ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA UREASA TRABAJADA DESDE LAS VARIABLES DE TIEMPO

DE INCUBACIÓN, EFECTO PH, EFECTO CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO, EFECTO

CONCENTRACIÓN ENZIMA Y TEMPERATURAS DE INHIBICIÓN

Manuel Fernando Muñoz Rodríguez, estudiante de la Universidad Pedagógica Nacional de

Colombia, Licenciatura en Química 2018. 1

OBJETIVO GENERAL

 Identificar el comportamiento de la actividad enzimática de la ureasa a partir de factores

como tiempo de incubación, pH, concentración y temperatura.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Determinar el comportamiento del efecto pH en la ureasa a partir de una lectura

potenciometrica
 Determinar el comportamiento de la temperatura en la actividad enzimática
 Analizar los efectos producidos por la variación en la concentración del sustrato de la
enzima y su velocidad de reacción
 Determinar las variables de constante de Michaelis-Menten, Velocidad máxima y
linealizacion de lineweaver-burk para el estudio enzimático de la ureasa.

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos
Espátula Ureasa 5 g (0,01 g en 50 mL de buffer fosfato) diluir 25 /50
Vidrio de reloj Urea 1M
3 vasos de precipitado de 250ml Buffer fosfatos pH 7,0
2 vasos de precipitado de 100ml Reactivo nitroprusiano
Varilla de vidrio Reactivo hipoclorito
4 balones aforados de 50ml Buffer fosfato pH 3,5 y 7.9
1 balón aforado de 100ml Buffer acetato pH 4,0
Frasco lavador NaOH 1M
Gotero
3 pipeteadores
5 pipetas graduadas de 1ml
1 pipeta graduada de 5ml
2 pipetas aforadas de 2ml
1 pipeta aforada de 10ml
2 tubos cónicos para centrifuga
1 micropipeta
1 probeta de 100ml
12 tubos de ensayo
1 gradilla

1
Estudiante del espacio académico Sistemas Bioquímicos, Práctica de laboratorio dirigida por el docente
Rodrigo Rodríguez Cepeda.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

1. Curva de Calibración

Pesar 0.03g de NH4Cl

Aforar en balón con agua destilada (100ml)

Establecer soluciones a partir de patrón

0 ppm 0.1ppm 1,0 ppm 2ppm 5 ppm 7ppm 8ppm 10ppm

Para cada muestra

Tomar alícuotas de 10ml

Adicionar (2ml reactive nitroprusiano y 2ml reactivo hipoclorito)

Aforar a 25ml o 50ml

Dejar reposar por 10 min

Realizar lectura en espectrofotómetro a 350nm

Registrar las absorbancias

2. Extracción de la Ureasa

Pesar 500mg de Harina de Soya

Adicionar 5ml de Buffer fosfato (Agitar)

Centrifugar 5min a 4000 rpm

Llevar sobrenadante a tubo de ensayo con taparosca

Preparar solución 10 ml (1:80) en Buffer 2

2
(Se utilizaron 123microlitros de ureasa en 9,87ml de Buffer)
 3. Efecto tiempo de incubación

Tomar 0.3ml de extracto de Ureasa.

0,3ml de buffer En tubo de ensayo y baño de hielo
0,2ml de Urea
0,2 ml de agua

Agitar e incubar a 37°C

Durante

0min 5 min 10min 15min 20 min 25min 30min

Llevar a baño de hielo 5min

Adicionar

2ml reactivo nitroprusiano

2ml reactivo hipoclorito

Completar volumen de 10ml con Agua y agitar

Leer en espectrofotómetro a 350nm

4. Efecto PH (Variación)

Tomar 0.3ml de extracto de Ureasa.

