Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
COMPOST
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el título de
Microbiólogo Industrial
1
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia”.
2
EVALUACIÓN EN 3 MICROAMBIENTES DIFERENTES DE LA
COMPOST
APROBADO
Dra. Ana Karina Carrascal M.Sc Dra. Maria Mercedes Martínez M.Sc
Director Asesor
Dra. Ivonne Gutiérrez Rojas M.Sc Dra. Adriana Matíz Villamil M.Sc
Jurado Jurado
3
EVALUACIÓN EN 3 MICROAMBIENTES DIFERENTES DE LA
COMPOST
APROBADO
Dra. Ingrid Schuler PhD. Dra. Janeth Arias Palacios M.Sc – M.Ed
Decana Académica Directora de Carrera
4
A mis padres y hermanos, el motor de mi vida. A quien
desfallecer.
desfallecer. A la Mona por su cariño y paciencia. Y a Glo por
5
Agradecimientos
6
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN 10
INTRODUCCIÓN 11
1. MARCO TEÓRICO 13
2. JUSTIFICACION 24
3. OBJETIVOS 25
3.1 Objetivo general 25
3.2. Objetivos específicos 25
4. METODOLOGÍA 26
4.1 Microorganismos de estudio 26
4.1.1 Banco de cepas primario 26
4.1.2 Caracterización de la cepa 27
4.3 Microcosmos 28
4.3.1 Preparación de los inóculos 28
4.3.2 Montaje del microcosmos 29
4.3.3 Análisis y seguimiento del microcosmos 29
5. RESULTADOS 34
5.1 Microorganismos de estudio 34
7
5.1.1 Aislamiento de la cepa 34
5.1.2 Caracterización de la cepa 34
5.4 Microcosmos 37
6. DISCUSION DE RESULTADOS 44
6.3 Microcosmos 45
6.5 Valor D 53
7. CONCLUSIONES 55
8. RECOMENDACIONES 56
9. REFERENCIAS 57
10. ANEXOS 70
8
ÍNDICE DE TABLAS
ÍNDICE DE FIGURAS
9
RESUMEN
10
INTRODUCCION
11
Del mismo modo la identificación de un microorganismo con características
especiales de adaptación en ambientes hostiles concede importancia al estudio de
los métodos empleados para contrarrestar la inclemencia del medio en donde se
desarrolla y la posibilidad de exhibir estas cualidades en otros ambientes, bajo otras
circunstancias o incluso representarlas a nivel de laboratorio.
12
1. MARCO TEORICO
1.1.1 Compost
13
patógenos. Del mismo modo el tamaño de las partículas a compostar, el diseño de
la pila y el tamaño de ésta afectan la velocidad de aireación, y la tendencia del
compost a retener o desperdiciar el calor que es generado (Chen et al., 2000).
14
aumento de la temperatura hasta los 40ºC, lo que provoca que los microorganismos
termófilos sean más competentes y se incremente la temperatura hasta los 70ºC
(Pinto, 2001).
Por otra parte, aunque la mayoría de patógenos son destruidos rápidamente cuando
la pila de compost alcanza una temperatura uniforme de 55ºC, unos pocos logran
sobrevivir y se hace necesario lograr temperaturas superiores a los 67ºC para
garantizar la ausencia de quistes de protozoos, huevos de helmintos, cepas de
Clostridium perfringens y C. botulinum (Jones & Martin, 2003). Además, se ha
reportado la capacidad de ciertas cepas de Salmonella spp. para crecer y
desarrollarse a temperaturas cercanas a los 68ºC (Droffner y Brinton, 1995).
15
Los desperdicios animales en forma de estiércol son unos de los más aplicados en
la agricultura debido a que es un método económico y ambientalmente sostenible
para el tratamiento del suelo, ya que posee un valor benéfico como fertilizante
fuente de nitrógeno, fosfato y potasio que puede ayudar a mantener la calidad del
suelo. Sin embargo, el estiércol animal frecuentemente contiene microorganismos
patógenos que ingresan en la cadena alimentaria. Por tal motivo, es indispensable
controlar el nivel de patógenos con el fin de evitar la contaminación del suelo,
aguas, cosechas, animales y el hombre (Islam et al., 2004).
Sin embargo, son bastantes los casos reportados de brotes asociados con bacterias
por el consumo de frutas, verduras y hortalizas provenientes de lugares en donde se
fertiliza la tierra con estiércol y con desechos de plantas de tratamiento. Este es uno
de los factores que contribuye a las infecciones humanas de tipo entérico, pues los
abonos orgánicos de baja calidad, usados en cultivos de vegetales frescos de
consumo directo especialmente en lechugas y zanahorias, son a base de estiércol
animal (Pell, 1997).
16
Tabla 1. Temperatura necesaria para la eliminación de algunos patógenos en
compost (Arnedo et al., 2002).
