PROTOCOLO PARA OPERAÇÃO DO

MICROSCÓPIO CONFOCAL DE VARREDURA A LASER

ZEISS LSM 510 META

COMO LIGAR O MICROSCÓPIO

Ligar o microscópio (botão verde à direita).

Ligar os monitores do computador.

Para trabalhar com fluorescência (filtros azul, verde e vermelho), ligar a lâmpada HBO de
mercúrio no botão POWER SUPPLY (luz verde acende).

Caso o sistema esteja totalmente desligado, favor chamar o técnico.

COMO MANUSEAR O SOFTWARE DO LSM 510 META

INICIAR O SOFTWARE E CRIAR BANCO DE DADOS

1. Clicar 2 vezes no ícone LSM 510 META na área de trabalho do computador.

2. Clicar em Scan New Images (normalmente já está habilitado) e em Start Expert Mode.

3. Criar banco de dados:

1
3.1. Clicar em File.
3.2. Clicar no botão New
3.3. Selecionar o diretório D.
3.4. Nomear o banco de dados.
3.5. Clicar em Create.

SELECIONAR OS LASERS
1. Clicar no botão Acquire.
2. Clicar no botão Laser.

3. Definir o laser que será utilizado:

Recomenda-se usar laser com λ igual ao λ do pico de excitação do fluorocromo. Por
exemplo, para Alexa 488 usar o laser 488nm.

Na ausência de laser com λ igual ao do fluorocromo, a escolha dependerá do fluorocromo.
Os técnicos recomendam que, se a curva de excitação (absorção) do fluorocromo estiver
ligeiramente desviada ou maior para a esquerda, deve-se usar laser com λ menor, por outro
lado, se a curva de excitação (absorção) do fluorocromo estiver ligeiramente desviada ou
maior para a direita, deve-se usar laser com λ maior.
4. Selecionar o laser clicando sobre o nome do mesmo.

2
5. Clicar em Standby para os lasers que requerem tempo para aquecimento (Argon/2) e clicar
em On para os demais (HeNe). Para obter imagens de maior resolução, esperar o
aquecimento dos lasers por 30 minutos para adquirirem estabilidade.
6. Estabelecer a força de saída do laser Argon/2 (Output [%]) em 25%.

FOCALIZAR A AMOSTRA
1. Clicar no botão VIS.
2. Clicar no botão Micro.

3. Selecionar a objetiva:
3.1. Clicar no botão Objective para visualizar as opções disponíveis.
3.2. Clicar na objetiva que se deseja usar. A objetiva selecionada move-se automaticamente
para o caminho do feixe.

As objetivas de 40x, 63x e 100x são de imersão em óleo.

Após usá-las, remover o óleo com lenço de papel e solvente apropriado.

Com luz transmitida (campo claro):

3. Colocar a amostra na mesa do microscópio com a lamínula voltada para baixo.
1. Clicar no botão Reflector e selecionar opção None.
3
2. Configurar o microscópio para luz transmitida:
2.1. Clicar no botão Trasmitted Light.
2.2. Clicar no botão On.
2.3. Ajustar a intensidade usando a barra deslizante (1 é suficiente).
2.4. Clicar em Close para fechar a janela.
4. Usar o cursor do foco (macrométrico e micrométrico) para focalizar a amostra.
5. Buscar região desejada da amostra movendo a mesa em x e y usando o charriot.

Com fluorescência:
1. Verificar se a lâmpada HBO está ligada (botão POWER SUPPLY com luz verde acesa).
3. Colocar a amostra na mesa do microscópio com a lamínula voltada para baixo.
2. Clicar no botão Reflector e selecionar o filtro desejado clicando sobre ele (azul, verde ou
vermelho).
3. Clicar no botão Reflected Light.
4. Usar o cursor do foco (macrométrico e micrométrico) para focalizar a amostra.
5. Buscar região desejada da amostra movendo a mesa em x e y usando o charriot.

Os botões VIS, TV e LSM determinam o caminho do feixe.

