ÍNDICE DE CONTENIDOS

Contenido Páginas
RESUMEN ........................................................................................................................ i
CAPITULO I .....................................................................................................................1
Introducción .......................................................................................................................1
1.1. Antecedentes...............................................................................................................1
1.2. Revisión bibliográfica.................................................................................................2
1.3. Conceptualización ......................................................................................................4
1.3.1 Hongo antártico. .............................................................................................. 4
1.3.2 Pigmento microbiano....................................................................................... 4
1.3.3 Fibra textil. ...................................................................................................... 4
1.3.4 Contaminación del agua. ................................................................................. 5
1.3.5 Fermentación sumergida.................................................................................. 5
1.4 Definición del problema ..............................................................................................5
1.5 Justificación .................................................................................................................6
1.6 Pregunta directriz .........................................................................................................7
1.7 Objetivos......................................................................................................................7
1.7.1 General............................................................................................................. 7
1.7.2 Específicos. ...................................................................................................... 7
1.8 Hipótesis ......................................................................................................................7
1.9 Marco legal ..................................................................................................................8
CAPITULO II ..................................................................................................................10
Marco metodológico ........................................................................................................10
2.1 Caracterización del área de estudio ...........................................................................10
2.2 Materiales y métodos .................................................................................................10
2.2.1 Cepas de hongos y selección. ........................................................................ 10
2.2.2 Fermentación sumergida................................................................................ 11
2.2.3 Extracción de pigmentos extracelulares e intracelulares. .............................. 11
2.2.4 Estimación de la biomasa y pigmentos.......................................................... 12
2.2.5 Caracterización de los pigmentos. ................................................................. 12
2.2.6 Tinción de fibras textiles. .............................................................................. 13
2.2.7 Caracterización molecular de las cepas productoras de pigmentos. .............. 13
2.2.8 Diseño experimental. ..................................................................................... 13
2.2.9 Consideraciones bioéticas. .....................................................................................13
CAPITULO III ................................................................................................................14
Marco administrativo .......................................................................................................14
3.1 Cronograma de actividades .......................................................................................14
3.2 Presupuesto ................................................................................................................15
3.2.1 Costos ............................................................................................................ 15
3.2.2 Financiamiento .............................................................................................. 16
Referencias ......................................................................................................................17
 UNIVERSIDAD TÉCNICA DEL NORTE
FACULTAD DE INGENIERÍA EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y
AMBIENTALES
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

OBTENCIÓN DE PIGMENTOS NATURALES DE HONGOS ANTÁRTICOS

CULTIVADOS EN FERMENTACIÓN SUMERGIDA A ESCALA DE
LABORATORIO
Anteproyecto del trabajo de titulación

Nombre del estudiante: Luna Ramos Oscar Daniel

RESUMEN

Los pigmentos naturales tienen propiedades anticancerígenas, antiinflamatorias,

antioxidantes que los vuelve candidatos para su aplicación en las industrias de los
alimentos y fármacos. Sin embargo, no hay muchos avances con aquellos enfocados en
fibras textiles. Además, la aplicación de pigmentos microbianos ayudaría a reducir la
contaminación del agua que causan las aguas residuales de este tipo de industrias. Para
dicho fin pueden ser usados microrganismos como hongos para la producción de
pigmentos. Por lo tanto, en el presente estudio se utilizarán hongos antárticos
proporcionados por el Laboratorio de Investigaciones Ambientales (LABINAM), los
mismos que serán cultivados mediante fermentación líquida con pH 5.3, temperatura de
28 º C. La extracción de los pigmentos intracelulares y extracelulares se realizará con
etanol al 90%, la cuantificación de la biomasa será obtenida mediante peso seco y la
estimación del pigmento será mediante espectrofotometría, el proceso será
complementado con la caracterización del pigmento con cromatografía. Después se
realizará la tinción en fibras textiles como el algodón. Se espera que el rendimiento del
pigmento producido por los hongos antárticos sea significativo y la adhesión de este en
la fibra textil sea muy buena. Así mismo que mediante la cromatografía se pueda
determinar la composición de los pigmentos fúngicos. Los pigmentos extraídos pueden
ser sometidos a más pruebas en futuros estudios, porque, pueden darse usos que vayan
más allá del campo textil.

Palabras clave: Hongo antártico, pigmento microbiano, fibra textil, contaminación del
agua, fermentación sumergida

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 CAPITULO I
Introducción
1.1. Antecedentes

Un pigmento es una sustancia usada para colorear algún tipo de material y es así que los
pigmentos orgánicos fabricados a partir de fuentes naturales se han utilizado durante siglos,
pero la mayoría de ellos en la actualidad son inorgánicos y sintéticos (Encyclopaedia
Britannica, 2019). Algunos ejemplos de pigmentos inorgánicos son: óxidos de hierro, dióxido
de titanio, cadmios, cromatos de plomo, óxido de cromo y óxidos metálicos mixtos (Muller,
2011). Estos compuestos se usan en pinturas, tintas, plásticos, telas, cosméticos y alimentos,
entre otros (American Chemical Society, n.d.).
Los pigmentos de origen natural, generalmente se extraen de frutas, verduras, semillas,
raíces y microorganismos que a menudo se denominan "biocolores" debido a su origen
biológico (Heer & Sharma, 2017; Kaur, Ghoshal, & Jain, 2019). Por otro lado, los colorantes
sintéticos están siendo sustituidos por aquellos naturales, y éstos tienen un mercado estimado
en US $ 600 millones y que crece constantemente alrededor del 2% anual, además, los
pigmentos naturales suelen ser más fáciles de metabolizar que sus homólogos y presentan
propiedades bioactivas beneficiosas, como es el caso de los carotenoides, así mismo, los
pigmentos microbianos son adecuados para la producción en masa, en comparación con
extractos vegetales o animales (De Carvalho et al., 2014).
Los pigmentos microbianos suelen ser obtenidos de bacterias, hongos y microalgas, los
cuales se producen a escala industrial y son usados en alimentos, productos farmacéuticos,
cosméticos y textiles, no obstante, la extracción de estos compuestos en formas relativamente
puras y concentradas es el principal desafío tecnológico (Rodriguez-Amaya, 2016; Venil,
Zakaria, & Ahmad, 2013). Aquellos pigmentos como el caso del β- caroteno, astaxantina,
ankaflavina , incluso la riboflavina que a pesar de ser una vitamina, puede ser utilizada como
pigmento natural se encuentran actualmente disponibles en el mercado (Sen, Barrow, &
Deshmukh, 2019).
Los hogos producen una clase interesante de metabolitos secundarios que funcionan como
pigmentos, los cuales son llamados azafilonas, que recientemente muchas industrias
farmacéuticas lo están usando en sus productos (Akilandeswari & Pradeep, 2016; Tirumale &
Wani, 2018). Un ejemplo representativo es la producción industrial de pigmentos amarillos y
1
rojos mediante fermentación sumergida y fermentación en estado sólido haciendo uso de
Monascus sp. (Liu, Zhao, Huang, Xin, & Wang, 2018; Srianta et al., 2014; Vendruscolo et al.,
2016).
Las algas de igual forma han sido aplicadas para la producción de pigmentos con algunas
especies de microalgas (llamadas microalgas carotenogénicas), principalmente los
representantes de Chlorophyta, se encuentran entre las fuentes biológicas más ricas de
carotenoides, como el β-caroteno y la astaxantina (Solovchenko & Chekanov, 2014).
Espirulina platensis es usada para la producción de ficocianina, la cual tiene las características
de alta eficiencia y baja toxicidad, y se puede utilizar como un alimento funcional (Jiang et al.,
2017; Kumar, Dhar, Pabbi, Kumar, & Walia, 2014).
Un especto importante que se debe tomar en cuenta es la búsqueda de nuevas especies que
sirvan como fuentes de pigmentos mediante bioprospección (Celestino et al., 2014).
Afortunadamente, Ecuador posee espacios geográficos locales e internacionales para hacer
investigación, tal es el caso de la base científica Pedro Vicente Maldonado, ubicada en la
Antártida (Instituto Antártico Ecuatoriano, 2017). El aprovechamiento de estos espacios ayuda
generar conocimiento científico contribuyendo a la vez con una de las metas del Plan Nacional
de Desarrollo 2017 – 2021 Toda una Vida (SENPLADES, 2017).
En Ecuador existen trabajos de investigación relacionados a los pigmentos naturales como
el de Cano, (2011) donde se extrajo tres pigmentos vegetales a partir del Mortiño (Vaccinium
myttillus L.) mora de castilla (Rubus glaucus) y del mucílago interno que recubre a la semilla
del tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.), así mismo se ha realizado una tesis por Loaiza,
(2016) en la cual se extrajo pigmentos natural a nivel de laboratorio de Pycnoporus sanguineus
y su posterior aplicación en el teñido de fibras de lana y algodón.

1.2. Revisión bibliográfica

Para el cultivo de los microorganismos es importante determinar la escala en la que se va a

trabajar, más que todo el volumen como Crater & Lievense, (2018) ejemplifican que a pequeña
escala se puede trabajar desde 0.05L a 10L. A pesar de los avances recientes, los matraces
tradicionales agitados con volúmenes nominales por debajo de 250 ml se usan con frecuencia,
que facilita el control y medición de parámetros como temperatura, pH, realizar cinéticas de
crecimiento y producción (Marques, Cabral, & Fernandes, 2010).
El cultivo de los diferentes microrganismos de interés se lleva a cabo mediante fermentación
en estado sólido (SSF) o fermentación sumergida (SmF), aun cuando se realza un número
2
mayor de investigaciones en SSF que en SmF por las ventajas que ofrece el primero (B.-B.
Zhang, Lu, & Xu, 2015). La fermentación sumergida resulta útil porque el medio de es más
fácil de esterilizar, de igual manera, permite el control eficiente de parámetros pH, temperatura,
humedad, la transferencia de oxígeno y la aireación (Suriya, Bharathiraja, Krishnan,
Manivasagan, & Kim, 2016).
Los microorganismos producen diversos pigmentos que presentan propiedades atractivas
(Tuli, Chaudhary, Beniwal, & Sharma, 2015). En primer lugar está la antioxidante como es el
caso de los carotenoides que han sido ampliamente descritos (Dasgupta & Klein, 2014). Este
compuesto producido por Micrococcus spp ha sido evaluado para ver su capacidad protectora
contra los rayos UV (Mohana, Thippeswamy, & Abhishek, 2013). En una investigación similar
se observó la capacidad de producción de caroteno por parte bacterias del género Pedobacter
aisladas de la Antártida (Correa-llantén, Amenábar, & Blamey, 2012). Se ha demostrado que
un compendio de pigmentos extraídos del género de hongo Monascus posee actividad
antioxidante, pero aún no se han identificado pigmentos específicos responsables de la
actividad (Srianta et al., 2017).
Otra de las propiedades que presentan los pigmentos microbianos es la anticancerígena,
como muestra de esto se ha estudiado un pigmento caracterizado como estafiloxantina de
Staphylococcus gallinarum, su actividad fue evaluada por un ensayo de citotoxicidad en 4
líneas celulares de cáncer diferentes, los resultados del estudio sugieren que éste compuesto
puede actuar como agente terapéutico potencial (Barretto & Vootla, 2018). Una investigación
llevada a cabo con Pseudomonas aeruginosa permitió obtener un pigmento llamado ácido
fenazina-1-carboxílico(PCA) y para su posterior prueba anticancerígena en un línea celular de
melanoma de piel humana SK-MEL-2, el PCA mostró ser efectivo (Patil, Paradeshi, &
Chaudhari, 2016). Un carotenoide conocido como fucoxantinol extraído de Pseudomonas
stutzeri JGI 52 mostró potencial apoptótico en las líneas celulares cancerosas (Shukla &
Varalakshmi, 2018).
Un enfoque con gran demanda de desarrollo es el de obtener compuestos con actividad
antimicrobiana, en este caso se ha identificado y evaluado dos pigmentos, uno violeta
denominado violaceina (Aruldass, Masalamany, Venil, & Ahmad, 2018; Durán et al., 2016) y
otro rojo más ampliamente estudiado conocido como prodigiosina presente en algunas especies
Serratia sp y otras cepas microbianas no relacionadas, como Streptomyces griseoviridis,
Pseudomonas magnesiorubera, Vibrio sp, el pigmento actúa contra una amplia variedades de
bacterias grampositivas y negativas (Danevčič, Borić Vezjak, Tabor, Zorec, & Stopar, 2016;

3
Li et al., 2018), por ejemplo, se ha visto eficaz la aplicación de este compuesto obtenido de
Serratia marcescens en la inhibición del crecimiento de una bacteria de interés clínico como
es Pseudomonas aeruginosa (Kimyon et al., 2016).
La extracción de los pigmentos de manera general se realiza con ayuda de solventes como
etanol, acetato de etilo, metanol, complementado con procesos de agitación con calor,
centrifugación y filtrado, por ejemplo, según Babitha, Soccol, & Pandey, (2006), donde se tomó
una cantidad conocida de materia fermentada en un matraz cónico de 250 ml y se mezcló con
etanol al 90% (agregando 5 ml de etanol por gramo de materia fermentada en base a la biomasa
seca). El contenido se mezcló en un agitador rotatorio a 200 rpm durante 1 h, se dejó reposar
durante 15 minutos y se filtró con papel de filtro Whatman No. 1, el extracto de etanol del
sustrato no fermentado se mantuvo como blanco para el análisis de pigmento
La aplicación de pigmentos microbianos se ha reportado en varios estudios, en los cuales se
han usado para la tinción de fibras textiles como lana, algodón, seda, poliéster incluso cuero
(Gulani, Bhattacharya, & Das, 2012). Además, los pigmentos han conferido propiedades
interesantes en las fibras, porque se ha reportado actividades antimicrobianas (Chadni,
Rahaman, Jerin, Hoque, & Reza, 2017; Kanelli et al., 2018). Los estudios se complementan
con la identificación y purificación de los pigmentos con técnicas como cromatografía de capa
fina (Pandey, Jain, Pandey, & Tamta, 2018),espectrofotometría UV y HPLC (Pandiyarajan,
Premasudha, & Kadirvelu, 2018; Serive et al., 2017).

1.3. Conceptualización
1.3.1 Hongo antártico.
El aquel hongo que ha sido aislado de muestras de suelo, líquenes, rocas y otros , las mismas
son provenientes de zonas pertenecientes al continente Antártico (Ruisi, Barreca, Selbmann,
Zucconi, & Onofri, 2007).
1.3.2 Pigmento microbiano.
Es aquella sustancia natural que puede provenir de hongos, bacterias o microalgas, en los
microrganismos cumplen funciones biológicas, como aquella relacionada con la actividad
antioxidante (Babitha, 2009).

1.3.3 Fibra textil.

Una fibra textil es una unidad de materia, ya sea natural o manufacturada, que constituye el
elemento básico de los tejidos y otras estructuras textiles (Qin, 2016).

4
1.3.4 Contaminación del agua.
Cualquier alteración directa o indirecta de las propiedades físicas, químicas, biológicas y de
cualquier cuerpo de agua por descarga, emisión o depósito de desechos que a su vez causan
efectos adverso para la salud pública, el medio ambiente o el bienestar de los animales, plantas
,la vida silvestre y acuática (Balasuriya, 2018).

1.3.5 Fermentación sumergida.

Es la tecnología en la cual se utilizan sustratos líquidos que fluyen libremente como la
melaza y los caldos. Los productos finales de la fermentación se liberan en el caldo de
fermentación (Suriya et al., 2016).

1.4 Definición del problema

Los pigmentos sintéticos pueden dividirse en dos grandes grupos como son aquellos
denominados orgánicos e inorgánicos, que pueden ser bases, sales u óxidos (Herbst, Hunger,
Wilker, Ohleier, & Winter, 2005). A pesar de que en el mercado actualmente se comercializan
pigmentos de fuentes naturales, la mayoría de ellos están destinados a las industrias
farmacéuticas y alimenticias, pero no se constata progresos con aquellos que estén dirigidos a
su aplicación en fibras textiles, lo cual significa que es un reto, en relación a una producción
viable, optimización y aceptación del público, a su vez se debe superar la producción a escala
laboratorio (Narsing Rao, Xiao, & Li, 2017).
Aquellos pigmentos producidos por síntesis química tienen aspectos negativos debido a que
la mayoría contienen metales pesados o metales de transición que pueden afectar
negativamente al ambiente y la salud humana si se superan los niveles críticos (Jansen &
Letschert, 2000; Khan & Malik, 2014; Lai & Christiani, 2013). Adicionalmente, los tintes son
uno de los componentes que tienen dificultad de ser tratados porque tienen grandes cantidades
de metales pesados como Cr, As, Au, Zn y otros, adicionalmente, puede traducirse a costos
elevados al momento de tratar este tipo de agua ya sea con métodos, químicos, físicos o
biológicos (R Ananthashankar, 2013; Stefanakis, Akratos, & Tsihrintzis, 2014).
La industria textil considerada una de las que más contamina después de la industria
petrolera debido a que contribuye con emisiones de dióxido de carbono y principalmente
genera aguas residuales (ONU, 2018). El agua residual textil contaminada con químicos
degrada la calidad del suelo y el agua, en consecuencia producen problemas importantes de

5
contaminación ambiental (Pattnaik, S, & Kumar, 2018). Las industrias textiles comúnmente
liberan una gran cantidad de aguas residuales, que contiene varios tintes de telas como el
componente principal, estas aguas residuales se caracterizan por su color fuerte, alta salinidad,
alta temperatura, pH variable y alta DQO (Demanda química de oxígeno). En general, la
mayoría de las industrias textiles manejan una gran cantidad de tintes sintéticos, sulfuro de
sodio, sal de Glauber (en solución de baño de tinte) y peróxido de hidrógeno (como agente
oxidante) (Vijayaraghavan & Shanthakumar, 2015).
Los efluentes de las industrias textiles que se descargan en los ríos, a menudo tienen un
color rojo púrpura oscuro debido a los colorantes azoicos, que pueden transformarse en aminas
aromáticas cancerígenas, por lo tanto, los productos químicos utilizados en el teñido no se
degradan fácilmente en la naturaleza y, conlleva su precipitación en los sedimentos de ríos , a
pesar de ello, poco se sabe sobre cómo los químicos del teñido afectan los sedimentos y el agua
de los ríos o cuánto tiempo persisten porque son difíciles de controlar (Ito, Adachi, Yamanashi,
& Shimada, 2016).
Las altas concentraciones de tintes textiles en cuerpos de agua detienen la capacidad de
reoxigenación del agua y no permiten pasar con facilidad la luz solar, lo que altera la actividad
biológica en la vida acuática y también el proceso de fotosíntesis de las plantas acuáticas o
las algas y la muerte de zooplancton (Gita, Hussan, & Choudhury, 2017).

1.5 Justificación
Los microorganismos con capacidad de producir pigmentos pueden ser asilados de espacios
geográficos locales e internacionales, gracias a convenios y programas de investigación que al
mismo tiempo ayuda con la generación que conocimiento científico (Ministerio del Ambiente,
2011; SENPLADES, 2017).
Esta investigación forma parte del programa antártico del Ecuador, en el cual la Universidad
Técnica del Norte forma parte con la participación del LABINAM, en donde se encuentra un
banco de cepas como resultado de los proyectos de investigación que se llevan a cabo en el
laboratorio. La línea de investigación de los pigmento está respaldada porque se han encontrado
microrganismos de la Antártida que muestran diferentes pigmentaciones como azul, rosada,
roja, anaranjada, amarilla con propiedades antioxidantes y de protección a la radiación UV que
pueden ser estudiados y aprovechados (Duarte et al., 2019).
Por otro lado, las industrias generan contaminación con impactos negativos en suelo, aire y
principalmente agua, muestra de ello según la UNESCO (2017) estima más del 80% de las

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aguas residuales en los países en vías de desarrollo se descarga sin tratamiento, contaminando
ríos, lagos y zonas costeras. La industria textil produce serios problemas de contaminación en
el agua, relacionada con la tinción de las fibras textiles, por tal razón, es imprescindible el
desarrollo de nuevos compuestos biotecnológicos destinados para dicha actividad, para este fin
se puede utilizar microorganismos como hongos, bacterias y microalgas que resultan ser
versátiles ya que para su cultivo se emplea desechos agroindustriales, domésticos, que se suma
al hecho de aprovechar y gestionar residuos (Mansi & Gaurav, 2016; Ravindran & Jaiswal,
2016).
El empleo de pigmentos de especies microbianas puede contribuir significativamente para
que los efluentes de aguas servidas de la industria textil tengan impactos mínimos para el
ambiente y que su tratamiento se facilite, lo que conduce a una disminución en el costo
económico del tratamiento de aguas residuales. En el contexto nacional, el sector textil es el
segundo que genera empleo, quiere decir que es importante eje económico (Líderes, 2017). Así
mismo, la provincia de Imbabura perteneciente a la zona 1, está situada en el quinto lugar donde
se asientan la mayor cantidad de establecimientos dedicados a la industria textil (INEC, 2012).

1.6 Pregunta directriz

¿Es posible obtener pigmentos naturales de hongos de la Antártida mediante fermentación
sumergida?
1.7 Objetivos
1.7.1 General.
Obtener pigmentos naturales de hongos antárticos cultivados en fermentación sumergida a
escala de laboratorio

1.7.2 Específicos.
 Cultivar dos cepas de hongos antárticos mediante fermentación sumergida
 Caracterizar los pigmentos naturales extraídos del cultivo de las dos cepas
 Determinar la capacidad de tinción de los pigmentos naturales obtenidos
1.8 Hipótesis
Los hongos aislados de la Antártida cultivados mediante fermentación sumergida producen
pigmentos naturales

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1.9 Marco legal
La investigación que se llevará a cabo está sujeta a lineamientos y normativas, en primer
lugar, está la Constitución Nacional del Ecuador con los siguientes artículos:
El artículo 75, serán funciones principales de las universidades y escuelas politécnicas, la
investigación científica, la formación profesional y técnica, la creación y desarrollo de la
cultura nacional y su difusión en los sectores populares, así como el estudio y el planteamiento
de soluciones para los problemas del país, a fin de contribuir a crear una nueva y más justa
sociedad ecuatoriana, con métodos y orientaciones específicos para el cumplimiento de estos
fines. Con esto se busca que los trabajos de investigación puedan ser aplicado en beneficios de
la sociedad.
El artículo 161, el Congreso Nacional aprobará o improbará los siguientes tratados y
convenios internacionales: los que comprometan al país en acuerdos de integración. Nuestro
país es signatario del Tratado Antártico lo que ha permitido la creación del Instituto Antártico
Ecuatoriano por lo que es importante mencionar que el trabajo de investigación ayudará con
una de las funciones de esta organización como es la de fomentar y desarrollar actividades
científicas. Dichas actividades a su vez permiten cumplir con objetivos y metas del Plan de
Desarrollo Toda una vida, de forma más específica con la generación de bioconocimiento
(Asamblea Nacional del Ecuador, 2008; Instituto Antártico Ecuatoriano, 2017).
En el país en materia de marco legal, existen las leyes orgánicas que contribuyen con estatutos
y artículos más específicos como en el caso de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Derechos de los profesores o profesoras e investigadores o investigadoras. - Son derechos de
las y los profesores e investigadores de conformidad con la Constitución y esta Ley los
siguientes: a) Ejercer la cátedra y la investigación bajo la más amplia libertad sin ningún tipo
de imposición o restricción religiosa, política, partidista, cultural o de otra índole; b) Contar
con las condiciones necesarias para el ejercicio de su actividad, cabe mencionar que las
investigaciones deben darse bajo normativas de las instituciones y del organismo rector de la
educación superior.
El artículo 8, fines de la Educación Superior. - La educación superior tendrá los siguientes
fines: e) Aportar con el cumplimiento de los objetivos del régimen de desarrollo previsto en la
Constitución y en el Plan Nacional de Desarrollo; f) Fomentar y ejecutar programas de
investigación de carácter científico, tecnológico y pedagógico que coadyuven al mejoramiento
y protección del ambiente y promuevan el desarrollo sustentable nacional en armonía con los
derechos de la naturaleza constitucionalmente reconocidos, priorizando el bienestar animal;

8
 El artículo 160, fines de las instituciones de educación superior.- Corresponde a las
instituciones de educación superior producir propuestas y planteamientos para buscar la
solución de los problemas del país (CES, 2010).
Por otro lado, está el Código Orgánico Ambiental, que en su artículo 5, derecho de la población
a vivir en un ambiente sano. El derecho a vivir en un ambiente sano y ecológicamente
equilibrado comprende: 4) la conservación, preservación y recuperación de los recursos
hídricos, cuencas hidrográficas y caudales ecológicos asociados al ciclo hidrológico; 8) el
desarrollo y uso de prácticas y tecnologías ambientalmente limpias y sanas, así como de
energías alternativas no contaminantes, renovables, diversificadas y de bajo impacto ambiental
(Del Pozo, 2017).

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 CAPITULO II
Marco metodológico

2.1 Caracterización del área de estudio

El estudio se realizará en la zona 1, provincia de Imbabura, ciudad de Ibarra en el
Laboratorio de Investigaciones Ambientales (LABINAM) ubicado en el antiguo hospital San
Vicente de Paul.

Figura 1. Mapa de ubicación del Laboratorio de Investigaciones Ambientales

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Cepas de hongos y selección.
Las cepas serán proporcionadas por el Laboratorio de Investigaciones Ambientales
(LABINAM) , las mismas son procedentes de la Antártida (Oña, 2016). Los hongos se
mantienen en cajas petri con PDA como un medio estándar para el crecimiento de estos
organismos (Celestino et al., 2014; Tsuji et al., 2013) al mismo tiempo que se mantiene en
refrigeración 4 ºC. Por otro lado, para el estudio se procederá a mantener los cultivos a
condiciones ambientales y 32 ºC para estresar y adaptar los hongos antárticos. Para su
crecimiento el tiempo estimado será de 7 días (Wentzel et al., 2019) o dos semanas (Tsuji et
al., 2013).
La selección será de forma cualitativa en función de criterios de intensidad de la pigmentación
utilizando la siguiente tabla. Las cepas seleccionadas serán aquellas que tengan la calificación
más alta.

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Tabla 1
Criterios de selección de las cepas de experimentación
Cepas Intensidad de pigmentación
Petar 1 xxx
Moho 1 xxx
M3 x
M2 xx
Nota: Intensidad de pigmentación, baja x, media xx, y alta xxx

2.2.2 Fermentación sumergida.

El procedimiento consta en su primera etapa de la inoculación mediante la transferencia de
un disco de 5 mm (~ 6 × 108 esporas / mL) de una colonia de hongo mantenida a 32 º C en
PDA por 7 días en un frasco de 125 ml con 50 ml de Caldo Papa Dextrosa como como en los
estudios de (Pandey et al., 2018; Stanly Pradeep & Pradeep, 2013) y en un medio que contiene
(gramos por litro): sacarosa, 50; (NH4)2 SO4, 2.5; KH2PO4, 1,0; MgSO4 · 7H2O, 0.5; NaCl,
0.01; CaCl2 · 2H2O, 0.01; y 1 g de extracto levadura, en este último se puede variar la fuente
de carbono, adicionalmente este medio ha sido utilizado para el crecimiento de hongos
antárticos para la extracción de antioxidantes. El pH debe ser ajustado a 5.3 con HCl a una
temperatura de 28 º C, ya que se ha reportado ser óptima en la producción de pigmentos de
cepas Monascus sp, demás la incubación se realizará durante 7 días (Dimitrova et al., 2013) o
dos semanas (Tsuji et al., 2013).

2.2.3 Extracción de pigmentos extracelulares e intracelulares.

El procedimiento se realizará como plantea (Velmurugan, Lee, et al., 2010) con ligeras
modificaciones y complementaciones. Para los pigmentos extracelulares, se añaden 5 ml de
etanol al 90% por cada mililitro del fermentado pigmentado tomado. Tanto el solvente como
la muestra se mantienen en un agitador rotatorio a 200 rpm por 1 hora con una temperatura de
30 ºC (Velmurugan, Kamala-Kannan, et al., 2010), después se deja reposar durante 15 minutos
y se filtra a través de un papel filtro Whatman GF/C (47 mm).
La extracción de pigmentos intracelulares se debe considerar lo siguiente, debido a que los
pigmentos intracelulares están en las estructuras internas de los hongos la biomasa debe ser
separada del fermentado con uso de papel filtro Whatman #1 para su posterior lavado con aguas
desionizada estéril, el proceso debe repetirse hasta que el agua del lavado se vuela clara.
11
Posteriormente, 5ml de alcohol al 90% es añadido en el filtrado por cada gramo de micelio
fresco, después la mezcla se mantiene por 30 minutos en baño maría a 30 ºC, seguido de esto
se mantiene a 200 rpm por 1 hora a la misma temperatura que el paso anterior en un agitador
rotatorio. Una vez más se deja reposar por 5 minutos y finalmente el contenido obtenido se
filtra por medio de papel filtro Whatman #1.

2.2.4 Estimación de la biomasa y pigmentos.

Para la estimación de la biomasa producida se procederá a realiza como plantea
(Velmurugan, Lee, et al., 2010) con ligeras modificaciones, en el cual la biomasa del hongo es
filtrada y separada del medio con sales mediante un disco de papel filtro Whatman GF/C (47
mm), después el producto obtenido es lavado dos veces con agua desionizada para su posterior
secado a 90 ºC por 16 horas seguido del pesado. Para la estimación de la cantidad de pigmento
obtenido, en primer lugar, se contrasta con el medio de cultivo sin inoculación como blanco y
aquí se mide la absorbancia. Además, se utiliza longitudes de onda de 400, 460 y 500 los mimos
que corresponden a los colores amarillo, anaranjado y rojo (Suraiya et al., 2018). Por lo tanto,
se utilizad la siguiente fórmula (X. Zhang, Wang, Chen, & Wang, 2013):
𝐴·𝑛
𝑆=
𝐺

Donde S es el valor de pigmento expresado U/g, A es la absorbancia, n es factor de dilución,

G es materia fermentada seca.
Para la cinética de crecimiento de los hongo se puede realizar mediante un método indirecto
con una correlación entre el peso seco celular y la densidad del color como plantea Abdul
Manan & Webb, (2018) debido a que el cambio del color del medio líquido está en función del
crecimiento de los hongos. Este método sería propicio ya que se trabajará con pigmentos.

2.2.5 Caracterización de los pigmentos.

Los pigmentos pueden ser caracterizados por Cromatografía de Capa Fina (TLC) y
Cromatografía Líquida de alto rendimiento HPLC. Para TLC usa una placa de Silica Gel y
cloroformo/metanol/agua en proporciones (9:25:4) como fase móvil, el procedimiento se
completa con la medición de los valores del factor de retención (Rf) (J. Nithya Kamalam et al.,
2012). Por otro lado, el uso de HPLC es extensamente reportado en la caracterización de
pigmentos, muestra de ello es la investigación de Singh, Singh, Singh, & Sharma, (2014)
realizada con Thelebolus microsporus, un hongo antártico en el cual se detectó carotenoides.
12
2.2.6 Tinción de fibras textiles.
El proceso se realizará con la metodología de Chadni, Rahaman, Jerin, Hoque, & Reza,
(2017), con complementaciones. Las fibras textiles se someten a teñido, usando FeSO4 como
un químico mordiente. Para ello, se utiliza un trozo de tela de 1 g. Se toman aproximadamente
50 ml de pigmento de en un vaso de precipitación y se añade un 5% de FeSO4. Después la tela
se sumerge en la solución. El teñido se lleva a cabo durante la noche a temperatura ambiente.
La muestra se lava luego con agua fría y se seca a la luz del sol.

2.2.7 Caracterización molecular de las cepas productoras de pigmentos.

Esta información será proporcionada por el LABINAM para tener conocimiento de la
extracción y purificación del ADN, de la secuenciación del ADN y la construcción de los
árboles filogenéticos para la determinación de las especies.

2.2.8 Diseño experimental.

El diseño está constituido por Factor 1 que corresponde a las cepas y Factor 2 los medios, en
el experimento se plantea hacer comparación de varianzas, prueba de Tukey al 5%.
Variables de estudio
Medios y cepas de hongos
Variables dependientes
Biomasa(mg) y Cantidad de pigmento (U/g)
Tabla 1
Tratamientos del experimento
Tratamiento Factor 1 Factor 2 Combinaciones Repeticiones
T1 C1 M1 C1M1 4
T2 C1 M2 C1M2 4
T3 C2 M1 C2M1 4
T4 C2 M2 C2M2 4
Nota: C1: Moho1, C2: Petar, M1:PDB, M2: Medio con sales
2.2.9 Consideraciones bioéticas.

La investigación usará hongos que son producto de las investigaciones del Programa
Antático,de tal forma que la manipulación de los organismos serán manipulados con todas las
precausiones para evitar la pérdida o contaminación de las mismas. Por otro lado , los
resultados obtenidos deben ser reportados a las personas encargadas del programa para que
determinen si serán publicados o no.
13
 Cronograma de actividades

Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes 6 Mes 7 Porcentaje

Actividades Métodos
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 %
1. Objetivo Específico 1:• Cultivar dos cepas de hongos antárticos en fermentación sumergida.
1.1 Actividad 1: Preparación de medio de cultivo PDA Uso de medio PDA 5%
3.1 Cronograma de actividades

1.2 Actividad 2: Siembra de los hongos Tomar micelio de los cultivos madre 6%
1.3 Actividad 3: Adaptación de los hongos Mantenimiento de los cultivos a temperatura ambiente y 32 ºc 6%
1.4 Actividad 4: Revisar contaminación Inspección visual de los cultivos 5,0%
1.5 Actividad 5: Preparación de medio liquido con sales Uso de sales 6,0%
1.6 Actividad 6: Siembra de los hongos Inoculación del medio 6,0%
1.7 Actividad 7: Revisión de cultivo Inspección visual de los cultivos 6,0%

14
1.8 Actividad 8: Repeticiones Cultivo de los hongos 6,0%
1.9 Actividad 9: Cuantificación de biomasa Secado y pesado de micelio 6,0%
2. Objetivo Específico 2: Caracterizar los pigmentos extraídos del cultivo de las dos cepas.
CAPITULO III

2.1 Actividad 1: Separación del fermentado y micelio Filtración con papel filtro whatman GF/C (47mm) 6,0%
Marco administrativo

2.2 Actividad 2: Extracción de los pigmentos Uso de etanol al 90% y uso de agitador rotatorio 6,0%
2.3 Actividad 3: Estimación de la producción de pigmento Medición de absorbancia 6,0%
2.4 Actividad 4: Caracterizacón de los pigmentos Uso de técnicas cromatográficas 6,0%
3. Objetivo Especifico 3: Evaluar la capacidad de tinción de los pigmentos obtenidos.
3.1 Actividad 1: Conseguir la tela Realizar complra de la tela de algodón 6%
3.2 Actividad 2: Aplicar el pigmento Usar el pigmento extraído para teñir la tela 6%
3.3 Actividad 3: Revisar los resultados Medición de absorbancia 6%
3.4 Actividad 4: Análisis estadísticos Usar programas como SPSS para analizar los datos obtenidos 6%
100%
3.2 Presupuesto
3.2.1 Costos
Tabla 1
Tabla de costos del trabajo de grado
Descripción Unidad Precio unitario Total
Etanol 96 % 1L $3.68 $3.68
Extracto de levadura 500 g $89.57 $89.57
Papel filtro GF/C (47 mm) 100 unidades $44.50 $44.50
Caldo papa dextrosa (PDB) 500 g $63.84 $63.84
Tubos falcon 50 mL 50 unidades $14.30 $14.30
Matraces Erlenmeyer 125 mL 4 unidades $6.00 $24.00
Sales 250 g $80.00 $80.00
Secuenciación cepas 2 $15.00 $30.00
Kit de extracción y purificación ADN 1 $150.00 $150.00
Análisis de cromatografía 4 $30.00 $120.00
Impresiones $8.00
Anillado $10.00
Alimentación $90.00
Empastado $25.00
Transporte $30.00
Subtotal $782.89
Imprevistos 10% $78.29
Total $861.18

Tabla 2
Tabla de equipos disponibles en los laboratorios
Equipo Disponibilidad
Cámara de flujo laminar Si
Agitador rotatorio Si
Centrifugadora Si
Balanza analítica Si
Estufas Si
Autoclave Si
Agitador magnético Si
15
3.2.2 Financiamiento
El trabajo de investigación será financiado en un 43% que representa $365.89 por el
Laboratorio en Investigaciones Ambientales ya que será el que brinde de materiales, equipos y
reactivos, de igual manera estos últimos puede ser provistos por el Laboratorio de
Biotecnología Vegetal y el Laboratorio de Biotecnología Aplicada. Por otro lado, debido a que
el estudio está ligado al programa antártico el aporte económico por parte del estudiante será
de porcentaje restante sería 57% que representa $495.29.

16
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