17
Ahora bien, los humanos pueden entrar en contacto con los patógenos presentes en
los bioinsumos ya sea por contacto directo o indirecto con agua o comida
previamente contaminada. El contacto directo se puede dar mediante manipulación
del material orgánico, por caminar sobre el área donde se aplica, por manipular el
suelo donde se aplica o por inhalación de los microorganismos presentes en el aire.
El contacto indirecto se puede dar por el consumo de las cosechas contaminadas,
por ingestión de agua contaminada, por contacto con el bioinsumo o con patógenos
transportados por vectores como roedores, insectos e incluso mascotas (Gutiérrez &
Martínez 1999).
18
depende de la cepa de Salmonella presente y la fase de crecimiento en la que se
encuentre, la composición del medio y otros factores como los microorganismos
presentes (Doyle y Mazzotta, 2000).
1.3.2 Serotipificación
19
La definición del serotipo se realiza mediante la descripción de sus antígenos de
pared y flagelares. Esta se basa en la mezcla del organismo, que hace el papel de
antígeno, con el suero inmune (anticuerpo). Si el suero posee aglutininas frente al
antígeno, se presenta una aglutinación (Schneider, 2001).
20
Por otra parte, Salmonella spp. no se caracteriza por ser una bacteria que presente
elevada termorresistencia en comparación con otras cepas como S. senftenberg o
S. typhimurium (Doyle & Mazzotta, 2000). No obstante, estudios de resistencia
térmica bacteriana en alimentos y medios de cultivo han demostrado que
Salmonella spp. es capaz de generar factores de termorresistencia como proteínas
de membrana alternas que le confieren una mayor protección al calor (Humpheson
et al., 1998).
Las bacterias del género Salmonella continúan siendo un problema mayor en lo que
a salud pública respecta y al riesgo que representa en la industria alimentaria,
debido a que son una de las bacterias más importantes que pueden provocar
enfermedades en el hombre por ingestión de alimentos contaminados. Ha sido
aislada de una amplia variedad de alimentos y de materias primas para la
fabricación de estos. Varios procesos térmicos aplicados en la industria durante la
fabricación de alimentos suelen ser efectivos para la destrucción de este
microorganismo, sin embargo, el tratamiento con calor ha dejado de ser altamente
efectivo y debe combinarse con otro factor como lo es la variación en los valores de
pH (Leguérinel et al., 2007). Esta resistencia a los tratamientos térmicos resulta en
gran medida de cambios en la formulación o características del alimento en el que
se encuentre y alteraciones en los sólidos totales, acidez y actividad del agua (aw)
(Doyle y Mazzotta, 2000).
21
Los brotes producidos por Salmonella spp. anualmente reportan en países
industrializados y en vías de desarrollo una gran cantidad de pérdidas no solo de
vidas sino también a nivel monetario, sólo en EEUU y Canadá las pérdidas
ascienden a $3.4 billones de dólares (Figura 1).
22
huevos, pescados, ensaladas y chocolates en donde el agente causante ha sido
identificado. El costo a nivel económico de la salmonelosis ha sido estimado en un
valor cercano al billón de dólares por año, debido al tratamiento de la sintomatología
caracterizada por nausea, calambres, diarrea, y en cerca del 2% de los casos se
presenta artritis (Pell, 1997).
23
2. JUSTIFICACIÓN
24
3. OBJETIVOS
25
4. METODOLOGIA
26
4.1.2 Caracterización de la cepa
27
Figura 2. Montaje del inóculo para curvas de crecimiento
El recuento en placa se realizó cada dos horas, haciendo diluciones seriadas (base
10) del inóculo en agua peptonada 0.1% p/v estéril y sembrando en profundidad
(1ml) en agar BHI para ser llevadas a incubar a 37ºC durante 18h.
4.3 Microcosmos
Un tubo Khan con 2.5 ml de caldo BHI estéril se ajustó al tubo 0.5 de McFarland a
partir de la emulsión de una colonia de Salmonella spp crecida en agar XLD (24h –
37ºC), para posteriormente ser adicionado a un erlenmeyer de 50 ml con 22.5 ml de
caldo BHI estéril y ser llevado a incubación (16h - 37ºC - 120 rpm). Pasado este
tiempo se midió la absorbancia del inóculo y las UFC/ml en placas de agar BHI para
establecer la concentración inicial.
28
A partir del inóculo se realizaron diluciones sucesivas en frascos Schott de 500 ml
con 225 ml de agua peptonada 0.1% p/v estéril hasta obtener concentraciones de
100 y 10 células/ml. Cada dilución fue agregada a una muestra de compost y
homogenizada manualmente. A la muestra de compost control se le adicionó agua
peptonada 0.1% p/v estéril para mantener las condiciones de humedad similares.
Se emplearon envases de vidrio de 750 cm3 y cada uno fue adicionado con 150 g de
la muestra de compost (tabla 2). Este compost tenía la misma procedencia del cual
se aisló la cepa inicialmente, y se encontraba en fase mesofílica (1 semana). Cada
envase se selló con un tapón de caucho, se rotuló adecuadamente y se llevo a
incubar a 70ºC (figura 3). Previamente se tomaron muestras de cada tratamiento
correspondientes al tiempo cero (inicio del estudio) para el análisis de pH y
Salmonella spp.
