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BIOLOGIA

Proprietà delle cellule


La vita è la proprietà fondamentale delle cellule, che sono le più piccole unità a mostrare questa
caratteristica.
Le cellule possono essere rimosse da una pianta o da un animale e poste in coltura, dove
cresceranno e si riprodurranno per lunghi periodi di tempo. Se maltrattate possono morire. La
morte pu essere anche considerata una delle maggiori proprietà di base della vita. Le cellule
nell’organismo di solito muoiono per propria volontà (apoptosi), un sistema capace di portare le
cellule che non sono più necessarie o che rischiano di diventare tumorali ad autoeliminarsi. Le
cellule possiedono un programma genetico e i mezzi per utilizzarlo: gli organismi sono costruiti
seguendo l’informazione depositata in un insieme di geni. Questa vasta informazione è
condensata in un insieme di cromosomi che occupano il volume del nucleo cellulare.
I geni sono progetti di costruzione di strutture cellulari, direttive per lo svolgimento di attività
cellulari e un programma per replicarsi.
Le cellule sono capaci di riprodursi: la riproduzione cellulare avviene per divisione, un processo
con ci il contenuto di una cellula madre si distribuisce in due cellule figlie. Prima della divisione,
il materiale genetico viene fedelmente duplicato e ogni cellula figlia riceve una quota uguale e
completa di informazione genetica.
Le cellule acquisiscono energia e la utilizzano: ogni processo biologico necessita di un contributo
di energia. Per la gran parte delle cellule animali, l’energia arriva preconfezionata, di solito in
forma di glucosio.
Nell’uomo il glucosio è riversato dal fegato nel sangue che, circolando attraverso il corpo, porta
energia chimica a tutte le cellule. Una volta nella cellula, il glucosio viene demolito in modo che
il suo contenuto energetico sia immagazzinato in forma facilmente utilizzabile (di solito ATP) e
in seguito reso disponibile per la miriade di attività cellulari che richiedono energia. Le cellule
spendono un’enorme quantità di energia per demolire e ricostruire le molecole e gli organelli di
cui sono costituite. Questo continuo turnover preserva l’integrità delle componenti cellulari. Le
cellule svolgono una varietà di reazioni chimiche: le cellule funzionano come un impianto
chimico in miniatura. Tutte le trasformazioni chimiche che avvengono nella cellula richiedono
enzimi.
L’insieme delle reazioni chimiche che hanno luogo in una cellula costituisce il metabolismo
cellulare.
Le cellule sono impegnate in numerose attività meccaniche: nelle cellule ha sede un’intensa
attività. Materiali sono trasportati da un punto ad un altro, strutture sono rapidamente costruite
e altrettanto velocemente smantellate e, in molti casi, l’intera cellula si muove. Tali attività
dipendono da modificazioni dinamiche e meccaniche all’interno della cellula, molte delle quali
iniziano con modificazioni della forma di alcune proteine motore.
Le cellule sono capaci di rispondere agli stimoli: La maggioranza delle cellule è rivestita di
recettori che si legano a sostanze presenti nell’ambiente con elevata specificità. Le cellule
possiedono recettori per gli ormoni, per i fattori di crescita, per i materiali extracellulari ecc. Le
cellule possono rispondere a stimoli specifici modificando le loro attività metaboliche. Le
cellule sono capaci di auto-regolazione: oltre a richiedere energia, il mantenimento di uno
stato complesso e ordinato richiede una costante regolazione. Nella cellula, il progetto per la
costruzione dei prodotti è contenuto negli acidi nucleici, e le proteine sono gli addetti alla sua
realizzazione. Ogni tappa di un processo deve svolgersi in maniera spontanea e in modo tale che
ogni tappa successiva si inneschi in maniera automatica.
Le cellule evolvono: l’evoluzione è un processo continuo capace di modificare le proprietà delle
cellule che saranno presenti negli organismi futuri.

Esistono 2 classi fondamentali di cellule: procariotiche ed eucariotiche, che si distinguono per le


loro dimensioni e per il tipo di strutture interne contenute. 

Le Cellule Procariotiche sono strutturalmente più semplici, sono rappresentate dai batteri. Le
Cellule Eucariotiche sono strutturalmente più complesse, e sono rappresentate dagli altri tipi di
organismi: protisti, funghi, piante ed animali.
Caratteristiche comuni
- Membrana plasmatica di struttura simile
- Informazione genetica codificata dal DNA che usa lo stesso codice genetico: i numerosi
cromosomi delle cellule eucariotiche contengono una molecola lineare di DNA strettamente
associato a proteine a formare la cromatina; nelle cellule procariotiche invece il singolo
cromosoma circolare è composto da DNA essenzialmente “nudo”.
- Meccanismi simili per la trascrizione e la traduzione dell’informazione genetica, compresi
ribosomi simili, che funzionano da banchi di lavoro per la costruzione delle proteine.
- Parete cellulare rigida con funzioni simili ma diversa composizione chimica tra i 2 tipi di
cellule
- Vie metaboliche comuni (glicolisi e ciclo di ATC)
- Apparato simile per la conservazione dell’energia chimica sotto forma di ATP (localizzato
nella membrana plasmatica dei procarioti e nella membrana mitocondriale degli eucarioti)
- Meccanismi simili di fotosintesi
- Meccanismo simile per sintesi e l’inserzione delle proteine di membrana
- Proteasomi (strutture che digeriscono le proteine) di struttura simile tra archeobatteri ed
eucarioti.
- Entrambi possiedono una regione nucleare, in cui risiede il materiale genetico, circondata
dal citoplasma: nei procarioti questa regione si identifica nel nucleoide, che manca di
membrana che lo separi dal citoplasma circostante; le cellule eucariotiche invece,
posseggono un nucleo delimitato da una complessa struttura membranosa, l’involucro
nucleare.