LSM: permite escaneamento com o laser e a observação através do monitor do computador.
Neste caso, dispositivos de segurança bloqueiam os lasers para que não atinjam os olhos
através da ocular (não é possível visualizar o espécime na ocular).
VIS: acionando-o, o sistema desliga automaticamente os lasers e permite a visualização da
amostra através da ocular, desde que o sistema esteja configurado para luz transmitida.
TV: permite observação através da câmera digital, se esta estiver conectada. Indisponível no
Microscópio Confocal do NMM.

CONFIGURAR A VIA DO FEIXE LUMINOSO

1. Clicar no botão Config.

4
2. Selecionar Channel Mode.
3. Escolher a configuração Single Track ou Multi Track.

SINGLE TRACK MULTI TRACK

Marcação única, dupla ou tripla, em Mais de duas marcações, com
Diferenças
varredura simultânea. varredura sequencial.
Vantagens Aquisição mais rápida da imagem. Menor sobreposição de canais.
Aquisição mais lenta da imagem,
Desvantagens Sobreposição de canais.
photobleaching.
Marcações fracas, fluoróforos com
Fluoróforos com emissões
Aplicações emissões bem distantes, materiais
próximas e marcações fortes.
vivos e análises por tempo.

Cada track é uma unidade separada que pode ser configurada independente dos outros
tracks em relação a espelhos dicróicos, filtros de emissão, canais e detectores. Quando um
track está escaneando, o outro está desligado, reduzindo a sobreposição.

Cada track permite selecionar até 2 canais e podem ser definidos, simultaneamente, no
máximo, 4 tracks, ou seja, no máximo 8 canais podem ser ativados e varridos um após o outro
(4 varreduras sequenciais com 2 varreduras simultâneas cada).

Configuração Single Track

5
Configurar um novo single track:
1. Selecionar o botão Single Track.

2. Selecionar a linha de laser:

2.1. Clicar em Excitation.
2.2. Marcar a linha de laser desejada.
2.3. Definir a força do laser (Laser Power) entre 10-15%.
2.4. Clicar em Close para fechar a janela.

3. Selecionar os espelhos dicróicos apropriados.

Os espelhos dicróicos ou dicromáticos são dispositivos (espelhos ou filtros) capazes de
separar a luz de acordo com suas cores (λ). Refletem λ ou faixas de λ específicos e
transmitem os demais, separando a luz do laser da luz fluorescente emitida pela amostra e
separando esta última em diferentes regiões do espectro de luz.
Três espelhos dicróicos determinam o caminho do laser e da fluorescência emitida
pela amostra no Microscópio Confocal Zeiss LSM 510 META.

6
 O 1º dicróico (HFT, dicróico do feixe principal) recebe a luz proveniente do laser,
direcionando (refletindo) apenas os λ indicados para a amostra e permitindo a passagem de
todos os outros λ.
Na tabela abaixo estão relacionados os espelhos dicróicos encontrados no Microscópio
Confocal do NMM com a função de 1º dicróico:

1º DICRÓICO REFLETE OS λ TRANSMITE (DEIXA PASSAR) OS λ

NT80/20 20% do laser 80% da luz refletida pela amostra
HFTUV/488/543/633 UV, 488, 543 e 633nm Os demais
HFT458/514 458 e 514nm Os demais
HFT477/543 477 e 543nm Os demais
HFT488/543 488 e 543nm Os demais
HFT514/633 514 e 633nm Os demais
HFT458 458nm apenas Os demais
HFT488 488nm apenas Os demais

O 2º dicróico determina o caminho da fluorescência emitida pela amostra,

direcionando-a para o canal META (luz transmitida) ou para os canais normais Ch2 ou Ch3 (luz
refletida). Nesta posição podem ser encontrados 2 tipos de espelhos dicróicos, o espelho NFT
(dicróico do feixe secundário) e o filtro KP (short pass filter).
O NFT reflete λ menores que o indicado em direção aos canais normais e transmite
(deixa passar) λ maiores em direção ao detector META enquanto o filtro KP absorve λ
maiores que o indicado e transmite λ menores em direção ao detector META.
2º DICRÓICO
ESPELHO REFLETE OS λ TRANSMITE OS λ
None Nenhum Todos
Plate Nenhum Todos
Mirror Todos Nenhum
NFT515 < 515nm > 515nm
NFT545 < 545nm > 545nm
NFT635Vis < 635nm > 635nm
FILTRO ABSORVE OS λ TRANSMITE OS λ

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 KP545 > 545 < 545nm
NFT635Vis é usado para excitação de fluoróforos em 635 (far red) e
observação no espectro visível (verde e vermelho).

