RNA DECAY

(Claudia Delli Colli, lezione 30.04)

Ogni qual volta rendiamo l’RNA messaggero più stabile abbiamo problemi nella sua espressione, i
macchinari coinvolti nella stabilità sono coinvolti anche nella degradazione e nel controllo dei trasposoni.

Una volta che l’RNA viene trascritto passa per il nucleo poro e arriva nel citoplasma dove l’RNA messaggero
incontra il complesso formato dalle subunità elF4E (lega il cap ) ed elF4G (interagisce con la PAB sulla coda
di poliA). Il messaggero nel citoplasma assume quindi una componente trascrizionale.

Se vediamo i livelli di messaggero espressi in una cellula. In lievito (figura 1) vediamo sull’asse delle y il
numero di geni e sull’asse delle x il numero di copie: la maggior parte dei geni sono presenti in singole copia
(una copia per gene), alcuni geni sono anche presenti in 100 copie e 1000 copie ma sono pochissimi. Se
andiamo negli eucarioti troviamo la situazione più complessa: abbiamo una media di 10 copie per cellule
quindi vuol dire che dieci copie di un trascritto sono sufficienti a sostenere una trascrizione che avrà un
ruolo importante nella fisiologia cellulare. Se guardiamo le proteine la media delle proteine è 16 mila e
questo significa che da 17 m RNA produciamo 16 mila proteina. Dunque se abbassiamo i livelli di una
singola copia abbiamo un grosso dislivello di produzione di proteine questo perché un messaggero è
tradotto molte volte e su messaggero viaggiano più ribosomi (polisomi) questo fa si che i livelli di m RNA
siano molto importanti ai fini della trascrizione genica.

Quando facciamo una real time o northern blot misuriamo la quantità di RNA che corrisponde a quanto è
trascritto e quanto è degradato ma non sai se quel valore deriva da degradazione o espressione. Per
staccare i fenomeni e capire quando è stabile un m RNA dobbiamo bloccare sempre la trascrizione. Per
bloccare la trascrizione usiamo droghe che bloccano la polimerasi o uso promotore che si può spegnere
come Tet/OF o Gal. Da quanto spengo faccio un time coop 0,1,6 4 12 ore e vedo come variano i livelli di
RNA.

Quando parliamo di degradazione parliamo di un fenomeno con due facce.

2
Una faccia (in giallo, figura2) è quello che avviene a tutti i messaggeri della nostra cellula : degradare è
importante perché se voglio avere fluttuazioni dell’espressione genica cioè variare i livelli di trascritto non
posso avere m RNA sempre stabile. La degradazione è funzionale a variazione trascrizionali: se accumulo
RNA nella cellula per una continua trascrizione non avrei fluttuazioni significative dovute alla traduzione
perché i livelli di m RNA sarebbero sempre alti. Quindi tutti i nostri messaggeri vanno in contro ad il
pathway giallo in cui la degradazione di un messaggero inizia sempre con la de-adenilazione quindi
rimozione della coda di poli A (fatta dalla PAP) è un requisito per iniziare la degradazione. Come vedremo I
micro RNA o M6a de-adenilano il messaggero per destabilizzarlo.

Dopo la de-adenilazione abbiamo diversità tra organismi eucariotici superiori e più semplice ma diciamo
che abbiamo due vie: o avviene degradazione al 3’ o rimozione del cappuccio al 5’ ( azione esonucleasi 5’
 3’). Tutti i messaggeri vanno in contro a degradazione. A questo pathway di default si aggiungo dei
pathway regolativi: esempio quando facciamo RNA interference (RNAi) stiamo degradando un messaggero
attraverso un pathway che non è quello canonico mediate de-adenilazione così come le ARE inducono una
degradazione dal 3’ primo della molecola. Questi pathway alternativi si uniscono a pathway di default.