29
El pH del compost fue medido semanalmente a los envases retirados para el
análisis de Salmonella spp. Éste se midió diluyendo una muestra de compost en
agua destilada relación 1:5 (Lemunier et al., 2005).
Para preparar el inóculo, un erlenmeyer de 500 ml con 180 ml de caldo BHI estéril
fue adicionado con el cultivo de 12h y llevado a incubación durante 10h a 37ºC y
130 rpm, tiempo durante el cual la cepa ha alcanzado ya la fase estacionaria y por
ende mayor termorresistencia (Pagan et al., 1997; Fang et al., 1996; Foster &
Spector, 1995). Para la cepa control se realizó la misma metodología bajo las
mismas condiciones, con la única diferencia que el tiempo de incubación del inóculo
30
fue de 12 horas, tiempo necesario para que la cepa de S. enteritidis alcanzara la
fase estacionaria.
A partir del inóculo se tomaron 0.5 ml y se realizaron diluciones seriadas (base 10)
en agua peptonada 0.1% p/v estéril hasta 10-8, sembrando por triplicado en
profundidad las ultimas tres diluciones (10-6, 10-7, 10-8) en agar BHI a fin de conocer
la concentración inicial en UFC/ml antes de iniciar el tratamiento térmico (Meza et
al., 2002). Así mismo, se realizó coloración de Gram para asegurar la pureza del
inóculo.
4a 4b
31
Las curvas a temperatura de 50, 60 y 70ºC se llevaron a cabo durante 120 minutos,
mientras la curva a 80ºC se realizó durante 240 minutos.
La curva de muerte térmica fue llevada a cabo en caldo compost (Galindo &
Londoño, 2005), suplementado con peptona de caseína al 2.5% (p/v), pH 7.0
(Anexo 1).
Se preparó una variación del caldo compost no filtrado, a fin de evaluar la incidencia
de los sólidos en la termorresistencia del microorganismo. De tal forma que se
realizaron dos curvas de muerte térmica a 80ºC x 120 minutos, una en caldo
compost filtrado y otra en caldo sin filtrar. Tanto el preinoculo como el inóculo se
desarrollaron en este medio. La metodología para el tratamiento térmico y la
recuperación de células viables fue la misma que se empleó para el caldo BHI.
4.4.3 Valor D
Para hallar el valor D a partir de las curvas de muerte térmica, se aplicó el modelo
propuesto por Stumbo (1973) representado en la siguiente fórmula matemática:
32
X
Dt =
No
ln
Nf
Donde:
Se halló un valor D lineal y un valor D Tail (con colas) para las gráficas que no
presentaron comportamiento lineal. Este valor se calculó teniendo en cuenta los
shoulders (hombros), mientras que en el valor D lineal solo se tuvieron en cuenta los
datos que presentaron comportamiento lineal decreciente (Humpheson et al., 1998).
33
5. RESULTADOS
Medio Resultado
MSRV Colonia blanquecina con halo grande de movilidad
XLD Colonias transparentes con centros negros. Fig 5a.
HECKTOEN Colonias verde-azules con centro negro. Fig. 5b.
SULFITO BISMUTO Colonias de color verde metálico con centro negro y
halo de precipitación. Fig. 5c.
TSI Reacción ALK/AC con producción de H2S. Fig 6c
LIA Reacción ALK/ALK con producción de H2S. Fig 6b
UREA Negativo, sin cambio de color del medio. Fig. 6a
COLORACIÓN DE GRAM Bacilos Gram negativos
Los resultados de las pruebas bioquímicas API 20E y BBL Crystal E/NF se muestran
en la tabla 4. En ambos casos el microorganismo fue identificado como Salmonella
spp.
34
5a 5b 5c
6a 6b 6c
Prueba Microorganismo % ID T
Salmonella spp. 99,9 0,97
Salmonella 0,1 0,25
API 20E choleraesuis ssp
arizonae
BBL Crystal E/NF Salmonella species 73,97 0,96
35
Los resultados del análisis mediante antisueros realizado en la Facultad de
Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia se muestran en la Tabla 5.
Análisis Resultado
ANTISUERO POLIVALENTE “O” Positivo, aglutinación
ANTISUERO GRUPO “B” Negativo, no aglutinó
ANTISUERO GRUPO “D” Negativo, no aglutinó
Con relación a la figura 8 que muestra los recuentos en UFC/ml, los resultados son
similares, solamente se observa un cambio en la hora 8 representado en el aumento
de la población, cambio que no se presenta en la gráfica de absorbancia (figura 7).
36
5.4 Microcosmos
37
Por otra parte, a temperatura de 60ºC la población inicial se vio disminuida en un
53.2% y a 70ºC en un 62%. No obstante gráficamente las curvas a 60 y 70ºC no
presentan una conducta linear decreciente, por el contrario exhiben un
comportamiento irregular conocido como shoulders (hombros) (Asselt & Zwietering,
2006).