Differenze
Il citoplasma di una cellula eucariotica è pieno di strutture molto diverse; anche i lieviti, gli
eucarioti più semplici, sono strutturalmente molto più complessi di un tipico batterio. Le
cellule eucariotiche contengono una serie di strutture membranose e organuli delimitati da
membrane. Le cellule animali e vegetali contengono ad esempio mitocondri, che producono
energia chimica per l’espletamento delle attività cellulari, un reticolo endoplasmatico, dove
vengono sintetizzati molti dei lipidi e delle proteine della cellula, i complessi del Golgi, dove le
sostanze vengono selezionate, modificate e smistate verso specifici distretti cellulari, e una
varietà di vescicole semplici, di varie dimensioni e delimitate da membrane. Le cellule vegetali,
inoltre, contengono organuli membranosi come i cloroplasti e spesso un unico vacuolo. Le
membrane delle cellule eucariotiche hanno la funzione di dividere il citoplasma in
compartimenti in cui hanno luogo attività specializzate. Il citoplasma delle cellule procariotiche
invece è fondamentalmente privo di strutture membranose. Il citoplasma di una cellula
eucariotica è estremamente affollato, e rimangono spazi molto piccoli per la fase solubile del
citoplasma, chiamata citosol.
Le membrane citoplasmatiche delle cellule eucariotiche formano un sistema di canali e vescicole
comunicanti , con la funzione di trasportare sostanze da una parte all’altra della cellula o
dall’interno all’esterno.
Le cellule eucariotiche contengono numerose strutture non delimitate da membrane, tra cui i
tubuli e i filamenti del citoscheletro, impegnati nella contrattilità, nel movimento e nel
supporto meccanico della cellula. Il citoscheletro dei procarioti è molto più semplice sia
strutturalmente che funzionalmente.
Altra differenza consiste nella riproduzione. Le cellule eucariotiche si dividono per mitosi
mentre nei procarioti il DNA si duplica e le due coppie ottenute vengono separate dalla
membrana cellulare che cresce e si interpone fra di esse. La maggior parte dei procarioti è
asessuata: il loro cromosoma è in singola copia e non hanno processi analoghi alla meiosi. Alcuni
procarioti sono capaci di coniugazione, per cui un frammento di DNA passa da una cellula ad
un’altra.
I procarioti sono più capaci degli eucarioti nell’incorporare DNA estraneo dall’ambiente, un
processo che ha avuto un forte impatto sull’evoluzione microbica.
Il movimento di una cellula procariotica pu essere realizzato da un semplice filamento
proteico, detto flagello, che protrude dalla cellula e ruota. Il movimento rotatorio del flagello
esercita una pressione sul fluido che lo circonda, fornendo alla cellula la spinta a procedere nel
mezzo.
Alcune cellule eucariotiche posseggono flagelli che sono molto più complessi dei semplici
filamenti proteici dei batteri e impiegano meccanismi diversi per generare movimento. I
procarioti vivono in complessi, comunità multispecie dette biofilm.
Tipi di cellule procariotiche
I procarioti sono divisi in due grandi gruppi tassonomici o domini: gli Archea (o archeobatteri) e i
Bacteria (o eubatteri).
Archea: sono specie che vivono in ambienti estremamente inospitali, per cui sono spesso
chiamati “estremofili”. Es: metanogeni, alofili, acidofili.
Bacteria: tutti gli altri tipi di procarioti.
I batteri sono presenti in ogni possibile habitat sulla Terra.
I procarioti più complessi sono i cianobatteri, che possiedono nel citoplasma elaborate strutture
membranose, sede di attività fotosintetica. Nei cianobatteri la fotosintesi produce la scissione
della molecola dell’acqua, con liberazione di ossigeno molecolare. Molti cianobatteri, oltre alla
fotosintesi, hanno la capacità di fissare l’azoto e di trasformarlo in composti ridotti (es
ammoniaca), che possono essere usati dalla cellula per la sintesi di composti organici contenenti
azoto, amminoacidi e nucleotidi inclusi.
Sono state individuate circa 6000 specie di procarioti. Tutti gli organismi hanno in comune certi
geni, come quelli che codificano per gli RNA presenti nei ribosomi o per gli enzimi di certe
catene metaboliche. Le sequenze dei nucleotidi che li formano variano considerevolmente da
una specie all’altra. Questa è la base dell’evoluzione biologica.
Tutti i geni presenti nei microbi di un dato habitat possono essere sequenziati, generando un
genoma collettivo o metagenoma.
C’è notevole diversità tra microbi che vivono all’interno o sul nostro corpo, in ambienti come il
tratto intestinale, la bocca, la pelle ecc. Questa collezione di microbi è conosciuta come
microbioma umano.

Tipi di cellule eucariotiche: la specializzazione cellulare


Le cellule specializzate si formano con un processo chiamato differenziamento. Un uovo umano,
ad esempio, viene fecondato e progredisce nel corso del suo sviluppo embrionale, che porta alla
formazione all’incirca di 250 distinti tipi di cellule differenziate. Le vie del differenziamento
dipende innanzitutto dai segnali che riceve dall’ambiente circostante; questi segnali dipendono
dalla posizione in cui quella cellula si trova nell’embrione.
Come risultato del differenziamento, tipi diversi di cellule acquistano forme differenti e
contengono materiali particolari.
Nonostante le numerose differenze, tuttavia, le varie cellule di una pianta o di un animale
pluricellulare sono costituite da organelli simili. Ad esempio, i mitocondri si trovano
praticamente in tutte le cellule; in alcune anno una forma rotondeggiante , in altre sono molto
allungati e filiformi.
Il numero, l’aspetto e la posizione dei vari organelli sono correlati con le attività di un
particolare tipo cellulare.

Le dimensioni delle cellule e delle loro componenti


Due unità di misura lineare sono quelle più usate per descrivere le strutture all’interno della
cellula : il micrometro e il nanometro. Numerose sono le ragioni per cui la maggior parte delle
cellule è così piccola:

- La maggior parte delle cellule eucariotiche contiene un singolo nucleo che, a sua volta,
contiene soltanto due copie della maggior parte dei geni. Dato che questi agiscono da
stampo per la produzione di RNA messaggero, che trasporta l’informazione, la cellula in un
dato lasso di tempo pu produrre solo un limitato numero di questi messaggeri, quindi,
maggiore è il volume del citoplasma della cellula, più tempo sarà necessario per sintetizzare
il numero richiesto di messaggi nucleari.
- La capacità di una cellula di scambiare sostanze con l’ambiente è proporzionale alla sua
superficie. Se cresce in dimensione oltre un determinato limite, la sua superficie non sarà
sufficiente ad assumere le sostanze necessarie a sostenere le sue attività metaboliche. Le
cellule che sono specializzate per l’assorbimento di soluti possiedono tipicamente microvilli
che fanno aumentare enormemente la superficie disponibile per lo scambio.
- La cellula dipende in larga misura dal movimento casuale delle molecole (diffusione).
L’ossigeno deve diffondere dalla superficie cellulare verso i mitocondri, passando attraverso
il citoplasma. L’aumento del volume della cellula rende maggiore la distanza fra la
superficie ed il suo interno, per cui il tempo richiesto per introdurre o espellere per
diffusione una sostanza, in una cellula metabolica mente attiva, diviene proibitivamente
lungo.
CHIMICA DELLA VITA

Legami Covalenti
Sono legami forti che si stabiliscono fra gli atomi che formano una molecola . Gli atomi che
costituiscono le molecole sono tenuti insieme da legami covalenti, in cui coppie di elettroni sono
condivise da coppie di atomi. Il numero di legami che un atomo pu formare dipende dal numero
di elettroni necessari a riempire il livello più esterno.
Gli elettroni tendono a localizzarsi più vicino all’atomo che presenta la maggiore forza di
attrazione, cioè quello più elettronegativo. Fra gli atomi maggiormente presenti nelle molecole
biologiche, l’azoto e l’ossigeno sono fortemente elettronegativi.

Molecole Polari: hanno una distribuzione asimmetrica delle cariche, tipo l’acqua.
Molecole non Polari: molecole prive di atomi elettronegativi e di legami polarizzati, come
quelle costituite interamente da atomi di carbonio e idrogeno.

Legami Non Covalenti


Sono legami deboli, che costituiscono le interazioni fra le molecole (o fra le diverse parti di una
macromolecola biologica). I legami non covalenti dipendono dalle forze di attrazione fra atomi
caratterizzati da carica opposta. Essendo legami deboli si formano e rompono facilmente e
questo gli consente di partecipare alle interazioni dinamiche che avvengono fra le molecole
nelle cellule.
Se questi legami agiscono cooperativamente, le loro forze attrattive si sommano, come avviene
fra i due filamenti del DNA o fra le diverse parti di una grande proteina. I legami non covalenti
forniscono alla struttura una notevole stabilità.

Legami Ionici (o ponte salino)


Sono attrazioni fra componenti cariche. I legami ionici deboli fra i gruppi di carica opposta delle
macromolecole biologiche rivestono un ruolo importante; concorrono alla stabilizzazione dei
complessi, come avviene quando gli atomi di fosforo di una molecola di DNA, che hanno carica
negativa, sono strettamente associati a gruppi carichi positivamente presenti nelle proteine. La
forza dei legami ionici in una cellula è generalmente debole a causa della presenza dell’acqua,
per nella parte più interna di una proteina, dove l’acqua è spesso esclusa, questi legami
possono essere molto più forti.

