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GUÍA DE LABORATORIO
CURSO: BIOQUÍMICA
Tercera Edición
Segunda reimpresión
Autores:
Mg. Juan Alberto Salazar Sánchez
Bach. Yojani Bereniz Salazar García
Reservados todos los derechos: ningún material de este manual puede ser
reproducido sin autorización expresa por escrita por los autores. La autorización
será en hoja aparte y firmada y adosada a este material. Todo compromiso suscrito
aparte, no se refiere a este manual. Queda exento del compromiso, el fotocopiado
interno en una cantidad no mayor de 100, solo para uso con fines educativos y sin
lucro.
CONTENIDO
Prologo 1
CAPÍTULO 1. Espectrofotometría 7
PROLOGO
Los Autores
c) Eliminación de residuos
Los desechos sólidos, líquidos y las sales solubles, deben ser
depositados en los recipientes indicados por el profesor para
su posterior tratamiento.
Todo desperdicio de papel o residuo sólido debe dirigirse al
respectivo recipiente de basura situados en ambas
paredes laterales de cada Laboratorio
No se debe arrojar residuos sólidos al
lavadero.
c) Extinguidores contraincendios
El alumno debe conocer el uso y la ubicación de los extintores
contra incendios que en caso de emergencia se descolgará
de la pared con cuidado. El extintor, en la parte superior tiene
una palanca circular que se saca (se tira) para activar y se
presiona la manija con la mano derecha y con la mano
izquierda se coge la manguera la cual se orientará hacia la
fuente de peligro.
En el caso de incendiarse la ropa de una persona, se deberá
pedir ayuda inmediatamente, se debe estirar en el piso y
rodar sobre sí mismo para apagar las llamas. No se
recomienda utilizar el extintor sobre el cuerpo o rostro de una
persona.
5. TOMA DE DATOS
Manipular con habilidad, criterio y en forma adecuada los
diferentes materiales de laboratorio.
Desarrollar los experimentos en forma ordenada y con mucha
responsabilidad.
Observar con mucho cuidado los fenómenos que ocurren durante
el desarrollo de los experimentos.
Realizar las mediciones con precisión y efectuar las
anotaciones pertinentes, para obtener resultados satisfactorios
disminuyendo el margen de error. “un error mínimo al principio
puede ser máximo al final” (Aristóteles).
Todo alumno deberá contar con una calculadora personal que
contenga como mínimo funciones de potencia y logaritmo. No se
permitirá usar celulares como calculadora personal.
6. SISTEMA DE EVALUACIÓN
Laboratorio: 35%
RUBRO %
Control de aprendizaje I 10
Control de aprendizaje II 10
Informes 5
CAPÍTULO
1
ESPECTROFOTOMETRÍA
PRÁCTICA N°1
ESPECTROFOTOMETRÍA
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
02 pipeta graduada 10mL
PROCEDIMIENTO
INTRODUCCIÓN
Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para
la determinación de moléculas o elementos constitutivos de los organismos se
encuentra la espectrofotometría, que utiliza la medición de la intensidad de la
luz transmitida y/o absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos
químicos en solución.
I. Objetivos
Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro.
Aplicar la Ley de Lambert – Beer en el empleo del
espectrofotómetro.
Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul de
metileno.
𝐼𝑜
𝐿𝑜𝑔 = 𝜀. 𝐼. 𝑐
𝐼𝑡
Io Luz incidente
It Luz transmitida
ɛ Coeficiente de extensión
Distancia recorrida por la luz a través de
I
la solución
c Concentración del absorbente
Factor de calibración
Se define como la relación que existe entre la concentración
del estándar y su respectiva absorbancia. Este factor puede
obtenerse de la siguiente manera:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
1 2 3 4 5
PRÁCTICA 1
INFORME
ESPECTROFOTOMETRÍA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
2
FACTORES QUE AFECTAN
LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
PRÁCTICA N°2
MATERIALES
01 gradilla
17 tubos de ensayo 13x100mm
01 hígado de pollo (enzima fosfatasa ácida del hígado)
01 termómetro
01 piseta con agua destilada
02 pipetas graduadas o volumétricas 10mL
01 propipeta
PROCEDIMIENTO
Buffer Acetato 0.1M pH 3.6
Para obtener soluciones de buffer acetato 0.1M de pH 3.6 se deberá preparar:
Solución A (Acido acético 0.2M) medir 1,15 ml de ácido acético en una pipeta
de 2 ml. Colocar en una fiola de 100mL y aforar con agua destilada.
