Universidad Nacional de Piura

Facultad de Ingeniería Industrial

Escuela Profesional de Agroindustrias

Informe de laboratorio

Materia:

Biotecnología

Tema:

Extracción de pectina de la cascara de mandarina

Ciclo Académico:

2019-1

Docente:

Blgo: Jorge Bermejo

Integrantes:

Condolo Vásquez María Diana

Huaman Elera Elizabeth Clorinda
Yovera Mío Karla

Piura – 2019
Contenido
I. Introducción ........................................................................................................... 1

II. Objetivos ............................................................................................................ 3

Objetivo General: ......................................................................................................... 3

Objetivos Específicos: ............................................................................................. 3

III. Marco Teórico .................................................................................................... 4

IV. Materiales ......................................................................................................... 12

4.1. Materiales ................................................................................................. 12

1.1. Material biológico ................................................................................. 12

1.2. Material de laboratorio y/o campo ........................................................ 12
V. Metodología ..................................................................................................... 13

VI. Resultados ........................................................................................................ 15

VII. Discusiones................................................................................................... 15

VIII. Conclusiones ................................................................................................ 16

IX. Recomendaciones ............................................................................................ 17

X. Bibliografía ...................................................................................................... 18
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I. INTRODUCCIÓN

El Ácido desoxirribonucleico (ADN), es el material genético de todos los

organismos vivos y de casi todos los virus. Es el ADN quien lleva la

información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la duplicación de

la misma molécula. Esta biomolécula fue detectada en el núcleo celular por el

investigador F. Miesher en 1869, y desde los años 40 O. Avery y sus

colaborados descubrieron que el material genético está formado de ADN. En

las últimas décadas, la Biología se ha enriquecido con una variedad de técnicas

que han permitido la posibilidad de entender con mayor precisión, estructuras,

funciones, mecanismos o fenómenos de los sistemas vivos. La manipulación

del ADN, es uno de los ejemplos más espectaculares del avance de la aplicación

de una serie de herramientas, que anteriormente no se contemplaban en el

campo científico y que en la actualidad, se usan de manera rutinaria para

desarrollar una amplia variedad de estudios genéticos. Para estudiar el ADN es

imprescindible aislarlo e identificarlo. Existen diferentes métodos de

aislamiento, dependiendo del tipo de estudios o investigación que se quiera

realizar. Sin embargo todos comparten el hecho de que, debido a que la

molécula se encuentra al interior de estructuras membranosas y está asociada

con proteínas, se requiere usar sustancias adecuadas para obtener al ADN de la

forma más purificada posible. La técnica utilizada en esta actividad

experimental, se basa por un lado, en el principio de que el componente

fundamental de las membranas plasmática y nuclear, son los lípidos, por lo cual

se utiliza un detergente (surfactante) para romper estas estructuras y permitir la

salida del ADN. Por otro lado, el ADN de vegetales y animales se encuentra

asociado a proteínas de tipo histona, por lo tanto, al agregarle alcohol se

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precipitan las proteínas y de esta forma se obtiene al ADN como una estructura

más pura. Finalmente, se conoce que el ADN es una molécula de carácter ácido,

lo que le permite ser identificada con colorantes específicos como el anaranjado

de acridina
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II. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

 Efectuar la técnica de extracción y aislamiento de ADN en hígado de

pollo para visualizar el aspecto real de este tipo de ácido nucleico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Diferenciar entre el Modelo del ADN propuesto por Watson y Crick y

el aspecto real del ácido desoxirribonucleico extraído por esta técnica.

 Comprender que esta técnica, es sólo el inicio de otras que se aplican

en el ámbito científico para resolver problemas de genética humana y

mejoramiento de razas y variedades.

 Profundizar la comprensión de conceptos relacionados con la Ingeniería

genética y sus aplicaciones y promover el desarrollo de habilidades y

destrezas.
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III. MARCO TEÓRICO

La extracción de ADN se realiza para obtener las moléculas aisladas con

alto grado de pureza y poderlas utilizar en investigación científica, en medicina

o para la ciencia forense. La mayor parte de los métodos que existen para

extraer el ADN consisten en lograr primero la lisis o ruptura de la célula, para

luego separar las moléculas de ADN del resto de los constituyentes de la célula.

A la hora de escoger que método de extracción de ADN utilizar se tienen en

cuenta varios factores:

 La cantidad de muestra de la que se dispone para extraer el ADN.

 El tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN.

 La pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído.

 El tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento

esperado.