O 3º dicróico tem a função de direcionar a luz refletida pelo 2º dicróico para o canal
Ch2 ou Ch3 e a luz transmitida para o canal ChS ou para Fiber Out. O NFT (dicróico do feixe
secundário) reflete λ menores que o indicado para o canal 2 (Ch2) e transmite (deixa passar)
λ maiores para o canal 3 (Ch3) ou reflete λ menores que o indicado para Fiber out (Ch2) e
transmite (deixa passar) λ maiores para o canal ChS. O filtro KP (short pass filter) absorve λ
maiores que o indicado e transmite λ menores em direção ao canal 3 (Ch3). No Microscópio
Confocal de Varredura a Laser do NMM os espelhos dicróicos das posições 2 e 3 são iguais
conforme visualizado na tabela abaixo.
3º DICRÓICO
ESPELHO REFLETE OS λ TRANSMITE OS λ
None Nenhum Todos
Plate Nenhum Todos
Mirror Todos Nenhum
NFT515 < 515nm > 515nm
NFT545 < 545nm > 545nm
NFT635Vis < 635nm > 635nm
FILTRO ABSORVE OS λ TRANSMITE OS λ
KP545 > 545 < 545nm

4. Selecionar os filtros apropriados.

Os filtros são encontrados antes dos canais normais e tem a função de bloquear os λ
indesejáveis selecionando aqueles que devem atingir os canais Ch2 e Ch3. Podem ser de 2
tipos:
Filtros de um único λ
Short Pass Filter ou KP: absorve (bloqueia) λ > que o indicado e transmite (deixa passar) λ <
em direção ao canal.
Long Pass Filter ou LP: absorve (bloqueia) λ < que o indicado e transmite (deixa passar) λ >
em direção ao canal.

8
Filtros de faixa de λ (Band Pass ou BP)
São mais seletivos, pois absorvem λ > e < que os valores indicados, e permitem a
passagem de λ situados no intervalo.

FILTROS PARA CH2 ABSORVE λ TRANSMITE λ

LP475 < 475 > 475

LP505 < 505 > 505
BP475-525 < 475 e > 525 475-525
BP500/20IR < 490 e > 510 490-510
BP505-530 < 505 e > 530 505-530
BP530-600 < 530 e > 600 530-600
BP505-550 < 505 e > 550 505-550
ChangePos Posição livre Posição livre

FILTROS PARA CH3 ABSORVE λ TRANSMITE λ

LP505 < 505 > 505

LP530 < 530 > 530
LP560 < 560 > 560
LP585 < 585 > 585
LP650 < 650 > 650
BP560-617 < 560 e > 617 560-617
BP585-615 < 585 e > 615 585-615
None Nenhum Todos

5. Ativar o canal desejado (Ch2 e/ou Ch3) clicando na caixa. Se desejar, é possível alterar a cor
do canal clicando no canal e habilitando a cor desejada.
6. Salvar a configuração (apenas configurações não existentes e com autorização dos técnicos
responsáveis).
6.1. Clicar no comando Config.
6.2. Nomear e clicar em Store.
6.3. Fechar em Close.

9
Usar configuração existente:
1. Clicar no comando Config.
2. Selecionar a configuração desejada na caixa de lista.
3. Clicar em Apply.

Excluir uma configuração existente:

Apenas os técnicos responsáveis.
1. Clicar no comando Config.
2. Selecionar a configuração desejada na caixa de lista.
3. Clicar em Delete.

