"Año de la lucha contra la corrupción e impunidad"

UNIVERSIDAD NACIONAL
DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
E. A. P.AGROINDUSTRIAL

TEMA:

PRÁCTICA Nº10: “RECONOCIMIENTO DEL EQUIPO

CROMATÓGRAFO LIQUIDO DE ULTRA PERFORMANCE CON DETECTOR
ESPECTROMETRO DE MASAS”

ASIGNATURA:

Análisis Instrumental de Productos Agroindustriales

DOCENTE:

Ing. Rogger Armando Romero Usquiano

INTEGRANTES:

 Custodio Cornejo Jackeline Del Milagro

 Fabián Zavaleta José

CICLO:
VI

NUEVO CHIMBOTE

2019
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I. INTRODUCCIÓN

la cromatografía de líquidos es la técnica de separación más comúnmente utilizada para llevar

a cabo la separación de las HAs y su determinación en matrices alimentarias, ya que a diferencia
de la cromatografía de gases no se requiere una etapa de derivatización previa a su inyección
en el sistema cromatográfico. Si se combina la cromatografía de líquidos con la espectrometría
de masas el resultado es una metodología analítica de elevada selectividad y sensibilidad. Por
este motivo, cada vez son más numerosas las publicaciones relacionadas con las aminas
heterocíclicas que aplican técnicas basadas en el acoplamiento LC-MS.

La cromatografía líquida de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) es

una poderosa técnica analítica que combina el poder de separación del HPLC con la gran
selectividad, sensibilidad y precisión en la determinación de la masa molecular de la
espectrometría de masas, proporcionando información cualitativa y cuantitativa.

Los componentes de la muestra separados en el HPLC pasan al espectrómetro de masas a través

de una interfaz donde son ionizados. Los equipos de LC-MS pueden tener dos tipos distintos
de interfaces que se incluyen dentro de la denominada ionización a presión atmosférica (API),
denominadas electrospray (ESI) e ionización química a presión atmosférica (APCI), ambas son
compatibles con la mayoría de los solventes volátiles utilizados como fase móvil en HPLC.

Los iones generados en la interface son acelerados hacia un analizador y separados en función
de su relación masa/carga (m/z) mediante la aplicación de campos eléctricos, magnéticos o
simplemente determinando el tiempo de llegada a un detector. Los iones que llegan al detector
producen una señal eléctrica que es procesada, ampliada y enviada a un ordenador. El registro
obtenido se denomina espectro de masas y representa las abundancias iónicas obtenidas en
función de la relación masa/carga de los iones detectados.

se resumen las principales características de las fuentes API. La principal diferencia entre las
dos fuentes de ionización radica en el mecanismo de ionización. En ESI, los iones preformados
en fase líquida son a continuación desolvatados y evaporados. En cambio, en APCI la
ionización se produce en fase gas debido a reacciones ion-molécula entre el plasma generado a
partir de la fase móvil y los analitos. Otra diferencia importante está relacionada con el caudal
de fase móvil óptimo.

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II. OBJETIVOS

 Identificar las partes de un equipo cromatógrafo liquido de ultra performance con

detector espectrómetro de masas.

 Observar y comparar las bondades que nos presenta este equipo comparado con los
equipos anteriormente estudiados

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

La cromatografía es un método físico de separación, basado en la distribución de los

componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra móvil. En
cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que
contiene a la fase estacionaria. La cromatografía líquida se lleva a cabo en una columna de
vidrio.

Después se coloca la muestra por la parte superior y se hace fluir la fase móvil a través de la
columna por efecto de la gravedad. Para aumentar la eficiencia en las separaciones, en la
cromatografía de alta resolución; el tamaño de las partículas de fase fija se disminuye hasta los
micrones, usando altas presiones para lograr que la fase móvil pueda fluir.

Tipos De Cromatografía En HPLC Y Aplicaciones

La Cromatografía de líquidos, es una técnica de análisis químico ampliamente utilizada, la cual

permite separar físicamente y cuantitativamente los distintos componentes de una solución por
la absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla, consta de dos fases, una fija que
suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el
análisis, y que en este caso es un líquido. La tabla 1 nos muestra los tipos de cromatografía
líquida que existen, así como su separación cromatográfica.