0,3ml de buffer En tubo de ensayo y baño de hielo
0,2ml de Urea
0,2 ml de agua

Agitar

Buffer a adicionar de pH < 1 pH < 5 pH < 7

acuerdo a cada PH. Buffer pH 3 Buffer pH 5 Buffer pH 7

Incubar

A baño de hielo (5min) llevar A 37°C durante 5min

Adicionar
(2ml reactivo nitroprusiano y 2ml reactivo hipoclorito) Completar y agitar (Con agua)
Leer en espectrofotómetro
 5. Efecto concentración de sustrato 3

6. Efecto concentración de la enzima 4

3
Este trabajo se realizó con grupo de laboratorio # 1 (Ramírez, C. Rodríguez, L y Gómez, A.)
4
Este trabajo se realizó con grupo de laboratorio # 1 (Ramírez, C. Rodríguez, L y Gómez, A.)
 7. Efecto temperatura de incubación 5

8. Efecto inhibición de la ureasa 6

5
Este trabajo se realizó con grupo de laboratorio # 1 (Ramírez, C. Rodríguez, L y Gómez, A.)
6
Este trabajo se realizó con grupo de laboratorio # 1 (Ramírez, C. Rodríguez, L y Gómez, A.)
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

1. CURVA DE CALIBRACIÓN

Para realizar la curva de calibración se tomó una muestra de NH4Cl, cuyo peso fue 0.039g, peso
con el cual se determinó la concentración del patrón primario (Solución madre), obteniéndola de
la siguiente forma:

+
ppm NH4 =

+
ppm NH4 = 130.73

Datos obtenidos de forma experimental

Curva de calibración

Curva de Calibración
[ppm] NH4 Abs
0 0,001
0,02 0,004
0,2 0,015
0,4 0,01
1 0,02
1,4 0,026
1,6 0,026
2 0,031

Tabla 1. Datos curva de calibración y Grafica 1. Curva de calibración

Como se puede evidenciar en la gráfica 1, la curva de calibración presenta una linealidad del 90%,
razón por la cual se entra a evaluar cada uno de los datos que se obtuvieron en el laboratorio,
llegando a la conclusión de que el dato número 3 de la tabla 1 genera cierta desviación con
respecto a los otros datos obtenidos, por lo cual se procede a realizar el descarte de este dato,
obteniendo una nueva curva de calibración:
 Curva de Calibración
[ppm] NH4 Abs
0 0,001
0,02 0,004
0,4 0,01
1 0,02
1,4 0,026
1,6 0,026
2 0,031
Tabla 2. Datos curva de calibración corregida y Grafica 2. Curva de calibración corregida

La nueva curva de la calibración nos muestra una tendencia con menor grado de desviación, razón
por la cual nuestra ecuación de trabajo será:

Y= 0.0147x-0.0033

2. EXTRACCIÓN DE LA UREASA

Para la extracción de la ureasa se utilizó una muestra de 580 mg de harina de soya, la cual tuvo un
tratamiento por medio de una extracción simple, la cual se evidencia en el procedimiento # 2 del
presente informe. Aquel sobrenadante que se obtuvo de este procedimiento fue el que se utilizó
para realizar los procedimientos 3 y 4.

Imagen 1. Mecanismo de reacción para la Ureasa. Tomado de:

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:UREASA.png

3. EFECTO TIEMPO DE INCUBACIÓN

Para hallar la concentración del producto en cada tiempo que se realizó la experiencia se utiliza la
ecuación de Beer-Lambert (𝐴= 𝜀∗𝐶∗𝑏) donde Ԑ y b son constantes, las cuales se encuentran
representadas por pendiente de la recta (m=0.0147). Despejando C queda:
𝐴±𝑏𝑚=𝐶 Donde b=0,0033

Utilizando esta ecuación para cada absorbancia leida se tiene que:

Por tanto, C= 2.293 para el tiempo de incubación 0.

