Capítulo 5

La estabilización de las enzimas por multipunto Inmovilización covalente sobre

soportes activados con grupos glioxilo

Fernando López-Gallego, Gloria Fernández-Lorente,

Javier Rocha- Martin, Juan M. Bolívar, Cesar Mateo y José M. Guisan

Resumen

Estabilización de enzimas a través de técnicas de inmovilización es un enfoque valioso con el fin de convertir un protocolo necesario
(inmovilización) en una herramienta muy interesante para mejorar las propiedades de la enzima clave (estabilización). unión covalente de múltiples
puntos de cada enzima inmovilizada molécula puede promover un efecto estabilizador muy interesante. Las distancias relativas entre todos los
residuos de enzimas implicadas en la inmovilización tiene que permanecer inalterada durante cualquier cambio conformacional inducido por
cualquier agente de distorsión. Grupos amino son nucleófilos muy interesantes colocados en superficies de las proteínas. La inmovilización de la
enzima a través de la región que tiene la mayor cantidad de grupos amino (residuos Lys) es clave para una estabilización satisfactoria. grupos
glioxilo son pequeños aldehídos alifáticos que forman muy inestables bases de Schiff 's con grupos amino y que no parecen ser útiles para la
enzima inmovilización a pH neutro. Sin embargo, bajo condi- ciones alcalinas, soportes glioxilo son capaces de inmovilizar enzimas a través de un
primer multipunto covalente inmovilización a través de la región que tiene la mayor cantidad de grupos de lisina. La activación de los soportes con
una alta densidad superficial de grupos glioxilo y el rendimiento de muy intenso enzima-apoyo multipunto están aquí descritos covalentes attach-
mentos.

palabras clave Enzima de estabilización, el exceso de estabilización de enzimas aminados, las variables que la estabilización de control

1. Introducción

La baja estabilidad de la mayoría de las enzimas limita en gran medida su aplicación como
catalizadores industriales. La posibilidad de mejora ment su estabilidad durante el desarrollo
de las técnicas necesarias immobili- zación es un enfoque muy interesante [ 1 - 3 ]. El
enfoque más popular y más eficaz es la inmovilización de enzimas mediante la unión
covalente de múltiples puntos en los puertos SUP- altamente activados [ 4 , 5 ]. Cuando una
enzima se inmoviliza a través de muchos residuos superficiales sobre un soporte rígido a
través de brazos espaciadores muy cortos pueden conseguirse efectos estabilizadores
importantes. Ahora, las distancias relativas entre todos los residuos que participan en la
inmovilización multipunto

Jose M. Guisan (ed.), La inmovilización de enzimas y células: Tercera Edición, Methods in Molecular Biology, vol. 1051, DOI 10.1007 /
978-1-62703-550-7_5, © Springer Science + Business Media Nueva York 2013

59
60 Fernando López-Gallego et al.

ESTRATEGIA GENERAL para la estabilización de enzimas usando

multipunto Inmovilización covalente

Muchos residuos de enzimas

muy cortos brazos espaciadores

superficie de soporte rígido

posiciones relativas invariable de todos los residuos que participan

durante cualquier cambio conformacional

inducido por cualquier agente de distorsión

Figura 1 Una estrategia general para estabilización de enzimas

que permanecer inalterada durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier
agente de distorsión. Esta idea es relativamente simple, pero el problema principal es el
logro de los accesorios de este tipo de soporte multipunto covalentes por medio de
enzimas muy intensos (fig. 1 ). Los protocolos de inmovilización más populares y
convencionales son capaces de promover inmovilizaciones enzimáticas muy rápido, a
través de sus grupos amino, a pH neutro. Bajo esta condición, el amino terminal de
residuos (pK alrededor de 7,5) es mil veces más reactivo que los residuos de lisina en la
superficie de la enzima (pK alrededor de 10,5. De esta manera la inmovilización
convencional (CNBr-Sepharose activada, soportes de glutaraldehído activado, NORTE- hidroxisuccinimid
etc.) se produce a través del extremo amino terminal en su lugar, aunque la región de la
más alta cantidad de residuos de Lys sería más adecuada para la estabilización de
proteínas. Además de eso, los protocolos de activación convencionales utilizan grupos
reactivos inestables y no pueden ser contenida incu- bajo condiciones alcalinas con el fin
de favorecer una cierta adi- cional multipunto unión entre el soporte y residuos de Lys
colocado en la proximidad de la amino residuo terminal. En con- vencional inmovilización
de enzimas en general no es muy útil para obtener inmovilizaciones covalentes intensa
multipunto (fig. 2 ). La mejor solución para este problema sería hallazgo una noncon-
convencional inmovilización protocolo capaz de inmovilización directa de las enzimas a
través de la región que tiene la mayor cantidad de
 La estabilización de las enzimas por multipunto Inmovilización covalente ... 61

INMOVILIZACIÓN enzimas sobre con grupos muy reactivos

+
NUEVA HAMPSHIRE 3

¨
NUEVA HAMPSHIRE 2 +
NUEVA HAMPSHIRE 3

+
NUEVA HAMPSHIRE 3
-
OH
+
NUEVA HAMPSHIRE 3

el grupo más reactivo amino: amino terminal (pk: 7,5) <<< grupos lisina (pK:
10.5)

Muy inútil para rigidizar la superficie de la proteína a pH alcalino SOPORTES

Figura 2 protocolos de inmovilización convencionales

GRUPOS MUY poco reactiva

HN
C
+ R' RCNR'

Schiff's bases muy inestables

Estos grupos no son adecuados para la producción de enlaces covalentes entre la enzima y el apoyo a pH neutro;
Sin embargo, pueden ser convertidos en los mejores grupos de reactivos para la inmovilización de proteínas /
estabilización.

Fig. 3 grupos reactivos mal pueden ser adecuados para estrategias de estabilización

residuos de Lys. Desde hace varios años nuestro grupo de investigación ha alcanzado
muy buenos protocolos de estabilización de enzimas industriales mediante el uso de
soportes activados con grupos glioxilo, grupos aldehído aisladas de la superficie de apoyo
a través de brazos espaciadores muy cortos (Apoyo-O-CH 2 -CHO) [ 6 - 22 ]. Estos soportes
no son útiles para la inmovilización de enzimas a pH neutro ya que la for- mación de un
glioxilo-amino único archivo adjunto promueve la for- mación de una base Schiff's muy
inestable y por lo tanto enzimas monoméricas con un único extremo amino terminal no
son capaces de convertido inmovilizado incluso en glioxil- soportes muy altamente
activados (Fig. 3 ). La inmovilización también es imposible bajo condiciones alcalinas

1-2 (donde Lys son reactivos) sobre soportes pobremente activados. Una vez más un
2 Notas: accesorio de enzima-soporte único no es capaz de inmovilizar la enzima. Por el contrario
la combinación de condiciones alcalinas
62 Fernando López-Gallego et al.

PRIMERA reacción entre enzimas y glioxilo SOPORTE

NUEVA HAMPSHIRE 2
NUEVA HAMPSHIRE 2

H 2 norte

H 2 norte

H 2 norte

pH 8,0 (NO) H 2 norte

pH 10,0 (NO)
NUEVA HAMPSHIRE 2

H 2 norte
Primero inmovilización
por unión multipunto
H 2 norte

H 2 norte

H 2 norte

pH 10,0 (YES) Las regiones con alta cantidad

de grupos amino

La Fig. 4 Algunas características especiales de glioxil- soportes

(Por ejemplo, pH 10) y soportes muy altamente activados promueve una inmovilización
muy rápida e irreversible. Estos resultados claramente demostrado trado que este último
inmovilización se produce a través de un primer multipunto unión covalente a través de la
región de enzima que tiene la cantidad est alta de residuos de Lys. Lógicamente, esta
región es la más adecuada para una más intensa inmovilización covalente multipunto. Un
número de otros resultados adicionales también afirman para este protocolo la
inmovilización y que han sido ampliamente reportado y comentado en la literatura [ 24 ]. A
pH neutro, el amino terminal residuo es 1.000 veces más reactivos que los grupos Lys
pero utilizando un protocolo no convencional, bajo condiciones alcalinas, el lización
immobi- se ha dirigido a través de la región que tiene la mayor cantidad de residuos de
Lys en la superficie de la enzima (Fig . 4 ). Después de este primer evento inmovilización
multipunto podemos dejar que el conjugado enzima-apoyo para llevar a cabo una
reacción lar intramolecu- adicional en el que nuevos grupos amino de la superficie de la
enzima al lado del soporte se pueden alinear con nuevos grupos glioxilo para reaccionar
con el fin de obtener una más unión multipunto intensa (Fig. 5 ). Esta incubación adicional
tiene que ser largo (varias horas después de la inmovilización) y se produce mejor en
moderadamente altas temperaturas (por ejemplo, temperatura ambiente) como las
vibraciones de la superficie de la enzima es más intenso y favorece una más intensa
lisina glioxilo alineación y además de fijación [ 23 , 24 ].

El final de la enzima de soporte multi-interacción se realiza a través de una

reducción con borohidruro muy suave de los derivados (Fig. 6 ). De esta manera,
bases Schiff's entre grupos amino y los glioxilo se convierten en enlace amino
secundario y el restante
 La estabilización de las enzimas por multipunto Inmovilización covalente ... 63

La Fig. 5 El mecanismo de inmovilización covalente multipunto

La Fig. 6 Punto final de la inmovilización covalente multipunto

grupos glioxilo se convierten en inerte y grupos hidroxilo hidrófilos. De esta manera,

la modificación física fi química y de la superficie de la enzima será mínimo a pesar
de una muy intensa unión covalente multipunto [ 24 ].

grupos glioxilo que no son útiles a la enzima inmovilizar a pH 7,0 tienen un

conjunto de propiedades ideales para la enzima inmovilización por unión multipunto.
Estas propiedades se resumen en la siguiente figura. 7 [ 24 ].

Además de eso, los soportes con grandes áreas altamente activados (por
ejemplo agarosa geles) parecen ser óptimo para la bilization esta- de las enzimas
3-4 por inmovilización covalente multipunto.
2 Notas:
64 Fernando López-Gallego et al.

Glioxilo GRUPOS: SOPORTE -O-CH 2- CHO

Muy condiciones alcalinas eunder stabl

Muy cerca de la superficie de apoyo

En primer lugar la inmovilización a pH 10 es un accesorio de multipunto covalente

para las reacciones intramoleculares

..
NUEVA HAMPSHIRE 2

modificación química mínima de la ausencia de la enzima de impedimentos estéricos

Inerte y la superficie de apoyo final hidrófilo

La Fig. 7 Excelentes propiedades de los grupos glioxilo para la inmovilización covalente multipunto

La Fig. 8 Características especiales del glioxilo-agarosa

El soporte enzima congruencia geométrica es muy alta y la densidad de grupos

activos es muy alta. Este apoyo tiene también una gran densidad de grupos
reactivos. Por ejemplo, podemos preparar agarosa soportes que tienen 40-80
glioxilo residuos por immobi- Lized enzima molécula (Fig. 8 ).

Muchas enzimas industriales han sido altamente estabilizado en nuestro laboratorio mediante
la unión covalente de múltiples puntos sobre soportes glioxilo. En la mayoría de los casos, la
pérdida de actividad catalítica después de la inmovilización fue muy baja (entre 10 y 50%) y los
factores de estabilización eran
La estabilización de las enzimas por multipunto Inmovilización covalente ... sesenta y cinco

tabla 1
Estabilización de enzimas por unión covalente multipunto

actividad factor de
estabilización un
Enzima recuperada (%)

tripsina 75 10000 un

quimotripsina 70 10000 un

La penicilina G acilasa ( E. coli ) 70 8000 un

La penicilina G acilasa ( K. citrophila ) 70 7000 un

La ferredoxina NADP reductasa ( Anabaena 60 1000 un

)

esterasa ( B. stearothermophilus ) 70 1000 un

El glutamato racemasa 70 1000 un

formiato deshidrogenasa ( Pseudomonas 50 > 5000 un

sp. 101)

Alcohol deshidrogenasa (H. hígado) 90 > 3000

un factores de estabilización se definen como la relación entre la vida media de los derivados multipunto frente de

un punto enzimas inmovilizadas

muy alta (superior a 1.000 veces) [ 6 - 22 ] (Mesa 1 ). Por otra parte, estos factores se
calcularon mediante la comparación de un punto con inmovilizaciones de puntos múltiples y
por lo tanto representan la verdadera estabilización 3D de la enzima frente a los agentes de
distorsión.
Como comentario antes, de un punto de inmovilización también podría pro-
interesante mote efectos de estabilización porque la eliminación de causas diferentes de
la enzima de inactivación: agregación, la interacción con interfases hidrófobas. Por lo
tanto la estabilización 3D, debe añadirse a la estabilización mediante inmovilización puro.
Los mejores derivados podrían ser millones de pliegues más estable que las enzimas
solubles corres- pondientes.

Durante el proceso de inmovilización propuesto, algunas enzimas pueden

inactivarse a pH alcalino. En estos casos, algunos inhibidores se pueden añadir al
tampón de inmovilización para proteger a la enzima. Algunas formas de aumentar la
estabilidad de las enzimas solubles a pH 10,0 se resumen en la siguiente figura. 9 .

Por último, algunas enzimas tienen una baja cantidad de residuos de Lys de la
superficie y no pueden ser altamente estabilizados a través de este protocolo. Para
superar este problema, las enzimas pueden ser aminado por modi fi cación de grupos
carboxilo (asp y residuos de Glu) con enediamine etlyl- través de la activación previa
con norte - ( 3-dimetil-aminopropil) - N - etilcarbodiimida . Ejemplos de aminación se dan
en Métodos [ 24 , 25 ].
 66 Fernando López-Gallego et al.

MULTIPOINT INMOVILIZACIÓN requiere el uso de pH 10

Algunas enzimas solubles son muy inestable pH AT 10, 25 ° C

SOLUCIONES:

La inmovilización de la enzima a 4 ° C

Utilice de estabilizar inhibidores

Utilice de estabilizar polioles

Uso de iones de estabilización, ....

5-6 La Fig. 9 Manipulación de las enzimas a pH 10

2 Notas:

2 Materiales

1. reticulado 10BCL y 6BCL agarosa bolas fueron donados por perlas de agarosa
07
Tecnología, ABT (Madrid, España).
28/12/2019
istiano Salinas
2. glicidol (2,3-epoxi propanol) se adquirió de Sigma-Aldrich SA (St. Louise, MO,
EE.UU.) ( ver Nota 2 ).
3. solución de oxidación de apoyo fue de 0,1 M peryodato de sodio en agua ( ver Nota
08 3 ).

4. tampón Protein inmovilización consistía en 0,1 M de bicarbonato de tampón a pH 10

istiano Salinas
( ver Nota 3 ).

3 Métodos

3.1 Preparación de 1. Lavar 105 g (150 ml) de comercial de agarosa 6BCL o 10BCL a fondo con agua
glioxil- Apoyos destilada ( ver nota 5 ).

3.1.1 Activación del gel

2. Suspender la agarosa en agua destilada hasta un volumen total de 180 ml.

de agarosa al

gliceril-agarosa 3. Añadir a esta suspensión 50 ml de solución de NaOH 1,7 N que con- tienen 3,4 g de
borohidruro de sodio.

4. Tome el recipiente a un baño de hielo, mantener la suspensión se agitó suavemente, y

añadir gota a gota 36 ml de glicidol ( ver nota 6 ).

5. Mantener la suspensión bajo agitación suave durante la noche (18 h) a 25 ° C.

6. Filtrar y lavar el apoyo a fondo con agua destilada.


3.1.2 La oxidación de
glicerilo-agarosa para
glioxilo-agarosa
3.2 Enzyme
Inmovilización [ 27 ]
3.3 Estabilización
estructural por la unión
covalente de múltiples
puntos
3.4 Mejora de la estabilización
de la PGA por Multipunto La
unión covalente sobre soportes
glioxilo mediante aminación
parcial de la proteína de
superficie
3.4.1 Enzimas Aminación
La estabilización de las enzimas por multipunto Inmovilización covalente ... 67
1. Resuspender 105 g de glicerilo-agarosa (preparado en el Subtítulo 3.2.1 ) En
1.500 ml de agua destilada.
2. Añadir la cantidad apropiada de solución de oxidación apoyo lentamente a esta suspensión
mientras se agitaba ( ver nota 7 ).
3. Presentar la suspensión por agitación suave durante 2 h.
4. Lavar el soporte con un exceso de agua destilada y se filtro a sequedad.
1. Incube 10 g glioxil- agarosa con 100 ml de químicamente AMI- NATed o fi no
modi enzima solución preparada en immobili- zación buffer.
2. Añadir 1 ml de agua destilada a 9 ml de solución enzimática para ser utilizado como solución
de referencia ( ver nota 8 ).
3. Remover suavemente las mezclas por rotación de extremo a extremo a 25 ° C.
4. alícuotas de sobrenadante y la suspensión se retiran a intervalos de tiempo modo regular ( ver nota 9 )
para someter a ensayo la actividad enzimática.
5. Ensayo de la actividad de la solución de referencia utilizando el mismo intervalos de tiempo y
volúmenes alícuotas como en paso 5 .
6. Los acabados proceso de inmovilización cuando la actividad de la de Natant super- es cero.
7. fi Luego, la preparación inmovilizada se lava cinco veces con tres volúmenes de
tampón de inmovilización.
1. Resuspender el derivado de enzima (preparado en el Subtítulo 3.3 ) En 100 ml de
tampón de inmovilización.
2. Mantener la suspensión durante varias horas ( ver nota 10 ).
Aunque no es agitación necesario porque la enzima ya está inmovilizado sobre
el soporte, la agitación es necesario medir la actividad de la suspensión.
3. Añadir 100 mg de borohidruro de sodio sólido y se agita la sus- pensión durante 30 min
a 25 ° C.
4. Por último, se lava el derivado de enzima con sodio 25 mM fosfatasa phate pH
7,0 mientras que fi vacío ltrado para eliminar el borohidruro.
5. derivados de enzimas se almacenaron a 4 ° C.
1. 5 ml de penicilina G acilasa soluble (PGA) a partir de Escherichia coli se incubó
con 45 ml de solución de aminación proteína que contiene carbodiimida (EDAC)
hasta una concentración final de 10 fi -3 M. Este protocolo de aminación permite el
catión fi modi de 40-50% de los grupos carboxílicos externos. Esto significa que la
enzima fi ed modi ha añadido a las 41 aminas de la Lys, 12-14 de nuevos grupos
amino generan a través de la aminación. El catión fi modi presentó efecto
insignificante en la actividad de la enzima, pero se redujo la estabilidad de la enzima
(por un factor de ocho veces).
68 Fernando López-Gallego et al.

Sin embargo, como la plena fi modificación de grupos carboxílicos PGA causó una
desestabilización mayor, el parcial fi cación modi de los grupos carboxílicos con
etilendiamina (EDA) fue elegido para llevar a cabo estudios adicionales.

3.4.2 La penicilina G acilasa
Inmovilización
1. Se añadió 10 g de glioxilo agarosa 10BCL a 100 ml de AMI- fi nados o no
modificarse solución PGA (0,55 mg de proteína / ml) en tampón de bicarbonato
sódico 100 mM pH 9 o 10, que contiene 100 mM de ácido fenilacético y 20%
glicerol [ 4 ]. A continuación, la sus- pensión se agitó suavemente durante 3 horas a
pH 10 y 25 ° C ( ver
nota 11 ).
2. Cuando la inmovilización se llevó a pH 10, se observó completa inmovilización de
PGA dentro de la primera momentos, utilizando tanto no modi fi y aminación PGA.
La actividad residual era cerca de 100% en ambos casos.

A pH 9, no fue posible inmovilizar la enzima modi- ed no fi. Sólo la enzima

aminado podría ser rápida y completamente inmovilizado sobre el soporte. Este
hecho podría explicarse debido a que el valor de pK ε- NH2 de las lisinas
externos es 10,7, mientras que el valor de pK de la artificialmente introducido
grupos amino primarios es 9,2; por lo tanto, son incluso más reactivo a pH 9 que
las lisinas super fi cial a pH 10.

3. La actividad de ambos inmovilizado y PGA soluble se midió como sigue: las

velocidades de reacción iniciales se midieron usando un titulador automático (DL50
de Mettler Toledo) para determinar la cantidad de ácido fenilacético formado. Los
ensayos se llevaron a cabo mediante la adición de alícuotas de PGA a 10 ml de una
10 mM de penicilina G en fosfato de sodio 0,1 M / NaCl 0,5 M a pH 8 y 25 ° C. La
mezcla de reacción se valoró con NaOH 100 mM, se mantuvo a 25 ° C y se agitó
mecánicamente.

Una Unidad Internacional (UI) de actividad PGA se definió como la

cantidad de enzima que hidroliza 1 μ mol de penicilina G por minuto a pH 8 y 25
° C.

3.4.3 estructural 1. El PGA aminado inmovilizada sobre agarosa glioxilo a pH 10, presenta una vida
Estabilización a través de múltiples media alrededor de dos veces mayor que el i unmod- fi cada inmovilizado PGA
puntos unión covalente (es decir 10.000 veces más estable que el punto inmovilizado PGA) [ 4 ] (Higo. 2 ).

2. La estabilidad de los derivados inmovilizados a pH 9 fue menor que los

inmovilizados a pH 10. Sin embargo, la estabilidad se mejoró en gran medida si
después de la inmovilización a pH 9, el valor de pH se aumentó a pH 10 para
favorecer la reacción de las lisinas de la proteína de superficie con los grupos
aldehído en el soporte. Se encontró que este derivado estar alrededor de un
doble fac- tor más estable que el PGA aminado directamente inmovilizada a pH
10 (Fig. 3 ). A pH 10, la enzima se inmoviliza por
 La estabilización de las enzimas por multipunto Inmovilización covalente ... 69

la región / s con la mayor densidad de lisinas, además de grupos amino

primarios introducidas por el químico fi cación modi, mientras que a un pH de 9,
la inmovilización procede a través de la zona con la mayor densidad de grupos
amino primarios introducidas por química fi cación modi. Esta diferencia permite
un mayor nú- mero de vinculación apoyo enzima y / o a la implicación de una
región en la inmovilización implicado en la inactivación de la enzima.

4 Notas

1. Se ha descrito que el uso de 0,1 M EDA a pH 4,75 y carbodiimida 10 mM

(EDAC) permite la plena fi cación modi de los grupos carboxílicos de la
superficie de la proteína, mientras que usando EDAC 1 mM en 1 M EDTA a pH
4,75 la modi grado fi catión es sólo alrededor del 40-50% [ 26 ].

2. Almacenar entre 0 y 5 ° C (tóxico).

3. La elección de la cantidad de EDAC para ser utilizado se realiza mediante la
evaluación de su impacto en la actividad y la estabilidad de la enzima de la enzima
previamente inmovilizado. Por lo tanto, Modificación condi- ciones que disminuyen la
estabilidad de la fi modi se evitan enzimas [ 24 ].

4. Evitar agitación magnética de agarosa, especialmente durante tiempos largos reac- ción.

5. Además glicidol debe ser muy lentamente para evitar la tem- peratura se levanta sobre
25 ° C.

6. La oxidación de glicoles con peryodato de sodio es una reacción estequiométrica.

Por lo tanto, el grado de activación del soporte se puede controlar fácilmente a
través de la concentración de peryodato utilizado. El protocolo descrito permite la
obtención de un grado de activación de 75 y 200 μ mol / ml, y para ello, 112,5 y 300
ml de solución de oxidación tiene que ser añadido a completamente oxidan
agarosa 6BCL y 10BCL, respectivamente.

7. Si la actividad de la enzima disminuye durante el curso de inmovilización debido

a la inactivación enzimática, este efecto debe distinguirse de la pérdida del
sobrenadante resultante de la inmovilización.

8. El sobrenadante se obtuvo mediante una pipeta de filtro o por gación centrifu- gado de la
suspensión.

9. catión fi Rigidi de la estructura de la proteína a través de la formación de

enlaces covalentes multipunto entre sus grupos amina no iónicos y los grupos
reactivos del soporte se podría obtener manteniendo la suspensión a pH 10
durante un tiempo de interacción bastante largo a 25 ° C. El óptimo
multi-interacción
70 Fernando López-Gallego et al.

el tiempo es la más corta que proporciona la máxima estabilidad del derivado de

enzima.

10. Las enzimas ya inmovilizados se incubaron bajo las condiciones reportadas para
producir la estabilidad máxima de la enzima fi ed no modi [ 4 ].

11. Preparación profesional de GA (adquirido de Roche (Basilea, Suiza) se diluyó fi

vefold (v / v) en 25 mM tampón de fosfato potásico pH 7,0 y después se dializó
tres veces contra 100 volúmenes de 25 mM de fosfato de potasio tampón de pH
7,0. La dializó a continuación, la enzima se centrifugó (6.182 × sol en un rotor
JA-25.5) y el sobrenadante (que contiene 16 IU / ml y 11 mg de proteína / ml) se
utilizó como la preparación enzimática para experimentos adicionales. Más de
90% de la actividad inicial se recuperó después de este proceso.

referencias

1. Haki GD, Rakshit SK (2003) La evolución de enzimas
termoestables industrialmente importantes: una revisión.
Bioresour Technol 89: 17-34
2. Wong SS, Wong LJ (1992) química de reticulación y la
estabilización de proteínas y enzimas.
Enzyme Microb Technol
14: 866-874
3. Klibanov AM (1983) Las enzimas inmovilizadas contra la
inactivación termal. Adv Appl Microbiol 29: 1-28
4. Alvaro G, Fernández-Lafuente R, Blanco RM, Guisán
JM (1990) Immobilization-
estabilización de penicilina acilasa de mi . coli .
Appl Biochem Biotechnol 26: 181-195
5. Guisán JM, Alvaro G, Fernández-Lafuente R, Rosell CM,
Garcia-Lopez JL, Tagliatti A (1993) Estabilización de una
enzima heterodymeric por múltiples puntos covalente
inmovilización ción: penicilina G acilasa de Kluyvera
citrophila . Biotechnol Bioeng 42: 455-464
6. Blanco RM, Guisán JM (1988) efecto de los inhibidores
competitivos Protección durante la muy intensos adjuntos
multipunto puerto SUP- activados por enzimas
insolubilizados: tripsina (amina) - agarosa (aldehído)
sistema. Enzyme Microb Technol 10: 227-232
7. Guisán JM, Bastida A, Cuesta AC, Fernández-Lafuente R,
Rosell CM (1991) estabilización Immobilization- de la
quimotripsina por unión covalente
a aldehído geles de agarosa.
Biotechnol Bioeng 39: 75-84
8. Tardioli PW, Pedroche J, Giordano RL,
Fernández-Lafuente R, Guisán JM (2003) La hidrólisis
de proteínas por immobilized- estabilizado
AlcalaseR-glioxilo agarosa.
Biotechnol Prog 19: 352-360
9. Pedroche J, Yust MM, Girón-Calle J, Vioque
J, Alaiz M, Mateo C, Guisán JM, Millán F (2002)
Estabilización-inmovilización de boxypeptidase car- a
geles de aldehído-agarosa. Un ejemplo práctico en la
hidrólisis de la caseína. Enzyme Microb Technol 31:
711-718
10. Tardioli PW, Fernández-Lafuente R, Guisán JM, Giordano
RLC (2003) Diseño de nuevos estabilizado inmovilizado
carboxipeptidasa un derivado para la producción de
hidrolizados gratuitas aromáticos de las proteínas.
Biotechnol Prog 19: 565-574
11. Bes T, Gómez-Moreno C, Guisán JM, Fernández-Lafuente
R (1995) Selective enzy- metic oxidaciones: estabilización
mediante la unión covalente de múltiples puntos de
ferredoxina reductasa NAD: una enzima reciclaje cofactor
interesante. J Mol Catal 98: 161-169
12. Guisán JM, Polo E, Agudo J, Romero MD, Alvaro G, Guerra
MJ (1997) estabilización Immobilization- de termolisina en
geles de rosa AGA- activados. Biocatal Biotrans 15:
159-173
13. Betancor L, Hidalgo A, Fernández-Lorente G, Mateo C,
Rodríguez V, Fuentes M, Fernández-Lafuente R, Guisán JM
(2003) El uso de herramientas fisicoquímicas para resolver
los problemas de estabilidad de la enzima altera la elección
de la enzima óptima: estabilización de d oxidasa -aminoacid.
Biotechnol Prog 19: 784-788
14. Betancor L, Hidalgo A, Fernández-Lorente G, Mateo C,
Rodríguez V, Fuentes M, Fernández-Lafuente R, Guisán
JM (2003) Preparación de un biocatalizador estable de
hígado bovino catalasa. Biotechnol Prog 19: 763-767
15. Hidalgo A, Betancor L, López-Gallego F, Moreno R,
Berenguer J, Fernández-Lafuente
 La estabilización de las enzimas por multipunto Inmovilización covalente ...
R, Guisán JM (2003) Preparación de un biocatalizador
versátil de inmovilizado y estabilizado lase cata- desde Thermus
thermophilus . Enzyme Microb Technol 33: 278-285
16. Otero C, Ballesteros A, Guisán JM (1991) Inmovilización /
estabilización de lipasa de
Candida rugosa . Appl Biochem Biotechnol 19: 163-175
17. Palomo JM, Muñoz G, Fernández-Lorente G, Mateo C,
Fernández-Lafuente R, Guisán JM (2002) de adsorción
interfacial de lipasas en el apoyo muy hidrófobo
(octadecil-Sepabeads): Inmovilización, hiperactivación y la
estabilización de la abierto formar de lipasas. J Mol Catal
B enzimática 19-20: 279-286
18. Suh CW, Choi GS, Lee EK (2003) escisión enzimática de la
proteína de fusión usando inmovilizada uroquinasa
covalentemente conjugado con glioxilo-agarosa.
Biotecnol Appl Biochem 37: 149-155
19. Toogood SA, EN Taylor, Brown RC, Taylor SJC, McCague
R, Littlechild JA (2002) La inmovilización de
el termoestable l-
aminoacilasa de Thermus litotalis a gene- comió un
biocatalizador industrial reutilizable. Biocatal Biotrans 20:
241-249
20. Ichikawa S, Takano K, Kuroiwa T, Hiruta O, Sato S,
Mukataka S (2002) Inmovilización y estabilización de
quitosanasa mediante la unión multipunto a agar soporte
de gel. J Biosci Bioeng 93: 201-206
21. Kuroiwa T, Ichikawa S, Sato S, Mukataka S (2003) Mejora
del rendimiento de fisio oligosacáridos lógicamente
activos en la hidrólisis continua de quitosano utilizando
tosanases chi- inmovilizados. Biotechnol Bioeng 84:
121-127
71
22. Kuroiwa T, Ichikawa S, Sosaku H, Sato S, Mukataka S (2002)
Factores que afectan la com- posición de oligosacáridos
producidos en chito- hidrólisis san usando quitosanasas
inmovilizados. Biotechnol Prog 18: 969-974
23. Mateo C, Abian O, Fernández-Lafuente R, Guisan JM
(2000) aumento en la estabilidad conformacional de
enzimas inmovilizadas sobre soportes de epoxi activados
favoreciendo accesorio adicional multipunto covalente.
Enzyme Microb Technol 26: 509-515
24. Mateo C, Abian O, Bernedo M, Cuenca E, Fuentes M,
Fernández-Lorente G, Palomo JM, gražu V, Pessela BCC,
Giacomini C, Irazoqui G, Villarino A, Ovsejevi K, Batista-
Viera F, Fernandez- Lafuente R, Guisán JM (2005)
Algunas de las características especiales de glioxilo SUP-
puertos a inmovilizar proteínas. Enzyme Microb Technol
34 (7): 456-462
25. Abian O, gražu V, Hermoso J, González R, García JL,
Fernández-Lafuente R, Guisán JM (2004) Estabilización de
la penicilina G acilasa de Escherichia coli: sis mutagene-
dirigida al sitio de la superficie de la proteína para aumentar
covalente multipunto adjunto archivo. Appl Environ Microbiol
70: 1249-1251
26. López-Gallego F, Montes T, Fuentes M, Alonso N, gražu V,
Betancor L, Guisan JM (2005) aumento química de la
cantidad de grupos reactivos en enzima de la superficie
para mejorar su estabilización a través de multipunto
covalente attach- ment. J Biotechnol 116 (1): 1-10
27. Guisan JM (1988) geles de agarosa-aldehído como soportes
para la inmovilización-estabilización de enzimas. Enzyme
Microb Technol 10 (6): 375-382
anotaciones

La inmovilización de enzimas y células en serie

Editor
Guisan, Jose M.

01 cristiano Salinas Página 3

28/12/2019 03:43

02 cristiano Salinas Página 3

28/12/2019 03:43
Hasta aquí una persona

03 cristiano Salinas página 5

28/12/2019 03:44
otra gente

04 cristiano Salinas página 5

28/12/2019 03:44

05 cristiano Salinas página 8

28/12/2019 03:45

06 cristiano Salinas página 8

28/12/2019 03:45
Tercera persona

07 cristiano Salinas página 8

28/12/2019 03:47
4 persona MATERIALES Y METODOS
08 cristiano Salinas página 8

28/12/2019 03:46