 Uso que se le va a dar al ADN extraído.

Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN

de muchos sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos

corporales, tejidos vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros. En

este trabajo se analizan las diferencias, ventajas y desventajas de algunos de los

métodos existentes para la extracción del ADN.

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Incubación del lisado para su uso

Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a

temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que

mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con

aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este método son las pérdidas

de ADN por acción de las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que

están en contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para

almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de

ADN.

Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos

Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico

hay que tener en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que

se intentan separar, por lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células

pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método puede ser usado

para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede

romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando

ultrasonidos. El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol

isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la célula

solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra la

separación de los ácidos nucleicos. Este método se puede usar para moléculas

de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas

relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH

de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores que aseguran

una buena separación. Las desventajas de este método son el uso de disolventes

orgánicos dañinos para la salud humana y que pueden quedar como trazas en
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la muestra de ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como el PCR,

que es largo, en ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y

requiere de varios trasvases que aumentan la posibilidad de contaminación de

la muestra.

Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB

Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un

detergente aniónico puede romper la pared celular y así se produce la lisis de

las células. El uso de detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción

de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de bacterias y otros

tipos de organismos. Un ejemplo de este método, quizás el más conocido, es el

uso de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) como detergente para lograr

la lisis. El CTAB además, en presencia de EDTA como agente quelatante y

TRIS-HCl como tampón, forma complejos insolubles con el ADN. Luego se

extraen los residuos orgánicos con cloroformo, para separar posteriormente el

ADN por precipitación con etanol. Si se quiere evitar el uso de disolventes

orgánicos se puede llevar a cabo el método del CTAB separando directamente

los complejos insolubles formados con el ADN del sobrenadante donde han

quedado disueltos el resto de componentes celulares. Estos complejos se

resuspenden en disolución salina y se adiciona posteriormente alcohol y

RNAsa, logrando que precipite el ADN con un grado de pureza aceptable para

muchas aplicaciones.

Método de salting-out
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A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas

y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones

de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la

fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-

HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total

inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN.

Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio

y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las

moléculas orgánicas. El precipitado formado se separa por centrifugacón y

luego se puede extraer el ADN de la disolución acuosa mediante la adición de

alcohol, por precipitación.

Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN

obtenido en muchas ocasiones debe ser purificado antes de ser usado en

posteriores aplicaciones. La ventaja es que se elimina el uso de disolventes

orgánicos.

Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio

El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en inglés

proteinase K - sodium dodecyl sulfate, es uno de los más usados para la

extracción de ADN ya que la digestión de la muestra se puede realizar con

proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa K

inactiva las DNAsas presentes en el lisado celular usando detergente aniónico

el SDS. La proteinasa K también es usada en otros de los métodos descritos en

 8

este artículo para la digestión de las proteínas y otros contaminantes del lisado

celular.

Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico

en un único tubo

La compañía Wako pone a disposición de los investigadores y empresas

varios kit de ADN que usan yoduro de sodio como agente caotrópico, que

tienen la ventaja de que la extracción se realiza en un único micro tubo de

centrifugado. El yoduro de sodio además de provocar la lisis celular rompe la

capa de hidratación que rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los

grupos fosfatos del ADN queden más expuestas. En estos kits después del

tratamiento de la muestra con yoduro de sodio en el mismo tubo se adicionan

detergentes aniónicos como es el caso del N-lauril sarcosinato de sodio,

proteinasa K y/o otros reactivos que permiten separar las proteínas y lípidos

contenidos en las muestras biológicas del ADN.

El conocimiento del ADN, su estructura y función fue crucial para el

progreso de la biotecnología moderna. El ADN o ácido desoxirribonucleico, es

una base de datos en la cual está contenida toda la información e instrucciones

que determinan la forma y características de un organismo y sus funciones. Es

responsable además, de la transmisión de estas características a través de la

reproducción gracias a su poder de replicación, constituyendo la base de la

herencia. Después que la comunidad científica comprendiera la estructura de

los genes y cómo se traduce la información que estos portan, iniciaron la carrera

en la búsqueda de cómo estudiarlos, aislarlos, modificarlos y transferirlos entre

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organismos. De esta forma nació la ingeniería genética y con ella la clonación,

revolucionando así la biotecnología moderna. La clonación es la multiplicación

de fragmentos de ADN para expresar genes en organismos diferentes al de

origen. Así, es posible obtener proteínas de interés en organismos diferentes

del original del cual se extrajo el gen, mejorar cultivos y animales, obtener

nuevos fármacos, entre otras aplicaciones.