Legami Idrogeno
Quando un atomo di idrogeno è legato covalentemente ad un atomo elettronegativo, in
particolare un atomo di ossigeno o azoto, la coppia di elettroni condivisi è notevolmente
spostata verso il nucleo dell’atomo elettronegativo, lasciando l’atomo di idrogeno con una carica
parzialmente positiva. Ne deriva che il nucleo carico positivamente dell’atomo di idrogeno è
capace di avvicinarsi a una coppia di elettroni esterni non condivisi di un secondo atomo
elettronegativo per formare una interazione attrattiva; questa interazione debole è definita
legame idrogeno.
Sono particolarmente importanti nel determinare la struttura e le proprietà dell’acqua. Si
formano anche fra i gruppi polari presenti nelle macromolecole biologiche, come avviene fra i
due filamenti di una molecola di DNA. Avendo forza additiva, il grande numero di legami
idrogeno fra i filamenti rende stabile la struttura a doppia elica del DNA. Visto che per i singoli
legami sono deboli, i due filamenti possono essere separati localmente per consentire agli
enzimi di accedere ai singoli filamenti della molecola di DNA.
Le interazioni idrofobiche e le forze di van der Waals
Per la loro capacità di interagire con l’acqua, le molecole polari, come zuccheri e amminoacidi,
sono dette idrofiliche (o idrofile). Le molecole non polari, come gli steroidi o i trigliceridi, sono
insolubili in acqua.
Quando i composti non polari, detti idrofobici (o idrofobi), sono mescolati con l’acqua, tendono
ad aggregarsi, in modo da minimizzare la loro esposizione all’ambiente polare. L’associazione di
molecole non polari è anche detta interazione idrofobica. Questa è la ragione per cui nella
maggior parte delle proteine solubili i gruppi non polari tendono a localizzarsi nella parte più
interna della proteina, lontano dalle circostanti molecole di acqua.
I gruppi idrofobici sono capaci di formare dei legami deboli sulla base di reciproche attrazioni
elettrostatiche. La distribuzione degli elettroni nei legami covalenti di una molecola non polare
non è sempre simmetrica ma varia nel tempo. Queste asimmetrie transitorie nella distribuzione
degli elettroni danno luogo a separazioni momentanee della carica (dipolo) della molecola. Se
due molecole con dipoli transitori sono molto vicine l’una all’altra risentiranno di una debole
forza attrattiva, detta forza di van der Waals, che pu servire a tenerle associate.
Un singolo legame di van der Waals è estremamente debole e molto sensibile alla distanza che
separa i due atomi che lo compongono. Le molecole biologiche in grado di interagire fra loro,
come un anticorpo e un antigene, spesso hanno geometrie complementari, quindi molti atomi
delle due molecole possono avvicinarsi moltissimo, rendendo le forze di van der Waals un fattore
importante.

Proprietà dell’acqua
L’acqua è una molecola notevolmente asimmetrica, con l’atomo di O da un lato e i due atomi di
H dal lato opposto. Ognuno dei due legami covalenti è fortemente polarizzato. Tutti e 3 gli
atomi della molecola d’acqua tendono a formare legami idrogeno.
Le proprietà dell’acqua che sono essenziali per la vita originano da queste sue caratteristiche. Il
piccolo volume di acqua presente in una cellula contiene una miscela notevolmente complessa di
soluti.
Attraverso cui vengono trasferite sostanze da un compartimento all’altro della cellula; è il
reagente o prodotto di molte reazioni che hanno luogo nelle cellule; inoltre, protegge la cellula
in molti modi.
L’acqua è così importante nella cellula perché è capace di stabilire interazioni deboli con
numerosi e differenti tipi di gruppi chimici.
Le molecole d’acqua formano legami idrogeno con molecole organiche che posseggono gruppi
polari, quali amminoacidi e zuccheri, di cui in tal modo assicurano la solubilità all’interno della
cellula.
L’acqua svolge anche un ruolo chiave nel mantenere la struttura e la funzione delle
macromolecole e dei complessi da esse formati (come le membrane).

Acidi, Basi e Tamponi


La maggior parte dei processi biologici è estremamente sensibile al pH, poiché il cambiamento
della concentrazione degli ioni idrogeno influenza lo stato di ionizzazione delle molecole
biologiche. Persino modesti cambiamenti di pH possono impedire le reazioni biologiche. Gli
organismi e le cellule che li compongono sono protetti dalle oscillazioni del pH per mezzo di
sistemi tampone.

La natura delle molecole biologiche


La principale componente di un organismo è l’acqua. La maggior parte del rimanente peso secco
è rappresentata da molecole contenenti atomi di carbonio (molecole organiche).
I composti prodotti dagli organismi viventi sono stati chiamati biochimici. La chimica della vita
ruota intorno alla chimica del carbonio: un atomo di carbonio pu legare fino ad altri quattro
atomi. Inoltre, ogni atomo di carbonio è capace di legare altri atomi di carbonio, formando
molecole il cui scheletro è costituito da lunghe catene carboniose lineari, ramificati o ciclici. Le
molecole organiche presenti nelle cellule viventi possono essere suddivise in varie categorie:
- Macromolecole: molecole che formano la struttura delle cellule e che sono alla base delle
attività cellulari. Sono di grandi dimensioni e molto organizzate. Le macromolecole possono
essere divise in quattro grandi categorie: proteine, acidi nucleici, polisaccaridi e certi lipidi.
- Unità costitutive delle macromolecole: la maggior parte delle macromolecole ha vita breve
rispetto alla vita della cellula: ad eccezione del DNA, esse sono continuamente demolite e
sostituite da nuove. La maggior parte delle cellule ha una riserva di precursori di basso peso
molecolare, che vengono incorporati nelle macromolecole. Essi includono: zuccheri,
precursori dei polisaccaridi; amminoacidi, precursori delle proteine; i nucleotidi, precursori
degli acidi nucleici; acidi grassi, incorporati nei lipidi.
- Metaboliti: sono i composti intermedi del metabolismo: nelle cellule, ogni serie di reazioni
chimiche costituisce una via metabolica: i composti che si formano durante il percorso
possono non avere nessuna funzione di per sé e sono detti metaboliti intermedi.
- Molecole con funzioni varie: raggruppano molecole molto differenti fra loro. Ne fanno parte
le vitamine, che esplicano la loro attività in associazione con proteine, certi ormoni
steroidei o amminoacidici, molecole di riserva energetica come l’ATP e la fosfocreatina,
molecole regolatrici come l’AMP ciclico e prodotti di scarto del metabolismo come l’urea.

Le molecole vengono divise in quattro classi o famiglie: carboidrati, lipidi, proteine e acidi
nucleici.

CARBOIDRATI
I carboidrati includono gli zuccheri semplici (o monosaccaridi) e tutte le molecole più grandi
costruite a partire dalle molecole degli zuccheri. Funzionano principalmente come depositi di
energia chimica e come materiale da costruzione di lunga durata per strutture biologiche.
Formula degli zuccheri generica è (CH2O)n; negli zuccheri che interessano il metabolismo
cellulare, n ha un valore compreso fra 3 e 7. Gli zuccheri che contengono tre atomi di carbonio
sono detti triosi, quelli con quattro tetrosi, quelli con cinque pentoni ecc…
Zuccheri semplici: composti da uno scheletro di atomi di carbonio legati insieme in un
arrangiamento lineare, mediante legami singoli. Ciascuno degli atomi di carbonio dello
scheletro lega un singolo gruppo ossidrilico, ad eccezione di uno, che porta il gruppo carbonilico.
Se è il gruppo carbonilico è situato all’interno della molecola, lo zucchero è detto chetosio (es:
fruttosio). Se il gruppo carbonilico è situato ad una estremità dello zucchero, esso forma un
gruppo aldeico e la molecola è detta aldoso (es: glucosio).
L’anello dello zucchero esiste in una conformazione tridimensionale che assomiglia ad una sedia.