Enzimi coinvolti in questo processo di degradazione:

1) Deadenilasi: nei mammiferi sono di 3 tipi

a. PAN2/PAN3 (dimero)

b. CCR4/NOT (complesso multiproteico)

c. PARN (unica subunità)

2) Enzimi di decapping:

a. Dcp1/Dcp2 (attività prevalente)

Oltre agli enzimi abbiamo regolatori: proteine che stimolano l’attività di delle de -adenilasi e de-capping.
Poi abbiamo degli enzimi importanti: Esosomi e esonuclasi 5’3’ (Xrn1)

DEADENILAZIONE

Tutte le degradazioni non indotte da meccanismi di controllo qualità iniziano con la de adenilazione.
Abbiamo 3 tipi complessi (figura3): CCR4 (enzima che mangia la coda di poli A) mentre POP2 e NOT sono
proteine accessorie. Mutare POP due è come mutare l’enzima CCR4, quindi non posso discriminarle ma
l’unica che ha attività in vitro è CCR4. Questo complesso è inibito dalla PAB: la PAB sulla poli A non
permette la degradazione. Il secondo complesso è PAN2/PAN3, PAN 2 è l’enzima. Questo complesso è
stimolato dalla PAB (che lega la poli A). Un messaggero in traduzione è chiuso circolarmente, è importante
quindi che un enzima venga stimolato
dall’azione della PAB che in questo caso
permette la degradazione. Ricordiamo che 3
se un messaggero è in traduzione, il
messaggero circolarizza e la PAB lega
elF4G e quindi i messaggeri in traduzione
non hanno la coda di poli A accessibile ,
però quando non è in traduzione la PAB
richiama le PAN. Questo serve a produrre
la degradazione di un messaggero che
sarebbe in stabile infinitamente. Quindi la
PAB protegge durante la traduzione ma è
in grado anche di attivare il complesso PAN. La PARN sono un complesso tipico dei metazoi e sono inibiti
dalla PAB.

Vediamo quello che succede ad un messaggero (figura 4) : abbiamo un messaggero ElF4F che interagisce
con la PAB. Quindi in teoria quando il messaggero è in traduzione è protetto dalla degradazione, quando la
traduzione cale la PAB richiama PAN2/PAN3 che inizia a degradare. A questo punto l’enzima lascia il posto a
CCR4/NOT che è inibito da PAB. Abbiamo di continuo una adenilazione che protegge e stimola. Appena
questo non è tradotto abbiamo CCR4/NOT che
prende il sopravvento che degrada il messaggero 4
(attraverso esosoma in questo caso). Quando
abbiamo un blocco traduzionale, il blocco
traduzionale è quello che da la qualità alla
traduzione: un messaggero nel nucleo non era
buono se non aveva subito splicing. Nel citoplasma il
controllo della qualità avviene a livello della
traduzione. Quindi qualsiasi cosa blocchi la
traduzione induce degradazione specifica del
messaggero.

Dato che la de adenilazione è un fenomeno così

importante molti regolatori dell’espressione genica
agiscono con questo fenomeno. Ad esempio i micro
RNA legano al proteina AGO che lega l’effettore.
AGO lega GW182 che richiama il complesso CCR4.
Quindi i microRNA inducono una de-adenilazione. La
de adenilazione due effetti: 1) calo traduzionale e 2)
aumento dell’instabilità.

Ma anche abbiamo visto le modifiche dell’m6a, cioè

quando io ho un messaggero modificato con l’m6a il
messaggero è intrinsecamente instabile perché
richiama CCR4. Quindi un modo con cui le proteine
rendono instabile un messaggero è quello di
richiamare CCR4/NOT.

Gli effetti non sono mai drastici, cioè abbiamo sempre la PAB : se sono in traduzione grazie alla PAB ho
comunque protezione non abbiamo completo stop della traduzione ma piuttosto un calo della traduzione
ma che è significativo per la sua funzionalità. I micro RNA e l’m6a agiscono in trans.