Configuração Multi Track

Configurar um novo Multi Track:
1. Selecionar o botão Multi Track.

10
2. Clicar em Add Track para inserir o número de tracks desejado. Se desejar remover o track,
clicar sobre ele e, em seguida, clicar em Remove.
3. Clicar 2 vezes no ícone Track para nomear adequadamente cada track.
4. Para mudar a posição dos tracks, selecionar o track e clicar nos botões seta para cima ou
para baixo, para deslocar o track para uma posição acima ou abaixo na caixa de lista,
respectivamente.
5. Configurar cada track:
5.1. Selecionar um track (clicar na caixa e sobre o track de modo que fique em azul).
5.2. Selecionar a linha de laser:

Clicar em Excitation.

Marcar a linha de laser desejada.

Definir a força do laser (Laser Power) entre 10-15%.

Clicar em Close para fechar a janela.

11

Selecionar os espelhos dicróicos apropriados como descrito para single track.

Selecionar os filtros apropriados como descrito para single track.

Ativar o canal desejado (Ch2 e/ou Ch3) clicando na caixa. Se desejar, alterar a cor do canal
da mesma forma como descrito para single track.
6. Repetir o descrito no tópico 5 para os demais tracks.
7. Salvar a configuração (apenas configurações não existentes e com autorização dos técnicos
responsáveis).
7.1. Clicar no comando Config.
7.2. Nomear e clicar em Store.
7.3. Fechar em Close.

Usar configuração existente:

1. Clicar no comando Config.
2. Selecionar a configuração desejada na caixa de lista.
3. Clicar em Apply.

Excluir uma configuração existente:

Apenas os técnicos responsáveis.
1. Clicar no comando Config.
2. Selecionar a configuração desejada na caixa de lista.
3. Clicar em Delete.

DEFINIR OS PARÂMETROS PARA VARREDURA DA IMAGEM

12
1. Clicar em Scan.

2. Clicar em Mode.
3. Selecionar o modo de varredura como Frame.
4. Definir o tamanho do frame igual a 512 em Frame Size.
O tamanho do frame define o número de pixels da imagem. Por exemplo, uma imagem com
512x512 tem 262.144 pixels, isto é, 262.144 pontos formam a imagem. Imagens com nº de
pixels = 512x512 têm boa resolução para publicação, enquanto imagens com < 512x512 não.
tem boa resolução e aquelas com > 512x512 tem resolução excelente, mas são muito pesadas
e difíceis de serem trabalhadas no photoshop.
5. Caso deseja, clicar no botão Optimal (abaixo de Frame Size) para o software calcular o nº
ideal de pixels, de acordo com a objetiva e com o λ.
6. Ajustar a velocidade de varredura para 6 a 8 µseg/pixel em Scan Speed usando a barra
deslizante. O valor definido será a velocidade utilizada na varredura única (Single).

A velocidade de varredura é inversamente proporcional à resolução, isto é, quanto MENOR a

velocidade, maior é o nº de pixels varridos e, portanto, MAIOR é a resolução da imagem.

13
7. Definir o número de Bits por pixel em Data Depth:
Bit (Binary digit) é o número de tons de cinza de cada pixel de uma imagem. Uma imagem
com 8 bits tem 28 = 256 tons de cinza, enquanto uma com 12 bits tem 212 = 4096 tons.

8 para a maioria das imagens, pode ser convertida numa imagem de 12 bits.

12 para medidas de intensidade de fluorescência, para imagens de colocalização e imagens

com baixa intensidade de fluorescência. Não pode ser convertida numa imagem de 8 bits.

8. Determinar parâmetros para Mode, Method e Number:

8.1. No campo Mode, definir o modo de varredura como Line.

LINE: a imagem é formada varrendo-se a cada linha o número de vezes definido em Number.
Resulta num melhor resultado e é o mais usado.
FRAME: a imagem é formada varrendo-se a imagem toda, linha por linha, o número de vezes
definido em Number.