Solución B (Acetato de sodio 0.2M) pesar 2.72 g de Acetato de sodio en una
balanza analítica. Colocar en una fiola de 100mL y aforar con agua destilada.
Pepsina al 2%
Pesar 2g de pepsina en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta
completar un volumen de 100mL.
Realizar una dilución de la solución madre de albumina a 3.7x (5.40 ml para cada
20 ml). Verificar con el espectrofotómetro una absorbancia de 1.3
aproximadamente a una longitud de onda de 450 nm.
INTRODUCCIÓN
I. Objetivos
Explicar la actividad enzimática de la pepsina sobre la actividad de
la pepsina.
Explicar el efecto de un factor enzimático sobre la actividad de la
pepsina.
Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para la
albúmina a partir de la gráfica de Vi contra [S].
Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para la
albúmina a partir de la gráfica de dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S].
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua
destilada 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 -
(mL)
HCl 1N
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 -
(mL)
Albúmina
5% (MmL) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 -
Pepsina
2% P/V - - - - - - - - 4
(mL)
Hacer la diferencia:
Actividad Enzimática = Lectura Inicial - Lectura Final
El resultado de ésta diferencia se considerará como Actividad
Enzimática.
PRÁCTICA 2
INFORME
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
3
DETERMINACIÓN DE
ÁCIDO ÚRICO EN SUERO
SANGUÍNEO
PRÁCTICA N°3
Logro de
Determinación del ácido úrico en suero sanguíneo.
aprendizaje:
MATERIALES
01 gradilla
04 tubos de ensayo 13 x 100mm
01 piseta de agua destilada
03 pipetas de 5mL
03 propipetas
PROCEDIMIENTO
INTRODUCCIÓN
I. Objetivos
Determinar el nivel de ácido úrico en el suero sanguíneo,
uricasa
Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoína + H2O2 + CO2
POD roja
2H2O2 + 4 – AF Quinonimina
B x St
VALORES DE REFERENCIA:
Hombres: 2.5 – 6.0 mg/dL
Mujeres: 2.0 – 5.0 mg/dL
PRÁCTICA 3
INFORME
DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SUERO SANGUÍNEO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
4
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
DEL ALMIDÓN
PRÁCTICA N°4
MATERIALES
01 gradilla
03 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
02 pipetas graduadas o volumétricas 5mL
02 pipetas graduadas o volumétricas 10mL
01 propipeta
PROCEDIMIENTO
Tampón Fosfato 0.1M pH 6.5
Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 6.5, se mezcla 68.5mL de
Solución 1 y 31.5mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de
200mL con agua destilada. (Para otro pH y concentración ver el Anexo 1).
Almidón 1%
INTRODUCCIÓN
1 2 3
1 2 3
1 2 3
1 2 3
PRÁCTICA 4
INFORME
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
5
EFECTO DEL AYUNO
SOBRE EL CONTENIDO
HEPÁTICO
PRÁCTICA N°5
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
04 embudos para tubos de ensayo
01 plancha de calentamiento
01 beaker 250mL
03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
03 propipetas
PROCEDIMIENTO
Hígado de roedor
Se deberán solicitar los roedores con 3 días de anticipación a los
colaboradores de veterinaria.
Estándar de glucosa 5mg/dL
En la balanza analítica pesar 0.005g de glucosa (se puede emplear azúcar)
y luego agregar 100mL de agua destilada. Agitar y calentar. Dejar que
disuelva completamente y enfriar.
NOTA: Se debe preparer con al menos 1 día de anticipación.
KOH 30%
En un beaker de 250mL colocar 75g de KOH y luego agregar agua
destilada hasta llenar los 250mL. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
INTRODUCCIÓN
I. Objetivos
Identificar el glucógeno en un hígado en ayunas versus con comida.
1 2 3 4
Disolución de hígado en
1.0 - - -
ayunas (mL)
Disolución de hígado normal
- 1.0 - -
(mL)
Estándar de glucose 5mg/dL
- - 1.0 -
(mL)
Agua destilada (mL) - - - 1.0
PRÁCTICA 5
INFORME
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DEL GLUCÓGENO
HEPÁTICO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
6
CÁLCULO DEL BALANCE
ENERGÉTICO
PRÁCTICA N°6
INTRODUCCIÓN
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasa
pancreática. En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares,
compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lípidos para una eficiente
acción de la lipasa pancreática.
El Balance Energético es el equilibrio que debe existir entre el gasto energético
y diario de un individuo, de acuerdo a su metabolismo basal, edad, sexo,
actividad física y la ingesta energética diaria a través de los macronutrientes de
los alimentos consumidos.
Si predomina el gasto energético sobre la ingesta energética, en un tiempo
prolongado, el individuo tiende a perder sus reservas, y como consecuencia se
adelgaza. Por otro lado, si predomina la ingesta, el exceso de energía se
acumulará en el cuerpo, en forma de triglicéridos, en el tejido adiposo,
observándose un aumento de peso.
Para realizar este balance, es necesario, calcular, en forma independiente, el
gasto energético en las 24 horas de cualquier día rutinario, de acuerdo a la tasa
metabólica basal (TMB) y la actividad física realizada, luego compararlo con la
ingesta energética que proporcionaron los alimentos consumidos el mismo día,
utilizando la Tabla de composición química de los alimentos peruanos y Tabla
auxiliar de alimentos peruanos.
I. Objetivos
Calcular las propias necesidades energéticas (gasto energético)
del alumno
Calcular la ingesta energética del alumno
Determinar el balance energético del alumno
Determinar el % de adecuación de la dieta del alumno
DISPONIBLE EN:
-Tablas Auxiliares para la Formulación y Evaluación de Regímenes Alimentarios (CENAN)
http://www.ins.gob.pe/repositorioaps/0/5/jer/doc_tec_norm/TAFERA_1_compressed.
pdf
- Tablas Peruanas de Composición de Alimentos (CENAN)
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Tabla%20de%20Alimentos.pdf
X = 7.75gr de proteínas
Ejemplo 2:
Ingesta de pulpa de carne vacuno = 90gr
Pulpa de carne vacuno en 100gr contiene 21.3gr de proteínas
Para calcular la cantidad de proteína que existe en 90gr de pulpa
de carne de vacuno:
Pulpa de carne de vacuno en 90gr “x”
Pulpa de carne de vacuno en 100gr 21.3gr de proteínas
X = 19.17gr de proteínas
TABLA DE TRABAJO
Desayuno
SUB – TOTAL
ALMUERZO
SUB – TOTAL
CENA
SUB – TOTAL
MERIENDAS
SUB – TOTAL
FACTOR x4 x9 x4
TOTAL (Kcal)
Ejemplo 1:
𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑖𝑛𝑔𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎
% 𝑑𝑒 𝑎𝑑𝑒𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑥 100
𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎
PRÁCTICA 6
INFORME
CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
7
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
DE LOS LÍPIDOS
PRÁCTICA N°7
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
01 bureta de 25Ml
01 soporte universal con pinza mariposa
PROCEDIMIENTO
Fenolftaleína
Pesar 1.25gr de fenolftaleína y diluir con etanol al 95% hasta un volumen
de 250mL.
Hidróxido de sodio NaOH 0.05N
Pesar 1.9g de NaOH en la balanza analítica, luego agregar agua destilada
hasta completar un volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, la reacción es
exotérmica, es decir que desprende calor).
Es recomendable almacenar en envases de plástico para mayor duración
del reactivo.
Pancreatina al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Pancreatina y luego agregar agua
destilada hasta llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
Sales biliares al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Sales Biliares y luego agregar agua
destilada hasta llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
INTRODUCCIÓN
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasa
pancreática. En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares,
compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lípidos para una eficiente
acción de la lipasa pancreática.
I. Objetivos
Hidrolizar a los lípidos por la lipasa pancreática.
B 1 2 3
B 1 2 3
PRÁCTICA 7
INFORME
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
8
DETERMINACIÓN DE
TRIGLICÉRIDOS Y
COLESTEROL EN SUERO
PRÁCTICA N°8
MATERIALES
01 gradilla
06 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
03 propipetas
PROCEDIMIENTO
INTRODUCCIÓN
I. Objetivos
Determinar el nivel de triglicéridos en suero sanguíneo.
LPL
Triglicérido Ácido graso + Glicerol
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP ADP + Glicerol – 1 – fosfato
GPO
Glicerol – 1 – fosfato + O2 Dihidroxiacetona fosfato + H2O2
POD
2H2O2 + 4 – AF + clorofenol Quinonimia roja
B x St
VALORES DE REFERENCIA:
< 150 mg/dL
PRÁCTICA 8
INFORME
DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
INTRODUCCIÓN
.