Nei 3’UTR abbiamo sequenze stabilizzanti/destabilizzanti: AU-RICH ELEMENT (ARE). Trovati in trascritti che
hanno una vita molto breve. Quando spengo la trascrizione e misuro il tempo di espressione del
messaggero il tempo in cui ho la metà dei trascritti rispetto al tempo 0 è l’emivita del messaggero che può
essere di 10, 12 ore a seconda del trascritto, alcuni trascritti hanno emivita molto breve (qualche ora)
perché sono trascritti che traducono per fattori che hanno effetto sul ciclo
cellulare o differenziamento della cellula (cicline, oncogeni). Questi fattori
vanno espressi in archi temporali molto delineati. Gli elementi ARE
caratterizzano messaggeri che sono destabilizzati velocemente. Spesso però
le ARE sono elementi che stabilizzano il messaggero. A determinare se ARE
stabilizza o destabilizza un elemento è dato dalle proteine che le legano.
Abbiamo diverse proteine esempio: famiglia delle proteine HuR/HuA è una
proteina stabilizzante mentre la TTP è una proteina destabilizzante (quando
lega ARE il trascritto ha emivita breve). Quando queste proteine legano ARE richiamano: CCR4/NOT o
PARN. La prima fase della degradazione è la de- adenilazione. Queste proteine legandosi a 3’UTR
richiamano le de adenilasi che richiamano l’esosoma. Se si lega o una o l’altra proteina dipende
dall’espressione relativa da co fattori di richiamo , inoltre dobbiamo considerare la presenza dell’ m6A dei
micro RNA: la stabilità non deve essere vista a comportamenti stagni, dovremmo integrare tutti gli elementi
insieme. Le cose sono collegate.

DECAPPING

Il cap ha un ruolo importante nell’esporto (il recettore dell’esporto dei metazoi TAPP15 interagisce con il
cap) e quindi il cap è importante per esporto e anche per la stabilità e traduzione. Un messaggero con cap
non è come la poli A che di per se non è stabilizzante perché è legata da PAB , il cap invece è un elemento di
per se stabilizzante: grazie a questa modifica l’esonucleasi non può agire. Abbiamo due differenti pathway:
nei mammiferi dopo deadenilazione non abbiamo direttamente un decapping (come in lievito che il
decapping viene sempre dopo la deadenilazione). Questo perché nei metazoi abbiamo la risposta
all’interferone. Quando io ho un virus che infetta la cellula il messaggero virale non presenta capping e
quindi il mio sistema di difesa ha imparato a distinguere i self messaggeri da non self attraverso il cap. Il cap
è quindi un discriminante dell’immunità cellulare. Nei mammiferi il decapping non segue subito la
deadenilazione perché se io rimuovessi subito il cap da tutti i messaggeri non saprei se sono virali o self.
Nei metazoi in cui abbiamo risposta all’interferon dopo la deadenilazione il messaggero viene mangiato
dall’esosoma. L’esosoma comincia a mangia fino ad un pezzetto di pochi nucleotidi e al cap e il cap lega gli
ELF4E, se l’esosoma una volta degradato rilasciasse tutti questi pezzettini nel citoplasma gli ELF4E
verrebbero sequestrati e abbasserebbero la traduzione. Quindi l’esosoma viaggia con un complesso
chiamato DcpS che ha attività di decapping che agisce su questi pezzetti che rimangono per evitare che si
leghino ELF4E (figura6). (figura 6: sinistra in lievito , destra mammiferi).
3’5’ degradation

La cellula ha recettori citoplasmatici contro i virus : TRL3, 9

ecc non incontrano mai gli RNA perché si trovano negli
endosomi ma i recettori MDA5 e RIG-1 sono tutti
citoplasmatici e devono poter discriminare self da non self.
Nei mammiferi è importante che questi recettori non sia
attivati in modo aberrante.

Quando degrado l’esosoma DcpS rimuove il cap che sennò

sarebbe un competitore delle ELF4E. Abbiamo anche un
decapping indotto da effettori LSM-1-7 ma abbiamo anche
decapping indipendenti dalla deadenilazione . In alcuni casi
come quanto ho non sense mediated dacay ( quando ho un codone stop prematuro) UPF1 oltre ad indurre
un taglio endonucleotidico è anche in grado di indurre il decapping così come alcune proteine che legano le
ARE sono in grado di indurre un decapping (figura 7) .