2,5
2,0
Absorbancia 540 nm
1,5
1,0
0,5
0,0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Tiem po (m in)
Salm onella spp.
S. enteritidis
De igual forma sucede con las curvas de muerte térmica realizadas a temperatura
de 80ºC (figura 12), en donde no se presenta una tendencia lineal decreciente en la
inactivación de la cepa, pero con la variante que el tiempo de exposición al calor se
duplicó (240 minutos) para lograr la inactivación total de la cepa, siendo esta a los
180 minutos de tratamiento a pH 7.0 y de 105 minutos a pH 5.5.
38
9,5
9,0
8,5
Log UFC/ml
8,0
10
7,5
7,0
6,5
0 200 400 600 800 1000
T iem po (m in)
Salm onella spp.
S. enteritidis
90 7
80
6,5
70
60 6
NMP/4g
50
pH
5,5
40
30 5
20
4,5
10
0 4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (semanas)
100 Células/g
10 Células/g
pH
39
14 7
12 6,5
10
6
NMP/4g
pH
5,5
6
5
4
2 4,5
0 4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (semanas)
NMP/4g
pH
10
8
Log10 UFC/ml
2
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)
50ºC
60ºC
70ºC
Figura 11. Curvas muerte térmica a 50, 60 y 70ºC en caldo BHI a pH 7,0
40
10
6
Log10 UFC/ml
Tiempo (min)
pH 5,5
pH 7,0
10
6
Log10 UFC/ml
Tiempo (min)
Sin Filtrar
Filtrado
41
10
8
Log10 UFC/ml
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo (min)
Figura 14. Curva muerte térmica S. enteritidis a 70ºC en caldo BHI (pH 7.0)
5.5.1 Valor D
En la tabla 6 se presenta el valor D para cada una de las temperaturas y cada uno
de los medios empleados, con un valor D lineal y un valor D Tail (con colas) en
donde se tienen en cuenta los valores que no presentaron tendencia lineal
decreciente. En el caso de la curva de muerte térmica en caldo BHI a 50ºC no aplica
un valor D Tail debido a que el comportamiento de la gráfica fue lineal decreciente
durante todo el tratamiento.
42
En la tabla 7 se presenta el valor D correspondiente a la cepa de S. enteritidis con la
cual se comparó la cepa de estudio, y como era de esperarse los valores son
inferiores indicando una menor termorresistencia de la cepa.
Medio de cultivo Temperatura (ºC) Valor D lineal (min) Valor D Tail (min)
50 35.7 NA*
60 80.7 24.6
Caldo BHI pH 7,0 70 73.6 20.9
80 40.2 20.2
Caldo BHI pH 5,5 80 17.7 13.1
Caldo compost sin 24.5 8.1
filtrar 80
Caldo compost filtrado 31.8 14.52
* No Aplica
Medio de cultivo Temperatura (ºC) Valor D lineal (min) Valor D Tail (min)
Caldo BHI pH 7,0 70 10.8 16.9
43
6. DISCUSION DE RESULTADOS
Los datos de la fase estacionaria difieren con los obtenidos por Juneja & Marks
(2006), quienes requirieron para Salmonella spp, bajo las mismas condiciones
44
(caldo BHI sin suplementos), un período de tiempo de 18 horas para iniciar la fase
estacionaria, comparadas con las 8 horas requeridas en este estudio. Esto se debe
posiblemente a la elaboración del inóculo previo a la curva de crecimiento, ya que
mediante esta metodología se logra un proceso previo de adaptación por parte de la
cepa, propiciando de esta forma curvas de crecimiento en menor tiempo (Walker et
al., 1990; Gay et al., 1996).
6.3 Microcosmos
45
orgánicos por parte de los microorganismos fermentadores facultativos (Droffner &
Brinton, 1995). Durante la primer semana de estudio, el microcosmos exhibió el
mismo comportamiento descrito anteriormente presentando una leve disminución en
el pH acompañado de la reducción en la población de Salmonella spp (figura 9).
Ésta disminución en el crecimiento puede deberse a que el pH óptimo para
Salmonella spp oscila entre 5.5 y 7.4, siendo los valores más cercanos al neutro los
más favorables para su desarrollo (Weissinger et al., 2000), resultando un pH de 6.0
a temperatura de 70ºC sumamente hostil para su supervivencia ya que se dificulta la
síntesis de enzimas extracelulares encargadas de degradar el material orgánico
obstaculizándose de esta forma la toma de nutrientes por parte del microorganismo
(Tiquia et al., 1998).
