Introducción

En la década de 1880, en un hospital de Berlín trabajó el médico danés Hans

Christian Gram (figura 1), quien desarrolló la más importante tinción

bacteriológica. Él desarrolló una técnica de tinción en la cual observaba

bacterias en tejidos de pulmones de pacientes que morían de neumonía. El

procedimiento que desarrolló, ahora llamado tinción de Gram, demostró dos

categorías generales de bacterias que causaban neumonía: algunas se teñían

de violeta y otras se teñían de rojo. Las bacterias teñidas de azul fueron

conocidas como Gram positivas, y las teñidas de rojo como Gram negativas.

Pero fue hasta 1963 cuando M.R.J. Salton explicó el mecanismo de

diferenciación de la técnica de Gram.

Tinción de Gram: mecanismo y usos

La tinción de Gram diferencia a las bacterias en dos grandes grupos. Se

llama bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul-

violeta, y se denomina bacterias Gram negativas a las que se decoloran y

después se tiñen con safranina. Esta diferencia de tinciones se debe a la

estructura de las paredes celulares de ambos tipos de bacterias (tabla 1).

Tabla 1. Diferencias entre bacterias Gram positivas y Gram negativas

Las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa compuesta de

peptidoglucanos y polímeros, e impermeable, que hace que resista la

decoloración. En cambio, las bacterias Gram negativas tienen una capa

delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se puede

deshacer con la decoloración. La tinción de Gram puede proporcionar

información rápida para diagnósticos de infecciones, puede revelar los

agentes causales incluso con una toma de muestra no adecuada. También

hace posible distinguir entre contaminación de la muestra y una verdadera

infección. Puede ayudar al clínico a seguir o cambiar un tratamiento

antibiótico inicial antes de los resultados del cultivo, y en algunos casos, es

capaz de mostrar la necesidad de una atención médica urgente. Actualmente

la tinción de Gram sigue siendo un método eficaz e importante en el

laboratorio, además de que es rápido y económico, por lo que se debe

estandarizar para evitar errores técnicos o de interpretación.

Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han propuesto varias

hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los
microorganismos.

Aquí puedes ver las diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de
pared bacteriana:

Pared Gram +
capa densa y uniforme de 200 a 800
A)

ácidos teicoicos

polisacáridos

proteínas (pocas veces)

glicopéptido (50% del peso seco)

Pared Gram -
 capa interna delgada de 20 a 30 A
cubierta por capas externas de
densidad menor)

lipopolisacáridos

lipoproteínas

proteínas

glicopéptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tinción Gram es la reseñado en el siguiente

esquema:

Productos
que se
Reacción y coloración de las bacterias
utilizan

GRAM +
1) Cristal Células color violeta
violeta
2) Lugol Se forma el complejo CV-I.
solución Las células continúan
iodada teñidas de color violeta.
3) Alcohol Se deshidratan las paredes
celulares. Se contraen los
poros. Disminuye la
permeabilidad. El complejo
CV-I no sale de las células
que continúan teñidas de
color violeta.
4) Safranina Células no decoloradas;
quedan teñidas de color
violeta.
GRAM -
Células color violeta
Se forma el complejo CV-I.
Las células continúan
teñidas de color violeta.
Eliminación por extracción
de grasas de las paredes
celulares. Aumenta la
porosidad. El complejo CV-I
se separa de la célula.
Células decoloradas; se
tiñen de color rosado.
 Material necesario:

Cultivo de bacterias, levaduras, vino agriado.

Antibióticos.
Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada).
Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potásico en 100 cc de agua
destilada). Fucsina básica (1 g de fucsina básica en 100 cc de agua
destilada).
Aceite de inmersión.
Microscopio
Portaobjetos, asas de cultivo, mechero, cápsulas de Petri, tubos de
ensayo. Papel secante.

Procedimiento

 Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un

cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.

 Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos

con el asa de siembra. Dejar secar.
 Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el
portaobjetos.

 Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.

 Lavar el exceso de colorante con agua.

 Añadir el mordiente lugol, solución de yodo-ioduro potásico, durante 1

minuto.

 Lavar el exceso de mordiente con agua.

 Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación,

durante 30 segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado
correcto).

 Lavar inmediatamente con abundante agua.

 Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.

 Lavar el exceso de colorante con agua.

 Dejar secar al aire.

 Añadir una gota de aceite de inmersión.

 Observar con objetivo de inmersión (100 x).

2.1.2 Coloración:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una
gota muy pequeña de aceite de cedro y observar al microscopio
con el objetivo de inmersión.

2.2. Observación

Debe utilizarse el
objetivo de
inmersión.
Se coloca una
gota de aceite de
cedro sobre la
preparación. Se
enfoca,
preferentemente,
con el
micrométrico.
Bacterias resistentes a la tinción de Gram
Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se tiñen como gram
negativas:

 Mycobacterias (están encapsuladas).

 Mycoplasmas (no tienen pared).
 Formas L (pérdida ocasional de la pared).
 Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared,
respectivamente).

Utilidades
En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por
cumplir varias funciones:

 Identificación preliminar de la bacteria causal de una infección.

 Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los
morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben
de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los
cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las
aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así
como la atmósfera de incubación.
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos
distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados
después de la división celular (micrococos), aparecer por pares (diplococos),
formar cadenas (estreptococos), o agruparse de manera irregular
(estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de

cadena (estreptobacilos) o en empalizada.

También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos (si

son de forma rígida) o espiroquetas (si son blandas y onduladas). Si por el
contrario, poseen forma de «coma» (o curvados) entonces se los designa
vibrios.

Utilidad en el diagnostico presuntivo

Las características fenotípicas que presentan algunas bacterias contribuyen
a su diagnóstico presuntivo:
 La observación de cocos Grampositivos dispuestos en racimos sugieren la
presencia de estafilococos.
 La disposición de cocos Grampositivos en cadena indica estreptococos.
 Diplococos Grampositivos en forma de lanceta o con extremos alargados
son característicos de S. pneumoniae cuando se observan en esputos.
 Diplococos Gram negativos arriñonados o reniformes son característicos
de las especies de Neisseria.
 Bacilos Grampositivos ordenados en letras chinas o empalizadas son típicos
del Corynebacterim
Factores que alteran la tinción de Gram
  Edad de la bacteria.
 Errores del operador.
 Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser

valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las
células (cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de
peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (al
decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que
bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas). Por esta situación,
junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas
(por ejemplo Staphylococcus aureus) y gram negativas (por ejemplo,
Escherichia coli).