Stereoisomeria: se i quattro gruppi legati al carbonio sono tutti diversi, esistono due possibili
configurazioni non sovrapponibili. Queste due molecole (chiamate stereoisomeri o enantiomeri)
strutturalmente sono immagini speculari l’una dell’altra. Il carbonio è detto in questo caso
asimmetrico.
Gli aldotetrosi hanno due carboni asimmetrici e possono avere quattro diverse configurazioni.
Gli enzimi di una cellula possono distinguere fra zuccheri della forma D e zuccheri della forma L.

Gli zuccheri sono uniti fra loro per costituire molecole più grandi tramite legami glicosidici. Le
molecole composte di due soli zuccheri sono dette disaccaridi e vengono utilizzate come riserva
di energia prontamente disponibile.
Il lattosio, fornisce energia ai neonati nei primi stadi della crescita e dello sviluppo; il lattosio
viene idrolizzato dall’enzima lattasi, presente nella membrana plasmatica delle cellule che
rivestono l’intestino.
Gli zuccheri si possono legare insieme per formare piccole catene che si chiamano
oligosaccaridi. Spesso queste catene si legano covalentemente a lipidi o proteine, trasformandoli
rispettivamente in glicolipidi e glicoproteine. Gli oligosaccaridi hanno particolare importanza nei
glicolipidi e nelle glicoproteine della membrana plasmatica, dove si proiettano dalla superficie
della cellula. Gli oligosaccaridi possono svolgere un ruolo informazionale, cioè servire a
distinguere un tipo di cellula da un altro e aiutano a mediare le interazioni specifiche di una
cellula con il suo ambiente.

Polisaccaridi: polimero di unità di zucchero unite con legami glicosidici. Il glicogeno ad esempio
è un polimero ramificato che contiene un solo tipo di monomero, il glucosio. Il glicogeno serve
come deposito di energia chimica in eccesso nella maggior parte degli animali.

LIPIDI
Sono un gruppo di molecole biologiche non polari, solubili in solventi organici ed insolubili in
acqua. Quelli importanti per le funzioni cellulari sono i trigliceridi, gli steroidi e i fosfolipidi.

Trigliceridi: consistono in una molecola di glicerolo legata mediante legami esterici a tre acidi
grassi (triglicerolo). Gli acidi grassi sono delle lunghe catene di idrocarburi non ramificate, con
un unico gruppo carbossilico ad una estremità.
Le due estremità dell’acido grasso presentano differenti proprietà. La catena idrocarburica è
idrofobica mentre il gruppo carbossilico è idrofilico. Le molecole che hanno regioni idrofobiche
ed idrofiliche sono dette anfipatiche e presentano importanti proprietà biologiche.
Gli acidi grassi presenti nelle cellule hanno fra i 14 e i 20 atomi di carbonio; quelli che mancano
di doppi legami sono detti saturi, quelli che possiedono almeno un doppio legame sono detti
insaturi.
I grassi che sono liquidi a temperatura ambiente sono chiamati oli.
Il processo di idrogenazione: converte alcuni dei doppi legami cis in doppi legami trans, che sono
dritti invece che angolati, generando dei grassi parzialmente idrogenati o grassi trans.
Una molecola di trigliceride pu contenere tre acidi grassi identici o pu essere un grasso misto,
che contiene diversi tipi di acidi grassi.
I grassi sono molto ricchi di energia chimica, molto più dei carboidrati, in quanto i carboidrati
sono una sorgente di energia di breve durata e rapidamente disponibile, mentre i grassi sono
riserve energetiche di lunga durata. In molti animali, i grassi sono depositati in adipociti, il cui
citoplasma è riempito con una o più gocce lipidiche. Gli adipociti hanno una notevole capacità di
cambiare il loro volume per ospitare quantità variabili di grasso.

Steroidi: contengono un caratteristico scheletro carbonioso a quattro anelli. Uno degli steroli più
importanti è il colesterolo, che è un componente delle membrane delle cellule animali e
precursore per la sintesi di numerosi ormoni steroidei (testosterone, progesterone ed estrogeni).

Fosfolipidi: La molecola assomiglia ad un trigliceride (triacilglicerolo) ma ha solo due acidi grassi


invece di tre: è quindi un diacilglicerolo. Il terzo gruppo ossidrilico della catena del glicerolo è
legato covalentemente ad un gruppo fosfato, che a sua volta è legato covalentemente a un
piccolo gruppo polare, come la colina.
I fosfolipidi presentano due regioni con differenti proprietà: l’estremit à con il gruppo fosfato ha
un carattere idrofilico, mentre l’altra estremità, con le catene di acidi grassi, ha un carattere
idrofobico. La principale funzione dei fosfolipidi è legata alla loro presenza nelle membrane
delle cellule e le proprietà delle membrane cellulari dipendono dalla loro composizione in
fosfolipidi.

PROTEINE
Sono macromolecole da cui dipendono tutte le attività della cellula. Permettono lo svolgimento
degli eventi. Come enzimi, aumentano la velocità delle reazioni metaboliche; Come ormoni,
fattori di crescita, svolgono numerose funzioni di regolazione; come recettori e trasportatori di
membrana, selezionano ci che reagisce con la cellula o ci che entra o esce dalla cellula; inoltre
formando filamenti contrattili esse costituiscono l’apparato per l’attività motoria, mentre
formando fibre forniscono il sostegno meccanico sia alla cellula che all’ambiente che la
circonda.
Le proteine agiscono anche da anticorpi, da tossine, fanno coagulare il sangue, assorbono e
rifrangono la luce e trasportano sostanze da una parte ad un’altra del corpo.
Ogni proteina ha una struttura unica e definita, che le consente di svolgere una particolare
funzione; hanno forme e superfici che consentono loro di interagire selettivamente con altre
molecole, mostrando un alto grado di specificità.
Le proteine sono biopolimeri costituiti da catene lineari di amminoacidi, ognuna con la sua
sequenza di amminoacidi che le conferisce proprietà peculiari.
Tutti gli amminoacidi hanno un gruppo carbossilico ed un gruppo amminico, separati fra loro da
un singolo atomo di carbonio (α). Anche gli amminoacidi hanno centri di asimmetria. Ad
eccezione della glicina, il carbonio degli amminoacidi lega quattro gruppi diversi, quindi esisterà
sia la forma D che L. Gli amminoacidi usati nella sintesi di una proteina sono sempre
Lamminoacidi.
Durante la sintesi delle proteine, ogni amminoacido, si unisce ad altri due, formando un lungo
polimero continuo e non ramificato detto catena polipeptidica. Sono uniti da legami peptidici,
che si formano dall’unione del gruppo carbossilico di un amminoacido con il gruppo amminico
dell’amminoacido contiguo, con l’eliminazione di una molecola di acqua.
Una volta incorporati in una catena polipeptidica, gli amminoacidi vengono chiamati residui. Il
residuo ad una estremità, cosiddetta N-terminale presenta l’ α-amminogruppo libero mentre il
residuo all’estremità opposta C-terminal, presenta il gruppo α-carbossilico libero.
Oltre agli amminoacidi, molte proteine contengono altri tipi di componenti che vengono aggiunti
dopo che il polipeptide è stato sintetizzato (es: carboidrati con formazione di glicoproteine). La
catena laterale o gruppo R varia molto fra i 20 amminoacidi utilizzati nelle proteine ed è proprio
questa variabilità che fornisce alle proteine le loro diverse strutture ed attività. Le
caratteristiche delle catene laterali degli amminoacidi sono importanti, sia nelle interazioni
intramolecolari, che determinano la struttura e l’attività della molecola, sia in quelle
intermolecolari, che determinano le relazioni di un polipeptide con altre molecole, inclusi altri
polipeptidi.
Gli amminoacidi sono classificati in base alle caratteristiche delle loro catene laterali. Si
suddividono in genere in quattro categorie: polari carichi, polari non carichi, non polari, dotati
di proprietà particolari.