8.2. Selecionar o método de obtenção da imagem (Method) como Mean.

MEAN (média): A imagem é formada pela soma dos pixels de cada varredura dividida pelo nº
de varreduras e apresenta melhor resolução (maior taxa sinal/ruído). É o mais usado.
8.3. Definir o nº de varreduras em Number para o cálculo da média ou da soma. Para
varredura rápida usar 2, para varrer a imagem a ser capturada usar 4 ou 8.

AJUSTAR O PINHOLE

14
1. Selecionar Channels.
2. Selecionar cada canal e definir o tamanho do pinhole em 1 Airy Unit.

Nos estudos de colocalização, ajustar o tamanho do pinhole de modo que os canais

apresentem fatias ópticas (Optical Slice) idênticas.

OTIMIZAR A IMAGEM

1. Clicar no botão Config.

2. Selecionar apenas um track.
3. Clicar em Fast XY.
4. Ajustar o tamanho da janela de visualização da varredura:
4.1. Para aumentar, clicar em Zoom e, em seguida, In.
4.2. Para diminuir, clicar em Zoom e, em seguida, out.
5. Mexer no micrométrico para ajustar o foco, se necessário.
6. Clicar em Palette.
7. Clicar em Range Indicator. A imagem aparecerá com uma escala de cores diferente: pontos
com maior a intensidade de fluorescência (saturação) aparecem em vermelho, enquanto
pontos com menor intensidade aparecem em azul.

15
8. Ajustar a intensidade de fluorescência:
8.1. Ajustar o ganho do detector (Detector Gain) até que apenas poucos pontos vermelhos
estejam presentes na imagem.
8.2. Aumentar o Amplifier Offset até que todos os pixels azuis desapareçam (imagem cinza
escuro) e, então, torne-o ligeiramente positivo (com poucos pontos azuis).
9. Clicar em Palette.
10. Selecionar No Palette.

ADQUIRIR E SALVAR A IMAGEM

1. Habilitar todos os canais desejados.
2. Clicar em Single (a imagem será varrida com velocidade, resolução e nº de bits definidos
anteriormente).
3. Clicar em Split xy para visualizar todos os canais. Para visualizar apenas a imagem com a
sobreposição de canais, selecionar o botão xy.
4. Clicar em overlay para inserir uma barra de aumento.
5. Clicar em Contr para ajustar brilho e contraste (esta ferramenta auxilia na remoção de
background).

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6. Clicar em Save As.
7. Nomear a imagem em Name.
8. Preencher descrição em Description, se desejar.
9. Clicar em Ok.

FUNÇÃO ZOOM (CROP)

1. Varrer a imagem com os canais desejados (Fast XY).

2. Clicar em Crop.
3. Definir a área a ser ampliada arrastando a figura.
4. Definir o tamanho do zoom alterando o tamanho da figura.
5. Clicar em Fast XY.
6. Ajustar o foco, se necessário.
7. Clicar em Single.
8. Salvar a imagem como descrito anteriormente.

17
 FUNÇÃO HISTOGRAMA (HISTO)

Pode ser feita através do software LSM Image Examiner.

Permite exibir distribuição de intensidades de pixel de uma imagem na forma de gráfico e
tabela.

1. Abrir a imagem.
2. Clicar em Histo.
3. Clicar em Area, Skip Black, Skip White ou Colocalisation de acordo com a forma de
apresentação desejada.
4. Para visualizar os dados na forma de tabela, clicar em Show Table.

Exemplo:

18
 1: Pixels do canal 2 (Ch2)
2. Pixels do canal 3 (Ch3)
3. Pixels colocalizados
4. Background
O gráfico de frequência absoluta mostra em cores a freqüência dos pixels.

FUNÇÃO PROFILE

Permite exibir distribuição de intensidades de pixel de uma imagem ao longo de uma linha
reta ou curva.