Por otro lado, en la primera semana de tratamiento disminuyó la población inicial del
tratamiento 1 hasta 5 NMP/4g; y el tratamiento 2 hasta 2.13 NMP/4g, pero en la
segunda semana el incremento del pH estuvo acompañado de un alza poblacional
que alcanzó los mismos valores en ambos tratamientos, 6.7 y 6.58 NMP/4g,
sugiriendo que en ambos tratamientos, independientemente de la concentración
inicial de Salmonella spp, el medio posiblemente le proporciona al microorganismo
las condiciones necesarias para recuperarse de la injuria sufrida a causa de la
temperatura a la que fue sometida. Estas condiciones hacen referencia al sustrato
disponible y a la protección al calor suministrada por las partículas de gran tamaño
presentes en el compost (Galindo & Londoño, 2005), ya que como se demostró en
estudios llevados a cabo por Natvig et al., (2002) y Franz et al., (2005) un tamaño de
partícula mediano en suelos favorece la retención de agua y disminuye la tensión de
oxígeno, incrementando las posibilidades de colonización de los microorganismos,
garantizando la sobrevivencia de éstos en el suelo.
46
es inevitable e irreparable (Doyle & Mazzotta, 2000), es allí donde se llega a la
destrucción total del microorganismo.
Las curvas de muerte térmica realizadas tanto en caldo BHI (pH 5.5 y 7.0) como en
caldo compost, no muestran una tendencia linear decreciente, por el contrario
exhiben un comportamiento particular conocido como shoulders (hombros) o
comportamiento bifásico, el cual puede deberse a varias razones como la
heterogeneidad dentro de la población o la adaptación al calor durante el
tratamiento térmico (Stringer et al., 2000).
Las curvas de muerte térmica realizadas en caldo BHI (pH 7.0) a temperatura de 60,
70 y 80°C muestran una reducción que oscila entre 4 y 6 unidades logarítmicas de
47
la población inicial de Salmonella spp. durante los primeros 15 a 30 minutos de
tratamiento, tiempo después del cual se presenta un leve incremento en la población
microbiana que se mantiene estable durante cerca de 30 minutos antes de
presentar una disminución linear en la población (figura 11 y 12).
48
aplicación de un tratamiento térmico, la expresión de 7 proteínas con pesos
moleculares de 14, 16, 21, 23, 60, 75 y 89 KDa, relacionando su producción con el
incremento de la resistencia al calor por parte de estos microorganismos (Xavier &
Ingham, 1997). Si bien no se ha comprobado que se trata de proteínas que
confieran única y exclusivamente termorresistencia, si se ha reportado su papel en
la modificación de la pared celular a nivel de conformación para disminuir la
permeabilidad y por ende limitar la pérdida de material intracelular (Xavier & Ingham,
1997; Humpheson et al., 1998). Por consiguiente, es posible que durante el
tratamiento térmico ocurra la producción de proteínas de choque térmico (HSP) en
una pequeña cantidad de células y conlleve a la aparición de colas (tails) en las
curvas de microorganismos recuperados.
49
resultado de una rápida disminución en el oxígeno disuelto (causado por la
respiración de las células) que reduce el daño oxidativo al microorganismo (Doyle &
Mazzotta, 2000).
50
Igualmente, el medio de recuperación juega un papel fundamental ya que las células
injuriadas pueden repararse y crecer en un medio nutritivo pero son incapaces de
desarrollarse en un medio selectivo debido al incremento en la sensibilidad hacia
ciertos reactivos químicos empleados para aumentar la selectividad en los medios
de cultivo (Ray, 1993). Boziaris et al., (1998) reportan que las células de Salmonella
spp y S. typhimurium injuriadas mediante calor se tornan sensibles al desoxicolato,
agente selectivo empleado en el medio xilosa - lisina - desoxicolato (XLD). Las
células injuriadas pierden su resistencia normal y se vuelven sensibles a muchos
agentes químicos, además de perder compuestos celulares de bajo peso molecular
hacia el medio. De esta forma se sugiere que la mayoría de estudios deben emplear
medios nutritivos sin agentes selectivos para la recuperación de células injuriadas
por tratamientos térmicos (Stephens et al., 1997; Boziaris et al., 1998).
Por otra parte, el pH juega un papel fundamental como complemento para el calor
en el desarrollo de las curvas de muerte térmica, viéndose disminuido drásticamente
el tiempo requerido para la inactivación de Salmonella spp a temperatura de 80ºC
en caldo BHI ajustado a pH de 5.5 (figura 12), siendo en este estudio reducido a la
mitad comparado con el caldo BHI a pH de 7.0.
51
suministrado al microorganismo afecta de manera más directa el material
intracelular denaturando e impidiendo la síntesis de nuevas proteínas.
Para esta parte se trabajó con caldo compost filtrado y sin filtrar a temperatura de
80ºC debido a que previamente se había logrado la inactivación total de la cepa a
esta temperatura en caldo BHI.
52
desarrollar factores de termorresistencia como la síntesis de proteínas de choque
térmico (HSP) o el reensamble de las partículas ribosomales la célula necesita de
sustratos asimilables (Humpheson et al., 1998), por consiguiente, las partículas
suspendidas en el caldo compost sin filtrar podrían obstaculizar el acceso del
microorganismo a los nutrientes de fácil metabolismo.
