Manualmicrobiología 15-2

CENTRO DE ESTUDIOS SUPERIORES
DE SAN ÁNGEL
MANUAL DE
PRÁCTICAS DE
DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
Elaborado por:
Karla M. Díaz Gutiérrez
Martha Gay Segura
Beatriz Serrano López
Centro de Estudios Superiores de San Ángel®
Laboratorio de Microbiología de Alimentos
Licenciatura en Gastronomía y Artes Culinarias
ÍNDICE
Reglamento de higiene y seguridad ........................................................................ 3
Introducción al laboratorio de microbiología ............................................................ 6
Ubicuidad de microorganismos ............................................................................... 9
Técnica aséptica ................................................................................................... 14
Grupos microbianos .............................................................................................. 20
Aislamiento de microorganismos a partir de pulque .............................................. 28
Recuento de hongos y levaduras en oleaginosas, semillas y frutos secos ........... 32
Fermentación láctica ............................................................................................. 35
Actividad microbiana en leche pasteurizada y UHT .............................................. 41
Lavado y Desinfección .......................................................................................... 46
Elaboración de Amazake partir de Aspergillus oryzae .......................................... 50
Microorganismos Psicrófilos y Psicrótrofos ........................................................... 53
Muerte térmica de bacterias .................................................................................. 58
Curva de crecimiento bacteriano ........................................................................... 63
Desinfección y Esterilización ................................................................................. 68
Prohibida la reproducción total o parcial de este documento, mediante ningún sistema o método,
2 electrónico o mecánico (INCLUYENDO FOTOCOPIADO), la grabación o cualquier sistema de
recuperación y almacenamiento de información, sin la expresa autorización, Quinta Edición,
CEOESA, Enero, 2015.
Reglamento de higiene y seguridad

Este reglamento es obligatorio para todo el personal y alumnos que trabajen
en el Laboratorio de Ciencias de los Alimentos; todos tenemos el compromiso
de cumplirlo y observar que sea cumplido.
1. El acceso de alumnos al laboratorio requiere indispensablemente de la presencia

de un profesor, y será exclusivamente para fines académicos.
2. La hora de entrada al laboratorio será la indicada en su horario de clases; hay

tolerancia de 10 minutos para el inicio formal de la sesión práctica; transcurrido ese
lapso se considera como retardo, la acumulación de 2 retardos equivale a una falta.
No podrá entrar al laboratorio ni hacer práctica, el alumno que llegue más de 15
minutos tarde, por no haber escuchado las indicaciones específicas del profesor
para esa práctica.
3. Los alumnos deberán leer anticipadamente el protocolo de cada sesión práctica así
como las indicaciones del trabajo a realizar, para evitar errores.
4. Deben conocer el funcionamiento y manejo adecuado de todos los equipos que

utilicen; si no lo saben o tienen dudas, pregunten primero para evitar accidentes,
errores ó descomposturas.
5. Para el uso adecuado de las balanzas de precisión es necesario NO moverlas del

lugar donde se colocan, revisar ANTES de pesar que el plato y la pantalla estén
perfectamente limpias, y SOLO utilizar las charolas de plástico para pesaje como
ÚNICO contenedor de lo que se desee pesar. NO utilizar vasos, bowls o cualquier
otro instrumento de cocina para pesar.
6. Los microscopios electrónicos deben de manejarse con mucho cuidado, SIEMPRE
transportarlo por la base y por el brazo; retirar los portaobjetos de la platina, apagar
la lámpara, enrollar el cable y limpiar los lentes oculares SOLO por fuera ANTES y
DESPUÉS de su utilización. NUNCA usar agua y/o jabón para este efecto. Manejar
con MUCHO cuidado los tornillos macro y micrométricos, se deben de subir y bajar
muy lentamente.
7. Para permanecer en el laboratorio y, desde luego, para trabajar, es indispensable

portar bata blanca, de algodón, debe estar limpia, abotonada y debe cubrir bien la
ropa. Por ningún motivo debe usarse la bata de laboratorio en las cocinas, por lo
que NO ES ACEPTABLE QUE UTILICEN FILIPINAS EN EL LABORATORIO, NI

SUÉTERES U OTRAS PRENDAS, ENCIMA DE LA BATA.
8. Por ningún motivo se corre, grita o salta en el laboratorio; se deben evitar a toda
costa los movimientos bruscos o forzados. Por ello, está prohibido llevar objetos que
impliquen riesgos de fuego, contaminación cruzada, y movimientos incontrolados,
tales como gorras, pelo suelto, moños, collares largos y pulseras, u otros accesorios
personales que puedan atorarse en el equipo, hacer contacto con las sustancias,
prenderse fuego con los mecheros, o que dificulten la visibilidad en el laboratorio.
9. En el laboratorio siempre se debe usar calzado cerrado, antiderrapante y cómodo.
10. La zona de trabajo debe estar siempre limpia, libre de objetos personales y tener el
material y equipo en uso, razonablemente ordenado.
11. Se debe trabajar siempre con cuidado; al utilizar mechero o artefactos de

calentamiento, encenderlos de la manera adecuada y aplicar las medidas
preventivas que eviten que algo se queme o se prenda, por ejemplo tener solventes
(alcohol) o sustancias volátiles siempre alejadas y tapadas y no dejar cerca papeles,
algodón u otros objetos flamables, asegurar que no estén en la zona de calor
plásticos, grasas u otros materiales que impliquen riesgo.
12. Si algo llega a prenderse, mantener la calma, retirar otras cosas flamables, cerrar la
fuente de energía (gas ó electricidad) y sofocar el fuego con toalla húmeda, o
extintor. NUNCA SOPLAR NI ARROJAR AGUA, ya que eso puede extender el
fuego o proyectar material ardiente.
13. Es responsabilidad de cada alumno, tener siempre lo necesario para el trabajo de

calidad, incluyendo marcadores o etiquetas, colectores de residuos y material de
limpieza.
14. Toda persona que entre la laboratorio debe lavarse las manos al llegar y al salir;
debe utilizar jabón, enjuagar bien y secarse con toallas de papel.
15. Dentro de las instalaciones del laboratorio queda ESTRICTAMENTE PROHIBIDO

COMER, BEBER Y FUMAR; el manejo de sustancias químicas y de
microorganismos exige siempre estas precauciones. Evite también llevarse las
manos a la cara, o llevarse a la boca objetos como plumas o lápices. Así mismo, se
prohíbe la aplicación de cremas o cosméticos en el laboratorio.
16. Todas las muestras y los reactivos que se empleen para una práctica deberán estar
perfectamente identificados con etiquetas donde se indique: el tipo de muestra,
reactivo o cultivo, la fecha de elaboración y el responsable de dicho material.
17. Nunca manejar las sustancias con los dedos, ni pipetear con la boca; utilizar siempre
espátulas, perillas, jeringas o los utensilios adecuados para un manejo seguro de
los productos químicos, o de los microorganismos, aunque no sean tóxicos ó
patógenos. Manejar el material caliente con pinzas o guantes.
18. Si llegase a derramarse alguna sustancia o cultivo, se informará de inmediato al

profesor, para proceder exactamente como él indique para la limpieza y para la
eliminación de los residuos.
19. Antes de salir del laboratorio, revisar que todas las instalaciones de gas o eléctricas
estén perfectamente cerradas así como todas las sustancias en el sitio
correspondiente a su resguardo.
20. Al término de la práctica se deberá de tener limpio y seco el material de laboratorio,

lavada la mesa de trabajo (y desinfectada en el caso de prácticas de microbiología),
y se habrán colocado los residuos en los recipientes correspondientes.
21. LA SEGURIDAD DE LAS PERSONAS Y EL CUIDADO DEL AMBIENTE SON MUY

IMPORTANTES EN EL TRABAJO CIENTÍFICO Y EN LAS ACTIVIDADES DEL
CESSA. CUÍDESE, CUIDE A LOS DEMÁS Y PROTEJA AL AMBIENTE. En caso
de duda CONSULTE A SU PROFESOR; está para ayudarlo y lo hace con mucho
gusto.
22. Seguir las instrucciones del profesor para desechar cualquier sustancia al final de
la práctica.
23. Llevar a cabo estrictamente los procedimientos descritos. No improvisar el uso de

otro material o modificar las cantidades o sustancias indicadas.
Introducción al Laboratorio de Microbiología
Introducción
Les damos la bienvenida a este curso práctico en el que hemos combinado la parte
experimental de las dos asignaturas científicas de este semestre: Microbiología de
Alimentos y Conservación de Alimentos.
El aprendizaje que están emprendiendo en estas materias requiere del apoyo del
laboratorio, en el cual lograrán conocer de cerca a muchos de los microorganismos
importantes en el campo de los alimentos; tendrán oportunidad de experimentar con
los factores que afectan a los microorganismos y con los efectos de los
microorganismos sobre los alimentos, para controlarlos y aplicar dicho control en la
conservación de los alimentos.
Desde luego, para hacer esto habrán de aprender algunas técnicas que nunca antes
han utilizado y que esperamos que encuentren tan interesantes como sus
aplicaciones.
Conviene recordar las reglas generales para el trabajo en el laboratorio y presentar

las particularidades del laboratorio microbiológico. Recuerden que el
comportamiento en el laboratorio debe ser responsable, adecuado para el nivel
universitario y siempre observando el Reglamento de Higiene y Seguridad vigente;
éste se encuentra desplegado en el laboratorio, está incluido en el manual de
prácticas y es su responsabilidad personal, conocerlo y aplicarlo.
Recuerden además, que los microorganismos son seres vivos; aunque en este
laboratorio no utilizaremos microorganismos patógenos, siempre es importante
prevenir que no se ubiquen ni se reproduzcan fuera de los espacios adecuados y
mucho menos, fuera de control.
Para esto deben tener sumo cuidado en:

 Lavarse las manos antes y después de trabajar,
 Evitar contaminación cruzada,
 El manejo de la técnica aséptica,
 El manejo de material contaminado (cajas, portaobjetos, pipetas),
 La eliminación adecuada de cultivos y muestras de laboratorio.
Por ningún motivo deben usar la bata de este laboratorio en otro lado,
especialmente en donde se manejen alimentos; en caso de derrame o
contaminación accidental, avisen de inmediato al profesor; él sabe cómo manejar la

situación y controlar la contaminación.
Objetivos
Mediante esta práctica, el alumno logrará:

 Explicar las razones de cada punto del Reglamento de Higiene y Seguridad,
especialmente en el campo de la Microbiología.
 Explicar las especificaciones y utilidad del material e instrumentos que se
emplean en Microbiología.
Metodología
1. Revisaremos detenidamente el Reglamento de Higiene y Seguridad del

Laboratorio, aclarando todas las dudas.
2. A continuación conoceremos el material y equipo más importante del laboratorio

microbiológico; aprovechen para recordar las características y uso del material
del laboratorio de química, ya que también lo utilizaremos en algunas prácticas.
Pregunten lo que necesiten.
Equipo Material
Microscopio Asa de siembras

Incubadora Asa micológica
Autoclave Mechero de Bunsen
Horno Termómetros
Balanza granataria Portaobjetos y cubreobjetos
Frascos gotero
Pipetas Pasteur con bulbo
Pipetas graduadas
Cajas de Petri
Tubos de ensayo 16x150 y 13x100
Matraces Erlenmeyer
Resultados
Como reporte de esta práctica, repase el Reglamento de Higiene y Seguridad y

haga un comentario personal, de ½ página, sobre su importancia.
Describa brevemente la utilidad de cada pieza de equipo y de material visto en la

práctica.
Traiga para la próxima clase todo el material de limpieza señalado en el reglamento,

incluyendo el recipiente para pipetas y portaobjetos contaminados y el hipoclorito
desinfectante.
Bibliografía
 Forsythe, S.J. 2002. The Microbiology of Safe Food. Blackwell Science. EUA.
 Prescott, L., J. Harley & D. Klein. 2004. Microbiology. 6th edition. McGraw Hill.
EUA.
Ubicuidad de los microorganismos
Introducción
El significado de ubicuo es “algo que está en todas partes, que se encuentra en todo
sitio al mismo tiempo”. En el caso de los microorganismos puede parecer una
exageración, pero desde luego no se trata del mismo ser en todos los casos y
momentos; y ciertamente, no hay exageración alguna en la expresión.
El pequeñísimo tamaño de los microorganismos facilita que se establezcan en

espacios mínimos y hace que su consumo individual de alimentos sea muy
pequeño: en una gota de alimento pueden crecer miles de microorganismos. Todo
esto, aunado a la rapidez con que se reproducen y a la diversidad de sustancias
que pueden utilizar como alimento, hace que los microorganismos realmente
puedan estar presentes casi en todo lugar y en todo momento.
Se puede decir que el “casi” es gracias al control que las personas podemos tener
de los microorganismos, control que es precisamente el objetivo de este curso,
específicamente en el campo de los alimentos. Para ello, ustedes ya han aprendido
las bases del manejo higiénico de los alimentos; ahora conocerán de cerca a los
microorganismos para entender cómo se reproducen, cómo se controla su actividad
y cómo se eliminan, de manera que puedan aplicar estos conocimientos tanto a la
utilización de microorganismos en la elaboración de algunos productos, por ejemplo
los fermentados, como en la prevención de riesgos microbiológicos.
En este ejercicio haremos evidente la ubicuidad de los microorganismos,

particularmente de hongos y bacterias, a los cuales podemos encontrar en:
 El aire casi a cualquier altura, y desde el cual pueden depositarse en los
alimentos;
 En el suelo, por lo que contaminan los productos que de él se obtienen;
 En el agua, incluso la que usamos para lavar y desde luego en el mar, donde
encontramos géneros muy particulares que pueden tener diferentes efectos
en los alimentos marinos;
 En el cuerpo humano, que se estima que contiene 1012 bacterias, distribuidas
principalmente en los tractos respiratorio y digestivo, y en la piel.
 En todos los alimentos, de origen vegetal, animal e inorgánico (sal, agua).
 En diversos objetos inanimados, que transportan a los microorganismos,
causando contaminaciones cruzadas.
Entre los microorganismos hay muchos que viven en condiciones muy comunes de
temperatura, como la del ambiente y la del cuerpo humano, pero hay algunos que
pueden encontrarse en condiciones extremas, por ejemplo:
 Temperaturas desde 0°C hasta de 105 °C, es decir, por arriba del punto de
ebullición del agua;
 pH desde 0.06 hasta 12;
 concentraciones salinas de hasta 25 % o más (una salmuera utilizada para
conservar aceitunas tiene 23.3 % de NaCl).
 También hay microorganismos que resisten concentraciones elevadas de
etanol, cloro u otros agentes antimicrobianos.
Esta extraordinaria facilidad de adaptación, hace que las bacterias y los hongos,
puedan ser fuente de problemas en la industria alimentaria.
Objetivos
Mediante esta práctica, los alumnos lograrán:

 Explicar las consecuencias de la ubicuidad de los microorganismos, para el
manejo de alimentos.
 Relacionar los conocimientos previos de Higiene de los Alimentos, con la
presencia microbiana en diferentes objetos y fuentes de contaminación
Material y equipo
Muestras
2 cajas de Petri con
Sabouraud dextrosa agar (Sab) Agua de la llave
2 cajas de Petri con agar nutritivo (AN) Alimentos diversos
1 pipeta Pasteur estéril Utensilios de cocina
2 hisopos estériles Uniformes
Incubadora a 35+2°C Llaves y bolígrafos
Huevo fresco
Carnes de res, cerdo o pollo
Metodología
Usted tiene 3 cajas Petri con medios de cultivo: el agar dextrosa Sabouraud que es
especial para el desarrollo de hongos y el agar nutritivo es un medio de uso general
en bacteriología. En este ejercicio, vamos a colocar los microorganismos presentes
en el ambiente o en objetos, en dichos medios de cultivo, mediante técnicas muy
sencillas, para poder observarlos.
1. Marque la caja de Sab y llévela al sitio de la escuela que el profesor le indique:
cocinas, almacén, jardín, baño, oficina; destape la caja y déjela 30 minutos,
durante los cuales las partículas suspendidas en el aire, como bacterias y
esporas, se depositarán en la superficie del agar; al final coloque la tapa y lleve
la caja al laboratorio, para incubar a temperatura ambiente (o a 25+2°C), en la
oscuridad, durante 5 a 7 días.
Cuando se siembran microorganismos en cajas de Petri, se quieren obtener

“colonias” aisladas y claramente distinguibles. Cuando hay evaporación del medio
de cultivo y se condensa en la tapa, las gotas pueden caer en el cultivo, arruinar la
placa y provocar escurrimientos. Para que eso no suceda, las cajas de Petri
siempre se incuban invertidas, es decir con la tapa abajo.
Base con medio de cultivo

Tapa de la caja de Petri
2. Desde el curso de Higiene en el primer semestre, usted sabe lo importante que

es recoger el cabello y usar red cuando se trabaja en la cocina. Arranque uno de
sus cabellos y colóquelo sobre la otra caja de Sab o en una caja de AN;
asegúrese de que el cabello hace contacto con el agar.
3. Utilice las cajas de agar nutritivo para detectar bacterias de los alimentos, de sus
vías respiratorias y de su piel; si lo desea puede marcar la base de la caja,
dividiéndola en dos, y sembrar dos muestras en cada caja. A continuación le
damos algunos ejemplos y la manera de sembrar, pero si tiene interés en otra
muestra, comente con el profesor cómo sembrarla.
Alimentos líquidos: Primero coloque la caja ligeramente inclinada, por ejemplo entre
la mesa y otra caja; introduzca la pipeta Pasteur hasta que el líquido llene el capilar;
luego colóquelo en contacto con el agar, en la parte elevada de la caja, en un solo
punto y deje que la gota escurra sobre el agar; repita la operación hasta que el
capilar quede vacío.
gotas
Alimentos sólidos: Tome un pequeño trozo y deslícelo suavemente sobre todo el

agar; cuide de no romper el gel.
Manos: Coloque las puntas de los dedos durante 10 seg sobre el agar, haciendo
ligera presión, o bien deslice los dedos sobre toda la superficie.
Llaves, bolígrafos, peines: Humedezca levemente el hisopo en agua estéril y frote

con éste, el objeto en estudio, tratando de “limpiarlo” bien con el hisopo; luego
deslice el hisopo sobre el agar, tratando de depositar la muestra. Este método
también puede usarse para superficies de frutas, por ejemplo.
Mesas de trabajo y utensilios de cocina. Humedezca levemente el hisopo en agua

estéril; frote un área definida de la mesa (10 x 10 cm, por ejemplo) o el interior de la
taza, o la superficie de un tenedor, tratando de “limpiarlo” bien con el hisopo y luego
deslice el hisopo sobre el agar, para depositar la muestra. Este método también
puede usarse para superficies de frutas, por ejemplo.
Boca y vías respiratorias: Puede dejar caer una gota de saliva y extenderla con
hisopo estéril. O bien, soplar durante unos 10 segundos, suavemente sobre la
superficie de la caja.
Agua de condensación de refrigeradores o campanas: sacuda unas gotas

directamente sobre el agar, o si es necesario, colecte y distribuya con un hisopo.
También puede colocar el objeto en el agar y presionar ligeramente para que haga
contacto y se humedezca, por ejemplo una moneda, cabellos o unos granitos de
arroz o trigo.
Frote en la superficie del medio, un trozo pequeño de carne cruda de res o de pollo,
o el cascarón de un huevo.
Todas las cajas AN se incubarán a 35+2°C durante 24 a 48 horas.
Resultados
Observe cuidadosamente las cajas de AN; con la ayuda de su profesor, distinga el

crecimiento masivo de las “colonias” y describa las características de éstas: bordes,
tamaño, elevación, color, aspecto, reverso; en algunos casos hay núcleo y
diferentes coloraciones en la colonia. También preste atención a otras
características que permitan describir el cultivo obtenido, como cambios en la
coloración del medio, olor, etc.
Si es posible, describa las diferencias en cantidad y variedad de colonias.
Preste especial atención a los hongos; tal vez hayan crecido muy poco en 48 horas,
pero observe el aspecto de las colonias y vuelva a incubar. A los 5 o 7 días, describa
el tamaño, bordes, color, reverso y longitud del micelio aéreo y profundo.
Reporte los resultados obtenidos y sus conclusiones. Envuelva las cajas en bolsas
de plástico y refrigere para usar en la segunda parte de la práctica.
Técnica Aséptica
Introducción
En la primera parte de esta práctica vimos que los microorganismos están

ampliamente distribuidos en la naturaleza, en los objetos cotidianos, en el aire.
Entonces ¿cómo obtener un cultivo puro de un microorganismo? ¿Cómo evitar que
en una fermentación de yogur, los microorganismos del aire y del recipiente
compitan por los nutrientes, con las bacterias fermentadoras?
La forma de manejar adecuadamente a los microorganismos y de mantener a

aquellos que nos interesan, libres de microorganismos contaminantes del ambiente,
es la técnica aséptica, que aprenderán en este ejercicio.
Como los microorganismos son seres vivos unicelulares (o no-celulares en el caso

de los virus), que por su pequeñísimo tamaño del orden de algunas micras (m),
no pueden verse a simple vista, tenemos que recurrir a:
 Observarlos mediante el microscopio, que aumenta la imagen de ellos; en el
caso del microscopio óptico que utilizaremos en este curso, se logran
aumentos entre 100 y 1,000 veces.
 Manejarlos como poblaciones (no como individuos). Por eso, generalmente
es necesario “cultivarlos”; es decir, hacerlos crecer y reproducirse en
condiciones controladas, para contar con un número suficiente que nos
permita estudiarlos y utilizarlos.
Hay varias formas de manejar a los microorganismos para cultivarlos o para verlos
al microscopio; la más común es mediante algún instrumento: como pipeta, jeringa,
o asa de siembras.
Lo importante en esta operación es no contaminar nada del laboratorio ni del

personal, con el microorganismo y desde luego, no contaminar al microorganismo
con otros que se encuentran en el ambiente: mesas, manos, etc. Para evitar que los
microorganismos del ambiente lleguen al material y medios de cultivo con que
estamos trabajando:
 Se emplean utensilios estériles: pipetas, asas, jeringas, tubos, etc; recuerde
que estéril significa totalmente libre de cualquier forma de vida, incluidos
microorganismos, esporas o virus.
 Los medios de cultivo y diluyentes también se utilizan estériles.
 Se aprovecha la “zona aséptica” que brinda el mechero de Bunsen: al

producir una flama de unos 8 cm de altura, el mechero calienta el aire que lo
rodea y genera un movimiento muy suave hacia arriba y hacia afuera, lo que
evita que partículas del aire, incluso microorganismos, se depositen en el
material y medios que utilizamos. La zona alrededor del mechero en la que
hay asepsia tiene unos 30 cm de diámetro. En esa área es posible destapar
un medio de cultivo estéril, sin que lleguen a él microorganismos
contaminantes, o abrir una pipeta o jeringa estériles sin contaminarla.
 También es posible eliminar directamente en la flama, hasta incinerar por
completo, los restos de un cultivo que se encuentren en el asa de siembras,
para no contaminar la zona de trabajo.
 Cuando se dejan de usar pipetas o portaobjetos que contienen muestras de
microorganismos, no es posible eliminarlos al fuego directo, como en el asa
de siembras. Deben colocarse de inmediato en un recipiente con
desinfectante, colocado junto a la zona aséptica; después de 30 minutos
pueden lavarse con seguridad.
El conjunto de operaciones que utilizamos para evitar contaminaciones (o presencia

microbiana no deseada) durante el manejo de material estéril y de cultivos
microbianos, constituyen la técnica aséptica, que desde luego es indispensable en
Microbiología.
Objetivo
Mediante este ejercicio, el alumno será capaz de:

 Realizar adecuadamente, la técnica aséptica en el laboratorio.
Material y equipo
Incubadora a 35+2°C
1 jeringa estéril
1caja de Petri con agar nutritivo (AN)
1 asa de siembras
1 caja de Petri con agar Sabouraud (Sab)
1 asa micológica
1 tubo de 13x100 con caldo nutritivo (CN)
1 pipeta Pasteur estéril
1 tubo de 13x100 con caldo Sabouraud (Sab)
Muestras
Los cultivos obtenidos en la práctica anterior.

También pueden usar pulque o vinagre.
Metodología
1. La técnica aséptica requiere del uso de material y medios de cultivo estériles;

recuerde que esterilización es la eliminación de toda forma de vida, de un objeto
o medio, y que es un término absoluto.
2. El propósito de la técnica aséptica es evitar la contaminación durante el manejo
de los cultivos y medios de cultivo; el problema más cotidiano es la
contaminación por medio del aire.
3. Para lograrlo, todas las manipulaciones deben ser cuidadosas, suaves, sin forzar
y sin arriesgarse a contaminar cultivos o utensilios, por lo que se requiere tener
todo el material a la mano y adecuadamente colocado:
Esquema de colocación de material para una transferencia aséptica en

personas diestras:
Pipetas y
portas
contaminados
Gradilla con
cultivos y medios
Mechero
en tubos
Pipetas,
Cajas Petri y asa o jeringa
portaobjetos
La zona aséptica está marcada con línea de puntos; note que están a la mano los
cultivos y medios, cajas Petri y portaobjetos, asas (o jeringas o pipetas), así como
el recipiente de desinfección de pipetas y portaobjetos. También note que NO HAY
OTROS OBJETOS en la zona de trabajo.
Para tener una buena zona aséptica, la flama del mechero debe ser azul, grande y
no temblar.
Al tomar los objetos, considere siempre dos cosas:

I. Sujetarlos por el extremo que quedará alejado de la flama, para que no se
queme, y
II. Tomarlos de manera que pueda ver lo que hace en el tubo o caja.
4. Transferencia con asa de siembras:
a. Sujete el asa por el extremo superior, como si fuera un lápiz, Coloque el

asa vertical en la flama, hasta la incandescencia y enfríe ligeramente en
el aire de la zona aséptica.
b. Con la mano izquierda, tome el tubo del cultivo por el

extremo inferior, entre el pulgar y el índice; ponga el
tubo en ángulo de 45° respecto a la mesa y acerque la
boca del tubo a su mano derecha.
c. Con el meñique y la palma derechos, sujete el tapón
del tubo y retírelo; flamee la boca del tubo.
5. Coloque el asa estéril paralela al tubo, e introduzca la punta en el tubo del cultivo,
enfríe el asa en la pared y luego sumerja en el líquido, para tomar una gota del
cultivo; retire el asa, flamee de nuevo el tubo, tape y deje en su lugar.
6. Tome el tubo de medio estéril, abra del mismo modo, introduzca en el caldo el
asa con el inóculo, agite suavemente, retire el asa, flamee el tubo y cierre.
Colóquelo en su lugar.
7. Antes de soltar el asa, esterilícela: primero coloque el asa inclinada con la punta
en la flama y después vertical, hasta la incandescencia. Puede dejarla en la
mesa o recargada en la base del mechero pero recuerde que está muy caliente.
8. Transferencia con jeringa o pipeta: Como ya están estériles, no es necesario
someterlas a la flama.
9. Acomode todo como en el caso anterior; rasgue la envoltura de la jeringa o de
la pipeta estéril (o abra el contenedor) en la zona aséptica y maneje la jeringa o
pipeta sólo con la mano derecha, evitando tropezar la mesa, o cualquier otro
objeto, con la aguja, punta o zonas que entrarán en contacto con el cultivo.
10. Cuando acabe de utilizar las jeringas, retire la aguja mediante el dispositivo
especial que tiene la tapa del colector de objetos punzocortantes y luego coloque
la jeringa en el recipiente con hipoclorito, para desinfectar.
11. Cuando acabe de utilizar las pipetas, colóquelas directamente en el recipiente
con hipoclorito, para desinfectar.
12. Transferencia a caja de Petri: Proceda igual que en los casos anteriores, pero
acomode las cajas Petri del lado izquierdo, cerca del borde de la mesa.
13. Una vez que tenga el cultivo que va a transferir en el asa (pipeta o jeringa) tome
la caja de Petri en su mano izquierda.
14. Para hacerlo, coloque el pulgar y el cordial en los costados de la tapa, el dedo
índice arriba de la tapa, y deslice la caja desde la orilla de la mesa, poniendo
abajo sus dedos anular y meñique.
15. Acerque la caja a la zona aséptica, incline la caja hacia la izquierda y baje
ligeramente los dedos que sostienen la base, para abrir la caja. Puede trabajar
mientras la controla así.
16. Para inocular, puede clavar la muestra en el agar, si se trata de hongos, o
deslizar el asa suavemente por la superficie del agar.
17. Cuando desee “aislar” microorganismos, es decir separarlos lo suficiente para
que una colonia provenga de una sola célula, lo que debe hacer es extender
mucho el inóculo, de manera ordenada: primero una descarga y luego estrías en
ángulos, cada vez más separadas, cuidando de no tocar con el asa las zonas
anteriormente estriadas, como muestra el esquema:
1 2 Las cajas y tubos inoculados

se incuban:
a 35+2°C para bacterias y
a 25+2°C (o T ambiente)
para hongos.
4 3
Resultados
Si la técnica aséptica que utilizó fue adecuada, en cajas y tubos habrá solamente
los microorganismos que usted inoculó. En los cultivos que utilizó tampoco debe
haber crecimiento diferente, originado por contaminantes.
Reporte los resultados obtenidos; describa las colonias como aprendió a hacerlo en
la primera parte de la práctica.
Incluya sus conclusiones sobre la técnica aséptica. Si logró manejarla bien,
felicidades. Si no lo logró la primera vez, sólo es cuestión de práctica.
Bibliografía
 Ramírez Gama, R.M., B. Luna, O. Velázquez, y cols. 2006. Manual de Prácticas

de Microbiología General. Facultad de Química, UNAM. México.
 Madigan, M.T., J. Martinko & J. Parker. 2006. Brock. Biología de los

microorganismos. 10ª. Ed. Pearson-Prentice Hall. España.
Principales grupos microbianos
Introducción
Los “microorganismos” constituyen un amplio grupo de seres vivos que se

distinguen por su tamaño microscópico; de ahí el nombre del grupo. Pueden ser
unicelulares o formar agregados de varias células (que no son organismos
pluricelulares), y pueden ser no-celulares, como es el caso de los virus que no son
células completas.
¿Qué distingue a los microorganismos de las células de plantas y animales?