Le proteine sono macromolecole complesse, ma la loro struttura in un dato ambiente è


completamente definita e prevedibile. La struttura della proteina pu essere descritta a diversi
livelli di organizzazione, ognuno dei quali dipende da differenti tipi di interazione. Si
descrivono quattro livelli: primario, secondario, terziario e quaternario.

Struttura primaria: è la sequenza lineare specifica degli amminoacidi che compongono la catena.
L’informazione per la precisa disposizione degli amminoacidi in ogni proteina che un organismo
pu produrre è contenuta nel suo genoma. La sequenza degli amminoacidi contiene
l’informazione necessaria per determinare la forma tridimensionale della molecola e quindi la
sua funzione.
Alterazioni della sequenza amminoacidica possono provocare gravi conseguenze, ad esempio la
modificazione nella sequenza degli amminoacidi dell’emoglobina causa l’anemia falciforme, ma
non sono tutte così gravi. Il fatto che alterazioni nella sequenza primaria vengano o meno
tollerate dipende da quanto esse influiscano sulla forma della proteina o disturbino i residui
critici per la sua funzione.

Struttura secondaria: le proteine sono formate da legami tra un gran numero di atomi e quindi la
loro forma è complessa. Si dice conformazione la disposizione tridimensionale degli atomi in una
molecola, cioè la loro organizzazione spaziale. La struttura secondaria descrive la conformazione
di parti della catena polipeptidica.
Esistono due conformazioni. In una, chiamata α elica lo scheletro del polipeptide assume la
forma di una spirale avvolta e delimitata da un cilindro e lo scheletro è all’interno dell’elica
mentre le catene laterali si proiettano all’esterno. La struttura elicoidale è stabilizzata da
legami idrogeno fra gli atomi coinvolti nei legami peptidici che si trovano adiacenti nella spirale.
L’altra conformazione è il foglietto β, costituito da alcuni segmenti di un polipeptide disposti in
modo affiancato. Lo scheletro di ciascun segmento del polipeptide in un foglietto β assume una
conformazione pieghettata.
Il foglietto β è caratterizzato da numerosi legami idrogeno orientati in modo perpendicolare
all’asse della catena polipeptidica e si proiettano trasversalmente da una regione della catena
ad un’altra adiacente.
I foglietti β resistono alle forze di trazione.
Le parti di una catena polipeptidica non organizzate in una α elica o in un foglietto β possono
formare cerniere, giri, anse o estensioni digitiformi. Spesso, queste sono le parti più flessibili di
una catena polipeptidica e le sedi della maggiore attività biologica. Gli antibiotici ad esempio,
interagiscono con le altre molecole mediante una serie di anse situate ad una estremità della
molecola dell’anticorpo.

Struttura terziaria: descrive la conformazione dell’intero polipeptide. Mentre la struttura


secondaria è stabilizzata principalmente da legami idrogeno tra atomi che formano i legami
peptidici della catena, la struttura terziaria è stabilizzata da una serie di legami non covalenti
tra le diverse catene laterali di una proteina. La struttura secondaria limitata da un piccolo
numero di conformazioni, mentre la varietà delle strutture terziarie delle molecole proteiche è
enorme.
Un numero sorprendente di proteine contiene segmenti che mancano di una conformazione
definita (regioni disordinate). Queste regioni disordinate rivestono ruoli chiave in processi
cellulari vitali, spesso legando il DNA o altre proteine.
La maggior parte delle proteine pu essere classificata sulla base della propria conformazione
globale: alcune sono proteine fibrose, con forma allungata, altre sono proteine globulari, con
forma più compatta. La maggior parte delle proteine che funge da materiale strutturale
all’esterno della cellula è rappresentata da proteine fibrose (collagene, elastine, cheratine).
Mentre la maggior parte delle proteine all’interno della cellula è rappresentata dalle proteine
globulari.
Mioglobina: è la prima proteina globulare di cui è stata determinata la struttura terziaria. Le
catene polipeptidiche delle proteine globulari sono ripiegate e avvolte in forme complesse. Punti
distanti sulla sequenza lineare degli amminoacidi sono ravvicinati e legati fra loro mediante vari
tipi di legame.
La mioglobina nel tessuto muscolare funziona come un deposito dell’ossigeno; la molecola di
ossigeno si lega ad un atomo di ferro al centro del gruppo eme (gruppo prostetico).
Il primo profilo della mioglobina rivel la presenza di otto strutture a bacchetta, corrispondenti
ad α eliche di lunghezza variabile tra 7 e 24 amminoacidici. Non è stato trovato nessun foglietto
β.
La mioglobina non contiene ponti disolfuro; la struttura terziaria della proteina è tenuta insieme
esclusivamente da interazioni non covalenti.
La maggior parte delle proteine globulari invece, possiede sia le α eliche che foglietti β.
Ciascuna proteina ha una struttura terziaria unica, che è direttamente correlata con la sua
sequenza amminoacidica e con la sua biologia.
Molte proteine, soprattutto quelle più grandi, sono composte da due o più moduli distinti, o
domini, che si strutturano indipendentemente l’uno dall’altro. Domini proteici spesso
corrispondono ad una funzione specifica. Il rimescolamento dei domini genera proteine con
combinazioni uniche di attività.

Struttura quaternaria: anche se molte proteine sono composte di un’unica catena polipeptidica,
molte altre sono costituite da più di una catena, o subunità. Queste subunità possono essere
legate fra loro da legami disolfuro covalenti, ma la maggioranza è tenuta insieme da legami non
covalenti. Le proteine costituite da subunità si dice che sono dotate di una struttura
quaternaria.
Una proteina composta da due subunità identiche si chiama omodimero, mentre una proteina
composta da due subunità diverse è eterodimero.
Una molecola di emoglobina umana è composta da due polipeptidi chiamati globine α e due
chiamati globine β, ognuno dei quali lega una singola molecola di ossigeno. Anche se è costituita
da quattro subunità, essa è considerata come una singola proteina con una singola funzione.

Le complesse funzioni delle proteine si possono realizzare tramite piccole variazioni nella loro
conformazione.
Le proteine sono flessibili e capaci di considerevoli movimenti interni: sono molecole con parti
mobili. Casuali fluttuazioni su piccola scala nell’arrangiamento dei legami all’interno di una
proteina creano un incessante movimento termico dentro la molecola.
I movimenti dinamici delle catene laterali all’interno della proteina porterebbero alla rapida
apertura e chiusura di una “porta”, che consentirebbe alle molecole di acetilcolina di diffondere
nel sito catalitico dell’enzima.
I movimenti prevedibili (non casuali) all’interno di una proteina, che sono innescati dal legame
di una specifica molecola, sono chiamati modificazioni conformazionali ed in genere implicano il
movimento coordinato di varie parti della molecola.
Ciascuna attività alla quale una proteina prende parte è accompagnata da cambiamenti
conformazionali all’interno della molecola.
Il cambiamento conformazionale nella miosina ad esempio avviene durante la contrazione
muscolare. Il legame della miosina ad una molecola di actina comporta una piccola rotazione
della testa della miosina, che si traduce in un movimento del filamento adiacente.