Al comparar los resultados obtenidos en el caldo compost (filtrado – sin filtrar) con el
caldo BHI (pH 7.0) se observa una gran diferencia, pues la cepa en estudio resistió
75 minutos más el tratamiento térmico a 80ºC en el caldo BHI respecto al caldo
compost filtrado, y 120 minutos comparado con el caldo sin filtrar.
6.5 Valor D
En la tabla 6 se presentan los valores DL (Lineal) y DT (Tails “colas”) para cada uno
de los tratamientos realizados en este estudio. Como se puede observar el valor DL
53
corresponde al comportamiento de la cepa una vez ha sufrido la injuria, mientras
que en el valor DT se tienen en cuenta todos los valores obtenidos durante el
tratamiento térmico, es decir, antes, durante y después de sufrir injuria. Es por esto
que el valor DT es menor en todos los tratamientos realizados a Salmonella spp,
excluyendo el ensayo a 50ºC en donde el comportamiento de los datos fue lineal
decreciente y no presentó shoulders o tails (hombros o colas).
Caso contrario sucede con la cepa de Salmonella enteritidis, empleada como punto
de referencia para los ensayos, en donde el valor DL es menor que el DT (Tabla 7).
Esto puede deberse a que el comportamiento de la cepa fue diferente al exhibido
por el microorganismo de estudio. S. enteritidis no presentó comportamiento bifásico
ni recuperación durante el tratamiento térmico, lo cual podría suponer que no sufrió
de injuria bacteriana, y por ende, no desarrolló mecanismos de termorresistencia,
aunque se ha reportado en S. enteritidis la sobre-expresión de 2 proteínas de pesos
54
moleculares de 75 y 60 kDa luego de un tratamiento térmico, sugiriendo que se trate
posiblemente de proteínas de choque térmico (Xavier & Ingham, 1997). Sin
embargo, en este estudio no se podría sugerir que la cepa de referencia haya
sufrido de injuria, y por ende, hubiese exhibido algún mecanismo de
termorresistencia más allá del que le confieren sus proteínas regulares de
membrana y los componentes del medio.
55
7. CONCLUSIONES
• Fue posible establecer el valor DL y DT (Lineal – Tails “colas”) para cada uno
de los tratamientos a causa de la injuria bacteriana sufrida por la cepa,
siendo el valor DT el que presenta una disminución del 90% de la población
inicial en un menor tiempo de tratamiento.
56
8. RECOMENDACIONES
57
9. REFERENCIAS
ANGELIDIS, A.S. y SMITH, G.M. 2003. Role of the glycine betaine and carnitine
transporters in adaptation of Listeria monocytogenes to chill stress in defined
medium. Applied and Environmental Microbiology 69: 7492 – 7498.
BACON, R.T.; RANSOM, J.R.; SOFOS, J.N. ; KENDALL, P.A.; BELK, K.E. y SMITH,
G.C. 2003. Thermal inactivation of susceptible and multiantimicrobial-resistant
Salmonella straind grown in the absence or presence of glucose. Applied and
Environmental Microbiology 69: 4123 – 4128.
58
BAIRD-PARKER, A.C.; BOOTHROYD, M. y JONES, E. 1970. The effect of water
activity on the heat resistance of heat sensitive and heat resistance strains of
salmonellae. Journal of Applied Bacteriology 33: 515 - 522.
BRACKETT, R.E.; SCHUMAN, J.D.; BALL, H.R. y SCOUTEN, A.J. 2001. Thermal
inactivation kinetics of Salmonella spp. Within intact eggs heated using humidity-
controlled air. Journal of Food Protection 64: 934 – 938.
59
CHEN, Y.; CHEFETZ, B.; ROSARIO, R.; HEEMST, J.; ROMAINE, P. y HATCHER,
P. 2000. Chemical nature and composition of compost during mushroom growth.
Compost science and utilization 8 (4): 347.
CORRY, J.E.L. 1974. The effect of sugars and polyols on the heat resistance of
salmonellae. Journal of Applied Bacteriology 37: 31 - 43.
DOYLE, M.E. y MAZZOTTA, A.S. 2000. Review of studies on the termal resistance
of Salmonellae. Journal of Food Protection 63: 779-795.
60
EKLIND, Y.; HJELM, O.; KOTHÉUS, M. y KIRCHMANN, H. 2004. Formation of
chloromethoxybenzaldehyde during composting of organic household waste.
Chemosphere 56: 475 – 480.
FAN, P.H. y LOU, H.X. 2004. Isolation and structure identification of grape seed and
polyphenols and its effect on oxidative damage to cellular DNA. Acta Pharmaceutica
Sinica 39: 869 – 875.
FANG, F.C.; CHEN, C.Y.; GUINEY, D.G. y XU, Y.S. 1996. Identification of sigma
regulated genes in Salmonella typhimurium: complementary regulatory interactions
between sigma and cyclic AMP receptor proteins. Journal of Bacteriology 178: 5112
– 5120.