Básicamente que tienen funciones vitales autónomas, es decir que pueden
metabolizar, crecer y reproducirse independientemente de otras células, lo cual no
sucede con las células de organismos superiores.
En ese amplio grupo de microorganismos la característica común es el tamaño: son

tan pequeños que no pueden verse a simple vista, sino que se requiere del
microscopio; las unidades para medir su tamaño son las micras, los nanómetros y
los Armstrongs (respectivamente 10-6 m, 10-9 m, 10-10 m). El minúsculo tamaño de
los microorganismos hace que sean casi transparentes, por lo que además del
microscopio, se requieren ciertas técnicas para poder observarlos.
Los microorganismos pueden variar mucho en sus características; por ello se
agrupan de la siguiente manera:
No-celulares: No son células completas, por lo que necesitan parasitar a otros

Virus seres vivos para reproducirse; por eso siempre son patógenos.
Tamaño: 20 a 200 nm. Se consideran sub-microscópicos, ya que
no pueden verse con el microscopio óptico.
Células procarióticas: Células completas pero con núcleo primitivo que tiene un solo
Bacterias cromosoma circular. Reproducción asexual. Gran variedad de tipos
fisiológicos, incluyendo autótrofos, heterótrofos, aerobios y
anaerobios estrictos.
Tamaño: 0.2 a 5 m.
Células eucarióticas: Células completas con núcleo verdadero que tiene pares de
Hongos, Levaduras, cromosomas y organelos celulares bien diferenciados. Pueden tener
Algas y reproducción asexual y también sexual; algunos tienen ciclos de vida
Protozoarios muy complejos.
Tamaño de hongos y levaduras: 5 a 30 m.
Tamaño de Algas y protozoarios: 10 a 60 m.
En prácticas anteriores hemos cultivado bacterias y hongos incluyendo levaduras,

y hemos observado las características macroscópicas de los cultivos de estos
microorganismos.
En este ejercicio veremos las características microscópicas de bacterias, hongos y

levaduras, algas y protozoarios. Los virus no pueden verse en el microscopio óptico,
así que los estudiaremos mediante actividades extra-clase.
Para observar a los microorganismos utilizaremos el microscopio óptico, que no es

otra cosa que un sistema de lentes de aumento, ensamblados en una estructura
que permite iluminar los objetos en estudio (colocados en una preparación sobre un
portaobjetos), y enfocarlos. Utilizaremos dos tipos de preparaciones, que son las
más comunes para el microscopio óptico:
 Preparaciones en fresco, también llamadas "húmedas" o "para examen
directo", que pueden hacerse sin teñir, o teñidas con colorantes vitales.
 Preparaciones fijas y teñidas; utilizaremos una tinción simple y la tinción más
útil en bacteriología, que es la tinción de Gram.
Objetivos

 Utilizar el microscopio óptico para la observación de microorganismos
 Hacer preparaciones húmedas, simples y de Gram, para observar
microorganismos de importancia en alimentos, con microscopio óptico.
 Interpretar correctamente las observaciones microscópicas mencionadas.
 Diferenciar microorganismos de los 4 grupos principales, microscópicamente
y por sus características generales.
Sesión 1. Observación de hongos, algas y protozoarios

Material y equipo Muestras
Asa microbiológica Los cultivos de hongos obtenidos en
. Asa micológica la práctica de ubicuidad de los
Colorante vital microorganismos.
Mechero Agua de charco cercano a plantas o
Lactofenol azul de algodón agua de los recipientes de yerbas de
6 portaobjetos y 4 cubreobjetos los refrigeradores del supermercado
Recipiente de tinciones
Metodología
1.0 Iluminación del microscopio
 Recuerde que el microscopio, como todos los aparatos de laboratorio, deben
manejarse con cuidado, suavemente y con la mayor seguridad.
 Coloque el aparato en la mesa, lejos del mechero y de la orilla, para prevenir
riesgos. Conecte la clavija y seleccione en el revólver, el objetivo de 10x.
(Este aumento, combinado con el aumento del ocular que también es 10x,
nos dará un aumento total de 100x o 100 veces).
 Utilice el tornillo macrométrico para poner lo más cercanos posible, al objetivo
y a la platina, mientras observa de frente al aparato.
 Ahora, viendo por el ocular derecho, ajuste la fuente de luz, el condensador
y el diafragma para iluminar el campo; el tipo y movimiento de estas pieza
varía de un modelo de microscopio a otro, por lo que es importante que
PREGUNTE AL PROFESOR todo lo que requiera, para lograr una buena
iluminación. Luego observe por ambos oculares y ajuste el izquierdo, con su
tornillo, para lograr una buena visión.
El campo bien iluminado es perfectamente redondo, blanco y no tiene sombras ni
brillos.
2.0 Observación de hongos (preparación húmeda)

 Marque dos portaobjetos, póngalos en el recipiente para tinciones y luego
coloque en cada uno una gota de lactofenol azul de algodón.
 En la zona aséptica y con técnica aséptica, desprenda un pequeño trozo del
cultivo de hongo, tomando desde el agar hasta la parte terminal, tratando de
no maltratarlo y suspenda en el colorante.
 Coloque suavemente un cubreobjetos, procurando que no se forme burbujas.
 Coloque la preparación en la platina, con cuidado.
 Mientras observa por los oculares, utilice el tornillo macrométrico para alejar
la platina del objetivo; hágalo suavemente, hasta que encuentre alguna
imagen. Ésta puede desaparecer con facilidad, o ser muy vaga, ya que
apenas ha hecho el enfoque grueso.
 A continuación, utilice el tornillo micrométrico para lograr un enfoque fino. Si
es necesario, ajuste la iluminación y procure centrar la zona de más
microorganismos.
Los hongos se distinguen por sus hifas, largos filamentos con o sin divisiones
transversales, que tienen en la punta alguna de la formas de producción de esporas
(pueden ser conidiosporas, esporangiosporas o artrosporas).
Para apreciar mejor la forma de estos microorganismos, utilizaremos un aumento
mayor.
 Mueva suavemente el revólver, hasta hacer que el objetivo de 40x quede

alineado con el tubo del ocular; con el aumento del ocular, lograremos un
aumento total de 400 veces ó 400 diámetros.
 Vea por los oculares; generalmente se conserva el enfoque y sólo es
necesario afinar con el micrométrico. Si el enfoque se perdió, acerque de
nuevo el tubo a la platina, viendo el microscopio de frente y repita el proceso
de enfoque, completo.
 Observe los hongos, las formas de las hifas y, sobre todo, de las esporas, ya
que éstas permiten iniciar su identificación.
3.0 Observación de algas y protozoarios (preparación húmeda)

 Marque dos portaobjetos y luego coloque en uno de ellos, una gota de agua
de charco o del recipiente de yerbas; en el otro, ponga primero una gota de
rojo de metilo u otro colorante vital y luego la gota de muestra.
 Coloque suavemente un cubreobjetos, procurando que no se forme burbujas.
 Coloque la preparación en la platina, con cuidado.
 Enfoque siguiendo el mismo procedimiento.
Para apreciar mejor la forma de estos microorganismos, utilice un aumento mayor;
hágalo como en el caso anterior, con 400x. Generalmente es suficiente con este
aumento para ver algas y protozoarios.
 Observe los microorganismos y la forma en que se mueven; note estructuras
como flagelos y bocas.
NOTA: Las algas se distinguen por sus colores verdes o cafés, debidos a la
clorofila que contienen. Algas y protozoarios se verán en movimiento en el
líquido.
Sesión 2. Observación de levaduras y bacterias
Muestras
Material y equipo Los cultivos de bacterias obtenidos en la
Asa microbiológica práctica de ubicuidad de los
Mechero microorganismos.
Azul de metileno Levadura de panificación, suspendida en
Colorantes de Gram agua.
6 portaobjetos Pulque
Piseta con agua destilada Yogur
Recipiente de tinciones
Metodología
Preparaciones fijas
Este tipo de preparaciones se utiliza para bacterias principalmente, y para

levaduras, ya que su pequeño tamaño no permite apreciarlas bien con un aumento
de 400 diámetros o 400 veces, como el que utilizamos para ver hongos, protozoarios
y algas.
Además de un aumento mayor, de 1000x (si, mil veces o mil diámetros), se requiere
aumentar el contraste entre el medio y los organismos, que son casi transparentes,
por lo que se utilizan diversas técnicas de coloración: unas sencillas, con un solo
colorante, y otras más complicadas que combinan mordentes (o fijadores) y
decoloraciones y que permiten hacer evidentes algunas diferencias en la
composición de los microorganismos, lo cual nos permite tener más información
sobre ellos; por ejemplo la tinción de Gram.
1. Ilumine el microscopio.
Tinción simple
2. Marque uno o dos portaobjetos y mediante técnica aséptica, coloque una gota
de la suspensión de levadura, en el centro de portaobjetos. Extienda bien con el
asa, formando una película delgada, casi transparente. Si el cultivo es muy
denso o está en medio sólido ponga antes una gota de agua y suspenda en ella
la muestra. Recuerde esterilizar el asa antes de dejarla. Si el cultivo está en
medio sólido, colocar antes una gota de agua destilada en el centro del
portaobjetos y suspender en ella la asada del cultivo.
3. Deje secar la preparación al aire y a continuación, para fijarla pásela 4 ó 5 veces
sobre la flama.
4. Cubra la zona de la muestra con el colorante (azul de metileno, por ejemplo) y
tome el tiempo de la tinción; mueva suavemente el portaobjetos, para asegurar
el contacto del colorante con la muestra.
5. Una vez transcurrido el tiempo (1 minuto para azul de metileno), incline el
portaobjetos para escurrir el exceso de colorante. Luego enjuague muy
suavemente, deslizando un pequeño chorrito de agua de la piseta, hasta que
salga clara. Escurra y deje secar.
6. Coloque la preparación en la platina y enfoque como en la sesión pasada.
Recuerde que por el pequeño tamaño de las levaduras, en el aumento más bajo
(100x) no logrará apreciar su forma, sólo encontrará la zona de la muestra en la
preparación.
7. Cambie el objetivo y enfoque de nuevo con 400x; tal vez empiece a apreciar la
forma de las levaduras, pero no es suficiente. Deje bien centrada una zona que
parezca interesante.
8. Para usar el objetivo de mayor aumento del microscopio, el de 100 diámetros, y
obtener un aumento total de 1,000x se requiere usar aceite de inmersión entre
la lente y la preparación. Para hacerlo, mueva un poco el revólver para tener
espacio, y coloque una gota del aceite en el centro de la preparación. Luego
ponga el objetivo de 100x, que seguramente quedará en contacto con el aceite.
9. Corrija la iluminación si es necesario y luego enfoque como siempre: separe el
ocular de la platina, moviendo primero el tornillo macrométrico y luego el
micrométrico, hasta enfocar bien.
10. Observe cuidadosamente la forma de las levaduras, su agrupación, las yemas o
brotes.
Tinción de Gram
Fue desarrollada empíricamente hacia 1884 por el danés Christian Gram;

posteriormente, se encontró que la diferencia entre las bacterias Grampositivas y
las Gramnegativas, se debe a la composición y estructura de la pared celular, que
hace que las primeras retengan el complejo cristal violeta-yodo, en tanto que las
Gramnegativas lo pierden, y por eso se tiñen con el colorante de contraste, que es
la safranina y es roja. Recuerde que conocer el Gram de una bacteria nos permite
asumir algunas otras características, como el tipo de requerimientos nutricionales y
la resistencia a agentes externos.
1 Seleccione las colonias de bacterias a las que hará tinción de Gram. Conviene
usar algunas de AN y otras de ABRV.
2 Marque 2 ó 3 portaobjetos y en cada uno aplique una gota de agua destilada al
centro y luego, con técnica aséptica, una muestra de la colonia que le interesa;
extienda bien antes de esterilizar el asa.
3 Deje secar al aire y fije las preparaciones, pasándolas 4 ó 5 veces sobre la flama.
Deje enfriar.
4 Aplique cristal violeta para cubrir la zona de la preparación y deje actuar durante
1 minuto; mueva la preparación para favorecer la penetración del colorante.
Escurra y enjuague, como en la tinción fija. Es importante que no quede agua
del enjuague en la zona de la preparación, para que no diluya los otros
colorantes.
5 Aplique lugol o solución de yodo y deje actuar por 1 min, del mismo modo.
Enjuague y escurra bien.
6 Para decolorar, debe sostener la preparación entre los dedos, inclinada sobre el
recipiente para tinciones y deslizar suavemente el decolorante (alcohol-acetona)
desde la parte superior del portaobjetos, hasta que salga claro.
7 Enjuague muy bien, pues no debe quedar decolorante que pueda afectar el
siguiente paso. Escurra para eliminar el exceso de agua.
8 Aplique la safranina que es el colorante de contraste, durante un minuto; luego
enjuague y deje secar.
9 Coloque la preparación en la platina y enfoque como siempre; es indispensable
observar con 1,000x y aceite de inmersión.
10 Observe bien las formas de las bacterias, su agrupación en el espacio, la
bipartición si es posible. Ponga especial atención a la diferencia de color entre
bacterias Grampositivas y Gramnegativas.
Resultados
En todos los casos, pida ayuda a su maestro para estar seguro de que está
observando la muestra, y de que ha considerado todos los detalles disponibles.
Para reportar las observaciones microscópicas, se acostumbra el siguiente

formato:
Fecha: 30-06-07
Muestra: colonias en AN, obtenidas de
la muestra 12-114 de queso
Tinción: Gram
Aumento: 1,000 x
Descripción:
Mezcla de bacilos largos Grampositivos y
Gramnegativos, y bacilos cortos
Grampositivos.
Siempre que haga observaciones microscópicas, repórtelas así. Puede copiar el

formato o bajarlo de Intranet. Puede entregarlo a mano, ya que debe hacer el
dibujo.
Bibliografía
 Ramírez Gama, R.M., B. Luna, O. Velázquez, L. Vierna, A. Mejía, G. Tsuzuki, L.

Hernández e I. Müggenburg. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología
General. Facultad de Química, UNAM. México.

Aislamiento de microorganismos a partir de pulque
Introducción
El pulque es una bebida tradicional Mexicana que se obtiene por la fermentación de

la savia azucarada conocida como aguamiel obtenida a partir de diferentes especies
de maguey. El crecimiento de esta planta es muy lento: tarda de 7 a 10 años en
alcanzar su madurez y una vez en esta etapa se castra para iniciar la extracción de
este líquido. Cada planta puede producir hasta 6 litros de aguamiel diarios y
después de 4 a 6 meses la planta se seca y muere. La producción tradicional de
pulque es una actividad de gran importancia para muchos grupos de la población
en regiones en las que se produce esta bebida. Tradicionalmente se le han asociado
al pulque diversas cualidades medicinales y nutricionales desde épocas
prehispánicas, entre las que destacan la prevención de trastornos
gastrointestinales, anorexia, infecciones renales, astenia y baja producción de leche
durante la lactancia. Así mismo, se ha determinado que es una fuente importante
de diversas vitaminas. El alcohol (etanol) presente en el pulque no representa una
fuente importante de energía, pero por el contrario, se ha propuesto que puede
existir una relación entre el consumo de grandes cantidades de pulque y el
desarrollo de enfermedades como la cirrosis hepática, particularmente en aquellas
regiones de alto consumo.
Los primeros estudios sobre la microbiología del pulque datan de finales del S XIX.
Sin embargo, no es sino hasta el período de 1925- 1932, que gana relevancia
científica a nivel internacional cuando P. Linder reporta el aislamiento de una
bacteria productora de etanol a la que nombró como Termobacterium mobile,
bacteria que en la actualidad se denomina como Zymomonas mobilis, la cual es
considerada de gran interés industrial, por su capacidad de producir elevados
niveles de etanol. Varios trabajos sobre la microbiología del pulque describen
diversas especies de bacterias, siendo Z. mobilis y otras bacterias ácidolácticas
identificadas como miembros del género Lactobacillus y a la levadura
Saccharomyces cerevisiae como las responsables de la producción del etanol. La
bacteria láctica Leuconostoc mesenteroides es responsable de la viscosidad
característica de esta bebida, por la producción de una goma (polisacárido).
Se encontró en la literatura que la diversidad microbiológica del pulque es muy alta.

En esta bebida se pueden recuperar más de 50 géneros diferentes, dependiendo
del tipo de agave utilizado y el tipo de medios de cultivo empleados para el
aislamiento. De acuerdo a los resultados obtenidos, en un estudio realizado en el
Instituto Politécnico Nacional y la Pontificia Universidad Javeriana, sobre la

fermentación alcohólica, ácida y viscosa del aguamiel, que dichas fermentaciones
son realizadas por un consorcio microbiano compuesto por levaduras, bacilos Gram
positivos y cocobacilos Gram negativos, los cuales están presentes en todas las
etapas del proceso de elaboración de Pulque.
Objetivo
Mediante esta práctica el alumno logrará:
 Aislar bacterias y levaduras a partir de diversas muestras de pulque.
 Sembrar y resembrar microrganismos en diversos medios, utilizando la técnica
de agotamiento.
 Explicar la importancia del Reglamento de Higiene y Seguridad, en el campo de
la Microbiología para llevar a cabo un buen aislamiento de microorganismos.
Materiales
Una muestras de 250 mL de pulque

4 tubos de 16 x 150 con 9 mL de agua peptonada
12 cajas con 20 mL de agar cuenta estándar (cst)
12 cajas con 20 mL de agar papa dextrosa (pdx)
4 jeringas estériles desechables de 3mL
Asa, porta asa, mechero, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, gradilla
Metodología
1 Marcar los 4 tubos según corresponda:

 cst1= para agar cuenta estándar, primera dilución
 cst2= para agar cuenta estándar, segunda dilución
 pdx1= para agar papa dextrosa, primera dilución
 pdx2= caldo agar papa dextrosa segunda dilución
2 Transferir un ml de pulque al tubo cst1 primera dilución, homogenizar y un ml de
pulque al tubo pdx1 primera dilución, homogenizar.
3 Ahora tienes 2 tubos sembrados: cst1 y pdx1. De cada uno de estos 2 tubos
transferir un ml a los tubos de la segunda dilución correspondiente. Por ejemplo:
del tubo pdx1 1mL pdx2.
4 Sembrar por agotamiento y por duplicado las 8 cajas de Petri de la siguiente

manera:
cst1 1 agar cst1
Primera dilución 2 agar cst1
Nota: Marcar cada caja

5 Incubar las cajas de agar cuenta estándar a 37°C por 48 h y las cajas de agar
papa dextrosa a temperatura ambiente por 3-5 días.
6 Análisis de primeros resultados.Análisis macroscópico de las cajas de Petri. (8
tablas)
Ejemplo.- Resultados del desarrollo de colonias de las cajas de Petri de agar cuenta
estándar. Primera dilución
Colonias color tamaño bordes textura reverso
colonia 1
colonia 2
colonia 3
colonia 4
7 Elaborar una tabla para cada dilución.

8 Hacer tinción de Gram o tinción simple según corresponda de las colonias que
sean escogidas para resembrar en la siguiente sesión. (Discusión grupal de esta
actividad).
9 Resultados de análisis microscópico:
Resultados de análisis microscópico del desarrollo microbiano en agar cuenta
estándar. (Las 2 diluciones)
Colonias Tipo de microorganismo Gram (+ o --)
Colonia 1- cst1
Colonia 2- cst2
10 Elabora dos tablas de resultados microscópicos: una para cst y otra para pdx
11 Refrigerar las cajas de Petri de las colonias escogidas para hacer la resiembra
en la siguiente sesión.
12 Siguiente sesión.- Sacar las cajas del refrigerador y hacer tinción de Gram o
tinción simple para verificar pureza de las colonias escogidas. (Una colonia por
caja).
13 Resembrar por agotamiento en los agares correspondientes (cst en cst y pdx en

pdx). (2 cajas)
14 Incubar a 37°C/48h las cajas con agar cst y a temperatura ambiente/3-5días las
cajas de pdx.
15 Siguiente sesión: Hacer tinción correspondiente de las 2 colonias escogidas.
Refrigerar las 2 cajas.
16 Siguiente sesión: Repetir las actividades desde el inciso 13 y terminar el con la
tinción de Gram para verificar pureza. 2 cajas.
17 Reportar resultados finales.
Colonias Tipo de Gram Aislado

microorganismo
bacteria
Moho o levadura
Bibliografía
 ACADEMIA DE CIENCIAS DE MORELOS, A.C. La Ciencia, desde Morelos para

el mundo CIENCIA Adelfo Escalante Instituto de Biotecnología, UNAM Campus
Morelos. Guillermo Gosset Miembro de la Academia de Ciencias de Morelos
Instituto de Biotecnología, UNAM Campus.
Moreloshttp://pulquesnichos.es.tl/MICROORGANISMOS-EN-EL-PULQUE-.-
.htm. Consultado el 29 de diciembre de 2014.
 Mario Cervantes-Contreras, Aura Marina Pedroza-Rodríguez. (2007). El pulque:

características microbiológicas y contenido alcohólico mediante espectroscopia
Raman. PUBLICACIÓN CIENTÍFICA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS. p.p101-212.
 Sosa D, Navarro A, Matiz A, Quevedo B, Pedroza A. (2001). Obtención de etanol

a partir de almidón de papa proveniente del sector agrícola. En: VII Congreso
Latinoamericano de Microbiología e Higiene de Alimentos IV Congreso
Internacional de Microbiología Industrial. Bogotá; p. 12-23.
 Poutou R, Gómez A.L, Torres C, Matiz A. (2000) Producción de etanol con cepas
autóctonas de Zymomonas mobilis spp. (Parte I: Aislamiento y caracterización
bioquímica. Distritalia. 2:49-57.
Recuento de hongos y levaduras en oleaginosas, semillas y frutos secos
Introducción
Los hongos y levaduras se encuentran distribuidos ampliamente en el ambiente, por

lo que son frecuentes en la microbiota de muchos alimentos y se caracterizan por
producir múltiples alteraciones en los mismos. Debido a su crecimiento lento y a su
baja competitividad, los hongos y levaduras se desarrollan en condiciones que no
favorecen el crecimiento bacteriano, como por ejemplo: pH ácido, baja humedad,
alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento,
presencia de antibióticos o sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano.
Las contaminaciones en frutos secos, oleaginosas, cereales y otros granos se
pueden dar a través de mohos transmitidos por el aire o residuos sobre las
superficies en contacto directo con el alimento. Su presencia puede evidenciar el
grado de contaminación de un alimento o indicar el riesgo de desarrollo de hongos
toxigénicos. Existe, por ejemplo, evidencia de la presencia de aflatoxinas en nueces,
pistachos, cacahuate y maíz, las aflatoxinas son producidas por Aspergillus flavus,
A. parasiticus y A. nonius y pueden invadir los cultivos durante la maduración en el
campo o después de la cosecha.
Es relevante, por lo tanto, la identificación de hongos y levaduras en este tipo de
alimentos ya que su determinación indica prácticas sanitarias inadecuadas durante
la producción, almacenamiento o el uso de materias primas inadecuadas.
El deterioro de este tipo de productos depende principalmente de la actividad de
agua, productos con una actividad de agua entre 0.5 y 0.8 pueden sufrir alteración
por levaduras osmófilas y mohos xerófilos; a menor actividad de agua, el producto
se hace más estable.
La contaminación y desarrollo de hongos deterioradores en frutos secos y
oleaginosas pueden ser minimizados o evitados a través del empaquetamiento
anaeróbico, reducción de la actividad de agua a valores menores a 0.6, el
congelamiento y el uso de conservadores que inhiban el crecimiento de los hongos;
sin embargo la medida principal es evitar su desarrollo a través de las Buenas
Prácticas de Manufactura (BPM), en este sentido el Comité del Codex ha
desarrollado un código de prácticas para el control de la contaminación en alimentos
por micotoxinas.
Objetivos
Mediante este ejercicio, el alumno logrará:

 Identificar la importancia de mohos y levaduras como microorganismos
indicadores de calidad de frutos secos y oleaginosas.
Muestras
Muestras de frutos secos y oleaginosas (almendra picada, nuez picada, cacahuate
natural, piñón, pistache, semilla de girasol, pasitas, coco rallado, orejones de
manzana).
Material y equipo
Mechero Portaobjetos
Asa Cuchillo estéril
Marcador de tinta indeleble 4 pipetas Pasteur estéril
Portaobjetos y cubreobjetos 2 cajas de agar cuenta estándar
Microscopio óptico 2 cajas con agar papa dextrosa (PDA)
Lactofenol Azul de Algodón acidificado
Colorantes de Gram 4 tubos con agua peptonada estéril
Cubreobjetos
Metodología
1. Marque la base de las cajas Petri para dividirlas en dos y marque cada zona con
el nombre de uno de los alimentos que se le asignaron. (El procedimiento se
realiza en Agar cuenta estándar y PDA)
2. Picar en pequeños trozos con el cuchillo estéril las muestras que así lo requieran.
3. En zona aséptica, prepare una dilución 1/10 en el tubo con solución peptonada
de cada una de las muestras de alimento.
4. Siembre 0.1 mL (o dos gotas con pipeta Pasteur), en la mitad de la caja
correspondiente a la muestra en ambos medios de cultivo (cuenta estándar y
PDA); deje que se absorba antes de invertir las placas (10 minutos).
5. Incube las cajas de Agar Cuenta Estándar a 352ºC y las de PDA a 252ºC
Resultados
Realice una descripción macroscópica con un diagrama, dibujo o foto de cada caja.
Realice una tinción simple y observe al microscopio, registre su observación en un
diagrama con dibujo o foto donde indique el objetivo utilizado, el tipo de
microorganismos presentes, así como las partes que se observen de cada uno de
ellos.
Explique técnicamente el porqué de los resultados obtenidos en función de la
procedencia de la muestra, su procesamiento, su método de conservación y envase.
Registre en un cuadro todos sus resultados.
Cuestionario
1. ¿Por qué es importante la identificación de mohos y levaduras en frutos
secos y oleaginosas?
2. ¿Qué son las micotoxinas y por qué se debe evitar su desarrollo en los
alimentos?
3. ¿Qué condiciones deben controlarse para evitar el desarrollo de mohos
toxigénicos?
4. Investigue el valor de actividad de agua de los productos analizados y
relacione los datos con los resultados obtenidos:
5. Investigue y presente los criterios microbiológicos de los productos
analizados; compare con los resultados obtenidos:
Bibilografía
 Módulo 2. Microorganismos Indicadores. Recuperado el 7/01/15 de:

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/2Indicadores_6422.pdf
 Norma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para

la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Recuperado el 9/01/15 de:
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/111ssa14.html
 Ray, B y Bhunia, A. (2010). Fundamentos de Microbiología de los Alimentos. Mc

Graw Hill: México
 Torres, M.R y Castillo, A. (2006) Microbiología de los Alimentos. Universidad de

Guadalajara. Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías.
Departamento de Farmacobiología: México
Fermentación láctica
Elaboración de yogurt
Introducción
Se define como yogur al producto lácteo preparado a partir de leche entera o

descremada, tratada térmicamente y fermentada mediante las bacterias lácticas:
Lactobacillus acidophilus (bulgaricus) y Streptococcus thermophilus. Según el tipo
de yogur, puede contener frutas, azúcar, miel, saborizantes, colorantes y
estabilizantes permitidos por la Secretaría de Salud. Cuando tienen fruta
adicionada, al menos 75 % del producto, debe ser yogur.
El yogur debe tener color y aroma característico y agradable, sabor ácido y

agradable, así como la consistencia y viscosidad características del producto. Debe
contener de 0.8 a 1.8 % de ácido láctico y tener pH< 4.5, lo que es fundamental
para lograr la consistencia, que se debe a la desestabilización de la caseína, y sobre
todo para que el producto sea seguro, ya que debajo de pH 4.5 hay poca
probabilidad de que desarrollen patógenos y flora de deterioro.
La variedad de presentaciones del yogur es enorme: los hay con diferentes

contenidos de grasa, con azúcar y con edulcorantes, con frutas, extractos y
combinaciones de éstos, batidos, para beber, semisólidos, etc. La calidad del
producto obtenido depende fundamentalmente del tipo de leche que se utilice, de
las cepas bacterianas y del control de la fermentación.
Se utilizan dos tipos de bacterias en la elaboración del yogur: Lactobacillus

bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Ambas bacterias se ayudan mutuamente
en este proceso. ¿Cómo se ayudan estas bacterias?
Lactobacillus bulgaricus, inicia la hidrólisis de las proteínas de la leche, con lo que
se liberan aminoácidos. Streptococcus thermophilus, requiere uno de los
aminoácidos que se libera al cortar las proteínas, la valina, y le sirve de alimento, lo
cual le permite multiplicarse.
Streptococcus thermophilus no soporta demasiado la acidez, por lo tanto al

aumentar ésta en el proceso de elaboración de yogur, se inhibe, mientras que
Lactobacillus bulgaricus que si soporta la acidez, se multiplica más rápido. Esto
hace que ambas bacterias se encuentren en igual cantidad al final del proceso de
elaboración del yogur. Lactobacillus bulgaricus es el principal productor de aroma y
sabor en el yogur.
Además de ácido láctico, aromas y sabores, las bacterias del yogur producen
bacteriocinas, sustancias que pueden inhibir a otros microorganismos, incluidos los
patógenos, y péptidos pequeños que tienen importantes funciones metabólicas.
Cuando consumimos el yogur, las bacterias pueden establecerse en el tracto

intestinal y defenderlo de la colonización de patógenos, por su presencia y porque
siguen liberando esos producto. Para ello, debe haber del orden de 2,000 ufc/g en
el yogur.
El yogurt puede consumirse en forma natural o emplearse en algunas recetas para

la elaboración de postres, ensalada, sopas, carnes, ciertas verduras y otros.
Es interesante saber que la elaboración de yogurt hace unos 3500 años era una
fermentación espontánea, es decir que se lograba sin agregar ningún
microorganismo, simplemente se dejaba la leche en vasijas de barro y se
fermentaba por la flora natural de la leche. Los pastores nómadas de Europa del
Este y de Asia que empezaron a producirlo, lo apreciaban mucho por su estabilidad,
y atribuían a las vasijas de barro o a las pellizas en las que guardaban la leche, el
“poder” de transformarla. En realidad, la flora permanecía en los recipientes y servía
como inóculo para nuevos lotes de leche.
En este ejercicio haremos una fermentación láctica y llevaremos registro del cambio
de pH. Utilizaremos dos temperaturas de incubación, que por supuesto tienen efecto
diferente en la forma de crecimiento de las bacterias fermentadoras. Por los
nombres de las bacterias productoras del yogur, ¿cuál cree usted que crece mejor
a temperaturas más altas?
Finalmente, compararemos las características del producto, la estabilidad del yogur

y de la leche y la composición semi-cuantitativa de la población bacteriana final.
Objetivos

 Llevar a cabo una fermentación láctica, utilizando un iniciador.
 Determinar el efecto de la temperatura de incubación en las propiedades
sensoriales del yogur.
 Explicar los cambios en la estabilidad del producto, en comparación con la
materia prima.
Material y equipo
Dos recipientes de peltre, vidrio o acero inoxidable de 1.5 - 2.O L

Dos cucharas de peltre.
Dos palitas de madera.
20 tubos de ensayo de 22 x 175
Un termómetro.
Papel pH
Incubadoras
Lienzos o toallas para cubrir los recipientes
Microscopio
Colorante para tinciones: azul de metileno o cristal violeta
10 Portaobjetos
pH-metro digital calibrado
Buffers de referencia
Muestras
Dos litros de leche Alpura pasteurizada (no usar leche ultrapasteurizada)

Dos litros de yogur comercial natural, muy fresco (Nestlé de 200 g)
Metodología
1. Tratamiento térmico de la leche: aunque la leche es pasteurizada y ya tiene un

tratamiento térmico se calienta a ebullición durante 3 min, en el recipiente en el
que se va a fermentar. El propósito es inactivar flora contaminante que pueda
competir en la fermentación, y alcanzar la temperatura adecuada para el inicio.
2. Se deja enfriar hasta 42 °C (ó a 34°C si le asignaron esa temperatura) y a
continuación, se agregan de 100 a 150 g de yogur comercial (que será el
inóculo o iniciador) por cada litro de leche.
La cantidad de inóculo es muy importante, pues si es insuficiente no se alcanza
la acidez necesaria, lo que afecta la textura y, sobre todo, la seguridad del
producto final. Si el inóculo es excesivo, su propia acidez puede inhibir a S.
thermophilus y afectar las características del yogur.
3. Se homogeniza suavemente, sin agitar demasiado, ya que debe evitarse la
incorporación de aire, pues las bacterias lácticas son anaerobias.
4. Se transfieren muestras de unos 20 mL a cada uno de 10 tubos de ensayo de
22 x 175, marcados como indica el cuadro de Resultados; las muestras deben
tomarse cada media hora; anote siempre la hora para determinar con precisión,
el tiempo de fermentación transcurrido.
5. Se tapan los tubos con película plástica y se colocan en la incubadora, según
la temperatura asignada (40°C ó 32°C), bien envueltos en lienzos o toallas,
para que conserven la temperatura inicial.
Considere las siguientes precauciones:

 Si la leche está por debajo de la temperatura requerida, las bacterias tendrán un
desarrollo escaso y no se alcanzarán la acidez ni la textura deseadas. Recuerde
que si no se alcanza la acidez, el producto no es seguro, pues pueden desarrollar
microorganismos patógenos.
 Si la leche está muy caliente, las proteínas se empiezan a desnaturalizar antes
de que las afecte el pH, por lo que la cuajada será indeseable y soltará mucho
suero.
6. Cada 30 minutos, se saca el tubo de ensayo correspondiente, se enfría en baño
de agua a 20 °C, se determina el pH y se refrigera hasta la siguiente sesión. El
punto final de la fermentación se alcanza cuando el pH es < 4.5, lo que sucede
en 3 a 5 horas.
7. Guardar los tubos en el refrigerador hasta la siguiente sesión.
Resultados
Sacar del refrigerador los tubos de muestra, poner en un baño de agua a 25 °C,
hasta que lleguen a unos 20 °C y medir a cada uno el pH: registrar datos en la tabla
siguiente. A continuación, graficar tiempo vs. pH.
Temperatura:
Tiempo pH sig Proporción

Tubo Hora transcurrido pH sesión bacilos:cocos Observaciones
Leche
1 0
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Elabore una tinción simple de cada tubo y trate de establecer la proporción de

bacilos y cocos.
Responda:
¿Qué variables se mantuvieron constantes?
¿Qué variables cambiamos?
En los productos finales, compare:

Textura Sabor pH
Leche
Yogur
producido a
40 °C
Yogur
producido a
32 °C
Finalmente, deje a temperatura ambiente una porción de yogur y una de leche, de

igual tamaño. Tápelas con película plástica y observe diariamente; reporte cambios
en la estabilidad: cortado, coloración, aromas o desarrollo microbiano evidente.
Elabore sus conclusiones.
Bibliografía
 García Garibay, Quintero y López-Munguía. 2005. Biotecnología Alimentaria.

Limusa. México.
 Yousef, A. & C. Carlstrom. 2006. Microbiología de Alimentos. Manual de

laboratorio. Limusa, Wiley. México.
 Bourgeois, D. & J. Larpent (coords). 1995. Microbiología Alimentaria, Vol 2.

Fermentaciones Alimentarias. Acribia. España.
Actividad microbiana en leches pasteurizadas y ultrapasteurizadas
Introducción
La leche es un líquido de composición compleja, blanco, opaco, de sabor dulce y

pH cercano a la neutralidad.
Es una emulsión de materia grasa en un líquido análogo al plasma sanguíneo, que
a su vez es una suspensión de materias proteicas en un suero que contiene
principalmente lactosa y sales minerales.
La leche es un producto que se altera muy fácilmente en especial bajo la acción del
calor. Por su valor nutritivo, numerosos microorganismos pueden proliferar en ella,
por lo que las exigencias sanitarias para su transformación industrial, son muchas y
deben cumplirse para tener un producto de alta calidad nutricional, bromatológica y
sensorial.
Pasteurización
La pasteurización es el calentamiento controlado de un producto para destruir
microorganismos, toxinas y enzimas. Las condiciones se definen para cada
producto, donde se incluyen dos valores necesariamente:
1.- la temperatura que debe alcanzarse.
2.- El tiempo de exposición a esta temperatura.
En el caso de la leche, la pasteurización tiene una doble finalidad:

1.- Eliminación de patógenos para el hombre.
2.- Reducción de la flora saprófita para mantener la calidad de la leche.
Valores de tiempo y temperatura para la pasteurización de la leche

LTLT (low temperature long time) 63°C durante 30 min.
HTST (hot temperature short time) 72°C durante 15s.
Después de la pasteurización la leche contiene aún, bacterias termofílicas y
esporas. La flora láctica residual está constituida sobre todo por estreptococos
(thermophilus, bovis y durans principalmente) los cuales influyen en la duración de
la leche pasteurizada, por lo que un gran número de estos microorganismos significa
un mal proceso.
Ultrapasteurización
Este método permite obtener leche comercialmente estéril sin mayor modificación
que la leche pasteurizada.
Valores de tiempo y temperatura para la ultrapasteurización de la leche
1s. -5s dependiendo del valor de la temperatura. 130 – 150°C
Resistencia térmica de algunos microorganismos en leche

Microorganismo Temp. de Medio Dt
“D” (°C)
Mycobacterium tuberculosis 65 Buffer de fosfatos 0.2-0.3 min.
Coxiella burnetti 65 Buffer de fosfatos 0.5-0.6 min.
Escherichia coli 72 leche 1 seg.
Staphylococcus aureus 72 leche 0.6 seg.
Saccharomyces cerevisiae 72 Jugo de naranja 0.02 seg.
Efecto protector de los componentes de la leche.

Temperaturas (°C) necesarias para matar al microorganismo en 10 min.
Medio L. lactis lactis E.coli L. bulgaricus
crema 70 73 95
leche entera 64 69 91
leche descremada 61 65 89
suero 59 63 83
Algunas bacterias lácticas más comúnmente utilizadas en la elaboración de

productos lácteos.
Especie Producto en que se usa funciones
Lactobacillus lactis Quesos cocinados a temp. Producción de ácido
lactis moderada, jocoque, crema láctico
Lactobacillus lactis ácida queso cottage
cremoris
Leuconostoc lactis
Streptocuccus Quesos cocinados a Producción de ácido
thermophilus temperaturas altas, yogurt, láctico.
Lactobacillus labné Aroma y sabor
delbrueckii bulgaricus.
Lactobacillus casei Yakult y otras leches Producción de ácido
casei fermentadas láctico.
Aroma, sabor, probiótico
Bifidobacterium bifidum Yogurt AB, Biogarde Probiótico
Bifidobacterium infantis
Objetivos
Al finalizar esta práctica, el alumno será capaz de:

 Comparar la calidad fisicoquímica y microbiológica entre la leche pasteurizada y
ultrapasteurizada.
 Determinar variación de pH, densidad y temperatura a lo largo de la vida útil de
los productos estudiados. Determinar existencia de microorganismos.
 Comparar los cambios sensoriales en ambas leches.
 Observar los efectos de los microorganismos en los componentes de la leche.
Material y Sustancias
Mechero
Asa
Microscopio
Portaobjetos y cubreobjetos
Colorantes Gram
Picnómetro
pH metro
Termómetro
2 varilla de vidrio en L para extender muestra
2 pipetas de 10 mL o jeringas
2 pipetas de 1 mL o jeringas
2 vasos de precipitados
8 cajas de agar Extracto de levadura glucosa (TGELA)
10 tubos de 16x150 con 9 mL de agua peptonada
Muestras: Ambas leches de la misma clase y marca, pero diferentes para cada
equipo
1L de leche pasteurizada
1L de leche ultrapasteurizada
Nota.- El material se repartirá a lo largo de la práctica
Metodología
1. En la zona aséptica abrir los empaques de leche previamente sanitizados.

2. Tomar 0.1 mL de las muestras y sembrar en la superficie de las cajas de petri.
3. Incubar en refrigeración por 8 días.
Nota: estos 3 pasos se harán en zona aséptica solo la primera vez.
4. Verter 25 mL de ambas muestras en cada uno de los 2 vasos de precipitado.
5. Tomar temperatura.
6. Evaluar textura, color y aroma.
7. Llenar el picnómetro que tendrá que estar previamente pesado con el tapón
esmerilado.
8. Pesar el picnómetro con el tapón y los 20 mL de leche.
9. Elaborar cálculos y obtener la densidad.
Resultados
Los resultados se reportan en 2 tablas para cada producto.
Tabla 1. Características microbiológicas

Obs. macroscópica Obs. microscópica
Colonia 1
Colonia 2
Colonia 3
Tabla 2. Características fisicoquímicas y sensoriales

fecha pH densidad color aroma textura temp.
Traer las tablas durante todo el experimento.

Se discutirán los resultados, en forma grupal, cada vez que precipiten las muestras
de un equipo. El tiempo de la práctica es variable.
Cuestionario
1 ¿Qué parámetro medido tiene mayores cambios durante el estudio de vida de
anaquel de la leche, y por qué?
2 ¿Por qué cambia el olor? Es una reacción química o microbiológica, fundamenta
tu respuesta.
3 ¿Cuál de las dos leches es más estable? ¿Que ha influido para esta estabilidad?
4 En teoría, ¿cuánto tiempo dura una leche pasteurizada y otra ultrapasteurizada
una vez abiertas, en el refrigerador?
5 ¿Podría el proceso de pasteurización o de ultrapasteurización, ser un factor para
la estabilidad de la leche? Fundamenta tu respuesta.
Bibliografía
 Ray,B. & Bhunia, A. (2010). Fundamentos de Microbiología de los Alimentos. Mc

Graw Hill. Cuarta Edición.
 Roberts,D. & Greenwood,M. (2003). Practical Food Microbiology. Blackwell

Publishing Ltd. USA. Third Edition.
 Alais, Ch. (2003) Ciencia de la leche, principios de la técnica lechera. Editorial

Reverté, S.A. Barcelona.
 Apuntes de la Profesora Aleida Mina del Departamento de Alimentos de la

Facultad de Química, U.N.A.M.
Lavado y desinfección
Introducción
La desinfección es un proceso moderado de eliminación de microorganismos que

sólo logra destruir a las células poco resistentes a condiciones adversas; como
muchos patógenos son relativamente poco resistentes a factores ambientales
adversos, puesto que están acostumbrados al ambiente muy controlado del cuerpo
de organismos superiores, muchos patógenos (pero no todos) son eliminados en un
proceso de desinfección.
Sin embargo, en la desinfección sobreviven formas resistentes como esporas y

microorganismos capaces de resistir el tratamiento moderado que se haya
empleado. Por ejemplo, la pasteurización permite la sobrevivencia de esporas y
bacterias termofílicas; el tratamiento con alcohol y el cloro lo resisten fácilmente las
bacterias Grampositivas, en tanto que el violeta de genciana y otros colorantes
pueden eliminar bacterias Grampositivas, pero los resisten bien los Gramnegativos.
Los antisépticos son sustancias químicas que pueden matar o inhibir

microorganismos pero que por su baja toxicidad, pueden utilizarse en tejidos vivos,
sin dañarlos, por ejemplo el etanol, el yodo, los jabones.
Los alimentos generalmente tienen cargas microbianas importantes por su origen y

porque permiten el desarrollo microbiano a partir de los nutrientes y agua que
contienen, especialmente si no se controlan la temperatura y otros factores (pH por
ejemplo). Además pueden contaminarse durante el manejo y procesamiento, con
otros microorganismos del ambiente y de las personas que los manipulan. Esa flora
microbiana presente en los alimentos tiene consecuencias en dos ámbitos
importantes:
 Durante el almacenamiento, el proceso y hasta el consumo, pueden causar
deterioro en el alimento, generando desde notas de olor peculiar, hasta
descomposición evidente, pasando por olores y sabores extraños, cambios
de color y textura, desarrollo microbiano perceptible y producción de
sustancias tóxicas.
 Cuando los ingerimos, los microorganismos presentes llegan al tracto
digestivo; ahí pueden ser neutralizados por la flora habitual y defensas del
consumidor o pueden superarlas, establecerse y causar enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA’s, por sus siglas, ó TIA’s, siglas de toxi-
infecciones alimentarias).
En el procesamiento de alimentos sea industrial o culinario se utilizan métodos de

desinfección y también de esterilización; en este caso, el tratamiento debe ser muy
drástico pero puede aprovecharse el efecto sinérgico de algunos factores. Por
ejemplo a menor pH, menor resistencia de los microorganismos al calentamiento; la
concentración elevada de solutos, al aumentar la presión osmótica, favorece la
penetración del calor.
También es de gran importancia la adecuada desinfección de utensilios y equipo,

así como de las manos del personal que maneja alimentos
En este ejercicio se utilizarán como muestras algunos utensilios y frutas; se

requieren 6 piezas para la práctica. Primero se hace un muestreo con hisopo, de la
carga inicial de la muestra (fruta, cuchara, mesas), tal como se recibió. Luego, las
otras piezas de la muestra se someten a lavado y desinfección, muestreando con
hisopo en diversos momentos del proceso.
Objetivos
Al finalizar esta práctica, los alumnos serán capaces de:
 Explicar los efectos del lavado, la desinfección y sus etapas, en la flora habitual
de alimentos y utensilios.
 Relacionar las características de estas operaciones, con la calidad
microbiológica de los alimentos.
Muestras
Utilizar 3 piezas para muestras grandes como manzanas y dividirlas en 2, o utilizar

6 piezas para las muestras pequeñas, como limones, chiles o higos.
En los utensilios, tomar las muestras de la zona “útil” de la cuchara o el plato; en

las latas de refresco, muestrear la tapa superior y el borde, donde se apoyan los
labios cuando se bebe directamente de la lata. En la mesa, muestree una zona
diferente de 10 x 10 cm cada vez.
Para las manos, muestrear los dedos cordiales para la muestra inicial y la
enjuagada, los índices para las muestras lavadas y los pulgares para las muestras
desinfectadas; cuidar que no lo que se hace en una etapa no afecte las zonas de la
siguiente muestra.
Material y equipo
3 cajas de Petri con Agar nutritivo Marcadores

6 hisopos estériles Jabón o detergente
1 tubo con agua destilada estéril Desinfectante y recipiente para aplicarlo.
Incubadora Toallas de papel desechables
Limones (6) Cucharas desechables (6)
Higos (6) Platos (3)
Chiles serranos (6) Manos
(u otros más o menos lisos) (se muestrean 3 dedos de c/u)
Rábanos (6) Mesa de trabajo
Manzanas (3) (zona de 40 x 40 cm)
Peras (3) Latas de refresco (6)
Naranjas (3) (se pueden consumir después)
Metodología
1. Divida 3 cajas de Agar nutritivo en dos cada una, y marque cada mitad como
se indica:
I Inicial o del objeto directo CAJA 1
E Enjuagado CAJA 1
LH Lavado y húmedo CAJA 2
LS Lavado y seco CAJA 2
DH Desinfectado y húmedo CAJA 3
DS Desinfectado y seco CAJA 3
2. En el caso de muestras grandes (manzanas, peras, naranjas, platos), divida las
3 piezas a la mitad, marcando con un plumón. Utilizará cada porción como si
fuera una muestra.
3. Tome la muestra “inicial” directamente del objeto. Tome el hisopo en la zona
aséptica y humedezca en agua estéril; tome la muestra con el hisopo, moviendo
éste muy bien por toda la superficie a muestrear, y girándolo continuamente.
Enseguida, inocule los medios de cultivo en la zona correspondiente, trazando
rectas con el hisopo; gírelo para cada recta de manera que lo “descargue” todo.
4. A continuación, lavar una o dos piezas con agua y jabón; tomar la muestra
“lavado húmedo” con hisopo. Después, secar la otra pieza (o mitad) lavada y
tomar la muestra respectiva.
5. Incube las cajas a 35 °C por 48 horas.
Resultados
Observar las cajas y registrar los resultados. ¿Qué cantidad y tipo de desarrollo
obtuvo en cada caso?
Hacer tinciones de Gram de las bacterias más abundantes (o preparaciones en

fresco de los hongos), describir sus características.
Hacer un cuadro donde se relacionen el tipo de tratamiento que recibió el alimento

o utensilio, y el resultado obtenido. Explicar las implicaciones que tienen estos
resultados en su trabajo.
Elaborar conclusiones.
Bibliografía
 Ramírez Gama, R.M., B. Luna, O. Velázquez, L. Vierna, A. Mejía, G., Tsuzuki,

L. Hernández e I. Müggenburg. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología
General. Facultad de Química, UNAM. México.

microorganismos. 10ª. Ed. Perarson-Prentice Hall. España.
 UAM Azcapozalco. 2004. Laboratorio de Microbiología. Licenciatura en

Ingeniería Ambiental. En: www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia
Elaboración de Amazake a partir de Aspergillus oryzae
Introducción
El Amazake es una bebida fermentada, no alcohólica, elaborada tradicionalmente

con arroz; se caracteriza por una consistencia suave y cremosa, y un sabor
ligeramente dulce. El sabor dulce del Amazake se debe a la acción enzimática del
Koji en el almidón de los granos de arroz para producir azúcares simples.
El Amazake es una bebida tradicional japonesa que hoy en día se consume en el
mundo occidental en diversas formas, ya sea como helados no lácteos, malteadas,
pudines, en pan y pasteles, o como base para aderezos de ensaladas.
El Amazake de arroz integral ofrece diversos beneficios a la salud, es rico en fibra,
carbohidratos, vitaminas del complejo B y es bajo en grasa; si se obtiene por el
proceso tradicional, ofrece un contenido importante en ácidos grasos. Contiene
principalmente maltosa y 50% de carbohidratos complejos, mismos que se asimilan
lentamente, suministrando suficiente energía en un periodo de tiempo prolongado;
por lo que se recomienda como una alternativa para los atletas y personas activas.
Es un alimento que presenta diversas enzimas activas que favorecen la digestión
de proteínas, grasas y carbohidratos en aminoácidos, ácidos grasos y azúcares
simples respectivamente.
La bebida se obtiene a partir del proceso tradicional con Koji, o con el uso de
enzimas; de igual forma se pueden combinar ambos métodos.
El proceso tradicional con Koji implica la acción de diversas enzimas de forma
simultánea sobre las proteínas, grasas y carbohidratos del grano de arroz; lo que
resulta en una mezcla compleja de compuestos para el desarrollo del aroma y sabor.
La fermentación se realiza en dos fases; en la primera fase, el arroz al vapor se
inocula con esporas del hongo Aspergillus oryzae y se incuba a una temperatura
entre 27-30ºC, la mezcla se agita ocasionalmente para promover el crecimiento del
hongo en la superficie del arroz. El producto resultante es el Koji de arroz, que
contiene las enzimas necesarias para una segunda fermentación y la producción
del Amazake.
En la segunda fase de la fermentación, las enzimas del Koji de arroz, principalmente
las amilasas, hidrolizan el almidón en el Koji y en el arroz fresco cocido para formar
azúcares simples, responsables del ligero sabor dulce del Amazake.
El proceso de obtención del Amazake a través del uso de enzimas permite un mayor
control en las características del producto final; por ejemplo, si se requiere un mayor
dulzor en el producto, se promueve a través del uso de enzimas específicas el
desarrollo de un mayor porcentaje de glucosa que de maltosa.
Hoy en día el Amazake es una bebida popular en Japón, especialmente en las casas
de té, la bebida se ofrece caliente en una taza de cerámica acompañada de raíz de
jengibre.
Objetivos
Mediante esta práctica el alumno lograra:

 Identificar el proceso de fermentación del grano de arroz con Aspergillus oryzae.
 Explicar las variables que influyen en el proceso fermentativo .
 Identificar los beneficios de productos fermentados.
 Desarrollar propuestas gastronómicas a partir del Amazake.
Material y equipo
500g de arroz blanco o integral

10g de sal
cepa grado alimenticio de Aspergillus oryzae o Koji de arroz
Olla Express
Cuchara
Frasco de vidrio con tapa de 1000ml
Termómetro
Asa micológica
Incubadora
Metodología
1. Cocer el arroz al vapor en una olla de presión o vaporera (El arroz debe quedar
poco húmedo para favorecer el crecimiento del hongo).
2. Lavar y esterilizar un frasco de vidrio con tapa.
3. Bajar la temperatura del arroz cocido a 45-30ºC.
4. Vaciar el arroz en el frasco estéril.
5. Inocular con esporas del hongo Aspergillus oryzae e incorporar a todo el arroz.
6. Incubar a una temperatura entre 30-32ºC durante 14-24 horas, la mezcla se agita
ocasionalmente para favorecer el crecimiento uniforme del hongo (El crecimiento
del hongo se confirma por la presencia de manchas blancas en el arroz y se
percibe un aroma dulce).
7. Refrigerar de 4°C a 8°C el producto una vez terminada la fermentación.
8. Desarrollar un producto con el Amazake.
Resultados
Describir las características sensoriales del producto obtenido (olor, color y sabor).
Presentar una propuesta gastronómica con el producto desarrollado y describir sus
características.
Cuestionario
1. ¿Cuáles son las condiciones óptimas de crecimiento del Aspergillus oryzae?
2. ¿Qué factores se deben controlar para que se lleve a cabo el proceso
fermentativo con éxito? Explique el porqué.
3. ¿Qué cambios ocurren durante el proceso fermentativo con A.oryzae en el grano
de arroz?
4. ¿Qué beneficios puede ofrecer el Amazake?
Bibliografía
 Belleme, John., Belleme Jan (2007). Japanese Foods that Heal. [Versión electrónica]
Tuttle Publishing: Canada. Recuperado el 8/01/15 de:
https://books.google.com.mx/books?id=lVz0tjE2NZAC&printsec=frontcover#v=
onepage&q&f=false
 Shurtleff, W y Aoyagi, A. (1988) Amazake and Amazake Frozen Desserts.

[Versión electrónica] Soyfoods Center: USA. Recuperado el 8/01/15 de:
https://books.google.com.mx/books?id=IbXxAAAAMAAJ&printsec=frontcover&
dq=amazake&hl=en&sa=X&ei=6LmuVPfAO4W3yQSH1oLQCw#v=onepage&q
=amazake&f=false
Microorganismos psicrófilos y psicrótrofos
Introducción
Hemos visto en diferentes prácticas y en teoría, que los microorganismos son

capaces de vivir en muy variadas condiciones ambientales. La temperatura es uno
de los factores que afectan el crecimiento de los microorganismos, y éstos pueden
clasificarse, según su temperatura óptima (es decir aquella en la que se alcanza el
mayor desarrollo en el menor tiempo), en termófilos, mesófilos y psicrófilos.
Temperatura de crecimiento (°C)

Grupo mínima óptima máxima
Termófilos 40 a 45 50 a 60 60 a 90
Mesófilos 5 a 15 30 a 40 35 a 47
Psicrófilos –5 a +5 12 – 20 15 a 20
Psicrótrofos –5 a +5 25 a 30 30 a 35
Muchos autores, han clasificado como psicrófilos o criofílicos, a todos aquellos

microorganismos que son capaces de crecer a 0ºC, sin tener en cuenta cuál es su
temperatura óptima. Otros distinguen en este grupo a dos tipos de microorganismos:
 Psicrófilos obligados, con temperaturas óptimas inferiores a 20ºC y
 Psicrófilos facultativos que aunque puedan crecer a 0°C, tienen temperaturas
óptimas más altas.
Conforme se dispone de más herramientas analíticas y se investigan más estos

grupos, se hace necesario hacer más específicas las definiciones, por lo que
actualmente se considera que son:
 Psicrófilos los microorganismos que tienen una temperatura óptima de
crecimiento alrededor de, o inferior a 15ºC y una máxima de 20ºC,o menos.
 Psicrótrofos los microorganismos capaces de crecer en las proximidades de 0ºC,
pero cuya temperatura óptima de crecimiento es más cercana a la de
microorganismos mesófilos.
Entre los psicrótrofos se incluyen bacterias Gram positivas y Gram negativas;

aeróbicas, anaeróbicas, y anaeróbicas facultativas; móviles e inmóviles;
esporuladas y no esporuladas. También se encuentran cepas psicrótrofas de
levaduras en los géneros Candida, Torulopsis, Cryptococcus y Rhodotorula. Hay
igualmente mohos psicrótrofos pertenecientes a géneros tan importantes como
Penicillium (rochefortii, por ejemplo), Cladosporium y Aspergillus.
En la Tecnología de los Alimentos los microorganismos psicrófilos son menos

importantes que los psicrótrofos, en virtud de su mayor sensibilidad a las
temperaturas elevadas y, sobre todo, de su origen natural; los auténticos psicrófilos
son generalmente de origen marino, de zonas muy frías y comprenden sólo unos
pocos géneros.
En este ejercicio detectaremos los psicrótrofos y psicrófilos presentes en alimentos

refrigerados y congelados, y examinaremos su efecto en los principales
componentes de los alimentos.
Objetivos
Al finalizar esta práctica, los alumnos serán capaces de:
 Distinguir a los microorganismos psicrófilos de los psicrótrofos por sus

temperaturas óptimas de crecimiento,
 Explicar los efectos de estos microorganismos en los componentes de los
alimentos y la relación microorganismos-composición-efecto.
Material y equipo
Mechero
Asa 2 cajas de agar cuenta estándar
Marcador de tinta indeleble. 2 cajas con agar papa dextrosa
Portaobjetos y cubreobjetos. 2 cajas de agar leche descremada
Microscopio 2 cajas de agar BHI con aceite de oliva
Tenedor y cuchillo estériles. 4 cajas de Petri estériles.
Colorantes Gram
Lactofenol – azul de algodón.
Muestras
Verduras refrigeradas, con desarrollo de microorganismos
Verduras o pescados congelados, de preferencia por largo tiempo
Un pepino sano
Una papa blanca sana
Metodología
1 En zona aséptica, cortar el pepino y la papa en rebanadas de aproximadamente

un centímetro.
2 Colocar una rebanada mediana o dos chicas de pepino en cada una de dos cajas
de Petri estériles.
3 Hacer lo mismo con la papa, usando las otras 2 cajas estériles.
4 A partir de la muestra de verdura con desarrollo de microorganismos o del
pescado o marisco congelado, según asigne el profesor, se inoculan las
verduras en todas las cajas de Petri.
5 Se inoculan también todas las cajas con medios de cultivo.
6 Se separan las cajas Petri en dos juegos, cada uno con una caja de leche
descremada, una de BHI+aceite, una caja con pepino y una caja con papa.
7 Un juego se incuba a temperatura de refrigeración por 8 días.
8 El segundo juego de cajas de Petri se incuba a temperatura ambiente durante 2
días.
9 Se revisan todas las cajas en el tiempo indicado, describiendo los cambios
macroscópicos es decir, describiendo lo que ha sucedido a las rebanadas de
papa y pepino, y si hubo algún cambio en los medios de leche descremada y el
de BHI con aceite de oliva.
10 Se lleva a cabo tinción de Gram y tinción simple para hongos en el crecimiento
obtenido.
Resultados
OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS.
T ambiente
Agar leche desc. BHI + aceite pepino papa
T refrigeración
Agar leche desc. BHI + aceite pepino papa
OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS
T ambiente
Agar leche desc. BHI +aceite pepino papa
T refrigeración
Agar leche desc. BHI +aceite pepino papa
En sesión plenaria, discutir los resultados de todos los equipos.

Incluir en el reporte las siguientes respuestas:
1. ¿Cuáles de los microorganismos obtenidos son psicrófilos y cuáles son

psicrótrofos? ¿Por qué?
2. ¿Qué actividad enzimática es responsable del deterioro del alimento y del
cambio en el medio de cultivo, en cada caja?
3. ¿Qué importancia tienen los psicrófilos y los psicrótrofos en el manejo de
alimentos en las cocinas? Explique detalladamente y dé ejemplos.
Bibliografia
 Adams & Moss. 2000. Food Microbiology. Royal Society of Chemistry. U.K.
 Kuehn & Gunderson. 1963. Psycrophilic and mesophilic fungi in frozen foods.
 Appl. & Env.l Microb. 4:325. En: http://aem.asm.org/cgi/reprint/11/4/352

Muerte térmica en bacterias
Introducción
En la elaboración de alimentos, sea culinaria o industrial, se aplica generalmente

algún tratamiento térmico que tiene varios propósitos: uno es modificar sabores y
texturas, otro es generar aromas y colores. Pero además, el calor causa un daño
importante en las poblaciones microbianas que siempre están presentes en los
alimentos y en los utensilios; por eso los productos que han tenido un proceso
térmico son más estables que los alimentos frescos y lo que es más importante, son
más seguros pues muchos microorganismo patógenos son eliminados en el
calentamiento.
Si conocemos la resistencia al calor de los microorganismos y controlamos el

proceso térmico, podemos lograr alimentos más estables y sobre todo, más
seguros. Por ejemplo, bajo un enfoque de análisis de riesgos para la obtención de
alimentos seguros, se controla rigurosamente que el tiempo de calentamiento de un
alimento, sea suficiente para eliminar al microorganismo más peligroso.
La aplicación de temperaturas elevadas es letal para los microorganismos, pero la

tolerancia de cada especie es diferente; a cierta temperatura, la tasa de destrucción
es logarítmica y proporcional al número de microorganismos presentes. El número
de células microbianas eliminadas depende de la especie, de la temperatura y del
tiempo de exposición; también pueden influir algunos agentes ambientales, por
ejemplo: a pH ácido, la mayoría de los microorganismos mueren más rápidamente
(a una temperatura dada), que a pH neutro; la presencia de grandes cantidades de
grasas o proteínas (muy común en alimentos) puede tener un efecto protector sobre
los microorganismos durante el tratamiento térmico.
La tasa de destrucción (o de muerte térmica) depende de la temperatura y el tiempo

de exposición, y es proporcional al número de microorganismos presentes. Conocer
la forma en que se comportan algunos microorganismos de importancia en
alimentos nos permite controlar los procesos que aplicamos, para asegurar la
destrucción de los microorganismos “blanco” y con ello, hacer seguro el alimento.
Para calcular las variables de un proceso térmico para alimentos, deben conocerse:
 El tamaño de la población inicial;
 El tipo y concentración aceptables de microorganismos residuales; por ejemplo
podemos aceptar que sobrevivan algunos esporulados en un alimento, si
estamos seguros de haber eliminado a todos los patógenos que

afortunadamente, tienen menor resistencia a las altas temperaturas, en términos
generales;
 La tolerancia térmica de los microorganismos que se desea eliminar (si hay
varios, se utiliza la del más resistente de ellos);
 La combinación de tiempo y temperatura requeridos para destruir al organismo
“blanco”, en las condiciones del alimento: pH, sales, sustancias protectoras,
entre otras.
Por ejemplo, en la pasteurización se ha tratado de eliminar siempre a

Mycobacterium tuberculosis y Coxiella burnetti, que son los patógenos más
peligrosos y resistentes que pueden estar presentes en la leche, (conviene
mencionar que con el surgimiento de nuevos patógenos, los parámetros de proceso
están en constante revisión). Así, el proceso se ha diseñado de manera que con el
tiempo y temperatura utilizados no haya posibilidad de supervivencia de estos
microorganismos, en una leche con carga microbiana usual.
Para definir dichos parámetros, se elabora la curva de muerte térmica, que nos
permite definir las condiciones para eliminar cierta cantidad del microorganismo en
cuestión. La cantidad de microorganismos que se considera es generalmente un
ciclo logarítmico (o un orden de magnitud, es decir el 90 % de la población).
En la curva de muerte térmica, se pueden encontrar tres datos muy importantes

para diseñar los procesos de los alimentos, pero el más utilizado es:
El factor D: el tiempo en minutos, requerido a cierta temperatura, para reducir en

un ciclo logarítmico (es decir, en 90 %), la población de cierta bacteria. Desde luego,
todas las bacterias con menor tolerancia térmica serán destruidas también.
Este dato se utiliza para establecer las condiciones de proceso; por ejemplo, la
pasteurización se hace calentando durante un tiempo de 12 D de Coxiella burnetti.
(es decir que si se hace a 65°C, el tiempo de tratamiento es 12 veces el necesario
para eliminar 90 % de la población de C. burnetti a 65°C; si se hace a 72°C, el
tiempo es 12 veces el requerido para eliminar 90% de la bacteria, a esta T.
En el reporte de la práctica, indique cuántas células de Coxiella burnetti se

pueden eliminar en la pasteurización.
En el siguiente ejemplo, calcule el valor D:
Muerte térmica
6 1,000,000
log # células viables
5 100,000
4
10,000
3
1,000
2
100
1
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
t (minutos)
En el eje de las abscisas tenemos el tiempo de calentamiento, en minutos. En el eje

de las ordenadas está el logaritmo del número de células viables; para comodidad,
a la derecha están los números de células viables.
El factor D es el tiempo necesario para reducir la población en un ciclo logarítmico,

por ejemplo de 100,000 a 10,000 (o de 5 a 4 en la escala logarítmica). Note las
líneas que cruzan la gráfica en 100,000 y en 10,000. Vea cómo se prolongan hasta
el eje del tiempo y señalan la diferencia, es decir el tiempo necesario para matar al
90 % de las bacterias, en este caso es de 8 minutos (16 – 8). Puede hacer el mismo
cálculo para otras poblaciones.
En este ejercicio haremos la gráfica de muerte térmica de una bacteria, en diferentes

condiciones.
Objetivos

 Explicar la dinámica de la mortalidad de los microorganismos.
 Encontrar el factor D para un microorganismo, en un sistema determinado, y
 Explicar el efecto (sinérgico o protector) de factores como pH, concentración y
tipo de solutos, en la muerte térmica de bacterias.
Material y equipo
12 tubos de ensayo de 16 x150 con 10mL del caldo alimenticio seleccionado por
los alumnos
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL con 150mL con el medio indicado por el profesor
(caldo de res, de pollo, de pescado, verduras, carne de cerdo, jarabe o salmuera))
pipetas Pasteur de plástico estériles
Gradilla
Termómetro 0 a 250°C
Cronómetro
Mechero
Tela de alambre
Tripié
Cultivos en caldo nutritivo, de E. coli
Metodología
Cada equipo utilizará una condición diferente y uno de los dos microorganismos
de prueba; note también los intervalos de muestreo:
Intervalos
Eq Medio Bacteria Temp muestreo
1 Solución de ácido E. coli 72°C 5 min
2 Agua destilada E. coli 72°C 5 min
3 Salmuera 20 % ó Jarabe 25 °Bx E. coli 72°C 5 min
4 Solución de ácido E. coli 85°C 3 min
5 Agua destilada E. coli 85°C 3 min
6 Salmuera 20 % ó Jarabe 25 °Bx E. coli 85°C 3 min
1. Marcar los tubos de caldo con: el nombre o iniciales del microorganismo y los
tiempos de muestreo, desde 0 es decir antes de iniciar el calentamiento.
2. Tomar una gota del cultivo asignado e inocularlo en el tubo testigo.

3. Marcar el matraz con las iniciales de la bacteria y el medio, y llevar a la
temperatura indicada.
4. Manteniendo la temperatura, verter en el matraz el cultivo asignado e iniciar el
cronómetro. A los 5 minutos exactamente, tomar una muestra con pipeta Pasteur
(como siempre, lleno el capilar) y transferir en zona aséptica al tubo que le
corresponde.
5. De manera similar, tomar muestras a los intervalos correspondientes y
transferirlas a los tubos marcados, usando una nueva pipeta o jeringa estéril
cada vez.
6. Incubar todos los tubos a 35+2°C durante 18 a 24 horas y refrigerar hasta el
momento de la lectura.
7. Homogenizar bien los tubos y determinar la densidad de la población, mediante
la escala turbidimétrica de Mac Farland.
8. Graficar tiempo de tratamiento térmico vs. log del número de microorganismos.
Calcular D en las condiciones del experimento.
Resultados
Compare las gráficas obtenidas para el mismo microorganismo en diferentes

condiciones (medio y temperatura), y para diferentes microorganismos en las
mismas condiciones. Explique las diferencias.
Elabore sus conclusiones y dé ejemplos de la aplicación de esta técnica, en
alimentos.
Bibliografía
 Adams & Moss. 2000. Food Microbiology. Royal Society of Chemistry. UK.


 Gouff, D. Termal destruction of microorganisms. Dairy Science and Technology.

University of Guelph. Canada. Disponible a través de Internet en:
http://www.foodsci.uoguelph.ca/dairyedu/TDT.html
Curva de crecimiento bacteriano
Introducción
Después de los estudios de Pasteur, hacia 1860, se empezó a comprender el papel

de los microorganismos en la salud, y en los alimentos; ha sido posible controlarlos
a partir de la comprensión de sus efectos y del origen de su presencia en los
alimentos.
Para la Gastronomía, este conocimiento es de gran importancia porque en los

alimentos, los microorganismos pueden ser causantes de enfermedades y de
deterioro, o pueden ser los productores de características únicas y muy deseables,
como en el vino, el yogur, los quesos o el pan, entre muchos otros alimentos.
Por eso es tan importante conocer las bases de su control; a veces debemos evitar
su presencia en los alimentos y desde luego su reproducción y actividad bioquímica.
Pero en otras ocasiones se requiere que se multipliquen o que transformen una
materia prima, o sólo una sustancia. En este ejercicio veremos la forma típica de
crecimiento de una población bacteriana.
Los alimentos son una mezcla de nutrientes que pueden ser utilizados por los
microorganismos para crecer y multiplicarse. Desde luego, además de los
nutrientes, necesitan condiciones ambientales favorables, como agua, temperatura,
aire y un estado vital que les permita hacerlo. Por su pequeño tamaño, cuando
hablamos de crecimiento microbiano, en realidad estamos hablando de crecimiento
de la población, de aumento en el número de células; en Microbiología se denomina
“viables” a los microorganismos que pueden reproducirse.
En el caso de las bacterias, la reproducción es muy simple, pues es asexual y por

fisión binaria. El tiempo de generación es el tiempo que tarda una población en
duplicar su número; puede ser tan corto como 20 min. ¿Qué significa esto? Veamos.
Calcule qué pasa con un puré de papa colocado en un bufete, al que le estornuda
cerca un comensal, que tiene en el flujo nasal 250,000 bacterias viables/mL.
Suponga que sólo una pequeña gota de 1/10 de mL cae en la superficie del puré.
Aunque el inserto se mantiene en baño de agua a 65°C, en la superficie la
temperatura es mucho menor. Además hay nutrientes, agua y todo lo que las
bacterias necesitan. Si el tiempo de generación de S. aureus es de 25 minutos y el
puré está en el bufete hasta las 16:30 horas, ¿cuántas células de S. aureus habrá
al final en cada gramo de puré?
En 0.1 mL habrá 25,000 células de S. aureus y, como hemos dicho, cada célula se
reproduce en 25 minutos, de manera que en ese tiempo se duplica la población:
Células de
Hora
S. aureus
14:00 25,000
14:25 50,000
14:50 100,000
15:15 200,000
15:40 400,000
16:05 800,000
16:25 1,600,000
Recuerde que cuando hay más de un millón de células /g, S. aureus produce
suficiente toxina para causar una intoxicación estafilocóccica.
En esta práctica veremos cómo se comporta una bacteria contaminante común, en

un medio de cultivo, bajo diferentes condiciones de temperatura y presencia de aire.
Objetivos

 Explicar la dinámica de crecimiento de las poblaciones bacterianas
 Explicar el efecto de factores ambientales en el crecimiento bacteriano.
Material y equipo
Gradilla
1 matraz de 250 mL con 150 mL de caldo alimenticio Mechero
13 Pipetas Pasteur con bulbo Refrigerador
12 tubos de 13 x 100 Termómetro
Aceite mineral estéril Incubadora
Suspensión de Escherichia coli
Metodología
Cada equipo trabajará una condición diferente, de acuerdo con el siguiente cuadro:
Para incubar a 6°C utilizaremos el refrigerador; para incubar a 25 °C se deja a
temperatura ambiente y para 35 °C se coloca en la incubadora; en todos los casos,
las temperaturas deben verificarse. Para incubar en presencia de oxígeno, basta
con el aire que queda en el matraz; para tener mínima cantidad de oxígeno, se cubre
la superficie del medio de cultivo ya inoculado, con una capa de 1.5 a 2 cm de
espesor, de aceite mineral estéril.
Equipo Bacteria Temperatura Aire

1 E.coli 6°C Si
2 E.coli 25°C Si
3 E.coli 35°C Si
7 E.coli 25°C reducido
8 E.coli 35°C reducido
1. Marque el matraz con el nombre del microorganismo y las condiciones

asignadas.
2. Marque los tubos limpios con los tiempos de crecimiento señalados en la tabla.
3. Con la ayuda del maestro, inocule el matraz con 3 mL del cultivo. Es muy
importante que la cantidad de inóculo sea exactamente la misma en todos los
matraces y que el cultivo esté bien homogenizado, para tener la misma población
inicial y poder comparar resultados.
4. En ese momento, tome la primera muestra, correspondiente al tiempo= 0 y
transfiera a un tubo limpio de 13 x 100.
5. Si le toca incubar con disponibilidad de aire reducida, agregue en zona aséptica,
el aceite mineral estéril contenido en un tubo; el aceite formará una capa en la
superficie, que evita la disolución de oxígeno del aire en el medio.
6. Coloque el matraz en las condiciones de incubación señaladas y active el
cronómetro.
7. Determine la turbidez del tubo t = 0, comparando con la escala turbidimétrica de
Mac Farland, y vea en la tabla a cuántas células / mL corresponde. Anótelo en
la tabla de resultados.
8. Cada 30 minutos, agite suavemente el matraz para homogenizar; tenga cuidado

con los matraces que tienen aceite, para evitar que se mezcle. En zona aséptica,
tome una muestra del matraz y transfiérala a un tubo. Regrese el matraz a
incubación.
9. Haga la lectura de turbidez del tubo, comparando con los tubos de la escala de
Mac Farland, y anote el número de células / mL que corresponden a cada
muestra.
10. Los tubos utilizados para la lectura turbidimétrica deben esterilizarse antes de
descartar el contenido; entréguelos al profesor, bien tapados con torundas de
algodón o con Parafilm.
Resultados
A continuación le presentamos un cuadro para registrar los resultados:

Microorganismo:
Temperatura: Aire:
Tiempo de
Turbidez
Persona Hora crecimiento Células/ mL
igual a tubo
(minutos)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
Trace la gráfica del crecimiento del microorganismo, con el tiempo en las abscisas
(eje de las X’s) y el número de células en las ordenadas (eje de las Y’s). Señale la
fase de adaptación y la fase logarítmica. Diga si llegó a la fase estacionaria y

explique por qué. Explique por qué no se llegó a la fase decreciente o de mortalidad.
Bibliografía
 Adams & Moss. 2000. Food Microbiology. Royal Society of Chemistry. U.K.
 Bourgeois, C.M., J.F. Mescle & J. Zucca (coordinadores). 1994. Microbiología

Alimentaria. Vol. 1. Acribia, España.
Desinfección y Esterilización
Introducción
Los términos “desinfección” y “esterilización” tienden a utilizarse indistintamente

cuando no se conoce su significado en el contexto de la Microbiología. Como
veremos en esta práctica, son muy diferentes.
Esterilización es un proceso que elimina absolutamente toda forma de vida y de

virus, de algún objeto o medio. Requiere de métodos drásticos como:
 Calor seco a 160°C por una hora,
 Calor húmedo a 121°C y 15 lb de presión por 15 min (volumen < 2L)
 Tratamiento con óxido de etileno
Desinfección, en cambio, es un proceso moderado de eliminación de

microorganismos que sólo logra eliminar a las células poco resistentes a
condiciones adversas; como muchos patógenos son relativamente poco resistentes
a factores ambientales adversos, puesto que están acostumbrados al ambiente muy
controlado del cuerpo de organismos superiores, muchos patógenos (pero no todos)
son eliminados en un proceso de desinfección. Sin embargo, sobreviven formas
resistentes como esporas y microorganismos capaces de resistir el tratamiento
moderado que se haya empleado.
Por ejemplo, la pasteurización permite la sobrevivencia de esporas y bacterias

termofílicas; el tratamiento con alcohol y el cloro lo resisten fácilmente las bacterias
Grampositivas, en tanto que el violeta de genciana y otros colorantes pueden
eliminar Grampositivas, pero los resisten bien los Gramnegativos.
Antisépticos son los agentes químicos que pueden matar o inhibir microorganismos
pero que por su baja toxicidad, pueden utilizarse en tejidos vivos, como el etanol, el
yodo, los jabones.
Los alimentos generalmente tienen cargas microbianas importantes por su origen y

porque permiten el desarrollo microbiano a partir de los nutrientes y agua que
contienen, especialmente si no se controlan la temperatura y otros factores (pH por
ejemplo). Además pueden contaminarse durante el manejo y procesamiento, con
otros microorganismos del ambiente y de las personas que los manipulan. Esa flora
microbiana presente en los alimentos tiene consecuencias en dos ámbitos

importantes:
 Durante el almacenamiento y proceso, así como durante el cocinado y hasta
el consumo, pueden causar deterioro en el alimento, generando desde notas
de olor peculiar, hasta descomposición evidente, pasando por olores y
sabores extraños, cambios de color y textura, desarrollo microbiano evidente
y producción de sustancias tóxicas.
 Cuando los ingerimos, los microorganismos presentes llegan al tracto
digestivo y pueden ser neutralizados por la flora habitual y defensas del
consumidor o pueden superarlas, establecerse y causar una enfermedad
transmitida por alimentos (también conocidas por sus siglas, como ETA’s ó
TIA’s: toxiinfecciones alimentarias).
En el procesamiento de alimentos, sea industrial o culinario, se utilizan métodos de

desinfección y también de esterilización; en este caso, el tratamiento debe ser muy
drástico pero puede aprovecharse el efecto sinérgico de algunos factores. Por
ejemplo a menor pH, menor resistencia de los microorganismos al calentamiento; la
concentración elevada de solutos, al aumentar la presión osmótica, favorece la
penetración del calor.
En este ejercicio hay dos variantes:

 Determinar si hay microflora presente en alimentos procesados por diferentes
métodos.
 Someter un utensilio contaminado a tratamientos de desinfección y
esterilización.
Objetivos
Al finalizar esta práctica, los alumnos:

 Explicarán los conceptos de desinfección y esterilización y
 Seleccionarán procedimientos básicos de estos procesos para aplicar en
diversas situaciones relacionadas con el arte culinario.
EJERCICIO 1. Presencia de microflora en alimentos procesados por

diferentes métodos.
Material y equipo
2 cajas Petri con Agar Triptona-Extracto de levadura-glucosa (TGELA)

2 cajas Petri con Agar leche descremada
2 cajas Petri con Agar papa-dextrosa (PDA) acidificado
4 tubos 16 x150 con 9mL de solución salina o agua peptonada estéril
1 juego de cubiertos estériles
Pipetas Pasteur con bulbo, estériles
Incubadora a 35+2°C.
Microscopio
Asa microbiológica
Portaobjetos
Colorantes de Gram
Muestras
Entre las siguientes, utilice las que le asigne el profesor.

Alimentos frescos: zanahorias, uvas, perejil, espinacas, cecina
Alimentos procesados no envasados: pan, tortilla, malteada, chorizo, café, salsas
Alimentos empacados: jamón, queso, Miguelito u otro dulce, leche pasteurizada y
ultrapasteurizada, botanas, yogur
Alimentos envasados y procesados térmicamente: mermelada, cajeta, leche
evaporada y condensada, jugos
Alimentos esterilizados: carnes, mariscos y vegetales enlatados
Metodología
1. Marque la base de las cajas de Petri, para dividirlas en 2 y marque cada zona
con el nombre de uno de los alimentos que le asignaron.
2. Si el alimentos lo requiere, prepare una dilución 1/10 en el tubo con solución
salina, adecuadamente marcado.
3. Enseguida siembre 0.1 mL (o dos gotas con pipeta Pasteur), en la superficie de
la mitad de la caja correspondiente; deje que se absorba antes de invertir las
placas (unos 10 min).
4. Para alimentos líquidos como leche, jugos o el fluido de las latas, puede sembrar
directamente.
5. Incube las cajas a 35+2°C; las de PDA a 25+2°C).
Resultados
Observe las cajas y registre los resultados; ¿qué cantidad y tipo de desarrollo
obtuvo en cada caso?
Haga tinciones de Gram de las bacterias más abundantes (o preparaciones en

fresco de los hongos), describa sus características.
Haga un cuadro donde relacione el tipo de tratamiento que recibió el alimento y el

resultado obtenido en los tres medios de cultivo. Explique por qué se usa ese
proceso y si se logra desinfectar o esterilizar el alimento.
Elabore sus conclusiones.
EJERCICIO 2. Desinfección y esterilización de un utensilio contaminado.
Material y equipo
7 tubos de ensayo de 16 x150 con caldo nutritivo

5 tubos de ensayo de 16 x 150 limpios
1 matraz de 250 mL con 100 mL de agua destilada estéril
1 jeringa desechable estéril
Gradilla
1 Pinzas de laboratorio.
Tela de alambre, 2 mecheros y tripié
Termómetro
Etanol al 65 % y al 95% (comercial)
Reloj o cronómetro.
Muestras
El profesor asignará diferentes cepas a cada equipo; trabajarán sólo con una y al
final se discutirán los resultados de todos los equipos.
 1 tubo de 22x175 con cultivo en caldo de E. coli y 6 espátulas de madera ó 5
agitadores de vidrio ó
 1 tubo de 22x 175 con cultivo en caldo de B. subtilis y 6 espátulas de madera ó
5 agitadores de vidrio.
2 desinfectantes diferentes, aplicables en alimentos.
Metodología
1. Marcar un tubo de caldo como “material estéril”. Abra la jeringa estéril y, en la

zona aséptica, utilizando las pinzas flameadas y sin tocar la aguja, para nada,
retírela de la jeringa, quite el protector e introdúzcala en el caldo nutritivo; tape
el tubo.
2. Marcar los otros 6 tubos de caldo con las iniciales del microorganismo que le
asignaron; luego marcar uno con cada una de las siguientes palabras: testigo,
alcohol 65%, alcohol 95%, hervido y los nombres de 2 sustancias desinfectantes
que van a probar.
3. Con la pinza flameada, retirar una espátula o agitador contaminado del tubo y
colocarlo en el tubo testigo; tapar
4. En cada uno de los tubos limpios colocar uno de los tratamientos desinfectantes
e introducir una espátula o agitador; dejar el tiempo indicado por el fabricante, o
el que se acostumbre. En el alcohol, dejar 10 minutos.
5. Transcurrido el tiempo de tratamiento, transferir las espátulas o agitadores a los
tubos con caldo que les corresponden.
6. En el último tubo con CN, poner la espátula contaminada, aflojar ligeramente el
tapón y llevar a ebullición suave durante 10 minutos; al finalizar, ajustar el tapón.
7. Incubar todos los tubos a 35+2°C durante 24 a 48 horas.
Resultados
Observe si hay crecimiento microbiano y determine la densidad mediante la escala

turbidimétrica; registre las diferencias.
Anote el tratamiento más efectivo contra cada bacteria. Compare con los resultados
del material estéril. Explique las diferencias considerando el Gram y la producción
de esporas. ¿Alguno de los tratamientos logró el mismo resultado que el “material
estéril”? ¿Por qué? Elabore sus conclusiones.
Bibliografía



Manualmicrobiología 15-2

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CENTRO DE ESTUDIOS SUPERIORES

Introducción al laboratorio de microbiología ............................................................ 6

Ubicuidad de microorganismos ............................................................................... 9

Técnica aséptica ................................................................................................... 14

Grupos microbianos .............................................................................................. 20

Aislamiento de microorganismos a partir de pulque .............................................. 28

Recuento de hongos y levaduras en oleaginosas, semillas y frutos secos ........... 32

Fermentación láctica ............................................................................................. 35

Actividad microbiana en leche pasteurizada y UHT .............................................. 41

Lavado y Desinfección .......................................................................................... 46

Elaboración de Amazake partir de Aspergillus oryzae .......................................... 50

Microorganismos Psicrófilos y Psicrótrofos ........................................................... 53

Muerte térmica de bacterias .................................................................................. 58

Curva de crecimiento bacteriano ........................................................................... 63

Desinfección y Esterilización ................................................................................. 68

Reglamento de higiene y seguridad

1. El acceso de alumnos al laboratorio requiere indispensablemente de la presencia

2. La hora de entrada al laboratorio será la indicada en su horario de clases; hay

4. Deben conocer el funcionamiento y manejo adecuado de todos los equipos que

5. Para el uso adecuado de las balanzas de precisión es necesario NO moverlas del

7. Para permanecer en el laboratorio y, desde luego, para trabajar, es indispensable

que NO ES ACEPTABLE QUE UTILICEN FILIPINAS EN EL LABORATORIO, NI

9. En el laboratorio siempre se debe usar calzado cerrado, antiderrapante y cómodo.

11. Se debe trabajar siempre con cuidado; al utilizar mechero o artefactos de

13. Es responsabilidad de cada alumno, tener siempre lo necesario para el trabajo de

15. Dentro de las instalaciones del laboratorio queda ESTRICTAMENTE PROHIBIDO

18. Si llegase a derramarse alguna sustancia o cultivo, se informará de inmediato al

20. Al término de la práctica se deberá de tener limpio y seco el material de laboratorio,

21. LA SEGURIDAD DE LAS PERSONAS Y EL CUIDADO DEL AMBIENTE SON MUY

23. Llevar a cabo estrictamente los procedimientos descritos. No improvisar el uso de

Introducción al Laboratorio de Microbiología

Conviene recordar las reglas generales para el trabajo en el laboratorio y presentar

Para esto deben tener sumo cuidado en:

contaminación accidental, avisen de inmediato al profesor; él sabe cómo manejar la

Mediante esta práctica, el alumno logrará:

1. Revisaremos detenidamente el Reglamento de Higiene y Seguridad del

2. A continuación conoceremos el material y equipo más importante del laboratorio

Microscopio Asa de siembras

Como reporte de esta práctica, repase el Reglamento de Higiene y Seguridad y

Describa brevemente la utilidad de cada pieza de equipo y de material visto en la

Traiga para la próxima clase todo el material de limpieza señalado en el reglamento,

Ubicuidad de los microorganismos

El pequeñísimo tamaño de los microorganismos facilita que se establezcan en

En este ejercicio haremos evidente la ubicuidad de los microorganismos,

Mediante esta práctica, los alumnos lograrán:

Cuando se siembran microorganismos en cajas de Petri, se quieren obtener

Base con medio de cultivo

2. Desde el curso de Higiene en el primer semestre, usted sabe lo importante que

Alimentos sólidos: Tome un pequeño trozo y deslícelo suavemente sobre todo el

Llaves, bolígrafos, peines: Humedezca levemente el hisopo en agua estéril y frote

Mesas de trabajo y utensilios de cocina. Humedezca levemente el hisopo en agua

Agua de condensación de refrigeradores o campanas: sacuda unas gotas

Todas las cajas AN se incubarán a 35+2°C durante 24 a 48 horas.

Observe cuidadosamente las cajas de AN; con la ayuda de su profesor, distinga el

Si es posible, describa las diferencias en cantidad y variedad de colonias.

En la primera parte de esta práctica vimos que los microorganismos están

La forma de manejar adecuadamente a los microorganismos y de mantener a

Como los microorganismos son seres vivos unicelulares (o no-celulares en el caso

Lo importante en esta operación es no contaminar nada del laboratorio ni del

 Se aprovecha la “zona aséptica” que brinda el mechero de Bunsen: al

El conjunto de operaciones que utilizamos para evitar contaminaciones (o presencia

Mediante este ejercicio, el alumno será capaz de:

Los cultivos obtenidos en la práctica anterior.