Interazioni proteina-proteina:
Sono noti molti esempi di proteine diverse, ognuna con una funzione specifica, associate
fisicamente per formare un grande complesso multiproteico.
Uno dei primi complessi multiproteici scoperto e studiato è la piruvato deidrogenasi del batterio
Escherichia coli, composta da 60 diverse catene polipeptidiche che formano tre diversi enzimi.
I complessi multiproteici che si formano non sono necessariamente associazioni stabili. La
maggior parte delle proteine interagisce con altre proteine in maniera molto dinamica,
associandosi e dissociandosi a seconda delle condizioni della cellula in quel dato istante. Le
proteine che interagiscono tendono ad avere superfici complementari.
Una volta che le due molecole sono a stretto contatto, la loro interazione è stabilizzata da
legami non covalenti.
In molti casi, le interazioni fra proteine sono regolate da modificazioni, come l’aggiunta di un
gruppo fosfato ad un amminoacido chiave, che agiscono come un interruttore in grado di
accendere o spegnere la capacità della proteina di legare una proteina partner. L’importanza
delle interazioni transitorie fra le proteine è divenuta sempre più evidente. Per esempio in
diversi processi come la sintesi del DNA, la formazione dell’ATP e il rimaneggiamento dell’RNA,
sono tutti compiuti da macchine molecolari costituite da un elevato numero di proteine
interagenti fra loro, alcune in maniera stabile ed altre in modo transitorio.
Le proteine che hanno molti partner di legame vengono chiamate hub. Alcune proteine hub
presentano parecchie differenti interfacce di legame e sono capaci di legare numerosi differenti
partner nello stesso tempo. Altre hub presentano una sola interfaccia di legame, che è capace di
legare parecchi diversi partner, ma soltanto per una volta.

Il ripiegamento delle proteine:


Lo srotolamento, o disorganizzazione, di una proteina è detto denaturazione e pu essere
causato da vari agenti, tra cui solventi organici, detergenti, radiazione, calore e composti come
urea e cloruro di guanidina, ognuno dei quali interferisce con le varie interazioni che
stabilizzano la struttura terziaria della proteina.
Le molecole attive, che si erano riformate dalle proteine denaturate, erano indistinguibili sia
strutturalmente che funzionalmente dalle molecole correttamente avvolte (native) presenti.
Questo perché la sequenza amminoacidica del polipeptide contiene tutta l’informazione
richiesta per l’assemblaggio della conformazione tridimensionale della proteina; pertanto,
l’avvolgimento avveniva per autoassemblaggio. Gli eventi tendono a procedere verso stati di
energia più bassa, quindi la struttura terziaria che una catena polipeptidica assume dopo
l’avvolgimento è quella con la più bassa energia, ovvero è la struttura più stabile dal punto di
vista termodinamico che pu essere formata da quella catena.
Sembra che l’evoluzione scelga quelle sequenze amminoacidiche che generano una catena
polipeptidica capace di arrivare spontaneamente, in un tempo biologicamente ragionevole, ad
uno stato nativo utile a svolgere una funzione.
Il ripiegamento delle proteine pu essere spiegato secondo 2 schemi:
1) Il ripiegamento della proteina inizia mediante interazioni tra residui limitrofi, che
portano alla formazione della maggior parte delle strutture secondarie della molecola.
Una volta formati le α-eliche e i β-foglietti, il successivo ripiegamento è guidato dalle
interazioni idrofobiche che spingono i residui non polari insieme nel nucleo centrale della
proteina.
2) Il primo evento importante è il ripiegamento del polipeptide per formare una struttura
compatta, e solo in seguito si sviluppano le strutture secondarie.
La maggior parte delle proteine si ripiega probabilmente mediante uno schema intermedio, in
cui la formazione della struttura secondaria e la compattazione si verificano simultaneamente.
Questi eventi precoci nel percorso di ripiegamento portano alla formazione di una struttura
transitoria parzialmente ripiegata, che somiglia alla proteina nativa ma è priva di molte delle
interazioni specifiche tra le catene laterali degli amminoacidi che sono presenti nella molecola
completamente ripiegata.
Quindi le alterazioni della sequenza amminoacidica possono alterare il modo in cui la proteina si
ripiega, portando ad una struttura terziaria anormale. Infatti, molte mutazioni responsabili di
malattie ereditarie sono state dimostrate alterare la struttura tridimensionale di una proteina.
Non tutte le proteine sono capaci di assumere la propria struttura terziaria definitiva mediante
un semplice processo di autoassemblaggio. Si sono evolute parecchie famiglie di proteine che
hanno la funzione di aiutare proteine non ripiegate o ripiegate male a raggiungere la giusta
conformazione tridimensionale. Queste proteine ausiliarie sono chiamate chaperoni molecolari;
esse si legano selettivamente a brevi segmenti costituiti da amminoacidi idrofobici, che tendono
ad essere esposti in superficie nelle proteine non native e nascosti all’interno nelle proteine con
una conformazione nativa.

Le catene polipeptidiche sono sintetizzate sui ribosomi mediante l’aggiunta di amminoacidi, uno
per volta, a partire dall’estremità N-terminale della catena. Gli chaperoni si legano alle catene
polipeptidiche in fase di allungamento mentre quelle emergono da un canale d’uscita situato
nella subunità maggiore del ribosoma. Una volta che la loro sintesi è completa, molte di queste
proteine vengono semplicemente rilasciate dallo chaperone nel citosol, dove si ripiegano
spontaneamente nel loro stato nativo.
Molti dei polipeptidi più grandi sono invece trasferiti a diversi tipi di chaperoni, detto
chaperonina.
Chaperonine: sono complessi proteici che contengono camere in cui i polipeptidi appena
sintetizzati possono ripiegarsi senza subire interferenze da parte di altre macromolecole.
L’intero inventario delle proteine prodotte da un organismo definito il proteoma di
quell’organismo.

Le proteine sono adattamenti biochimici soggetti alla selezione naturale ed ai cambiamenti


evolutivi, nello stesso modo di altri tipi di caratteri. L’evoluzione ha prodotto tipi differenti di
proteine; Il genoma umano codifica per parecchie differenti versioni di ciascuna di queste
proteine. Nella maggior parte dei casi, differenti versioni di ciascuna di queste proteine
(isoforme), sono adattate a funzionare in differenti tessuti o a stadi differenti dello sviluppo. La
maggior parte delle proteine è membro di grandi famiglie (o superfamiglie) di molecole
corredate.

ACIDI NUCLEICI
Sono macromolecole costituite da lunghe catene (filamenti) di monomeri chiamati nucleotidi. Le
loro funzioni principali sono l’archiviazione e la trasmissione dell’informazione genetica, ma
possono avere anche ruoli strutturali e catalitici. Negli organismi viventi sono presenti due tipi di
acidi nucleici: l’acido desossiribonucleico (DNA) e l’acido ribonucleico (RNA).
Il DNA costituisce il materiale genetico di tutti gli organismi cellulari (nei virus è svolto invece
dall’RNA). Nelle cellule, l’informazione depositata nel DNA viene usata per dirigere le attività
cellulari mediante la formazione di messaggi costituiti da RNA. Ogni nucleotide di un
filamento di RNA è costituito da tre parti: 1) Uno zucchero a cinque atomi di carbonio, il
ribosio;
2) Una base azotata
3) Un gruppo fosfato
L’insieme dello zucchero e della base azotata costituisce un nucleoside, per cui i nucleotidi di un
filamento di RNA sono anche definiti come ribonucleosidi monofosfati. Il fosfato è legato al
carbonio 5’ e la base azotata è legata al carbonio 1’ dello zucchero.
Durante la costruzione di un filamento di acido nucleico, il gruppo ossidrilico del carbonio 3’
dello zucchero di un nucleotide si connette con legame estere con il fosfato legato al gruppo 5’
dl nucleotide successivo nella catena. Così i nucleotidi di un filamento di RNA o DNA sono legati
da ponti zucchero-fosfato (legami 3’-5’-fosfodiesterici).
Un filamento di RNA (o DNA) contiene quattro tipi differenti di nucleotidi, che si distinguono per
la loro base azotata. Due tipi di basi si trovano negli acidi nucleici: pirimidine e purine.
Le pirimidine sono molecole più piccole, costituite da un solo anello.
Le purine sono più grandi e costituite da due anelli.
Gli RNA contengono le due purine adesina e guanina e le due pirimidine citosina e uracile. Nel
DNA l’uracile è sostituito dalla timina, una pirimidina con un ulteriore residuo metilico unito
all’anello.
Anche se consistono in un unico filamento continuo, gli RNA spesso si piegano su se stessi
formando molecole che presentano estesi segmenti a doppio filamento e complesse strutture
tridimensionali.
L’RNA è un componente della subunità minore del ribosoma batterico. Gli RNA ribosomali non
sono molecole che trasferiscono l’informazione genetica, bensì servono da impalcatura su cui si
ancorano le proteine del ribosoma e da elementi che riconoscono e legano vari componenti
solubili necessari per la sintesi delle proteine.
Gli RNA con ruolo di catalizzatori sono chiamati enzimi a RNA, o ribozimi (catalizzano la reazione
mediante la quale gli amminoacidi vengono legati covalentemente tra loro durante la sintesi
proteica).
I nucleotidi svolgono anche altre importanti funzioni: la maggior parte dell’energia utilizzata in
quasiasi momento dagli organismi viventi deriva dal nucleotide adenosintriofosfato (ATP), che ha
un ruolo chiave nel metabolismo cellulare. Il guanosintrifosfato (GTP) è un altro nucleotide di
enorme importanza nelle attività cellulari. Il GTP si lega ad una varietà di proteine (proteine G)
e agisce come un interruttore per attivarle. ENZIMI COME CATALIZZATORI BIOLOGICI
Gli enizmi sono i mediatori del metabolismo, responsabili di quasi tutte le reazioni che hanno
luogo in una cellula. Senza gli enzimi, le reazioni metaboliche procederebbero così lentamente
da essere impercettibili.
Il termine enzima viene generalmente riservato ai catalizzatori proteici, mentre il termine
riboima viene usato per i catalizatori a RNA.
Anche se gli enzimi sono proteine, molti di essi sono proteine coniugate, cioè contengono
componenti non proteici, detti cofattori, che possono essere inorganici (metalli) o organici
(coenzimi).