Gracias al estudio del ADN se puede, además, conocer cuáles enfermedades

se tiene el riesgo de padecer; descubrir al autor de un crimen; identificar restos

humanos; verificar la paternidad; o hasta diseñar un tratamiento contra el

envejecimiento a medida.

En las investigaciones de enfermedades como el cáncer, un avance

relativamente reciente es el análisis del ADN tumoral circulante (ctDNA),

basado en el ciclo de vida natural del tumor. El ctDNA son pequeñas porciones

de ADN de las células tumorales que portan los marcadores genéticos del tumor

y que se liberan al torrente sanguíneo. Actualmente es posible detectar

mutaciones genéticas con solo una muestra de sangre, mediante la

identificación y análisis del ctDNA. De esta manera se cuenta con una

alternativa importante a las biopsias, el método tradicional de análisis de

mutaciones que requieren la extracción invasiva de tejido o células del área

tumoral.

Como podemos ver, contar con técnicas de extracción del ADN cada

vez más eficientes y de fácil aplicación es un objetivo clave en el universo

científico. En anteriores artículos, hemos comentado sobre 10 métodos

existentes para la extracción de ADN, los factores a tener en cuenta a la

 10

hora de la selección del método, así como las principales características de

cada uno.

Entre ellos, la extracción de ADN con yoduro de sodio como agente

caotrópico es el método seleccionado por la compañía distribuidora de

reactivos químicos para la investigación, Wako Chemicals, para

desarrollar una serie de equipos con este fin. Este método aventaja en

cuanto a su elevado rendimiento, la sencillez del procedimiento ya que se

realiza en un único microtubo de centrifugado, la seguridad de la operación

al evitar solventes tóxicos como el fenol y/o cloroformo, así como por la

reducción de la contaminación en la muestra. Algunos de los packs de

reactivos para la extracción de ADN se describen a continuación: Mediante

el equipo extractor de ADN SP, de Wako, es posible extraer fragmentos

de ADN contenidos en el suero sanguíneo y en el plasma, incluso de

muestras muy pequeñas, con un alto rendimiento y poca variabilidad.

En el caso del aislamiento del ADN a partir de cortes y muestras de tejidos

parafinados y congelados, el equipo aislador de ADN PS permite el aislado en

un tiempo reducido con la mínima pérdida de material genético, gracias a que

todas las manipulaciones del método se pueden realizar en un solo tubo. Las

muestras después del aislamiento pueden ser utilizadas para la amplificación

del ADN.
 11

La introducción de la tecnología del ADN en la investigación médico

forense ha supuesto un invaluable avance tanto en la investigación biológica

de la paternidad, como en la investigación criminal, posibilitando el estudio de

indicios biológicos mínimos. El equipo de extracción de ADN FM,

desarrollado por Wako ofrece un procedimiento rápido para aislar el ADN de

materiales rígidos (vello, uñas, manchas de saliva, de sangre y otros fluidos

corporales), que contienen cantidades limitadas de ADN.

El biomarcador 8-OHdG ha sido un marcador fundamental para medir el

efecto del daño oxidativo endógeno al ADN, como factor de iniciación y

promoción de la carcinogénesis y también como un factor de riesgo para

muchas otras enfermedades. El equipo DNA extractor® TIS es el equipo de

extracción del ADN más útil para la detección y determinación del 8-OHdG.

Además, está diseñado especialmente para la extracción de ADN de tejido

parenquimatoso humano y animal. Logra la inhibición de la oxidación posterior

del ADN mediante un inhibidor de la oxidación.

El Extractor de ADN WB, constituye una herramienta potente para la

extracción de ADN genómico a partir de sangre completa, cultivos celulares y

cultivos tisulares. Emplea un procedimiento simple de extracción, con alta

eficiencia, para el aislamiento de ADN intacto de alta pureza.

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IV. MATERIALES

4.1. MATERIALES

1.1. Material biológico

 Hígado de pollo fresco

 Agua helada

1.2. Material de laboratorio y/o campo

 Mortero

 Vaso precipitado

 Probeta

 Pipeta

 Propipeta

 Alcohol isoprópilico

 Estereoscopio
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V. METODOLOGÍA

1. Triturar en un mortero 10 gr de hígado de ave más 10 gr de sal de cocina

más 100 ml de agua helada.

2. Filtrar el contenido anterior, 20 ml de detergente líquido, reposar por

10 minutos.

