Modificação genética - CRISPR/Cas9
Universidade de Coimbra – Departamento de Ciências da Vida
Genética
Figueiredo, B.*, Rafael, L.**, Silveira, R.*** , Simões, R. ****
*
Licenciatura Bioquímica UC – 2017265878; ** Licenciatura Bioquímica UC – 2017248616;*** Licenciatura Bioquímica UC – 2017267290;
****
Licenciatura Bioquímica UC – 2017250952
Abstract- O sistema CRISPR são Repetições Palindrômicas
Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas. A sua estrutura
e função revela bastante importância em técnicas de edição
genómica. O CRISPR é frequentemente usado como um termo
geral para se referir à edição genômica, mas é o acoplamento do
CRISPR e do sistema Cas9 que permite a deleção seletiva do DNA
Index Terms- CRISPR; Cas9; Genoma; Edição Génica; Ética
I. INTRODUCTION
T écnicas de engenharia genética são capazes de inserir, excluir,
modificar ou substituir o genoma de um organismo vivo. Ao
contrário das técnicas iniciais de engenharia genética que inserem
aleatoriamente material genético em um genoma hospedeiro, a
edição do genoma direciona as inserções para locais específicos
do locus.
O sistema CRISPR são Repetições Palindrômicas Curtas
Agrupadas e Regularmente Interespaçadas. Consistem em
pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de
nucleotídeos.
A transcrição do locus CRISPR resulta em pequenos
fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o
reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um
guia de modo a orientar a nuclease Cas, que irá promover a
clivagem e consequente eliminação do DNA invasor caso este
entre novamente em contato com a bactéria, atuando como
importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores.
Existem outros métodos de edição génica, tais como
Recombinação Homóloga (comumente empregada na
manipulação genica de células-tronco), Nucleases Dedos de Zinco
(ZFN, do inglês Zinc Fingers Nucleases) e Nucleases Efetoras
semelhantes à Ativadores de Transcrição (TALENs, do inglês
Transcription Activator–like Effector Nucleases). As duas últimas
requerem o reconhecimento em ambas as fitas de DNA para que a
clivagem promovida por nucleases sintetizadas especificamente
para tais metodologias seja bem sucedida, o que nos permite
considerar tais métodos menos práticos e simpes, quando
comparados ao sistema CRISPR.
Atualmente encontra-se disponível um gRNA (RNA guia) que
consiste na construção de uma molécula de RNA desenvolvida
biotecnologicamente, com a capacidade de mimetizar o que ocorre
naturalmente em bactérias, e desta forma, promover o
direcionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo
específica para que esta promova a clivagem e a sequência de
interesse tornando esta disponível para atuação da maquinaria de
reparo da célula e assim, promover a edição da porção de interesse
presente no genoma alvo. Tais fundamentos permitem-nos
considerar o sistema CRISPR (CRISPR/Cas) uma técnica rápida,
com relativa facilidade de manipulação e baixo custo quando
comparada a técnicas anteriores.
Para determinar as funções de genes específicos ou
elementos não codificantes como microRNAs (miRNAs), os
pesquisadores inativavam seletivamente e avaliam as
consequências fenotípicas em células ou organismos inteiros
Pequenos RNAs interferentes (siRNAs) têm sido
amplamente utilizados para estudar as funções dos genes; no
entanto, o knockdown de genes por siRNAs geralmente é
incompleto e inespecífico
Técnicas de Nucleases Programáveis
As nucleases são ferramentas de edição genética muito
importantes pelo facto de clivarem locais específicos do DNA.
Existem várias nucleases utilizadas na edição genética, com
destaque para as zinc-finger nucleases (ZFNs), as RNA-guided
engineered nucleases (RGENs) e as Transcription activator-like
effector nucleass (TALENs).
O princípio base e destas nucleases é a clivagem do DNA,
num local específico, criando uma quebra na cadeia dupla de
DNA. Esta quebra poderá então ser reparada por procesoss de
recombinação homologa ou não homologa.
Através de um processo de reparação homologa (HDR –
homology-directed-repair)), e na presença de uma pequena
sequênca nucleotidica dadora, poderá ocorrer a inserção de uma
pequena sequência, de apenas um par de bases ou até mesmo um
único nucleótido.
Utilizando um mecanismo de reparação não homologa
(NHEJ -error-prone non-homologous end-joining), não é
necessária uma sequência de nucleótidos dadora para realizar
pequenas inserções ou eliminações de pares de bases.
O mecanismo de corte e edição de genes por meio de
nucleases é apresentado na Figura 1.
 Figura 1 - Mecanismo de corte e edição de genes por meio de nucleases. [1]
Quando duas nucleases clivam um cromossoma, geram-
se duas quebras na cadeia dupla de DNA e, por mecanismos de
reparação de DNA, a região flanqueada poderá ser eliminada ou
invertida.
Quando duas nucleases clivam dois cromossomas
diferentes, pelos mesmos mecanismos, poderão ocorrer
translocações cromossómicas, ou seja, ocorre um re-arranjo entre
regiões de cromossomas não homólogos.
Figura 2 - Clivagem de um cromossoma por duas nucleases (1)1 Clivagem
de dois cromossomas diferentes, por duas nucleases [1]1
Zinc Fingers Nucleases (ZFN´s)
Figura 3 - Figura 1. Modelo de estrutura de ZFN´s [2]
São um grupo de nucleases baseadas em fatores de
transcrição eucariotas. Têm a capacidade de reconhecer os locais
específicos na sequência de DNA através de interações proteína –
DNA. Estes locais específicos são ricos em guaninas,
normalmente sequências 5´-GNN-3´. A sua estrutura contém um
domínio de proteína de dedo de zinco (ZFP) de ligação ao DNA e
um domínio de nuclease derivado da enzima de restrição (Fokl).
A ação da nuclease de Zinc fingers está dependente da ação de
zinc fingers adjacentes, nomeadamente da sua conformação. A
especificidade da ligação ao DNA pode ser alterada por
mutagénese, caraterística fundamental de uma nuclease
programável. Todo o redireccionamento de zinc fingers requer
processos laboratoriais de desenho e ressíntese de proteínas com
capacidade para indicar as nucleases para o local específico. [x]
Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)
À semelhança das nucleases zinc fingers, as TALENs
têm a capacidade de reconhecer os locais específicos na sequência
de DNA através de interações proteína – DNA e graças ao seu
módulo com capacidade para reconhecer um nucleótido. A sua
estrutura é constituída por um domínio da FokI no seu C-terminal
e por um domínio de ligação ao DNA – efetores de ativação de
transcrição (TALEs). As TALEs são compostas por 33-35
aminoácidos, sendo que cada matriz reconhece um único par de
bases do sulco principal. A especificidade nucleotídica de cada
domínio de repetição é determinada pelos 2 aminoácidos das
posições 12 e 13, denominados de diresíduos variáveis repetitivos
(RVD´s). As combinações são as seguintes:
- Asparagina – Asparagina corresponde a uma guanina
- Asparagina – Isoleucina corresponde a uma adenina
- Histidina – Aspartato corresponde a uma citosina
- Asparagina – Glicina corresponde a uma timina
Os TALENs podem ser formados através de métodos de
montagem em fase sólida ou por uma clonagem independente de
ligação. TALEN´s podem ser direcionados para qualquer
sequência de DNA, sendo que a única limitação é a exigência de
uma timina na extremidade 5´da sequência – alvo, que é
reconhecida por 2 dobras de repetição criptográfica amino –
terminal.
RNA-guided engineered nucleases (RGEN´s)
Tratam-se de sistemas de clivagem de DNA ligados por
RNA que fornecem imunidade adaptativa contra fagos ou
plasmídeos invasores. Têm a capacidade para capturar
protospacers – pequenos fragmentos de DNA estranho – de fagos
ou plasmídeos invasores com 20 pares de bases e inseri-los no seu
genoma de modo a constituir um sistema CRISP. Uma vantagem
deste sistema é o seu fácil desenho e preparação, sendo preparados
por clonagem da sequência de DNA guia. Os locais de destino
RGEN são direcionados para zonas que contenham a sequência
PAM que é reconhecida pelo Cas9.
Crispr/ CAS 9 [3]
O sistema CRISPR/Cas 9 é uma ferramenta
personalizável que permite cortar e inserir pequenos pedaços de
DNA em áreas precisas ao longo de uma cadeia de DNA. CRISPR
significa repetições palindrómicas curtas agrupadas e
regularmente Interespaçadas, enquanto a Cas 9 é proteína 9
associada a CRISPR.
Assim, o sistema CRISPR/Cas 9 do tipo II é um
mecanismo de defesa contra elementos genéticos invasores.
Consiste numa ferramenta de edição do genoma que consiste 2
componentes, uma de transcrição do locus CRISPR, que resulta
em curtos fragmentos de RNA com capacidade de reconhecer
DNA exógeno específico e atuar como guia e, uma proteína Cas
9, que cliva o DNA nesse local.
De forma simples o sistema CRISPR/Cas 9 funciona da
seguinte forma: em primeiro lugar, o locus vai ser transcrito num
pré-crRNA; em segundo lugar, as cadeias repetidas do crRNA
sofrem uma hibridização com um segundo RNA não codificante –
(trans activating Crispr RNA) tracrRNA – formando uma dupla
cadeia de RNA; o terceiro passo consiste na maturação da dupla
cadeia de RNA pela host factor ribonuclease III; o quarto passo
consiste na dupla cadeia de RNA maturada associar-se com
nuclease Cas 9, formando um complexo responsável pelo
reconhecimento e destruição do DNA invasor; por fim, o quinto
passo trata-se do domínio HNH cliva a cadeia complementar e o
domínio RuvC cliva a cadeia não complementar, o que provoca
um duplo corte na dupla cadeia de DNA. Isto só acontece, caso a
sequência alvo se encontre na região adjacente a uma pequena
sequência conhecida como o protospacer adjacente motif(PAM).
Tratamento de patologias com recurso à CRISPR/Cas9 [4]
• Doenças sanguíneas: β- Talassémia
São um grupo de doenças hereditárias do sangue causada
por uma mutação ao nível do HBB gene no cromossoma 11, gene
esse que codifica a hemoglobina Beta, reduzindo a sua produção e
causando anemia.
O sistema CRISPR/Cas9 foi estudado com o objetivo de
ser utilizado para combater esta doença, transfetando iPSCs
(células tronco pluripotentes induzidas, ou seja, células que são
geradas diretamente das células adultas que possuem a
característica de pluripotência), produzidas a partir de fibroblastos
de um doente homozigótico de β- Talassémia, com vetores que
possuem o sistema CRISPR/Cas9 direcionado para o alelo alvo e
DNA molde para que ocorresse recombinação homóloga. De
seguida, as células onde ocorreu essa recombinação foram usadas
em transplantação, sendo que antes disso foram diferenciadas em
células precursoras dos glóbulos vermelhos. [6]
• Vírus da Imunodeficiência Humana
O vírus HIV integra o genoma do hospedeiro para
sempre, sendo que a sua fase de latência ocorre nos linfócitos T de
memória. Desta forma, uma das estratégias utilizadas para
combater esta infeção foi a destruição da região LTR (Long
terminal repeats) do genoma do vírus, conservada em linfócitos T.
Esta destruição ocorreu com o auxílio do sistema CRISPR/Cas9
que foi direcionado para essa região do vírus, levando a
diminuição da carga viral e da eliminação do vírus latente.
No estudo realizado, demonstrou-se ainda que IPSCs
com vetores que possuem o CRISPR/Cas9 contra LTR e
posteriormente diferenciados em linfócitos T mostraram-se
resistentes ao vírus HIV. [6]
• Cancro do Pulmão
O cancro provém de alterações genéticas e epigenéticas
que iram ativar oncogenes ou inativar genes supressores de
tumores. Desta forma, uma das formas alternativas recentemente
estudada para combater/corrigir essas mutações genéticas em
genes específicos passa pelo recurso ao sistema CRISPR/Cas9
com o objetivo de criar uma imunidade adaptativa que possibilita
o combate dos mecanismos de carcinogenicidade.
No cancro do pulmão, o sistema pode atuar de diversas
maneiras, sendo que uma delas está relacionada com a regulação
dos oncogenes Ras. A carcinogenicidade pode ser suprimida por
proto oncogenes Ras uma vez que o alelo selvagem tem baixa
correspondência/relação a genes Ras com mutações. [6]
Ética e ciência
Eticamente, o CRISPR continua a dividir opiniões, sendo
que a utilização, ou não utilização desta técnica, ou até os limites
da CRISPR são alvo de uma grande discussão na comunidade
científica e também na comunidade em geral. Existem
argumentos a favor da CRISPR e na utilização de todo o seu
potencial na área da biomedicinda, especialmente, e existe ainda
um pensamento mais cético em relação a este tema. Em termos
éticos, o principal pensamento é comparar e analisar o rácio de
risco e benefício da utilização da técnica uma vez que, apesar de
ser uma técnica muito versátil, eficaz e com um enorme potencial
no tratamento de uma grande quantidade de patologias genéticas e
epigenéticas, a CRISPR pode apresentar algumas limitações e dar
origem a diversas preocupações. As principais preocupações são:
a falta de conhecimento do poder e das limitações da técnica,
sendo que a edição genética poderá não ser especifica, poderá ser
incompleta ou poderá mesmo não atingir o alvo correto; se um
organismo modificado geneticamente permanecerá com essas
alterações para sempre e será capaz de as transmitir à sua
descendência; e o facto de a relação entre o material genético e o
fenótipo ser muito complexa ou seja, poderá haver a possibilidade
de recorrer ao CRISPR para induzir um determinado fenótipo,
contudo, essa caraterística, esse fenótipo, não depende apenas de [1]
um gene mas sim de vários genes e até mesmo de fatores externos.
Posto isto, muitas questões são levantadas em torno desta [2]
técnica nomeadamente, deverá a utilização do CRISPR ser
permitida em medicina ou em investigação biomédica?
[3]
CONCLUSÃO
[4]
Existem várias técnicas de nucleases programáveis, com
capacidade para quebrar as ligações existentes entre bases
nucleotídicas. Existem grupos de proteínas que ligam ao DNA [5]
usadas em edição génica: as nucleases baseadas nos fatores de
transcrição – Zinc fingers, as transcription activator – like
effectors (TALENs) e as RNA – guided engineered nucleases [6]
(RGENs) [7]
As técnicas de Edição Genética são o futuro da ciência. [8]
[9]
O combate de doenças, a manipulação de genomas de modo a
formar indivíduos geneticamente superiores tem um grande
impacto em toda a comunidade geral. No entanto este impacto
levanta grandes questões, nomeadamente o rácio risco benefício.
Existe a grande preocupação da utilização da CRISPR
para fins maléficos / bélicos pelo que se questiona: Quem deve ter
acesso à tecnologia CRISPR e / ou seus produtos? Deve a
modificação do genoma humano ser limitada? (Edição somática
vs Edição de linhas germinativas); Devem ser criados e
promulgados regulamentos internacionais para a utilização do
CRISPR?
REFERENCES
Kim, H., & Kim, J.-S. (2014). A guide to genome engineering with
programmable nucleases. Nature Reviews Genetics, 15(5), 321–334.
Kim, H., & Kim, J.-S. (2014). A guide to genome engineering with
programmable nucleases. Nature Reviews Genetics, 15(5), 321–334. B.
Smith, “An approach to graphs of linear forms (Unpublished work style),”
unpublished.
Sander, J. D., & Joung, J. K. (2014). CRISPR-Cas systems for editing,
regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology, 32(4), 347–350.
https://doi.org/10.1038/nbt.2842
Ramos, A., CRISPR/Cas9: uma ferramenta de edição genética para
investigação e novas terapias. Retrieved from
https://eg.uc.pt/bitstream/10316/42065/1/MONO-DAVID.pdf
Sander, J. D., & Joung, J. K. (2014). CRISPR-Cas systems for editing,
regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology, 32(4), 347–350.
https://doi.org/10.1038/nbt.2842
http://www.rgenome.net/about/
https://cib.org.br/beta-talassemia/
https://pt.wikipedia.org/wiki/V%C3%ADrus_da_imunodeficiência_humana
C. Brokowski, M. Adli, CRISPR Ethics: Moral Considerations for
Applications of a Powerful Tool, J. Mol. Biol. (2018),
https://doi.org/10.1016/j.jmb.2018.05.044