Cromatografía de adsorción

Es la técnica más usada para la separación de compuestos orgánicos neutros, es adecuada para
compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Se basa en la
afinidad de adsorción, su fase estacionaria es la superficie de un sólido finamente dividido. El
soluto compite por los sitios sobre la superficie del sólido con el disolvente utilizado como

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eluyente; la retención es el resultado de la adsorción. Las únicas fases que se utilizan en este
tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida.

La elección de la fase móvil es fundamental para el éxito de una cromatografía líquido-sólido;

variando el disolvente, si este presenta una alta fuerza de elución eludirá las especies absorbidas
más rápidamente que uno que tenga un valor más bajo. La cromatografía de capa fina (TLC) es
un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un plano,
en la forma de un soporte sólido en un plato inerte.

CROMATOGRAFÍA Y TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS ACOPLADAS

Los métodos de acoplamiento combinan las capacidades de separación de la cromatografía con

las de detección cuantitativa y cualitativa de los métodos espectrales tales como infrarrojo,
resonancia magnética nuclear y masas, entre otros. A estas técnicas se les denomina en
ocasiones técnicas hifenadas.

En los primeros métodos de esta categoría los eluyente de la columna cromatográfica se

recogían como fracciones separadas en una trampa fría, después de lo cual se usaba un detector
no selectivo ni destructivo para la identificación de su presencia.

Posteriormente, se investigaba la composición de cada fracción por espectroscopia de

resonancia magnética nuclear, infrarroja, masas o con medidas electro analíticas. Una
importante limitación de esta aproximación era la pequeña cantidad (usualmente de micro
moles) de soluto contenida en las fracciones.

Sin embargo, hoy día muchos métodos hifenados monitorizan el efluente de la columna
cromatografía de manera continua, con métodos espectroscópicos dando como resultado una
combinación de dos técnicas, que basadas en principios distintos, permiten lograr una enorme
selectividad.

Cromatografía HPLC Acoplada A Espectroscopia De Masas (MS)

Aunque la espectroscopia de masas es una poderosa herramienta para la identificación de

compuestos puros, la complejidad de los espectros de masas dificulta enormemente el análisis
de mezclas, incluso simples. Por ello para el análisis de muestras complejas se emplean
acoplamientos de esta técnica con técnicas potentes de separación, como es la cromatografía
líquida.

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Así el acoplamiento Cromatografía Líquida-Espectroscopia de Masas (GL-MS), es una

herramienta más poderosa al alcance de los químicos para el análisis de muestras complejas.
En este caso se efectúan los espectros de masas de los compuestos que salen de la columna de
cromatográfica.

Es necesaria una interface entre ambos instrumentos que tiene como misión fundamental
eliminar el eluyente (fase móvil) antes de la introducción de los analitos en el espectrómetro.

Estos acoplamientos permiten reunir las ventajas de una técnica poderosa de separación con
una herramienta poderosa de identificación. Pueden registrarse espectros de masas a lo largo de
toda la separación cromatográfica.

Así pueden registrarse inequívocamente los picos y comprobar incluso su pureza, es decir si la
separación ha sido completa o se ha producido en algún momento la co-elución de dos
compuestos.

Tal vez una de las desventajas de esta técnica es que los espectros de masas de los compuestos
orgánicos analizados por esta técnica, dependen de las condiciones de análisis, principalmente
del tipo de fase móvil y del potencial de ionización aplicado; ya que comúnmente a partir del
espectro de masas se obtiene normalmente el ion molecular y fragmentos que proporcionan a
su vez el peso molecular del compuesto.

En tanto que en la técnica del HPLC-MS, el ion molecular forma fragmentos con el disolvente
empleado en la fase móvil y por tanto, no corresponden directamente con el peso molecular del
compuesto analizado.

Razón por la cual, se hace necesario inyectar disoluciones patrón que contengan los compuestos
objetos del análisis, en las mismas condiciones experimentales (eluyente potencial y
ionización), para conocer el espectro de masas característico del compuesto en cada caso.

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Sin embargo, pese a ello esta técnica resulta extremadamente útil en el análisis de ultra trazas
(ng/kg) de compuestos orgánicos. Donde un análisis de tan bajos niveles de concentración (ultra
trazas) puede resultar necesario cuando se trata de compuestos de muy altos niveles de toxicidad
y que se cumula en los organismos vivos.

Es el caso de las dibenzoparadioxinas policloradas (PCDDs), los dibenzofuranos policlorados

(PCDFs), o los bifenilos policlorados. Se analizan en los suelos y organismos vivos
principalmente ya que se acumulan en la materia orgánica del suelo.

Otra de las aplicaciones de esta técnica, es la identificación de analitos desconocidos, ya sea

como productos secundarios de síntesis, análisis de herbicidas y pesticidas, impurezas de drogas
comerciales, o la identificación inequívoca de sustancias de estructura similar, para las que un
simple espectro masas es insuficiente; cabe mencionar que el acoplamiento HPLC-MS es una
herramienta muy selectiva que se emplea hoy día permite la identificación de algunos péptidos
y proteínas.

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IV. MATERIALES

Equipo Cromatógrafo Liquido De Ultra Performance Con Detector Espectrómetro De Masas

Lapicero Cuaderno Cámara de Celular

V. PROCEDIMIENTO

Lo primero que se hizo en esta practica es reconocer al equipo, teniendo en cuenta que dicha
muestra se trabaja con liquidos pero que este equipo como que es mucho mas completo.

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Despues el ingeniero encargado de la practica nos explico las partes del cromatografo
liquidos de ultra perfomance con detector espectrometro de masas.

Luego se observo las partes internas de dicho equipo y asi poder estudiarlas.

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VI. RESULTADOS

 ¿Cuál es la diferencia entre en un cromatógrafo de gases y un cromatógrafo

líquidos de ultra performance?

El LC es una de las técnicas de separación más populares usadas en los laboratorios para la
separación de una mezcla de la muestra en base de las acciones recíprocas entre las moléculas
individuales en la muestra con las fases estacionarias y movibles ya mencionadas. Puede ser
realizado en una columna o en una hoja con una fase movible líquida y apoyo sólido como la
fase estacionaria. La cromatografía gaseosa se utiliza generalmente para separar composiciones
vaporizables o del volátil y para probar su pureza. también se utiliza para cuantificar los
diversos componentes en una mezcla. aunque la volatilidad de una muestra sea un requisito
previo para el análisis de la cromatografía gaseosa, la modificación del grupo funcional de cierta
molécula por un proceso conocido como derivatización habilita el análisis de las composiciones
que no se podrían vigilar de otra manera fácilmente por la cromatografía gaseosa.

Tabla Nª01: Diferencias entre cromatógrafo de gases y cromatógrafo liquido

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA CROMATOGRAFÍA DE GAS

La fase movible es un líquido La fase movible es un gas

La separación se basa en la acción recíproca del La separación se basa sobre todo en los puntos
soluto con el ambiente de la cromatografía de ebullición de las moléculas del soluto

Puede ser realizado en una hoja o una columna Puede ser realizado solamente en una columna

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Puede ser utilizado para separar cualquier Puede ser aplicado en la separación de
composición soluble, e.g aminoácidos, proteínas, composiciones volátiles y de mezclas gaseosas
drogas, ácidos nucléicos, lípidos, antioxidantes,
hidratos de carbono, y polímeros naturales y
artificiales

Realizado generalmente en las composiciones tan Realizado en substancias inestables más altas de
sensibles al calor de la temperatura ambiente puede las temperaturas pudo conseguir tan
ser analizado con seguridad usando la técnica térmicamente desnaturalizado

Esto es una técnica relativamente más lenta La separación se basa en los puntos de ebullición
de las moléculas del soluto así que no es muy
flexible en términos de separación óptima

Grafico N°01. Partes importantes de un cromatógrafo de gases

El primer paso del proceso de cromatografía de gases es suministrar uno o varios gases de
alta pureza en el cromatógrafo de gases. Uno de los gases (llamado gas portador) fluye
hacia el interior del inyector, pasa por la columna y se introduce en el detector

Se introduce una muestra en el inyector, la cual se calienta normalmente hasta 150 -

250 °C, lo que tiene como resultado la vaporización de los solutos volátiles de la
muestra. Estos solutos vaporizados se introducen posteriormente en la columna
mediante el gas portador y la columna se mantiene en un horno con control de
temperatura.

Los solutos pasan por la columna a velocidades variables, lo cual está determinado
principalmente por sus propiedades físicas y por la temperatura y composición de la
columna. El soluto más rápido sale (se eluye) de la columna en primer lugar, seguido
de los solutos restantes en el orden correspondiente.

A medida que se eluye cada soluto, se introduce en el detector calentado, donde se genera
una señal electrónica basada en la interacción del soluto con el detector. El tamaño de la
señal se registra en un sistema de datos y se representa gráficamente según el tiempo
transcurrido para generar un cromatograma.

La cromatografía líquida de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) es

una poderosa técnica analítica que combina el poder de separación del HPLC con la gran
selectividad, sensibilidad y precisión en la determinación de la masa molecular de la
espectrometría de masas, proporcionando información cualitativa y cuantitativa. Los
componentes de la muestra separados en el HPLC pasan al espectrómetro de masas a través
de una interfaz donde son ionizados.

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Los equipos de LC-MS pueden tener dos tipos distintos de interfaces que se incluyen dentro
de la denominada ionización a presión atmosférica (API), denominadas electrospray (ESI) e
ionización química a presión atmosférica (APCI), ambas son compatibles con la mayoría de los
solventes volátiles utilizados como fase móvil en HPLC. Los iones generados en la interface
son acelerados hacia un analizador y separados en función de su relación masa/carga (m/z)
mediante la aplicación de campos eléctricos, magnéticos o simplemente determinando el
tiempo de llegada a un detector.

Los iones que llegan al detector producen una señal eléctrica que es procesada, ampliada y
enviada a un ordenador. El registro obtenido se denomina espectro de masas y representa las
abundancias iónicas obtenidas en función de la relación masa/carga de los iones detectados.

Figura Nª01: Esquema del funcionamiento interno de un espectrómetro de masas

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Figura Nª02: Esquema del funcionamiento de un cromatógrafo de gases acoplado a un

espectrómetro de masas

Figura Nª03: Esquema del funcionamiento de un HPLC acoplado a un espectrómetro de

masas

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VII. CONCLUSIÓN

 Concluimos que el equipo cromatógrafo liquido de ultra performance con detector

espectrómetro de masas es un equipo de vital importancia ya que permite realizar
análisis con una gran precisión y sensibilidad.

 Así mismo concluimos que conocer las partes, usos y aplicaciones del equipo es de vital
importancia ya que es un equipo el cual es utilizado mucho en el campo agroindustrial,
por lo tanto, es necesario tener en claro las partes y el uso correcto de este equipo.

VIII. DISCUSIÓN

ROBERT H. (1992) menciona que Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia

de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del
sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la
separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende
de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución).

En el experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que

cada uno de ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más
afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a
la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio
cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada
sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un detector,
su caracterización química.

Así mismo; SKOOG A. (2001) afirma que, la cromatografía líquida en la fase móvil es un
disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las
sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible con
la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido). Esta
forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna,
en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un
tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de
espesor uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa
contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una
forma de cromatografía líquido-líquido.

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Sin embargo; ESTEBAN L. (2008) recalca que, en la cromatografía de gases, la fase móvil es
un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido)
o un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido). Este tipo de
cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase móvil gaseosa
se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase
estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede
depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta
100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor
capacidad de separación.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Casas J. (1994) Análisis instrumental 2: Cromatografía y electroforesis. Ediciones UPC,

Barcelona.

Esteban L. (2008) La Espectrometría de masas en imágenes. ACK editores, Madrid.

López M. (2002) Tesis doctoral. Universidad Politécnica de Catalunya (UPC), Terrassa.

ROBERT H. (1992) “Manual del Ingeniero Químico”. Sexta Edición. Tercera Edición en
español. Editorial McGraw Hill. México.

Skoog A. (2001) Principios de análisis instrumental, 5ª ed., Saunders Collage Publishing,

España.

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