1. Abrir a imagem.
2. Clicar em Profile.
19
3. Desenhar a linha ou curva na região que se deseja analisar a intensidade de fluorescência.
4. Para visualizar os dados na forma de tabela, clicar em Show Table

VARRER UM Z-STACK

1. Clicar em Z Settings.
2. Clicar em Z Stack.
3. Clicar em Frame.

4. Varrer a imagem (Fast xy).

5. Mexer no foco se necessário.
6. Otimizar a imagem (Palette).
7. Clicar em Mark First/Last.
8. Com o micrométrico, definir o ponto onde se deseja iniciar o stack.
9. Clicar em Mark First.
10. Com o micrométrico, definir o ponto onde se deseja terminar o stack.
11. Clicar em Mark Last.
12. Definir se deseja manter o nº de fatias (Keep Slice) ou o tamanho das fatias (Keep
Interval). No 1º caso, o software calcula automaticamente o tamanho das fatias e no 2º ele
calcula o nº de fatias para o intervalo definido.

20
13. Se desejar, clicar em Optimal Interval para que o software calcule automaticamente o nº
e o tamanho das fatias de acordo com a objetiva e tamanho do pinhole.
14. Se desejar, clicar no botão X:Y:Z = 1:1:1 para estabelecer o intervalo Z de forma que o
voxel tenha dimensões idênticas nas direções x, y e z (permite sobreposição exata dos stacks
para se obter uma imagem em forma de cubo).
15 . Clicar no botão Start para registrar o stack.
16. Clicar em Gallery para visualizar todas as fatias.
17. Clicar em Data para inserir a distância em Z (µm) de cada fatia.
16. Salvar o Stack.

IMAGEM 3D E VIDEO

1. Fazer o Z-stack.
2. Clicar em 3D View.
3. Clicar em Projection.

4. Definir o eixo que se deseja fazer imagem (X, Y ou Z) em Turning Axis.

5. Definir o ângulo inicial em First Angle.
6. Definir o número de projeções (fatias) em Number Projection.
7. Definir o ângulo entre as projeções em Difference Angle.
8. Clicar em Aplly.

21
COMO FAZER IMAGEM DE DAPI NO CONFOCAL
1. Desligar os lasers.
2. Verificar se a HBO está ligada.
3. Clicar em Micro.
4. Selecionar o filtro para DAPI (azul) em Reflector.
5. Clicar em Reflected Light.
6. Clicar em Config.
7. Clicar em Channel Mode.
8. Selecionar Single Track.
9. Definir NT80/20 como o 1º dicróico.
10. Direcionar toda luz refletida para a amostra para o META, selecionando None como 2º e
3º dicróicos.
11. Clicar em ChS para definir a região do espectro a ser detectada pelo META (azul).
12. Clicar em Scan.
13. Clicar em Channel.
14. Abrir completamente o pinhole.
15. Clicar em Fast XY.
16. Mexer no micrométrico se necessário.
17. Aumentar o ganho até obter imagem.
18. Definir parâmetros de varredura como já descritos anteriormente.
19. Clicar em Single.
20. Salvar imagem.
21. Fazer imagem da mesma região, com os mesmos parâmetros, para os demais
fluorocromos.
22. Salvar imagem.
23. Sobrepor as imagens:
23.1. Na janela LSM 510 - Expert Mode, clicar em Process.
23.2. Clicar em Copy.
23.3. Selecionar a imagem de origem na janela superior e a imagem de destino na janela
inferior.
23.4. Na janela inferior, no campo Channel, selecionar New.
23.5. Clicar em Apply.
22
23.6. Salvar a imagem formada pela sobreposição das 2 imagens.

COMO DESLIGAR O MICROSCÓPIO

1. Desligar os lasers.
2. Desligar a HBO.
3. Aguardar, no mínimo, 5 minutos para o resfriamento do laser Argônio.
4. Limpar, cuidadosamente, as objetivas de imersão a óleo com lenço de papel umedecido em
solução de éter 90% e etanol absoluto 10% ou em hexano.
5. Colocar na objetiva de 10x.
6. Fechar todas as janelas e sair do sistema.
7. Desligar o microscópio (botão verde à direita) e os monitores.
8. Colocar a capa protetora do microscópio.

23