Para determinar la velocidad de reacción de cada uno de los tiempos que se trabajó, se realizó la
siguiente operación:

Datos obtenidos de forma experimental:

t incubación Abs [NH4+] M V (M/min)

0 0,037 2,293 0,459
5 0,039 2,429 0,243
10 0,072 4,673 0,312
15 0,056 3,585 0,179
20 0,083 5,422 0,217
25 0,067 4,333 0,144
30 0,056 3,585 0,102

Tabla 3. Datos experimentales obtenidos para el estudio cinético para el efecto tiempo de
incubación

Grafico 3. Curva de trabajo para el efecto tiempo de incubación VS concentración con inclusión de
línea de tendencia polinomica de orden 6.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y
de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede
 medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el
enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura,
presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas
condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La
velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la
desaparición de los reactivos. (Tomado de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e)

Analizando la gráfica que se obtuvo a partir de los datos experimentales y con la ayuda de la línea
de tendencia polinomica de orden 6 que aparece en dicha gráfica, se establece que el tiempo de
incubación donde se produjo una mayor formación de amonio fue en el tiempo 20 minutos. Si se
intenta establecer un rango de tiempo óptimo de incubación para este procedimiento se establece
que este se encuentra entre los 20 y 25 minutos, a pesar de que existe una gran posibilidad de que
haya un rango con otro tiempo optimo entre los 10 y 15 minutos teniendo en cuenta los valores
que se tomaron de forma experimental en la práctica de laboratorio.

Grafica 4. Curva de trabajo para el efecto tiempo de incubación VS velocidad con inclusión de línea
de tendencia polinomica de orden 6.

Para el estudio cinético entre el tiempo y la velocidad (ver grafica 4) se puede visualizar que hay
una mayor velocidad para el intervalo de 5 a 10 minutos, esto hace referencia a que la reacción se
beneficia en su estudio cinético en estos tiempos. A pesar de que la gráfica presenta dos crestas,
las cuales nos permiten interpretar el comportamiento de la reacción, la que toma el rango de 5 a
10 minutos tiene una tendencia más “marcada” que la del tiempo 20-25 minutos.

El tiempo 0 minutos también presenta un punto muy alto en su desarrollo cinético, pero se debe
tener en cuenta que para este tiempo no hay una interacción significativa con relación a la
reacción química de trabajo (No se ha llevado a cabo la reacción química)
 4. EFECTO PH

Efecto pH
pH Abs [Amonio] Velocidad
1 0,009 0,388 0,078
4 0,016 0,864 0,173
7 0,030 1,816 0,363
Tabla 4. Efecto del pH sobre la actividad enzimática (Datos experimentales)

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol,
etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden
tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende,
en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada
para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo. (Tomado de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm)

Grafica 5. Efecto pH sobre la actividad enzimatica de la Ureasa.

En la ureasa se favorece en los pH con tentativa a la neutralidad (6,5-7,5) razón por la cual se
puede evidenciar con ayuda de la gráfica 5, que el pH óptimo en la actividad enzimatica de la
ureasa y con relación a la concentración del sustrato se encuentra en el pH 7,0.
Grafica 6. Efecto pH con relación a la velocidad de reacción

La grafica 6 confirma el comportamiento que se da en la actividad enzimatica con relación a la

variación de pH, donde se favorece su velocidad de reacción en pH 7,0. Por tanto, para la actividad
enzimatica de la ureasa el pH óptimo de trabajo que se obtuvo de forma experimental es de 7,0.
(Neutro)

5. EFECTO CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA

Datos obtenidos de forma experimental

Efecto Enzima
Ureasa Abs Conc. Velocidad
0 0,222 14,88 1,488
0,05 0,404 27,26 2,726
0,1 0,527 35,63 3,563
0,2 0,688 46,58 4,658
0,5 1,129 76,58 7,658
Tabla 6. Datos obtenidos para el estudio del efecto enzima
Gráfica 7. Efecto de la ureasa con relación a la concentración de amonio

En las reacciones enzimáticas ocurre que si se aumenta la concentración de enzima, mayor sera la
formación de productos por unidad de tiempo, esto denota que la velocidad en una reacción
enzimática es directamente proporcional a su concentración, siempre y cuando el sustrato no sea
el reactivo limite en la reacción.