FOSTER, J.W. y SPECTOR, M.P. 1995. How Salmonella survives against all the
odds. Annual Reviews of Microbiology 49: 145 – 174.
FRANZ, E.; VAN DIEPENINGEN, A.; DE VOS, O.J. y VAN BRUGGEN, A.H.C. 2005.
The effect of cattle feeding regime and soil management type on the fate of
Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium in manure,
manure-amended soil and lettuce. Applied and Environmental Microbiology 71:6165-
6174.
61
GALINDO, L. y LONDOÑO, N. 2005. Aislamiento de bacterias termófilas y hongos
mesófilos a partir de l fracción orgánica de residuos sólidos urbanos. Tésis de
Pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de
Microbiología. Bogotá. 103p.
GIBBS, R.A.; HU, C.J.; SIDHU, J. y HO, G.E. 1998. Risks associated with human
pathogens in composted biosolids. En: Water TECH, Australian Water Wastewater
Association, Brisbane, Queensland, Australia. 1 – 12p.
GOEPFERT, J.M.; ISKANDER, I.K. y AMUNDSON, C.H. 1970. Relation of the heat
resistance of Salmonella to the water activity of the environment. Applied
Microbiology 19: 429 – 433.
GONG, C. 2007. Microbial safety control of compost material with cow dung by heat
treatment. Journal of Environmental Sciences 19: 1014-1019.
62
HARRIS, L.J; FARBER, J.N.; BEUCHAT, L.R.; PARISH, M.E.; SUSLOW, T.V.;
GARRETT, E.H. y BUSTA, F.F. 2003. Outbreacks associated with fresh produce:
Incidence, growth and survival of pathogens in fresh and fresh-cut produce.
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2: 78 – 141.
HEDBERG, C.W.; ANGULO, F.J.; WHITE, K.E.; LANGKOP, C.W.; SCHELL, W.L.;
STOBIERSKI, M.G.; SCHUCHAT, A.; BESSER, J.M.; DIETRICH, S.; HELSEL, L.;
GRIFFIN, P.M.; McFARLAND, J.W.; OSTERHOLM, M.T. y The Investigation Team.
1999. Outbreaks of salmonellosis associated with eating uncooked tomatoes:
implication for public health. Epidemiology Infection 122: 385–393.
HUMPHREY, T.J.; SLATER, E.; McALPINE, K.; ROWBURY, R.J. y GILBERT, R.J.
1995. Salmonella enteritidis phage type 4 isolates more tolerant of heat, acid, or
hydrogen peroxide also survive longer on surfaces. Applied and Environmental
Microbiology 61: 3161-3164.
63
INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR
FOODS (ICMSF). 1996. Microbiología de los Alimentos: Características de los
Patógenos Microbianos. Editorial Acribia. Zaragoza, España. Pp 147 – 151, 255 –
260.
ISLAM, M.; MORGAN, J.; DOYLE, M.; PHATK, S.; MILLNER, P. y JIANG, X. 2004.
Fate of Salmonella enteric Serovar typhimurium on carrots and radishes grown in
fields treated with contaminated manure compost or irrigation water. Applien and
Environmental Microbiology 70: 2497 – 2502.
JONES, P.W. 1982. Waste and animal health. The public Health Engineer 10: 35-39.
JUNEJA, V.K. y MARKS, H.M. 2006. Growth kinetics of Salmonella spp. pre-and
post- thermal treatment. International Journal of Food Microbiology 109: 54 – 59.
KINNER, J.A. y MOATS, W.A. 1981. Effect of temperature, pH, and detergent on
survival of bacteria associate with shell eggs. Poult. Sci 60: 761 - 767.
KNOLL, K.H. 1961. Public health and refuse disposal. Compost Science 2: 35 – 40.
64
LEGUÈRINEL, I.; SPEGAGNE, I.; COUVERT, O.; COROLLER, L. y MAFART, P.
2007. Quantifying the effects of heating temperatura, and combined effects of
heating médium pH on the heat resistance of Salmonella typhimurium. International
Journal of Food Microbiology 116: 88-95.
LINDQUIST, S. y CRAIG, E.A. 1988. The heat shock proteins. Annu. Rev. Genet.
22: 631 – 677.
65
NATVIG, E.E.; INGHAM, S.C.; INGHAM, B.H.; COOPERBAND, L.R. y ROPER, T.R.
2002. Salmonella enterica serovar typhimurium and Escherichia coli contamination
of root and leaf vegetables grown in solis with incorporated bovine manure. Applied
and Environmental Microbiology 68: 2737 – 2744.
PELL, A.N. 1997. Manure and microbes: Public and animal health problem. Journal
of dairy science 80: 2673-2681.
66
POUTOU, R.; AMADOR, E. y CANDELARIO, M. 1994. Banco de células primarias
(BCP): Caracterización y papel en la producción de proteínas recombinantes.
Biotecnología Aplicada 11: 55 - 59.
RAY, B. 1993. Sublethal injury, bacteriocins and food microbiology. ASM News 59:
285 – 291.