El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen una
estrecha relación con diversas patologías, por cuyo motivo su determinación
puede contribuir al diagnóstico de: aterosclerosis, mixedema, diabetes mellitus,
nefrosis, hipertiroidismo, etc.
I. Objetivos
Determinar el nivel de colesterol en suero sanguíneo
Colesterol esterasa
Esteres de colesterol + H2O Colesterol + AGNE
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 Colesten – 3 – ona + H2O
Peroxidasa
2H2O2 + 4 – AF + fenol Quinonimia coloreada + 4 H2O
B x St
PRÁCTICA 8
INFORME
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
9
DETERMINACIÓN DE HDL Y
LDL COLESTEROL EN
PLASMA
PRÁCTICA N°9
MATERIALES
01 gradilla
06 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
03 propipetas
PROCEDIMIENTO
INTRODUCCIÓN
Las LDL y VLDL son precipitadas en forma selectiva con sulfato de dextrano en
presencia de iones magnesio, de tal manera que en el sobrenadante que se
obtiene después de centrifugar, quedan las HDL, donde se realiza la
determinación de colesterol que esta lipoproteína transporta.
I. Objetivos
Determinar el nivel de HDL en plasma.
Determinar el nivel de LDL en plasma.
B x St
Sobrenadante (µL) - 10 -
Estándar de colesterol (µL) - - 10
Reactivo de trabajo HDL
(mL) 1.0 1.0 1.0
Determinación de LDL
Las LDL se precipitan selectivamente con el uso de heparina,
quedando en el sobrenadante las HDL y VLDL. El colesterol que se
encuentran con estas lipoproteínas se determina enzimáticamente,
correspondiendo el valor de las LDL a la diferencia entre el colesterol
total y el determinado en este sobrenadante.
B x St
Sobrenadante (µL) - 10 -
Estándar de colesterol (µL) - - 10
Reactivo de trabajo LDL
(mL) 1.0 1.0 1.0
VALORES DE REFERENCIA
HDL 0,40 - 0,60 g/l
LDL
Riesgo bajo < 1.29 g/l
Riesgo moderado 1.30 – 1.89 g/l
Riesgo muy elevado ≥ 1.90g/l
PRÁCTICA 9
INFORME
DETERMINACIÓN DE HDL Y LDL EN PLASMA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
10
DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS PLASMÁTICA
PRÁCTICA N°10
MATERIALES
01 gradilla
04 tubos de ensayo 13 x 100mm
01 piseta de agua destilada
03 pipetas de 5mL
03 propipetas
PROCEDIMIENTO
INTRODUCCIÓN
Las proteínas plasmáticas cumplen diversas funciones que son muy importantes
para un apropiado funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. Pueden
cumplir cuantitativa es muy útil para el diagnóstico de algunas patologías como:
desnutrición, deshidratación, cirrosis, etc.
I. Objetivos
Determinar el nivel de las proteínas plasmáticas total en el suero
sanguíneo.
Determinar el nivel de albúmina en el suero sanguíneo.
B x St
VALORES DE REFERENCIA:
6.0 – 8.3 g/dL
Determinación de albúmina
La albúmina reacciona con el bromo cresoldulfonftaleína a pH 3.8
formando un compuesto coloreado que absorbe a 625 nm.
Preparar el siguiente sistema:
B x St
VALORES DE REFERENCIA:
3.0 – 5.0 g/dL
PRÁCTICA 10
INFORME
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO
12
DETERMINACIÓN DE
HEMOGLOBINA –
DETERMINACIÓN DE UREA
PRÁCTICA N°12
MATERIALES
01 gradilla
05 tubos de ensayo 13x100mm
01 piseta con agua destilada
01 pipeta volumétrica o graduada 5 mL
01 pipera volumétrica o graduada 10 mL
02 propipetas
PROCEDIMIENTO
INTRODUCCIÓN
I. Objetivos
Determinar el nivel de hemoglobina en sangre.
B x St
Sangre (µL) - 20 -
Estándar de hemoglobina
(µL) - - 20
Reactivo de trabajo (mL) - 5 5
Agua destilada (mL) 5 - -
PRÁCTICA 12
INFORME
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
INTRODUCCIÓN
I. Objetivos
Determinar el nivel de urea en suero.
B x St
B x St
Reactivo 1 (mL) 1 1 1
Reactivo 2 (mL) 1 1 1
PRÁCTICA 12
INFORME
DETERMINACIÓN DE UREA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS