UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
BIOLOGÍA MOLECULAR

ESTUDIANTES: Grace Pila, Danny Segarra, Martín Rojas.

NIVEL: 6to nivel, grupo 2.

PRACTICA N° 6

TEMA: EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Y VISUALIZACIÓN EN GEL DE

POLIACRILAMIDA-SDS PAGE.

OBJETIVO GENERAL:

- Visualizar proteínas extraídas en gel de poliacrilamida-SDS PAGE.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

- Conocer la metodología y la función de los diferentes reactivos utilizados en la

extracción de proteínas.
- Detectar la presencia de proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
SDS PAGE.

MARCO TEÓRICO

- Extracción de proteínas

La extracción de las proteínas representa un paso crucial para los análisis posteriores que se
realicen, siendo de vital importancia la elección del método de extracción con base al tipo
de muestra de partida. Lo primero a realizar es la ruptura celular o lisis, donde los métodos
más empleados se basan en la homogenización del tejido y la destrucción de membranas
por medio de procesos físicos y/o químicos, esto con el fin de maximizar la liberación de
las proteínas y al mismo tiempo evitando la degradación por factores como la temperatura,
o modificaciones por proteólisis, oxidación, entre otros. Las técnicas de ruptura celular se
pueden clasificar en métodos físicos mecánicos, métodos físicos no mecánicos y por
métodos químicos, entre los que se presenta el tratamiento con álcalis, detergentes,
solventes, ácidos o sustancias caotrópicas (González-Fernández, Valero-Galván, & Jorrín-
Novo, 2005).

Después de la lisis celular se produce la liberación de proteasas que pueden degradar las
proteínas de interés, por lo tanto, es importante que durante la preparación de la muestra se
evite la actividad proteolítica. Para esto se debe: evitar un exceso de ciclos de congelación/
descongelación, agregar soluciones inhibidoras de proteasa y trabajar rápido, a
temperaturas frías durante el proceso (González-Fernández et al., 2005) Existen varios
métodos que permiten purificar una o más proteínas. Para ello, se somete al extracto a
tratamientos que las separan en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales
como tamaño o carga, proceso denominado fraccionamiento. Las primeras fases en este
proceso utilizan diferencias en la solubilidad que depende del pH, la temperatura, la fuerza
iónica entre otros factores (Maldonado, Martell, Alvarado, Valero, & Martínez, 2018). Para
la obtención del extracto crudo, al momento de elegir el protocolo a seguir es importante
tener en cuenta: Material biológico de partida-tipo de organismo: En el caso de órganos u
otros tejidos animales, es necesario disgregarlos antes de proceder a la lisis celular, ya que
las células se encuentran rodeadas de tejido conectivo. En general estas técnicas involucran
una ruptura mecánica grosera. Para esto pueden utilizarse morteros, homogeneizadores
eléctricos, tijeras o tamices metálicos. Introducción a la Biología Celular y Molecular
IBCM 2 Cuando el material es un cultivo celular, la extracción puede realizarse
adicionando un detergente, realizando un shock osmótico, o por sonicación (Maldonado et
al., 2018). Finalidad del extracto proteico: esto determinará el buffer de extracción que se
utilizará dependiendo si se desea o no que las proteínas conserven su actividad biológica, su
conformación nativa, su interacción con otras proteínas u otras moléculas. Algunos
protocolos son tan violentos que involucran la ruptura de todas las membranas; otros en
cambio permiten fraccionar y obtener, distintos componentes subcelulares (núcleos,
mitocondrias, etc) (Maldonado et al., 2018).

- Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS PAGE

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas por migración en un

campo eléctrico. Las moléculas se separan en función de su carga eléctrica, desplazándose
al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la carga de la
molécula. La técnica de la electroforesis en gel de acrilamida es una de las técnicas básicas
más importantes en el laboratorio de Biología Molecular. Esta técnica permite la separación
de una mezcla de proteínas según su peso molecular y es la técnica de entrada para la
realización del Western-Blot, purificación de proteínas para su análisis por espectrometría
de masas, estimación de peso molecular o identificación de variaciones en la expresión o
estructura de proteínas (Pérez, Soriano, Ponce, & Díaz, 2015). Los geles de poliacrilamida
constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, por sus
propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con
una gran variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por
copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bisacrilamida (N,N'-metilén-bis-
acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el
persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al
monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son
entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante
uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las
concentraciones de los monómeros. Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"),
probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del
detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de proteínas,
como para ser combinada con técnicas de inmunoelectrotransferencia (Capítulo 14). En la
ténica de SDS-PAGE, se mezclan las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar
complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las
proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de
1,4g SDS/g proteína. Dado que la relación final carga/masa queda constante para las
distintas proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el gel poroso
fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño,
mayor movilidad de la proteína, y viceversa (Alberts & Cwi, 2005).

RECURSOS UTILIZADOS

- MATERIALES (todo el material para el laboratorio de biología molecular debe ser

autoclavado).

DESCRIPCION CANTIDAD
POR CURSO POR GRUPO
Vaso de precipitación 2
Caja de puntas para micropipetas pequeñas y medianas 1 c/una
(blancas y amarillas)
Micropipetas de 10, 100, 1000uL 1
Marcador para vidrio 1
Carrusel para micropipetas 1
Papel Aluminio 1
Papel Toalla 1

- REACTIVOS

DESCRIPCION CANTIDAD
POR CURSO POR GRUPO
Aspersor con etanol 70% 1
Buffer de extracción de proteínas 1
Solución tampón tris HCl 1,5 M pH 8,8 1
Solución tampón tris HCl 0,5 M pH 6,8 1
Solución SDS 10% 1
Persulfato de amonio (APS) 10% 1
Poliacrilamida 30% 1
Tampón de muestra 1
Tampón de electroforesis 10 X Tris Glicina pH 8,3 1
Tampón de electroforesis 1 X Tris Glicina pH 8,3 1
Tampón de tinción azul de Coomasie 1
Solución de colorante de geles 1

EQUIPOS

DESCRIPCION CANTIDAD
POR CURSO POR GRUPO
Cámara de electroforesis vertical 1

PROCEDIMIENTO

Extracción de proteínas

1. Macerar la muestra de la cual se van a extraer las proteínas.

2. Adicionar el Buffer de extracción de proteínas.
3. La muestra está lista para ser cargada en el gel.

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS PAGE

1. Colocar los vidrios limpios en el sistema de electroforesis lo más ajustado que se

pueda (tornillos blancos), para evitar fugas se coloca cinta adhesiva en la base de los
vidrios y colocarlo en la base goma que le da estabilidad al sistema hasta cargar el
gel.
2. Preparar de forma simultánea el gel de resolución y apilamiento, sin colocar el
TEMED ya que este es el responsable del proceso de polimerización.
3. Colocar los peines en el sistema y medir 1 cm bajo el peine hasta el cual se llena el
gel de resolución 12%.
4. Añadir el TEMED en el gel de resolución y mezclar con cuidado de no formar
burbujas, cargar el gel en el sistema hasta la marca trazada, posteriormente añadir
1mL de etanol al 70% sobre el gel cargando anteriormente, esperar que el gel
polimerice (aproximadamente 15 min).
5. Desechar el alcohol colocado invirtiendo el sistema y con la ayuda de un pedazo de
papel filtro retirar el exceso de alcohol presente en la superficie del gel de
resolución, con cuidado de no dañar el mismo.
6. Colocar el TEMED en el gel de apilamiento y mezclar con cuidado, cargar el gel
hasta el borde superior del vidrio, colocar el peine con cuidado de no formar
burbujas y dejar polimerizar el gel aproximadamente 15 min.
7. Retirar el sistema del soporte de goma, retirar las cintas adhesivas de los vidrios y
colocarlo dentro del contenedor de la cámara de electroforesis (tanque).
8. Colocar 700 mL aprox. Tris Glicina 1x dentro de la cámara de electroforesis, y
cuidadosamente retirar los peines del sistema.
 9. Cargar las muestras previamente realizadas, en un volumen de 15- 20 uL por
pocillo, en el primer pocillo se coloca el estándar de proteína (5 uL del estándar con
15 uL del tampón de la muestra) y seguida de las demás muestras.
10. Colocar la tapa en el sistema de electroforesis y ajustar los cables en sus respectivos
polos.
11. Encender la fuente de poder y de igual forma colocar los cables en los respectivos
polos de la fuente de poder, correr las muestras a 140 volt. constantes y 26 mA por
el lapso de una hora.
12. Abrir el sistema de electroforesis, aflojar los tornillos blancos, retirar los vidrios y
con la ayuda de una tarjeta separarlos con cuidado, desechar el gel de apilamiento y
enjuagar 3 veces con agua destilada el gel de resolución.
13. Colocar el gel en 60 mL de azul de coomassie, tapar el recipiente y colocarlo en
agitación por una hora.
14. Enjuagar el gel con agua destilada por 3 min y colocarlo en 60 mL de solución
decolorante, tapar el recipiente y mantener en agitación por una hora.
15. Observar las bandas obtenidas y anotar los resultados.
16. Limpiar todos los implementos utilizados ya sea con alcohol o agua destilada hasta
su próximo uso.

RESULTADOS ESPERADOS

Del extracto de proteínas a partir de una muestra macerada de Drosophila melanogaster

mediante el empleo de la técnica de precipitación salina donde el sulfato de amonio actúo
como agente principal. Se logró visualizar la corrida de proteínas totales de la muestra.

En la Figura 1 se muestra las proteínas obtenidas a partir de la extracción, las cuales fueron
posible visualizar mediante el empleo de electroforesis SDS-PAGE.
Como se observa en la figura 1, las proteínas
migraron en el gel de montaje y se
compactaron al llegar al borde es este, lo
que se visualiza como una línea azul sólida,
dando un mayor ordenamiento de las
proteínas. Posteriormente las proteínas entran
en el gel separador, donde migran de acuerdo
con su peso molecular. Se observa como las
proteínas de menor tamaño se resuelvan en la
parte inferior del gel y las de mayor tamaño
se van quedando retrasadas al atravesarla
malla del gel, por lo que se visualiza en la
parte superior del mismo.
Figura 1. Electroforesis de SDS-PAGE de la extracción
de proteínas obtenidos a partir de una muestra de
Drosophila melanogaster
CUESTIONARIO

1. ¿Qué otras técnicas de tinción se emplean en una electroforesis en gel de

poliacrilamida?

Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o tinción de
plata, azul de coomassie o tinción fluorescente, para las proteínas. Asimismo se emplean
otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es
fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo
dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una
autorradiografía (Ruiz, 2012).

2. ¿En la electroforesis SDS PAGE cuál es la función del gel separador?

El gel separador o resolving gel es en el que tiene lugar la separación de los componentes
(Maldonado 2014).

4. ¿De qué depende la velocidad de migración de una proteína en un SDS-PAGE y por

qué?

En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de

migración es inversamente proporcional a su tamaño. La desnaturalización hace que
pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es
proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria ni a su interacción con otras
macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más lentamente (Solís V, 2010).

5. De qué manera se puede estimar el peso molecular (unidades) de una proteína

mediante la técnica de SDS-PAGE?

El tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en

aminoácidos y su carga queda enmascarado por la mayor carga del SDS que la recubre, que
es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electroforética de la
proteína depende exclusivamente de su masa molecular (Ruiz 2012).

BIBLIOGRAFÍA

- Alberts, B., & Cwi, S. (2005). Introducción a la biología celular (2da ed.). Buenos
Aires: Médica Panamericana.
- González-Fernández, R., Valero-Galván, J., & Jorrín-Novo, J. (2005). Proteómica
en hongos fitopatógenos. Manual de Proteómica, 10(2), 25–30. Retrieved from
https://www.researchgate.net/profile/Jose_Galvan5/publication/266475301_Proteo
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- Maldonado, K., Martell, R., Alvarado, B., Valero, J., & Martínez, J. (2018).
Comparación de métodos de extracción de proteínas de cerebro y linfocitos de rata.
Ingeniería y Tecnología, 11(3), 127–140. Retrieved from
http://tecnociencia.uach.mx/numeros/v11n3/data/Comparacion_de_metodos_de_ext
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- Maldonado Carlos, 2010. electroforesis SDS PAGE
- Pérez, L., Soriano, J., Ponce, E., & Díaz, L. (2015). Electroforesis en gel de
poliacrilamida‐ SDS como herramienta en el estudio de las proteínas miofibrilares.
Una revisión. Nacameh, 9(2), 77–96. Retrieved from
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- Ruiz Melida, 2012. Metodo de visualización en geles de poliacrilamida-SDS.
- Solís Valeria, 2010. SDS-poliacridamida.