READ, R.B.; BRADSHAW, J.G.; DICKERSON, R.W. y PEELER, J.T. 1968. Thermal
resistance of Salmonellae isolated from dry milk. American Society for Microbiology
16: 998 – 1001.
RYSER, E. y MARTH, E. 1999. Listeria, Listeriosis and food safety. 2nd Edition.
Editorial Marcel Decker, Inc. New York, Estados Unidos.
67
SOLOMON, E.B.; YARON, S. y MATTHEWS, K.R. 2002. Transmission of
Escherichia coli O157:H7 from contaminated manure and irrigation water to lettuce
plant tissue and it subsequent internalization. Applied and Environmental
Microbiology 68: 397 – 400.
TIQUIA, S.M.; TAM, N.F. y HODGKISS, I.J. 1998. Salmonella elimination during
composting of spent pig litter. Biores. Technol. 63: 193 – 196.
68
THUNBERG, R.L.; TRAN, T.T.; BENNETT, RW.; MATTHEWS, R.N. y BELAY, N.
2002. Microbial evaluation of selected fresh produce obtained at retail markets.
Journal of Food Protection 65: 677– 82.
XAVIER, I.J. y INGHAM, S.C. 1997. Increased D-values for Salmonella enteritidis
following heat shock. Journal of Food Protection 60: 181 – 184.
69
ZHUANG, R.Y.; BEUCHAT, L.R. y ANGULO, F.J. 1995. Fate of Salmonella
montevideo on and in raw tomatoes as affected by temperature and treatment with
chlorine. Applied Environmental Microbiology 61: 2127–2131.
RECURSOS ELECTRONICOS
70
10. ANEXOS
Preparación:
Observaciones:
• Para la preparación del caldo compost sin filtrar se omitió el paso 4, los
demás se realizaron tal y como esta descrito.
71
ANEXO 2. Resultados Número Más Probable de Salmonella spp. según el Método de la
EPA Nº 1682/2006
1. Fase de enriquecimiento
Muestra Concentración
10ml TSB 3x 5ml TSB 3x 10ml TSB 1x
M1 5 4 4
M2 5 5 4
S1-10A 3 0 0
S1-10B 2 0 0
S1-10C 1 1 0
S1-100A 0 5 0
S1-100B 0 5 5
S1-100C 5 0 0
S2-10A 3 0 0
S2-10B 5 0 0
S2-10C 5 0 0
S2-100A 4 0 0
S2-100B 2 4 0
S2-100C 5 0 0
S3 0 0 0
S4 0 0 0
S5 0 0 0
S6 0 0 0
S7 0 0 0
S8 0 0 0
S9 0 0 0
M1: Muestra de compost inoculada con 10 M.O
M2: Muestra de compost inoculada con 100 M.O
S1: Número de la semana en la cual se realiza el muestreo
10-100: Número de células/g inoculados a la muestra (Salmonella spp.)
A,B,C: Número de replicas
72
3. Porcentaje de peso seco
73
4. Resultado NMP/4g
Muestra NMP/4g
M1 17.93
M2 84.46
S1-10 A 2.96
S1-10 B 1.88
S1-10 C 1.55
S1-100 A 4.6
S1-100 B 4.6
S1-100 C 5.79
S2-10 A 3.61
S2-10 B 6.65
S2-10 C 9.48
S2-100 A 4.99
S2-100 B 6.98
S2-100 C 8.035
S3-10 A.B.C 1.08
S3-100 A.B.C 0.72
S4-10 A.B.C 0.62
S4-100 A.B.C 0.76
S5-10 A.B.C 0.64
S5-100 A.B.C 0.57
S6-10 A.B.C 0.84
S6-100 A.B.C 0.62
S7-10 A.B.C 0.53
S7-100 A.B.C 0.52
S8-10 A.B.C 0.46
S8-100 A.B.C 0.48
S9-10 A.B.C 0.43
S9-100 A.B.C 0.44
74
5. Fase de enriquecimiento del control
Muestra Concentración
10ml TSB 3x 5ml TSB 3x 10ml TSB 1x
C0 5 4 2
C1 0 0 0
C2 0 0 0
C3 0 0 0
C4 0 0 0
C5 0 0 0
C6 0 0 0
C7 0 0 0
C8 0 0 0
C9 0 0 0
Muestra NMP/4g
C0 11.6
C1 0.63
C2 0.75
C3 1.0
C4 0.56
C5 0.52
C6 0.64
C7 0.53
C8 0.46
C9 0.44
75
ANEXO 3. RECUENTOS CURVAS DE MUERTE TÉRMICA
76
3. Salmonella spp. 70ºC en caldo BHI
77
5. Salmonella spp. 80ºC en caldo BHI a pH 5.5
78
7. Salmonella spp. 80ºC en caldo compost sin filtrar
79
ANEXO 4. RECUENTOS Y ABSORBANCIAS DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO
80
3. Absorbancia curva de 4. Absorbancia curva de
crecimiento S. enteritidis crecimiento Salmonella spp.
81