Il complesso principale di decapping è Dcp1/Dcp2. Dcp2 ha il NUDIX domains (dominio catalitico che
rimuove il cap). Nei mammiferi abbiamo altre proteine che presentano questo NUDIX domain che vengono
chiamate Nudt : Nudt 2, Nudt 3, Nudt 12, Nudt 16, Nudt17 e Nudt 19. (non è importante il nome). Alcune
hanno attività di decapping analogo a Dcp 2 , ad esempio, Nudt 16 che rimuove il cap come Dcp2. Poi
abbiamo DcpS che viaggia sempre con l’esosoma che rimuove il cap dai frammenti mangiati dall’esosoma.
Importante è che nei mammiferi abbiamo una marea di enzimi con dominio di decapping quindi , di queste
22 proteine NUDIX solo 7 proteine in vitro hanno attività di decapping. Come si dimostra l’attività di
decapping? TIN LAYER CROMATOGRAFY: abbiamo un pezzo di silice che viene immerso in un liquido che
sala verso l’altro. Solo le molecole leggere (mono o dinucleotidi) sono in grado di risalire la colonna , l’RNA
troppo pesante rimane sotto. Quando stacco il cap questo si sposta verso l’alto e vedrò dei puntini.

La differenza tra questi enzimi è come è rimosso il cap (figura 8)

8 - Dcp2,Nudt16/17/19: staccano il cap e rilascio del monofosfato. Un RNA
che non ha il monofostato non può essere degradata da esonucelasi 5 
3 che per agire sul trascritto necessitano del monofostato. Questi
enzimi de decapping aumentano la degradazione perché favoriscono
l’entrata di esonucleasi 5’3’.

-Nudt 12 e 15: Stacco il cap e lasciano difosfato al 5 non hanno quindi

azione di aumentare la degradazione del trascritto. Questo vuol dire che
questo trascritto potrebbe essere ricappato.

-Alcuni possono rilasciare sia il monofosfato che il difosfato.

Ad oggi non sappiamo la funzione di questi enzimi tranne di Nudt16,

quello che sappiamo è che questi complessi agiscono su RNA diversi.
Ricapitolando noi abbiamo un pathway normale e poi abbiamo proteine
che sono in grado di stimolare la degradazione richiamando o la
deadenilazione e o il decapping. Quando abbiamo un messaggero quanto
sarà stabile o instabile il messaggero , quanto sarà espresso o meno dipende da quanto è modificato
chimicamente (m6a) , quanti micro RNA si legano al 3’-UTR e quanti regolatori del decapping si vanno a
legare. Moltissime proteine sono in grado di stimolare il decapping. Tutti questi sono fattori in trans.
U-TAIL

I messaggeri sono anche regolati da una modifica analoga analogo all’adenilazione che è l’uridilazione (U-
tail). L’uridilazione è fatta da proteine che sono nucleotidil-transferasi come fa ad esempio la PAP che
aggiunge adenine all’estremità 3’. Abbiamo anche altri enzimi chiamati TUTTASI (terminal urydil transferasi:
TUT) che aggiungono U. L’aggiunta della U può avvenire sia nel nucleo che nel citoplasma. I substrati NEL
nucleo non sono i messaggeri mentre nel citoplasma i substrati delle U sono messaggeri.

Nel nucleo abbiamo due tipi di substrati principalmente:

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trasposoni , che sono uridilati per bloccarne la trascrizione e
soprattutto sono uridilati i micro RNA. Alcuni precursori di
microRNA tra cui let-7 (micro RNA oncosopressore). Il
precursore di questo micro RNA, ricordiamoci che siamo nel
nucleo quindi Drosha ha tagliato abbiamo una molecola che
deve essere esportata. Quando questo precursore è legato
da LIN28 questa proteina richiama le TUTTASI e questo
induce uridilazione del mio precursore che non fa esportare il
micro RNA e lo fa degradare. Esiste una esonucleasi che
viene richiamata dall’uridilazione. Quindi l’uridilazione in
questo caso inibisce l’espressione.

