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Las moléculas de la vida: su importancia y tecnologías innovadoras para

estudiarlas

Conference Paper · January 2016

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Robert Winkler
Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute
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 Las moléculas de la vida: su importancia y
tecnologías innovadoras para estudiarlas

Dr. Robert Winkler

Septiembre 26, 2016

Correspondencia: robert.winkler@cinvestav.mx, CINVESTAV Unidad Irapuato, Lab-

oratorio de Análisis Bioquímico e Instrumental (labABI, http://www.ira.cinvestav.mx/
lababi.aspx), Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Km. 9.6 Libramiento
Norte Carr. Irapuato-León 36821 Irapuato, Gto. México Tel.: +52 (462) 623 96 35,
Fax +52 (462) 624 58 46

Palabras clave: espectrometría de masas, biomoléculas, ionización ambiental, gen-

eración de imágenes, minería de datos

Introducción

Las moléculs orgánicas son la base de toda la vida en nuestro planeta. Para su
estudio, existen varios métodos analíticos, siendo la espectrometría de masas una
de las más importantes. El articulo desc ribe la naturaleza de las biomoléculas, la
importancia de su estudio y las estrategias innovadoras que hemos desarrollado en
el Laboratorio de Análisis Bioquímico e Instrumental (labABI) para facilitar su análisis.

1
Biomoléculas

Las moléculas orgánicas son los bloques de construcción de todas las formas de vida
que conocemos. Estos compuestos son químicamente diversos y tienen múltiples
funciones como estructura, movimiento, transporte de energía y comunicación. Hay
moléculas, que el mismo organismo puede producir, y otras que se tienen que
adquirir de la nutrición. Por lo tanto, se llaman “nutrientes esenciales”. Algunas
substancias también tienen Importancia economica, como los fármacos que se
extraen de plantas o microorganismos. Por lo tanto, el perfil de biomoléculas de
un organismo nos da información importante sobre su estado fisiológico o su valor
comercial. Químicamente, los elementos más importantes, que conforman a las
biomoléculas, son carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. Pero
también metales y otros elementos son esenciales para la estructura y la función de
compuestos bioquímicos. Las biomoléculas pueden presentarse como monómeros,
por ejemplo, amino ácidos, nucleótidos y azúcares simples, o como polímeros:
proteínas, ADN y carbohidratos complejos. Por lo tanto, existe una gran diversidad
físico-química de biomoléculas, con respecto a su composición, solubilidad, carga,
peso molecular, tamaño etc.

2
Figura 1. Las biomóleculas componen todos los organismos en la tierra. Aún
formados de pocos elementos simples, existe una diversidad físico-químico
impresionante de compuestos.

La concentración de los compuestos puede variar sobre varias órdenes de magnitud

y frecuentemente existen distintas variaciones de la misma molécula, con diferentes
funciones biológicas (figura 1). Además, el contexto biológico de una biomolécula
tiene un papel importante, es decir, la etapa de desarrollo de un organismo, su
condición ambiental, y el tejido donde se encuentra.

Espectrometría de masas

Un método universal para el análisis de biomoléculas es la espectrometría de masas.

Esta técnica mide las trayectorias de moléculas cargadas, llamados “iones”, en un
campo electromagnético. De esta manera, se pueden investigar diferentes analitos
desde átomos, moléculas biológicas grandes (Fenn, Mann, Meng, Wong, & White-
house, 1989, premio Nobel JB Fenn 2002), hasta virus enteros (Bothner & Siuzdak,
2004) . Por lo tanto, la espectrometría de masas es uno de los métodos analíticos

3
más importantes en las ciencias de la vida y la biotecnología (Siuzdak, 2006).
En figura 2 se muestra un espectrómetro de masas simple, que construimos en el
laboratorio para la medición de gases residuales de los siguientes componentes:

• Entrada de la muestra - Interfaz entre las condiciones ambientales y el sistema

de alto vacío en el analizador.
• Regulador de gas - Control del flujo, que puede entrar al espectro.
• Bomba de vacío - Eliminación de aire atmosférico del analizador.
• Bomba turbomolecular - Generación de alto vacío.
• Fuente de ionización - Conversión de moléculas neutras a iones.
• Analizador - Separación de iones a base de su relación masa/carga (m/z).
• Detector - Amplificación de las señales obtenidas.
• Controlador/ colección de datos - Conexión a una computadora.

Figura 2. Componentes de un espectrómetro de masas sencillo para medir

gases (diseño labABI, 2016).

4
Este análisis requiere condiciones de vacío, por lo cual la preparación de muestras
y la transferencia de moléculas al interior del analizador de masas representa un
reto técnico interesante. En la figura 3 se muestra el resultado del análisis de 3,650
árboles de café (Coffea canephora) con espectrometría de masas. Las diferentes
señales son indicativos para la presencia y la concentración de metabolitos.

Figura 3. Espectro de masas promedio de una población de arboles de café.

Los señales representan compuestos químicos como la cafeína o la clorofila.

Por ejemplo, se pueden identificar cafeína y clorofila. La cafeína es un criterio

importante de la calidad de café. La clorofila, por el otro lado, es necesaria para el
proceso de la fotosíntesis.

5
Innovaciones actuales

Debido al gran potencial de métodos de espectrometría de masas en química, física,

biología y medicina, estamos desarrollado estrategias para el análisis rápido de
muestras biológicas con un mínimo de manipulación de los objetos. A continuación
se presentan algunos ejemplos de tecnologías novedosas que se obtuvieron de
nuestra investigación.

Fenotipéo metabólico de alto rendimiento

Los “fenotipos” se pueden definir como todos los tipos de un organismo, que se
pueden distinguir mediante inspección directa o métodos más finos (Johannsen,
1911). Por ejemplo, fenotipos morfológicos se pueden estudiar por observación visual
o usando un microscopio. Organismos, que presentan diferencias en su metabolismo,
se podrían nombrar “fenotipos metabólicos” y caracterizar con espectrometría de
masas. El metabolismo de un organismo o de un tejido resulta de su genotipo, su
etapa de desarrollo y las condiciones ambientales:

G+E ⇒P
G - Genotipo
E - Condiciones ambientales
P - Fenotipo

Por lo tanto, la medición del perfil químico de una muestra biológica informa sobre
su genotipo y su estado fisiológico (García-Flores et al., 2012, Montero-Vargas et
al. (2013)). Una estrategia de alto rendimiento consiste en la inyección directa de
extractos y un análisis estadístico de múltiples muestras para el agrupamiento de
individuos según su perfil químico. En figura 4 se pueden distinguir dos variedades
de maíz (Zea mays L.), en condiciones óptimas o en condiciones adversas tales
como sequía o baja disponibilidad de nitrógeno. Cada combinación de genotipo y

6
condición ambiental resulta en un fenotipo metabólico particular.

Figura 4. Comparación de plantas de maíz (Zea mays L.) según su perfil

químico. Se pueden diferenciar genotipos y los estados fisiológicos de las
plantas (García-Flores et al., 2012).

Con esta estrategia se pueden analizar miles de muestras en un tiempo corto y con
un costo razonable. Por ejemplo, analizamos una población de cientos de familias de
árboles de café Robusta (Coffea canephora), para estudiar la diversidad metabólica
entre ellas. Con los mismos datos se pueden identificar variedades con un contenido
muy alto o muy bajo de cafeína (Montero-Vargas et al., 2013). Por lo tanto, los
resultados del fenotipeo metabólico se pueden utilizar para la selección de plantas
con propiedades agronómicas deseables.

7
Figura 5. Mejoramiento de la calidad de café mediante selección metabólica.

8
Actualmente, estamos ampliando los estudios sobre perfiles metabólicos de café y
su relación a la calidad sensorial de la bebida (figura 5).
Además, estamos investigando la heredibilidad de metabolitos y su potencial para pre-
decir propiedades como resistencia a plagas y productividad. Pensamos, que el uso
de marcadores metabólicos puede drásticamente acelerar el desarrollo de variedades
de plantas con alto rendimiento agronómico sin usar organismos transgénicos.

Ionización ambiental e “Imaging”

Los métodos convencionales para la preparación de muestras para la espectrometría

de masas requiere varios pasos manuales y tiempo considerable. Por lo cual, desde
hace algunos años se ha hecho una investigación intensa para el análisis directo,
idealmente sin ningúna manipulación de las muestras (Alberici et al., 2010, Shelley
& Hieftje (2011), Domin & Cody (2014)). Para el análisis directo de compuestos
en condiciones ambientales construimos una sonda de ionización mediante plasma
de baja temperatura - LTP por sus signos en Inglés (Martínez-Jarquín & Winkler,
2013b, Martínez-Jarquín & Winkler (2013a), Martinez Jarquin & Winkler (2016)).
Mediante esta tecnología se pueden detectar compuestos químicos de muestras
sólidas, liquidas y de gases.
Recientemente, presentamos una sonda de LTP, que está compuesta de partes
producidas en una impresora 3D (Martínez-Jarquín, Moreno-Pedraza, Guillén-Alonso,
& Winkler, 2016, figura 6). El diseño asistido por computadora (CAD) y la producción
de componentes con polímeros en el laboratorio nos permite el desarrollo rápido de
nuevos prototipos.

9
Figura 6. La fuente de ionizacíon “3D-LTP” se puede modificar en un programa
de CAD e imprimir con una impresora 3D. La sonda permite el análisis directo
de sólidos, líquidos y gases. También se pueden generar imágenes molecu-
lares.

En nuestro modelo el diámetro del rayo de plasma se puede modificar y ajustar

a la aplicación deseada. Usando una punta fina se pueden generar imágenes de
distribución de compuestos en superficies. Notablemente, este análisis no requiere
ninguna preparación previa de la muestra antes de la medición. En la figura 7 B) se
muestra la distribución de un compuesto en un corte de chile Jalapeño (Capsicum
annuum). Para facilitar el reconocimiento de patrones en la abundancia de señales
en un tejido, utilizamos lineas de elevación, que se usan para mapas topográficos
(figura 7 A). Notablemente, la generación de imágenes de masas usando ionización
con LTP permite localizar volátiles y semi- volátiles en tejidos biológicos (Gamboa-
Becerra, Ramírez-Chávez, Molina-Torres, & Winkler, 2015), y por lo tanto, se pueden
encontrar compuestos, que no son visibles con otros métodos.

10
Figura 7. Nuestra sonda de LTP permite la generación de imágenes, que rep-
resentan la distribución de metabolitos en un tejido biológico. Para aumen-
tar la visibilidad de patrones, usamos las lineas de elevación como se usan
en mapas topográficos. A) Mapa topográfico de la zona alrededor del volcán
Popocatepetl. B) Distribución de un metabolito de interés en un corte de chile
Jalapeño (Capsicum annuum).

Procesamiento y minería de datos

Otro aspecto importante es el análisis de los datos. Los datos crudos se tienen que
traducir en información química y después a conocimiento biológico. La figura 8
representa un esquema general del procesamiento de datos de espectrometría de
masas:

1. Importación de datos crudos y conversión de formatos de datos.

2. Procesamiento para reducir/eliminar ruido y detectar señales.
3. Análisis de “Features”, por ejemplo cuantificación de señales con la misma
m/z (relación masa/ carga, representando el peso molecular) y el mismo com-
portamiento (por ejemplo en una cromatografía tienen tiempos de retención

11
 parecidos), que representan los mismos compuestos.
4. Estadística y minería de datos para encontrar diferencias significativas entre
muestras.
5. Creación de modelos biológicos, que son congruentes con los datos experi-
mentales.

Figura 8. La generación de un modelo biológico utilizando datos de espec-

trometría de masas necesita varios pasos de procesamiento.

La “minería de datos” combina la estadística convencional con algoritmos de inteligen-

cia artificial (Williams, 2011). Por ejemplo, el análisis de asociaciones se utiliza en
plataformas de redes sociales y de comercio electrónico. Pero también ayuda en la
búsqueda de variables relacionados en un sistema biológico. Es decir, que se pueden

12
descubrir por ejemplo marcadores de enfermedades, que no son fáciles de encontrar
con métodos clásicos de estadística. Para facilitar el análisis avanzado de datos
de espectrometría de masas, hemos generado un sistema de Linux, que contiene
una colección de programas, que permiten el procesamiento de datos crudos, la
identificación de metabolitos y proteínas, y la minería de datos (Winkler, 2015).
La figura 9 demuestra de manera general la aplicación del método científico según
el filósofo de epistemología (ciencia de la generación de conocimiento) Karl Popper
(Popper, 1959, Winkler (2016)).

Figura 9. El método científico necesita la formulación de una hipótesis (Pop-

per, 1959). El uso de minería de datos ayuda en la creación de modelos pre-
dictivos y el descubrimiento de variable importantes (Winkler, 2016).

Para la generación de modelos con validez universal, el científico tiene que crear
una hipótesis o teoría, pensar sobre posibles consecuencias de esta hipótesis (“de-
dución”) y verificar/ falsear resultados predichos con experimentos, para conocer los
limites de su hipótesis. Una estrategia, que solamente integra datos a un modelo

13
estadísticamente correcto, según Popper, sería invalida. Por otro lado, las estrategias
de minería de datos generan modelos predictivos con un error calculable en rangos
definidos de parámetros. Por consiguiente, estos modelos se pueden aplicar, por
ejemplo en la clasificación de muestras biológicas (Sotelo-Silveira, Chauvin, Marsch-
Martínez, Winkler, & De Folter, 2015).
Algunos algoritmos de minería de datos también calculan variables importantes,
que a veces son soprendentes para los científicos y de esta manera soportan la
generación de nuevas hipótesis.

Conclusiones

El estudio de biomoléculas mediante espectrometría de masas tiene un papel muy

importante en las ciencias de la vida, y permite la investigación de aspectos básicos
en biología, química, física y campos relacionados. Partiendo de preguntas científicas,
se pueden diseñar estrategias experimentales, que dan acceso a conocimientos más
profundos sobre los sistemas biológicos de interés. Nuevas herramientas analíticas
basadas en espectrometría de masas además tienen un potencial importante en
aplicaciones de diagnóstico médico, control de calidad química y agrogenómica.

Agradecimientos

Quiero agradecer la Universidad Tecnológica de Matamoros, Tamaulipas (UTM,

http://www.utmatamoros.edu.mx/), por la invitación al Congreso, a los integrantes
actuales y previos del Laboratorio de Análisis Bioquímico e Instrumental por su
valioso trabajo, especialmente a la Dra. María Teresa Carrillo Rayas por la revisión
del texto, a las empresas Thermo y Waters por su servicio técnico, a Agroindustrias
Unidas de México, al Dr. Oscar González-Ríos del Instituto Tecnológico de Veracruz

14
y Garcomex por la colaboración en proyectos de café, al CONACyT por los fondos de
investigación (proyectos AVANCE 127280, ciencia básica I0017/CB201001/151596,
INNOVATEC PEI 451/2012, FINNOVA I010/260/2014, FRONTERAS 2015-2/814 y
becas de estudiantes de posgrado).

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