INMUNOPRECIPITACIÓN

La base de esta técnica consiste en concentrar al máximo la proteína de

interés para posteriormente desarrollar el immunoblotting, de tal forma que el número
de bandas inespecíficas obtenidas por esta técnica disminuye considerablemente.
En el tejido homogeneizado vamos a tener el antígeno de interés mezclado
con otros muchos. Para poder concentrarlo, primero se añade el anticuerpo primario a
una concentración saturante, para que todo el antígeno presente en el tejido se una
al anticuerpo (fase de inmunoabsorción). Después de la incubación con el anticuerpo
primario se realiza una segunda fase en la que se añade proteína G, que está unida a
sefarosa. La proteína G es una proteína de la pared celular de Streptococcus que une
la fracción constante (Fc) de las inmunoglobulinas G (IgG) con gran afinidad. Además
del receptor para la Fc, también tiene sitios de unión específicos para la albúmina y
para la fracción ab (Fab) de las inmunoglobulinas. La proteína G está unida a la
sefarosa a través del extremo amino terminal y el grupo ε-amino de la lisina. La sefarosa
confiere un carácter insoluble al complejo proteína G/sefarosa, con lo que resulta fácil
separarlos por centrifugación.

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 Y Anticuerpo primario

Proteína G conjugada
con sefarosa

Inmunoabsorción

Y Y Y
Y
Y Y Y
Y
Y YY
Y Y Y
Y Y
Y Y Y Y
Y Y Y
Y Y YY Y
Y
Y Y Y
Y
Y
Proteína
Centrifugación
G/sefarosa

2

Lavado de la proteína G1: (Protein G Sepharose®, Fast Flow Streptococcus sp.
Sigma: P-3296)

1. Lavar el conjugado de agarosa dos veces en tampón de lavado (Hepes 20

mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 0,1%, glicerol al 10%) centrifugando
durante diez minutos a 12000 rpm a RT. Descartar el sobrenadante.
2. Resuspender el conjundo en tampón de lavado para que quede una
suspensión de agarosa del 50% del volumen total.

Incubación con el anticuerpo primario:

1. Calcular la cantidad de tejido necesaria para tener, en un volumen final de 100

µl, un total de 750 µg de proteína. Llevar a 100 µl con tampón de
homogeneización.
2. Añadir 5 µl de anticuerpo primario e incubar durante una hora a 4 ºC en
agitación orbital.
3. Añadir 20 µl de suspensión de agarosa (10 µl de agarosa/vol) e incubar en
agitación orbital durante toda la noche.

Lavado de los complejos de proteína G:

1. Centrifugar las muestras 1 min a 13000 rpm.

2. Descartar el sobrenadante y añadir al precipitado 1 ml de buffer I.
3. Agitar y girar a 4 ºC durante 20 min.
4. Centrifugar 1 min a 13000 rpm. Volver a añadir buffer I e incubar de nuevo 20
min.
5. Repetir el mismo proceso con el buffer II.
6. Repetir con el buffer III
7. Centrifugar 1 min a 13000 rpm. Descartar el sobrenadante, limpiando bien.
8. Añadir 15 µl de tampón de carga y calentar a 99ºC durante 5 min.
9. Centrifugar 1 min a 13000 rpm.
10. Recoger el sobrenadante y pasar a un tubo limpio. Puede cargarse
directamente en una PAGE o bien congelarse a –20ºC.

1
Existen casas comerciales, como por ejemplo Santa Cruz (sc-2002), que venden la proteína G para uso
directo, sin necesidad de lavarla previamente.

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REACTIVOS:

Buffer I:
- 10 ml de Core buffer: 7,35 g Trizma base, pH 7,4, para 100ml.
- 7,5 ml NaCl.
- 5 ml detergente mix: 0,29 g Trizma base, 10 ml NP-40, 5 mg de Na-
deoxycholate, para 100 ml.
- 26,5 ml de agua (hasta 50 ml).
- 50 µl Na3VO4 1 M (en el momento de uso).

Buffer II:
- 10 ml de Core buffer.
- 25 ml de NaCl.
- 0,5 ml de detergente mix.
- 14,5 ml de agua (hasta 50 ml).
- 25 µl Na3VO4 1 M (en el momento de uso).

Buffer III:
- 1 ml de Core buffer.
- 0,25 ml de detergente mix.
- Agua hasta 50 ml.
- 25 µl Na3VO4 1 M (en el momento de uso).