3. Dejar reposar hasta formar un precipitado.

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4. Tomar 10 ml del líquido sobrenadante y adicionar alcohol isoprópilico

frio, 30 ml, al tubo de ensayo base.

5. Observar la precipitación del ADN en la interfase agua-alcohol, hilos

blancos.

6. Observar al estereoscopio, pinza o aza de siembra, se coloca en una

placa Petri y se observa.

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VI. RESULTADOS

Resultados se presentan en el laboratorio siguiente:

 Gracias a todos los pasos seguidos en la práctica se logró observar

fragmentos resplandecientes ADN.

VII. DISCUSIONES

Los resultados que obtuvimos fueron muy positivos ya que se logro la

obtención del ADN con la realización de todos los pasos antes descritos, lo

cual podemos decir que fue un método muy eficiente, las complicaciones que

pudimos observar fueron solo de tiempos entre unos equipos, de realización de

los procedimientos además que en la obtención del ADN muchos obtuvieron

gran cantidad de muestra y se facilito su extracción del tubo pero se puede decir

que se cumplió el objetivo de extracción de ADN de un hígado de pollo.

Mediante el procedimiento experimental se obtuvo el ADN de los vegetales,

pudiendo observar su forma; lo cuales confirman o reafirman la teoría.

Después de varios experimentos en la obtención de ADN se obtuvo la

misma forma fibrilar del ADN.

Los materiales a usar deben ser medidas exactas siguiendo el procedimiento

indicado, para no tener tendríamos errores experimentales.

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VIII. CONCLUSIONES

 Para la extracción de ADN a partir de un hígado de pollo concluimos que

si es posible gracias a la técnica de “extracción de ADN” con los pasos

antes expuestos es muy viable, pero no es aquí donde se demuestra que

fue viable la extracción.

 El ADN se encuentra dentro de las células y para poder extraerlo

necesitamos machacar el hígado y hacer una disolución que rompiera los

núcleos de las células. Después sacamos el ADN deshaciéndose de las

proteínas con el zumo y el fairy. Dejamos caer el alcohol que contraerá el

ADN y así poder observarlo.

 Dentro de las conclusiones se puede decir que se lograron los objetivos de

la práctica, la separación ya la extracción del DNA a partir de tejido animal

se logro correctamente, ahora esto aun no ha terminado completamente

aun siguen algunos procesos como la purificación del DNA, etc. Para

observar con más claridad las características del DNA, algunas

recomendaciones son el uso adecuado en esta práctica, se necesita de

mucho cuidado y poner atención en los procedimientos ya que cualquier

error podríamos perder todo nuestro trabjo realizado.

 En esta practica se logro el objetivo principal y planteado que es la

extracción del ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto siguiendo

una serie de pasos para poder lograrlo, así se pudo separar de otros

componentes como proteínas, lípidos, carbohidratos y se pudo distinguir

cual era cual y el resultado final fue la extracción y separación del ADN.
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IX. RECOMENDACIONES

 Utilizar distintos detergentes ya que algunos no funcionaran tan bien como

otros. o Mezclar despacio caso contrario corre el peligro de romper el

ADN. o Al momento de agregar el detergente ahitar lentamente.

CUESTIONARIO: 1.- Si pudiésemos tomar una cadena de ADN humano

y la estiráramos de forma lineal nos daríamos cuenta que el ADN humano

tiene una longitud de extremo a extremo.

 Como recomendaciones que uno haría seria que se siga investigando mas

sobre otras formas de poder extraer el ADN y poder separarlo, otras formas

en que cualquier tipo de persona aunque con pocos conocimientos sobre

este tema lo pueda hacer por lo menos acompañado de otro que sepa mas,

siguiendo otros pasos y utilizando otras sustancias que fueran un poco

menos peligrosas y mas fáciles de obtener.

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X. BIBLIOGRAFÍA

 http://files.biologia-ias-unipaz.webnode.es/200000115-

134081532f/PRACTICA%20DE%20LABORATORIO%20EXTRACCI

ON%20DE%20ADN.pdf

 https://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/post/10-metodos-de-

extraccion-de-adn/

 http://victorprietog6.blogspot.com/2018/03/extraccion-del-adn-del-

higado-de-pollo.html

 http://ingerayo.blogspot.com/2011/12/reporte-practica-extraccion-

adn.html

 https://www.monografias.com/trabajos91/informe-experimento-

extraccion-adn/informe-experimento-extraccion-adn.shtml