In altri casi uridilazione favorisce l’espressione micro RNA.

Per esempio nei micro RNA che hanno un taglio non
canonico , quindi una molecola non perfetta con il 3’ corto o
comunque non perfetto come dovrebbe essere , le TUTTASI
permettono di formare una simmetria che non era presente
in seguito al taglio di Drosha. In questo caso l’uridilazione è
processiva: l’uridilazione permette di formare una simmetria
che non si era formato in seguito al taglio di Dicer o Drosha. Quindi l’uridilazione del micro RNA può essere
contro producente e inibire l’espressione (come per let-7) o favorire l’espressione nei micro RNA che non
hanno un processamento perfetto.

L’ uridilazione nei messaggeri avviene nel citoplasma ed è stata scoperta studiando gli istoni. Gli istoni non
hanno la coda di poli A, ci si è chiesto se non hanno la coda di poli A non possono essere deadenilati e
quindi degradati. Come fa un istone quindi ad essere degradato? L’istone è degradato perché la TUTTASI
ZCCHC11/Tut4 che introduce code di U che sono riconosciute dal complesso Lsm 1- 7 (complesso che
interviene normalmente nelle Pol III che terminano con le U). Negli istoni succede che l’uridilazione
richiama sia il complesso Lsm 1-7 (decapping) sia esonucleasi specifica ERI1 ( 3’5’ esonucleasi che
interagisce con l’mRNA dell’istone e degrada il 3’ stem- loop).

In S.pombe è stata scoperta un’uridilazione nei messaggeri che però hanno coda di poi A (non come istoni)
e quindi alcuni messaggeri nonostante abbiamo la coda di poli A possono essere uridilati. Le due modifiche
non sono alternative.

L’uridilazione è trovata su tanti substrati, non solo sui messaggeri ma in tutti gli RNA cellulari. Se
sequenziassi il 3’ degli RNA attraverso una TAIL SEQ. Nella TAIL SEQ viene preso un adattatore che si lega al
3’ delle molecole. Taglio l’RNA e purifico l’adattatore con la biotina in modo da purificare solo il 3’. Dopo
aver purificato il 3’ posso sequenziare la coda di poli A al 3’ e anche cosa c’è tra la coda di poli A e
l’adattatore. Se faccio questo vedo che TUTTI GLI RNA CELLULARI (messaggeri, micro, sno) POSSONO AVERE
UNA CODA DI URACILE.
DIS3L2 lega gli RNA uridilati

DIS3 era la subunità catalitica dell’esosoma, l’unica subunità con attività catalitica dell’esosoma. DIS3
nell’esosoma è la parte sopra la ciambella, quest’ultima formata dalle 6 Dnasi e da 3 RNA binding proteins.
Nei mammiferi DIS3 si triplica e abbiamo: Dis 3 , Dis3L1 e Dis3L2. Sono tutte e 3 proteine omologhe con un
dominio rnasico ma Dis3L1 e Dis3 sono associate all’esosoma mentre DIS3L2 non è associato all’esosoma.
Per capire o meno se sono associate all’esosoma cosa faccio? Taggo le mie proteine con le FLAG e faccio
FLAG/DISL2, FLAG/DIS3 e FLAG/DIS3L1. Ho quindi transfettato le mie cellule con la proteina flaggata.
Questo si fa sempre quando si vogliono capire gli interattori ,
quindi prendo la proteine flaggata la purifico con un anticorpo 10
anti -FLAG. Successivamente eluisco quello che è legato e faccio
un Western Blot. Se faccio tutto questo con DIS3 vedo che è la
proteina lega RP6 .RP6 è la componente nucleare dell’esosoma.
DIS3L1 lega RP 40 ma non RP6 e questo ci dice che DI3L1 lega
l’esosoma nel citoplasma , DIS3L2 non lega ne RP6 né RP40
(figura 10). Questo esperimento mi dice che esistono 3 diverse
proteine due complessate con l’esosoma e una sola. Inoltre l’esperimento ci dai informazioni sulla posizioni
e sulla funzione perché :

- DIS3 essendo nucleare farà processamento e controllo qualità nucleare.