La gráfica 7 nos muestra el comportamiento directamente proporcional entre el aumento de la

concentración y el paso del tiempo. Este aumento también concuerda con el del sustrato.

Gráfica 8. Efecto enzima con relación a la velocidad de reacción

La gráfica 8 nos confirma el comportamiento del efecto enzima, ya que al aumentar la

concentración de amonio por unidad de tiempo también su velocidad aumenta.

6. EFECTO CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO

Efecto [] Sustrato

Urea Abs Concentración Velocidad

0 -0,028 -2,13 -0,21

0,005 -0,008 -0,77 -0,08

0,01 0,018 1,00 0,10

0,02 0,811 54,95 5,49

0,05 0,008 0,32 0,03

Tabla 7. Datos obtenidos para el estudio del efecto sustrato

El dato 4 de la tabla 7, se descarta, ya que la lectura que se tomo en el espectroscopio y su

posterior análisis matemático otorgaron un valor de concentración que se sale del rango de
trabajo, debido a que los reactivos que se utilizaron para dar coloración a la solución de trabajo se
acabaron y se implementaron otros cuya concentración no era muy confiable.

Gráfica 9. efecto sustrato con relación a la concentración de amonio

Gráfica 10. efecto sustrato con relación a la velocidad de reacción

De acuerdo con la información anterior, se puede deducir que la concentración optima se

encuentra entre los rangos de 0.01 y 0.05M aproximadamente. Con la gráfica 10 podemos deducir
que la concentración óptima con relación a la velocidad de reacción se da en 0.01M, ya que es
donde se manifiesta una velocidad máxima. (se forma el pico mas alto en la gráfica)
 Linealizacion efecto sustrato

1/[urea] 1/velocidad

200 -13,01

100 10

20 31,28

Tabla 8. Datos utilizados para la linealizacion del efecto sustrato

Gráfica 11. linealizacion lineweaver-burk para el efecto sustrato

A partir de los datos obtenidos en la linealizacion como se pueden ver en la tabla 8 y la gráfica 11
se pueden determinar variables para el estudio cinético de la enzima como los son la constante de
Michaelis-Menden (Km) y la velocidad máxima de reacción (Vmax).

Determinación de la velocidad máxima (Vmax)

Vmax = 1/Intercepto

Vmax = 1/35,6

Vmax = 0,0281 ppm/min

Determinación de la constante de Michaelis (Km)

Km= pendiente * Vmax

Km = 0,2454 * 0,0281
Km = 6,894*10^-3

Se puede concluir que el valor de velocidad máxima que se obtiene a partir de la linealizacion, se
asemeja al que se representa en la gráfica 10, como valor de la concentración optima del sustrato.

7. EFECTO INHIBIDOR

El reactivo utilizado como inhibidor para la reacción química fue el HgCl2, el cual por contener un
metal como el mercurio puede inhibir la reacción urea-ureasa, ya que en la estructura química de
la ureasa encontramos un dímero de Níquel, el cual puede ser reemplazado fácilmente por el
mercurio.

A continuación se presentan los resultados obtenidos de forma práctica para determinar el efecto
inhibidor en la reacción enzimática:

Efecto inhibidor
Tiempo (min) Absorbancia Concentración Velocidad
0 0,875 59,30
5 0,345 23,24 4,65
10 0,627 42,43 4,24
15 0,234 15,69 1,05
20 0,271 18,21 0,91
25 0,165 11,00 0,44
30 0,285 19,16 0,64
Tabla 9. Datos obtenidos para determinación del efecto inhibidor

Grafica 12. Concentracion de amonio en relacion con el tiempo de inhibicion

Grafica 13. Velocidad de reaccion en relacion con el tiempo de inhibicion

A partir de los datos obtenidos de forma experimental que se encuentran expresados en la tabla 9,
se obtienen dos graficas de trabajo que permiten deducir el tiempo optimo de inhibicion de la
reaccion urea-ureasa, los cuales se establecen a partir del comportamiento de dichas graficas
(Grafica 12 y grafica 13)

El tiempo optimo en el cual la reaccion enzimatica con inhibidor, presenta una mayor cantidad de
producto formado se encuentra en un rango entre los 5 y 15 minutos, evidenciando que la
presencia de este inhibidor retraza la actividad enzimatica como se puede evidenciar en la grafica
13. Por otro lado si se compara este efecto con el de la reaccion enzimatica sin inhibidor (efecto
tiempo de incubacion) este tiempo es mucho menor (vease tambien grafica 4)

LINEALIZACION EFECTO INHIBIDOR

[Sustrato] 1/[sustrato] 1/v

1082,6
1154,7 0,00087 0,2151
1116,3 0,00090 0,2357
1169,8 0,00085 0,9558
1164,8 0,00086 1,0982
1179,2 0,00085 2,2727
1162,9 0,00086 1,5655
Tabla 10. Datos obtenidos para la linealizacion del efecto inhibidor

[Urea] ppm = 0.02mol urea/L * 60,06g urea/1mol urea* 1000mg/1g

[Urea] ppm = 1201.2

[Sustrato] = [urea] -2[concentración NH4]

La estequiometria de la reacción determina que por cada mol de sustrato se producen dos de
NH4.

Grafica 14. Linealizacion del efecto inhibidor

En la gráfica 14 y con los datos obtenidos en la tabla 10, la linealización de Lineweaver y Burk
presentan desviaciones los cuales afectan la ecuación de la recta siendo esta poco viable para
calcular los valores de Vmax y constante de Michaelis, por ello se descartaron 3 datos (subrayados
en color verde) los cuales se encuentran en la tabla 10, con el fin de que esta linealización
presente una tendencia con menos errores; estos datos mostraron valores de absorbancia
irregulares, debido a que se utilizaron reactivos diferentes para generar color pues se acabó el que
se usó con las otras lecturas.

Grafica 15. Linealizacion del efecto inhibidor corregido

Los datos que se obtuvieron de forma experimental en la tabla 10 se encuentran en unidades de
ppm (partes por millon), los cuales deben ser expresados en concentracion Molar (M) para poder
determinar las variables de Vmax y Km. Dicho procedimiento se realiza de la siguiente manera:

[sustrato]M = [ppm] * 1g/1000mg * 1mol urea/ 60.06g

Linealización efecto inhibidor

Tiempo 1/[S] 1/V
10 0,00090 0,236
20 0,00086 1,098
25 0,00085 2,273
Tabla 11. Datos para estudio de linealizacion del efecto inhibidor

A partir de los datos obtenidos y registrados en la tabla 11 y la ecuación de la recta que se obtuvo
en la gráfica 15, se hallan las variables Vmax y Km (Para la enzima), los cuales se presentan de la
siguiente manera:

Vmax de reacción

Vmax = 1/Intercepto

Vmax = 1/ 33.746

Vmax = 0,0296 ppm/min

Determinación de Km

Km = Pendiente * Vmax

Km = 0,6246 * 0,0296

Km = 0,0185 M * ppm

Variables determinación efecto inhibidor

Variables Vmax Km
con inhibidor 0,0296 0,0185
sin inhibidor 0,02809 6,89*10^-3
Tabla 12. Variables obtenidas para determinación de efecto inhibidor

De acuerdo con los datos de la Tabla 12 el tipo de inhibición presentada es competitiva, ya que los
datos que presentan variación son los de la constante de Michaelis, mientras que los de la
Velocidad máxima se mantienen constantes.
 8. EFECTO TEMPERATURA DE INHIBICIÓN

Efecto temperatura de incubación

Temperatura °C Abs Concentración velocidad
0 -0,072 -5,1224 -1,0245
21,5 0,061 3,9252 0,7850
37 0,046 2,9048 0,5810
100 0,715 48,4150 9,6830
Tabla 13. Datos obtenidos para el estudio de la temperatura de inhibición

Grafica 16. Variacion de la concentracion con relacion a la temperatura de incubacion

Grafica 17. Variacion de la velocidad con relacion a la temperatura de incubacion

Los datos obtenidos en el efecto de la temperatura de incubación sobre la acción enzimática de la
ureasa, evidenciados en la tabla 11 y graficas 16 y 17, evidencian una tendencia de que a mayor
temperatura de incubación al reacción enzimática es más óptima, esto se debe a que, para toda
enzima una temperatura optima de actividad, a la cual la velocidad de reacción es máxima,
temperaturas por debajo de esta son menos optimas la reacciones; al incrementar la temperatura
aumenta la frecuencia de choques y se favorece la velocidad de reacción es decir la formación del
producto; pero si la temperatura es muy elevada, pueden romper la estructura de Van der Waals y
los puentes de hidrogeno que estabilizan la estructura terciaria y cuaternaria de la enzimas, como
consecuencia, se produce su desnaturalización y la perdida de la actividad enzimática.

Para este experimento este fue el caso, no se evidencio como tal una temperatura o rango de
temperatura el cual valores por encima o por debajo de esta sea menos optima la reacción, ya
que, solo se observó una tendencia que a mayor temperatura mayor eficiencia, por ello, basados
en estos resultados, se puede sugerir el trabajar también con temperaturas más elevadas, con el
fin de lograr evidenciar un rango de temperatura óptimo de reacción más claro.

CONCLUSIONES

Se determinó el comportamiento del pH para la reacción urea-ureasa con ayuda de un

potenciómetro, el cual es un instrumento con un buen rango de efectividad en las mediciones y se
logró establecer que el pH óptimo para esta reacción es de 7,0 (Neutro). Para lograr determinar
este valor se usaron soluciones buffer (amortiguadoras).

Para la actividad enzimática de la ureasa se logró determinar el comportamiento de la

temperatura, en la cual se utilizaron ensayos que fueron desde los 0°C hasta los 100°C,
estableciendo que la temperatura óptima para la incubación en la reacción Urea-Ureasa es de
37°C.

Se analizó los efectos que se produjeron en la variación de la concentración para reacciones con
inhibidor y sin inhibidor, teniendo parámetros como lo fueron el tiempo de reacción y la velocidad
de reacción. Para ambos casos se logra establecer que los tiempos óptimos varían desde los 5
minutos hasta los 15 minutos. También se deduce que la reacción con inhibidor presenta un
tiempo óptimo de 5 minutos, el cual es mucho menor con relación a la que no usa el inhibidor
cuyo tiempo se encuentra en un rango de 15-20 minutos.

Para los casos de la determinación de los efectos de la concentración y la inhibición en la reacción

se realizó la linealizacion de lineweaver-burk, para ello se establecieron los parámetros de la
constante de Michaelis-Menten (Km) y la velocidad máxima de reacción (Vmax), con lo cual se
concluyó que el tipo de inhibición que presento la reacción fue competitiva (Disminución de Km y
Vmax constante)

Por último y a manera de recomendación se sugiere preparar las soluciones de trabajo a

volúmenes más altos que los que se establecieron, es decir, que si se sugirió preparar 1L de
solución se prepare 1.5 L, esto con el fin de que se tenga el suficiente material para realizar las
determinaciones y no se tenga que realizar una nueva solución que influyo bastante en la
variación de los datos experimentales obtenidos y que posteriormente se generara el descarte de
algunos de ellos.
 BIBLIOGRAFIA

SITIOS WEB CONSULTADOS

 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática, buscado el 22 de mayo de 2018 a las

01:45, recuperado de http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e

 Efecto del pH en la actividad enzimática, buscado el 23 de mayo de 2018 a las 04:45,

recuperado de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm

 Efecto de la concentración en la actividad enzimática, buscado el 23 de mayo de 2018 a las

07:23, recuperado de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm