Tabla 1. Concentraciones de almacenamiento, concentraciones empleadas en la reacción

y volumen a añadir de los principales componentes de una PCR considerando un volumen
total de 25 µl.

Hasta completar el volumen final de 25 µl falta considerar la cantidad de ADN a añadir.

Entre 40 y 100 ng de DNA (cuando se trata de ADN total de planta) son valores habituales.
Es frecuente preparar el DNA de forma que se incorpore todo el ADN necesario añadiendo
1 µl a la reacción. El resto hasta el volumen total se completaría con agua destilada.
En cualquier caso, como se ha dicho previamente, se prepara en primer lugar la mezcla,
sin el ADN, en cantidad suficiente para todas las muestras a incluir en el análisis. Por tanto,
se multiplicarían los valores obtenidos en la tabla 1 para cada componente (además del
agua destilada) por el número total de muestras a analizar (incluyendo el control negativo,
ver cuadro 2). Una vez preparada esta mezcla, se distribuye en microtubos o en placa de
PCR: si de ADN se va a añadir 1 µl por reacción, se distribuirán 24 µl de mezcla por
reacción. A continuación se añade el DNA a cada muestra, y el mismo volumen de agua en
el control negativo. Los componentes y la mezcla de reacción se mantendrán en hielo
durante el proceso, con el fin de evitar su degradación.

10. Tipos de Reacción en Cadena de la Polimerasa:

10.1 PCR anida:

Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de
una amplificación es utilizado como molde para realizar
una segunda amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada, es decir,
cuando tenemos el primer amplicón se pueden unir los
cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro
del amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de
brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad
aumenta porque como es amplificación de un amplicón
obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar
en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una
única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones
inespecíficas de los cebadores. La desventaja de ésta

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técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

10.2 PCR de extensión solapada(Mutagenesis):

Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se
requieren 2 cebadores (primmers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y
un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutación. Se usan los productos en
otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa.

10.3 PCR in situ:

La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada
sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una
primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in
situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar
específicamente una población de secuencias de menor representación.

10.4 PCR múltiple:

PCR en la cual se amplifica simultáneamente
más de una secuencia. Para ello, se combinan
dos o más pares de cebadores en un mismo
tubo, junto con el resto de los reactivos de
la reacción en cantidades suficientes, para
amplificar simultáneamente varios
segmentos de ADN. Ventajas: información
sobre varios locus en una sola reacción,
menor cantidad de molde para el análisis,
menor cantidad de reactivos, rápida
construcción de bases de datos. Desventajas:
para llevarla a cabo adecuadamente y sin
errores, se requiere de una cuidadosa
optimización del proceso.
10.5 PCR con transcriptasa inversa(RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y
emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN
complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:
1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
3er paso: PCR estándar.

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10.6 PCR en tiempo real o cuantitativa:

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de
ADN o ARN presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también
denominado valor Tm, del inglés melting temperature).

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas

basadas en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada
ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es
medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una
secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su
realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos
que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse);
cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por
resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos
fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN
polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el
nivel de amplificación del gen.

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR

realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que
monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de
la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un
número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de
amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la
cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema
que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia.
Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayoría pueden trabajar con las
diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar
las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos
reactivos determinados.

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11. Aplicaciones de la PCR:

Clonación: en el campo de la biología molecular el PCR se utiliza para la clonación

molecular de genes y su secuenciación nucleotida. El PRC favorece la clonación si se
incorporan regiones de restricción (sitios específicos donde las enzimas endonucleasas de
restricción, cortan específicamente el ADN) en los extremos 5’. Cuando se utiliza los
oligonucleótidos, de tal manera que es posible clonar los fragmentos que se amplifiquen al
aprovechar estos sitios de restricción del vector.

Análisis y cuantificación de la expresión genética basado en el estudio de la cantidad de

ARN mensajero ( ARN m) en estos casos se requiere de la síntesis de ADN copia (ADN c) a
partir del ARN muestra por medio de la enzima transcriptasa reversa( enzima replicasa
viral que sintetiza ADN a partir del ARN m. Este ADN c se utiliza como molde para
amplificar las secuencias de interés al utilizar los oligonucleótidos adecuados.

Diagnóstico clínico, en este campo de PCR se usa en la genética médica para el

diagnóstico de enfermedades hereditarias y de algunas cromosomopatías comunes; en el
campo de la inmunología se emplea para determinar asociaciones en el complejo mayor
de histocompatibilidad y la predisposición genética para el desarrollo de enfermedades
autoinmunes; en el campo de la oncología para probar mutaciones activadoras de
oncogenes, para detectar arreglos cromosomáticos, presentes en procesos neoplásicos y
para la detección de un virus y de las consecuencias oncogénicas.

Entre las enfermedades genéticas en la que la técnica del PRC se ha empleado con éxito, y
como apoyo al diagnóstico debemos mencionar: fenilcetonuria, debida a mutaciones
autosomaticas recesivas del gen de la fenilalanina hidrolasa, la fibrosis quitica que se
presenta como resultado de las mutaciones que afectan la función de un canal de cloro; y
la distrofia muscular que resulta de mutaciones en el gen de la distrofina que se hereda
como un rasgo ligado al cromosoma X.

Detección de mutaciones, la técnica de PCR nos permite localizar mutaciones

previamente descritas. Se emplea así en la secuenciación de ADN como un método de
diagnóstico: Una vez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad de una
determinada mutación puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa
en la galactosemia, mutaciones en c-Ras y cáncer, etc.) o de una pequeña deleción
(deleción de tres bases en el gen CFTR de fibrosis quística ) puede desarrollarse un método
de detección rutinario , la secuenciación automática puede implementarse como método
de screening para la localización de nuevas mutaciones.

En la microbiología, la PCR, se ha utilizado en el diagnóstico rápido y preciso de las

infecciones producidas por bacterias, hongos, virus, particularmente de esos
microorganismos difíciles de detectar por análisis microbiológico directo y cultivo. Por

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ejemplo en el caso de Mycrobacteria, que consistía en un grupo de bacilos acido-

resistentes los cuales incluyen a patógenos humanos y animales existen 3 conocidas
Mycobacterium tuberculosis, M bovis y M leprae. Sin embargo en las últimas décadas, se
descubrieron un número importante de otras especies patógenas oportunistas (M avium,
M intracellulare, M kansaii, y M simiae) las cuales pueden causar enfermedad severa
cuando las defensas celulares normales están deprimidas temporalmente. El ejemplo más
sorprendente, es probablemente la prevalencia de la infección diseminada por M avium
en pacientes con SIDA. El establecimiento del diagnóstico definitivo de infección por
micobacterias radica en el aislamiento, cultivo e identificación del microorganismo.
Debido a su largo periodo de generación las técnicas de cultivo requieren de tres a ocho
semanas.
El diseño y empleo del método de amplificación del ADN ribosomal ADNr( secuencias del
ADN que codifican para el ARN ribosomal de la subunidad 30S) por la técnica de PRC
proporciona una identificación exacta del microorganismo por el hecho que este ADN está
muy conservado en las diferentes especies y es especifico del microorganismo a nivel
especie.
Así la identificación puede ser obtenida en dos días.
Actualmente se han diseñado marcadores o detectores que permiten la identificación de
los parásitos, Plasmodium sp, responsable del paludismo, Leishmania sp, responsable de la
enfermedad de Chagas y Tripanosoma sp responsable de la tripanosomiasis.

También se ha empleado la técnica de PCR para detectar aquellos microorganismos, que

son resistentes a los antibióticos, y por ende los genes responsables, de esa resistencia.
Ello se ha podido realizar en pus y en otros líquidos corporales, sin que sea necesario aislar
y caracterizar al microorganismo. Esta práctica puede ser de gran utilidad en el manejo
adecuado de antibióticos a nivel hospitalario.

Uno de los campos principales de aplicación del PCR en la detención de agentes

patógenos, es el desarrollo de métodos rápidos y sensibles para detectar el virus del VIH
que causa el SIDA. Gracias a que se conoce la secuencia del genoma del VIH se utilizan
partes de oligonucleótidos para amplificar los fragmentos conservados de regiones env y
gag de este virus y que se localizan en los linfocitos humanos. Otro campo de aplicación
para el PCR es la detección del papiloma-virus del humano HPV el cual se asocia con
ciertos tipos de cáncer cérvico-uterino.

La amplificación PCR también se permite la detección de ADN de poco menos de 100

células por 100 gramos de muestra y es usado en la ingeniería genética de
microorganismos y el monitoreo de poblaciones indicadoras y patógenas en suelo, agua y
sedimentos. El producto de la PCR puede ser cuantificado, permitiendo la estimación de
microorganismos y ARNm especifico en muestras del medio ambiente. Otro uso es de
medición de la expresión genética de los microorganismos viables. La PCR es usada para
clonar genes permitiendo la secuencialización de los mismos aun de aquellos

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microorganismos ambientales importantes que todavía no han podido ser cultivados.

Una de las características de la evolución es la capacidad del cambio de especies, las que
aún están cercanas filogenéticamente pueden tener una variabilidad genética enorme. La
PCR contribuye al conocimiento de la variabilidad de los grupos de organismos, ya que al
diseñar oligonucleótidos adecuados, esta será evidente en el análisis del resultado de
amplificación. Es posible detectar diferencias tan solo en una posición y en la secuencia de
ADN donde haya ocurrido una sustitución de bases.

En el proceso de evolución, el PCR, se ha aplicado a estudios de secuencias conservadas

del ADN, acelerando la construcción de árboles filogenéticos y se ha convertido en el
instrumento más accesible para el análisis de especies en vía de extinción. La arqueología
también ha encontrado una herramienta poderosa en el análisis genético de las muestras
biológicas antiguas, como por ejemplo las provenientes de las momias y fósiles en donde
se lograron amplificar algunos fragmentos de secuencias del ADN mitocondrial. En este
sentido a resultado de mucho interés la amplificación del ADN a partir de muestras de
tejido de un mamut siberiano cuya preservación fue la congelación.

Secuenciación de ADNs fósiles: El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar

secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especímenes de
museo y descubrimientos arqueológicos en los cuales la mayoría de las moléculas están
dañadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante
secuenciación.

Identificación de especies y Control de cruzas entre animales: Las técnicas para

identificar especies pueden ser muy importantes para descubrir fraudes comerciales, tales
como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o
el comercio ilegal de especies en peligro. Estos estudios pueden realizarse utilizando el
ADN mitocondrial, el cual presenta secuencias altamente variables entre especies
distintas, aunque sean cercanas entre sí, y bastante conservadas dentro de la misma
especie.
Los controles de relaciones Familiares entre animales tienen importancia forense para el
control de comercio ilegal de especies protegidas. Individuos jóvenes de especies en
peligro son sacados de sus lugares de nacimiento y disfrazados por certificados
veterinarios falsos. En estos casos el estudio familiar es el único medio de descubrir el
origen ilegal de los individuos.

Uno de los campos más ampliamente estudiados en los últimos años es el que concierne
en el proyecto genoma humano, en el cual se ha recurrido al método PCR para identificar
nuevos genes, secuencias y mutaciones.

Una de las áreas que más se ha visto enriquecida con la implementación de la PCR, es la

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medicina legal donde actualmente se realiza un análisis veraz de la prueba de paternidad

y de la identificación de individuos a través de la tipificación de regiones cromosomaticas
con secuencias de ADN altamente variables o polimórficas. El principio de esta aplicación
se basa en la variabilidad genética que existe entre los individuos, además de la gran
sensibilidad del método ya que por medio de él, se amplifican fragmentos de cantidades
pequeñas de ADN que se obtiene de los restos del tejido epitelial, sangre seca, cabellos o
semen. Comparando los patrones se obtiene específicamente de cada individuo, se puede
determinar a quién pertenece nuestra muestra de ADN

12. Conclusiones
 La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la
mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. Se ha presentado la base
teórica y práctica de la PCR.
 Existen muchas variantes de la PCR convencional, como son la PCR en tiempo real
o PCR cuantitativa (que permite cuantificar la cantidad de producto amplificado) o
la PCR por transcripción inversa (mediante la cual se obtiene una copia de DNA
complementario, DNAc, utilizando como molde ácido ribonucleico, ARN). Existe
gran cantidad de información referida tanto a la PCR convencional como a sus
variantes
 La PCR no es sólo lo una técnica exquisitamente específica, sino también muy
sensible, pues en principio para practicarla bastaría una sola molécula, por
ejemplo, del genoma humano, aunque habitualmente se emplean cantidades
excesivas de este (en el orden de hasta microgramos).
 la técnica es tan robusta que puede usar como substrato para la reacción al ADN,
sin tener que purificarlo de su fuente natural, y es común emplear productos
biológicos diversos como tejidos embebidos en parafina, semen recuperado de
escenas de violación, lavados bronquiales, exudados de mucosas, raíces de
cabellos o cejas, sangre, extendidos citológicos, etc.
 Muchas veces basta una simple ebullición de la muestra para lisar, liberar y de
paso desnaturalizar el ADN, dejándolo listo para la reacción.
 Teóricamente entre más ciclos de reacción integren el programa de amplificación,
más productos idénticos se generaron. Pero al aumentar los ciclos también se
aumenta proporcionalmente la posibilidad de agregar errores en las nuevas
secuencias.
 La PCR ha podido sustituir a muchas técnicas dando mayor especificidad y
sensibilidad. Pero precisamente esto ˙último es su principal problema. Su gran
sensibilidad se ha vuelto en su contra, pues, por pequeña que sea la menor
contaminación de la muestra inicial, puede tener serias consecuencias. Si el ADN
de partida se contamina, se amplificaran también estas contaminaciones.

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 A 20 años de su invención, la PCR se cataloga como la estrella de las herramientas

de la biología molecular.

13. Bibliografía:

 Barrera Saldaña HA. Información genética: estructura, función y manipulación.

Conacyt, Colección Ciencia Básica. México. 1992.

 Barrera Saldaña HA, Ortiz López R, Rojas Martínez A Reséndez Pérez D. Reacción
en cadena de la polimerasa: Una nueva Época dorada en la biología molecular.
Ciencia y Desarrollo, (Conacyt) 1993; 18 (108): 50-60.

 Simpson, C.G.; Sinibaldi, R.; Brown, J.W.S. 1992. Anáisis rápido de la expresión
genética por medio de la PCR. Plant Journal 2: 835-836.

 http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20c
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 http://www.elementos.buap.mx/num23/pdf/16.pdf

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 http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml

 http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa

 Mullis, K.B. 1993. Conferencia con motivo de la recepción del Premio Nobel.
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 McGraw Hill. Animación del proceso de PCR. Disponible en:

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf

 Scanelis. Animación del proceso de PCR. Disponible en:

http://www.scanelis.com/webpages.aspx?rID=679

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