- DIS3L1 farà degradazione messaggeri perché associato all’esosoma citoplasmatico
- DIS3L2 lega gli RNA uridilati e dovrebbe degradarli

Come dimostro che DIS3L2 lega gli RNA uridilati e li degrada? Mi prendo un RNA non uridilato e un RNA
uridilato ci aggiungo DIS3L2 e vedo quello che succede. Freccia blu: RNA degradato Freccia arancione: RNA
non degradato. Abbiamo un aumento crescente (sinistra destra) della proteina Dis3L2. L’enzima è
stimolato dalla coda di poli U: a parità di concentrazione dell’enzima avremmo più RNA degradato quando
questo è uridilato (figura c). La proteina ricombinante (figura g) non è attiva per niente su substrato non
uridilato ma funziona solo quando il substrato è uridilato.

Ora come abbiamo fatto con TRAMP dobbiamo dimostrare che un substrato uridilato è più degradato da
Di3l2. Come avevamo fatto con il complesso TRAMP , prendiamo un t RNA modificato e uno non modificato
e li avevamo aggiunti al complesso TRAMP. Avevamo visto che il TRAMP adenilava preferenzialmente il t
RNA non modificato. Quindi il modello è ora che DIS3L2 faccia una cosa simile nel citoplasma. Prendo un t
RNA maturo e un t RNA Immaturo (con coda di poli U) . La coda di poli U perché la terminazione Pol III
finisce con l’uracile infatti nell’evoluzione l’uridilazione nasce come meccanismo di qualità per i trascritti Pol
III. Immaginiamo di avere nel citoplasma un t RNA che non viene processato correttamente, questo viene
esportato e una volta esportato non ibriderà un RNA messaggero in modo corretto e quindi il t RNA non
sarà funzionale. A questo punto l’uridilazione richiama Dis3L2 che degraderà il mio t RNA. E infatti un t RNA
 maturo è molto poco degradati da Dis3L2 un t RNA non maturo (uridilato) è molto più degradato (figura
11). Questo complesso (DIS3L2/TUT) di degradazione del t RNA è stato chiamato TRUMP : complesso
analogo al TRAMP nucleare ma che funziona su trascritti uridilati. L’uridilazione infatti può avvenire da
aberrazioni di trascritti Pol III ma anche essere aggiunta dalle TUTASI (TUT).

Se muto DIS3L2 (non muto esosoma) il soggetto avrà la Perlman

11 syndrome: presentano un aumentata produzioni tumori, e
malformazioni facciali. Malattia multifattoriale perché altero
espressione in tutto il mio corpo.

Oltre ai trascritti aberranti che vengono uridilati o anche perché

non sono processati anche i messaggeri sono uridilati. Nei
messaggeri quando la coda di poli A è più corta di 25 adenine (limite
a cui si lega la PAB) viene aggiunta una coda di uracile. L’aggiunta di
uracile aumenta il decay di questo messaggero. Questo perché se io
avessi solo una deadenilazione avrei che la PAB inibisce CCR4/NOT
questo invece è un modo attraverso cui una volta raggiunta una
certa lunghezza critica induco degradazione o attraverso decapping
o attraverso DI3L2 o attraverso esosoma. Quindi esiste al pathway
canonico : Tutti i
trascritti sono anche
uridilati dopo essere stati deacetilati. L’uridilazione avviene
anche su precursori dei micro e permette un controllo qualità
nel citoplasma. L’uridilazione è quindi l’aggiunta di un
nucleotide che richiama attività degradativa come nel TRAMP.

PROCESSING (P) BODIES

La degradazione non avviene a casaccio nel citoplasma ma

all’interno di compartimenti chiamati P BODIES. I P BODIES
non sono organelli, non sono delimitati da una membrana ma
è un aggregazione di proteine. L’aggregazione di proteine è un
fenomeno comune nella cellula, in quanto è un meccanismo di
difesa. L’aggregazione serve a contenere lo stress, esempio
quando stresso la cellula si formano aggregazione di messaggeri uniti a ribosomi (STRESS GRANULI). I P
bodies sono aggregati di messaggeri con componenti proteiche dell’apparato di degradazione e sono
presenti in tutte le cellule. Se prendo una cellula e vado a taggarmi con GFP degli enzimi coinvolti nel
decapping si osservano dei puntini che corrispondono ad aggregati di questa proteina di degradazione
(figura 13 A -I). Se vado a fare la stessa con l’esosoma osservo che la proteina è in tutto il citoplasma se ,
invece lo faccio con gli enzimi di decapping osservo che sono aggregati (puntini) .

Se inibisco il decapping, per esempio in questo caso (in verde figura 14) muto gli enzimi del decapping e
vado poi a vedere l’espressione di un componente del decapping. Quindi taggo GFP-DHH1 e poi vado a
mutarmi le componenti del decapping oppure l’esonucleasi 5’3’. Quello che succede è che quando muto
le componenti del decapping aumento in volume e numero dei P bodies. Questo vuol dire che i P bodies
sono aggregati di proteine coinvolte nel decapping. Purificando i P bodies troviamo dentro tutti enzimi
del decapping (Dcp1/Dcp2, Lsm 1-7, Xrn1, CCR4) ma anche per esempio microRNA e le proteine associate
come ARGONAUTA, enzimi che fanno l’NMD (nonsense- mediated decay ).Vuol dire che quando io sto
inducendo una degradazione favorisco l’aggregazione dei messaggeri e di queste proteine di degradazione
che formano del P bodies. Perché è vantaggioso avere dei P bodies?

.
14 13

Perché è vantaggioso avere dei P bodies? Inoltre non abbiamo dimostrano che c’è l’RNA dentro.

Osservo l’azione della traduzione su P bodies, ovvero la formazione di questi aggregati è alternativo alla
traduzione? e quindi se non traduco aumento i P bodies? Blocco la traduzione in yeast togliendo glucosio e
osservo che aumentano i P bodies. E quindi levando la traduzione aumento il messaggero nel p bodies.
Se blocco invece il messaggero sul ribosoma? Cosa succede? Per studiare questo congelo il ribosoma sul
messaggero (lo faccio con la cicloesammide che blocca il messaggero in traduzione). In questo caso i P
bodies spariscono. Quindi se blocco la traduzione il messaggero non può essere più mandato al P bodies.

Il vantaggio è che il messaggero può uscire ed entrare nei P bodies. Per esempio la mia traduzione per
qualche motivo non va bene, quel messaggero in traduzione sarebbe direttamente degradato e se io poi lo
devessi esprimere un’altra volta dovrei di nuovo trascrivere, maturarlo, metterlo sui ribosomi, perdendo
tempo ed energia. Quindi il messaggero non in traduzione viene inserito nei P bodies e in questi non viene
direttamente degradato (ha un tempo per cui la degradazione è rallentata, questo tempo si chiama
buffering). Se avrò di nuovo bisogno del messaggero in traduzione lo sposto dai P bodies al citoplasma dove
potrà essere tradotto se, invece, rimane nel P bodies viene degradato (ogni messaggero ha un tempo entro
il quale viene degradato). Voglio dimostrare il passaggio da dentro a fuori il P bodies dei messaggero,
dobbiamo fare 2 cose: seguire il messaggero nella cellula e seguirne la traduzione.

1)Seguiamo messaggero nella cellula: ho poche copie di messaggero per cellula e quindi non posso fare la
FISH . Quindi un metodo più smart è una marcatura indiretta: prendo un RNA binding proteins che lega una
sequenza su un messaggero e alla RNA binding proteins lego la GFP. Per distinguere la GFP nuda da quelle
legata al RNA, metto la GFP in LMS in modo tale che la GFP una volta tradotta andrà nel nucleo, dove
legherà l’RNA messaggero. Con un microscopio particolare poi posso escludere il segnale dal nucleo ed
osservare solo quello nel citoplasma. NB non mi interessa un messaggero in particolare ma solo un
messaggero che può essere tradotto.

2) Seguiamo la traduzione attraverso un gradiente di polisomi.

Prendo l’estratto , lo centrifugo e separo per sedimentazione i polisomi e avrò libere le subunità 40s, 60s e
80s e tutti i polisomi. Ogni picco coincide con tot di ribosomi che traducono (freccia verde). Ho quindi una
cellula normalissima che prolifera con glucosio: traduce benissimo (prima colonna) e infatti la maggior
parte dei messaggeri si trova a destra ovvero in traduzione (cerchio verde).

A questo punto estraggo l’RNA e mi faccio un Northern Blot e vedo dove sta il mio messaggero. Una parte è
in traduzione (cerchio verde) e una parte no. Osservo il mio GFP: abbiamo Dcp2 (enzima di decapping)
localizzato nei P bodies e abbiamo PGK-1 e MAFA2P che sono due reporter uno meno stabile e uno più
stabile (differiscono per la stabilità dei loro messaggeri) : MAFA2P è più stabile perché è più accumulato
rispetto a PGK-1.

Il concetto generale è che quando un messaggero traduce questo sta un pochino nei P bodies e un pochino
in traduzione.

Spengo la traduzione togliendo glucosio (seconda colonna): i miei ribosomi cascano (freccia rossa) e il mio
messaggero si sposta verso sinistra , quindi non sono tradotti (cerchio rosso). Andando ad osservare la
fluorescenza osservo un aumento del messaggero all’interno dei P bodies (che prima non c’era). Correlo
quindi il movimento dei messaggeri dai ribosomi ai P bodies. Tolgo lo zucchero solo per 10 in modo che il
plasmide non venga degradato. Ridò subito glucosio (terza colonna) e vedo che i miei ribosomi tornano
quasi alla condizione inziale (freccia blu) : il mio messaggero torna dai P bodies ai ribosomi (cerchio blu).

Ho dimostrato con questo esperimento che i P bodies serve a rallentare la degradazione e in caso a
riutilizzare i messaggeri. Se non avessi avuto i P bodies avremmo dovuto ritrascrivere i messaggeri. Il
messaggero in traduzione non è in equilibrio con la degradazione ma è in equilibrio con i P bodies: il
messaggero quando non è tradotto non viene subito degradato ma viene aggregato con queste proteine
che fanno i P bodies. Tutti enzimi coinvolti nella degradazione sono quindi in grado di auto aggregarsi grazie
ad enzimi di interazione. Questa capacità di aggregazione può in alcune condizioni essere patologico.

Bisogna considerare un altro vantaggio: la cellula non ha una coordinazione efficiente tra espressione di
messaggeri e ribosomi , in condizioni ipotetiche dovrei avere tanti messaggeri quanti ribosomi. In condizioni
normali dovrei avere un equilibrio perfetto tra P bodies e messaggero. Se io però ho un eccesso di RNA
rispetto i ribosomi ,cosa che succede normalmente, farei tanti messaggeri che poi vengono degradati. Ma
se io aggrego i messaggeri ho tempo di aumentare i ribosomi e di permettere ai messaggeri di essere
tradotti. Stesso concetto se ho pochi ribosomi e tanto RNA. Quindi avere questo fenomeno è molto
importante anche se in alcuni casi è contro producente. Abbiamo altre aggregazioni che non sono
fisiologiche come i P bodies: se tolgo ad esempio glucosio al lievito per più di 10 minuti induco uno stress.
Durante lo stress abbiamo gli stress granuli.