Gli enzimi mostrano le seguenti proprietà:


- Sono necessari solo in piccole quantità;
- Non sono alterati irreversibilmente durante la reazione e, pertanto, ogni molecola di enzima
pu partecipare ripetutamente in singole reazioni;
- Non hanno nessun effetto sulla termodinamica della reazione.
Gli enzimi infatti non forniscono energia per una reazione chimica e perché non determinano e
una reazione sia termodinamicamente favorevole (esoergonica) o sfavorevole (endoergonica).
Come catalizzatori, gli enzimi possono solo accelerare la velocità a cui una reazione chimica
favorevole procede.
Gli enzimi sono catalizzatori particolarmente efficaci ed esercitano questo effetto a
temperature molto modeste e al pH presente nella cellula. Inoltre gli enzimi sono notevolmente
specifici per i reagenti a cui si legano e per la reazione che possono catalizzare. I reagenti
legati ad un enzima sono detti substrati.
Questa specificità fra enzimi e substrati o fra altri tipi di proteine e le sostanze che esse legano
è fondamentale per mantenere l’ordine richiesto per la sopravvivenza.
Oltre alla loro elevata attività e specificità, gli enzimi hanno anche il ruolo di sorvegliare il
traffico metabolico, nel senso che le reazioni da essi catalizzate sono molto ordinate, solo i
prodotti formati sono quelli giusti.

Le trasformazioni chimiche richiedono la rottura di alcuni legami covalenti nei reagenti. Per
questo è necessario che i reagenti abbiano una energia cinetica sufficiente a superare una
barriera, la cosiddetta energia di attivazione.
La velocità della reazione dipende dal numero di molecole di reagente che, in un determinato
momento, hanno la necessaria energia cinetica. Un modo per aumentare la velocità di reazione
è quello di aumentare l’energia dei reagenti in laboratorio oppure applicando del calore ad una
reazione mediata da un enzima, questo viene portato a rapida inattivazione, poiché viene
denaturato.
I reagenti, quando sono nel punto di massimo della curva energetica e sono pronti ad essere
trasformati in prodotti, sono allo stato di transizione. In questo punto, i reagenti formano un
complesso attivato, in cui i legami si riformano e si rompono.
Allorchè lo stato di transizione è convertito nei prodotti, l’affinità dell’enzima per il legame con
la molecola decresce ed i prodotti vengono rilasciati.

Come catalizzatori, gli enzimi accelerano i processi di rottura e di formazione dei legami, ma
devono essere coinvolti nelle attività che si svolgono tra i reagenti, con cui si formano un
complesso chiamato complesso enzima-substrato (ES). Nella maggior parte dei casi,
l’associazione fra enzima e substrato non è covalente.
La parte della molecola enzimatica che è direttamente coinvolta nel legare il substrato è
definito sito attivo.
Il sito attivo ed il substrato (o i substrati) hanno forme complementari, ci consente loro di
legarsi con precisione, ad incastro. Il legame quindi avviene tramite interazioni non covalenti
(legame ionico, idrogeno, ecc..) che determinano la struttura della proteina stessa.
Il sito attivo presenta una serie particolare di catene laterali di amminoacidi che influenzano il
substrato e abbassano l’energia di attivazione della reazione.
La struttura del sito attivo non solo spiega l’attività catalitica dell’enzima, ma anche la sua
specificità. La maggior parte degli enzimi è capace di legare una sola o un piccolo numero di
molecole biologiche molto simili.
I substrati legati alla superficie di un enzima sono molto vicini e orientati correttamente per
facilitare la reazione.
Gli enzimi sono composti da amminoacidi che hanno una varietà di catene laterali diverse
(gruppi R), da quelle completamente ionizzate a quelle nettamente non polari.
Quando un substrato è legato al sito attivo di un enzima, la distribuzione degli elettroni nella
molecola del substrato è influenzata dalle catene laterali adiacenti l’enzima. Questa influenza
incrementa la reattività del substrato e stabilizza il complesso dello stato di transizione formato
durante la reazione;
I siti attivi di molti enzimi contengono catene laterali con una carica parzialmente positiva o
negativa. Questi gruppi sono capaci di interagire con un substrato e alterare le sue proprietà
elettrostatiche e quindi la sua reattività; sono anche in grado di interagire con un substrato per
formare un legame covalente enzima-substrato.
Sebbene le catene laterali amminoacidiche possano prender parte in varie reazioni, esse non
sono molto adatte a donare o accettare elettroni. Il trasferimento di elettroni è l’evento
centrale nelle reazioni di ossido-riduzione, che hanno un ruolo vitale nel metabolismo cellulare.
Per catalizzare queste reazioni, gli enzimi utilizzano cofattori che aumentano la reattività dei
substrati rimuovendo o donando elettroni.

Benchè il sito attivo di un enzima possa essere complementare al substrato, varie ricerche
indicano uno spostamento nelle posizioni relative di atomi dell’enzima, una volta che il
substrato sia stato legato. In molti casi, la conformazione varia così che l’adattamento
complementare fra l’enzima e i reagenti venga migliorato (adattamento indotto), e i gruppi
reattivi specifici dell’enzima si dispongono nella corretta orientazione.

Cinetica enzimatica:
L’attività catalitica di un enzima viene descritta dallo studio della sua cinetica, cioè la velocità a
cui è catalizzata una reazione in varie condizioni sperimentali. Michaelis e Menten stabilirono
una relazione matematica fra concentrazione del substrato e velocità delle reazioni
enzimatiche, misurando la quantità di prodotto formato (o di substrato consumato) in un
determinato intervallo di tempo.
A basse concentrazioni di substrato, le molecole di enzima sono soggette a poche collisioni con il
substrato i un dato periodo di tempo. Di conseguenza, la quota di enzima libero è elevata e la
velocità dipende dal numero di molecole di substrato. Ad alte concentrazioni di substrato, gli
enzimi collidono in prevalenza con le molecole di substrato, più velocemente di quanto non
siano trasformate in prodotto.
Quindi ad elevate concentrazioni di substrato, le molecole enzimatiche lavorano alla loro
massima capacità, limitando la velocità.
Via via che aumenta la concentrazione del substrato presente nella miscela di reazione, l’enzima
si avvicina ad uno stato di saturazione, e la velocità in questo punto di saturazione viene definita
come velocità massima (Vmax).
La costante di Michaelis (KM) è uguale alla concentrazione del substrato a cui la velocità di
reazione è la metà della Vmax. KM è costante per un dato enzima e, perci , indipendente dal
substrato o dalla concentrazione dell’enzima.
V= Vmax * ( [S] / [S]+KM )
Il valore KM fornisce una misura dell’affinità dell’enzima per il substrato. Più alta è la KM più
grande è la concentrazione di substrato che è richiesta per raggiungere metà della Vmax, e perci
, più bassa è l’affinità dell’enzima per quel substrato.
Altri fattori che influenzano fortemente la cinetica enzimatica sono il pH e la temperatura del
mezzo di incubazione. Ogni enzima ha un pH ed una temperatura ottimali a cui opera ad attività
massima.

Inibitori enzimatici
Sono molecole capaci di legarsi ad un enzima e di diminuire l’attività. Gli inibitori vengono
utilizzati dalle cellule per regolare l’attività di molti dei loro enzimi. Si suddividono in due
categorie: reversibili o irreversibili.
Gli inibitori irreversibili sono quelli che instaurano un legame molto forte con l’enzima, spesso
covalente con i suoi residui amminoacidi.
Gli inibitori reversibili invece, interagiscono solo debolmente con un enzima, per cui possono
essere facilmente rimossi.
Gli inibitori competitivi sono reversibili e competono con il substrato per l’accesso al sito attivo
dell’enzima.
Gli inibitori competitivi sono analoghi al substrato e competono in tal modo per lo stesso sito
legante, ma ne differiscono in maniera tale da non poter essere trasformati in prodotti.
L’inibizione competitiva dell’enzima costituisce la base di azione di una grande varietà di
comuni farmaci.
L’effetto dell’inibitore diventa minimo se il numero delle sue collisioni con l’enzima diviene
insignificante rispetto al numero di collisioni fra l’enzima ed il suo substrato.
Nell’inibizione non competitiva, il substrato e l’inibitore non competono per lo stesso sito
legante; in genere l’inibitore agisce in un punto diverso dal sito attivo dell’enzima. Il grado di
inibizione dipende solo dalla concentrazione dell’inibitore.
In presenza di u inibitore non competitivo, una certa frazione delle molecole enzimatiche è
inattiva in un dato istante, la velocità massima riferita alle molecole enzimatiche non pu essere
raggiunta.
Le cellule utilizzano un tipo di inibizione non competitiva per regolare l’attività di enzimi chiave
nelle vie metaboliche.

IL METABOLISMO
Il metabolismo rappresenta l’insieme delle reazioni biochimiche che avvengono in una cellula e
comprende una notevole diversità di trasformazioni molecolari. Le sequenze di reazioni sono
dette vie metaboliche. Ogni reazione è catalizzata da un enzima specifico ed il prodotto
diventa il substrato della reazione seguente. Gli enzimi che formano una vita metabolica si
trovano di solito in un distretto specifico della cellula, come i mitocondri o il citosol.
I composti che si formano ad ogni passaggio della via metabolica sono i metaboliti intermedi (o
metaboliti), che portano alla formazione del prodotto finale (amminoacidi, zuccheri ecc..). Le
vie metaboliche di una cellula si intersecano in vari punti, cosicché un composto generato da
una vita pu prendere varie direzioni a seconda dei bisogni della cellula in quel momento.

Le vie metaboliche si dividono in due grandi gruppi:


- Vie Cataboliche: che conducono alla degradazione di molecole complesse per formare
costituenti elementari. Rendono disponibile materiale di partenza da cui possono essere
sintetizzate altre molecole e forniscono l’energia necessaria per molteplici attività della
cellula. L’energia liberata dalle vie cataboliche viene immagazzinata temporaneamente in
due forme: fosfati ad alto contenuto energetico (fondamentalmente ATP) ed elettroni ad
alta energia (fondamentalmente NADPH).
- Vie Anaboliche: sintetizzano composti complessi da materiali di partenza più semplici.
Utilizzano l’energia chimica liberata dalle vie cataboliche esoergoniche.
Le macromolecole sono inizialmente scomposte (idrolizzate) nei loro costituenti (amminoacidi,
zuccheri ed acidi grassi) cosicché la cellula pu riutilizzare queste unità costitutive direttamente
per formare altre macromolecole della stessa classe, trasformarle in composti diversi per
sintetizzare altri prodotti o degradarle ulteriormente.
Le vie di demolizione delle diverse unità costitutive delle macromolecole cambiano in funzione
del particolare composto che deve essere catabolizzato. Infine, tutte queste molecole sono
trasformate in una piccola varietà di composti che possono essere metabolizzati in maniera
simile. Anche se le sostanze sono macromolecole con strutture molto diverse, vengono
comunque trasformate negli stessi metaboliti di basso peso molecolare dalle vie cataboliche.

Ossidazione e Riduzione
Le reazioni che interessano una modificazione dello stato elettronico dei reagenti sono dette
reazioni di ossido-riduzione (redox); modificazioni di questo tipo si accompagnano a guadagno o
perdita di elettroni.
La sostanza che è ossidata durante una reazione di ossidoriduzione, cioè che perde gli elettroni,
è chiamata agente riducente, mentre quella che è ridotta, cioè che guadagna elettroni è
chiamata agente ossidante.
L’ossidazione e la riduzione di substrati organici durante il metabolismo cellulare interessano
atomi di carbonio legati covalentemente ad altri atomi.

Il grado di riduzione di un composto è anche la misura della capacità di svolgere lavoro chimico
nell’ambito della cellula. Più atomi di idrogeno possono essere “strappati” dalle molecole
“combustibile”, maggiore è la quantità di ATP che alla fine pu essere formato
I
I carboidrati sono ricchi di energia chimica perché contengono ripetizioni di unità H-C-OH.

I
Gli acidi grassi contengono una maggior quantità di energia per unità di peso perché contengono
ripetizioni di unità I
H – C – H più ridotte.
I
L’energia libera prodotta dalla completa ossidazione del glucosio è molto grande. In confronto,
l’energia libera necessaria per convertire ADP in ATP è relativamente piccola.
Fino a 36 molecole di ATP sono formate dall’ossidazione di una molecola di glucosio nella
maggior parte delle cellule, e la molecola di zucchero è demolita in molti passaggi. In questi
passaggi, dove la differenza di energia libera fra reagenti e prodotti è relativamente grande,
essa è associata a reazioni che portano alla formazione di ATP.
Vi sono fondamentalmente due stadi nel catabolismo del glucosio e sono praticamente identici in
tutti gli organismi aerobi. Il primo stadio, la glicolisi, avviene nella fase solubile del citoplasma
(citosol) e porta alla formazione di piruvato. Il secondo stadio è il ciclo degli acidi tricarbossilici
(TCA), che avviene nei mitocondri delle cellule eucariotiche e nel citosol dei procarioti e infine
ossida gli atomi di carbonio ad anidride carbonica. La maggior parte dell’energia chimica del
glucosio viene accumulata sotto forma di elettroni ad alta energia, che sono rimossi quando le
molecole del substrato sono ossidate nella glicolisi e nel ciclo TCA; l’energia di questi elettroni è
infine usata per sintetizzata ATP.

GLICOLISI E FORMAZIONE ATP


La glicolisi ha inizio con l’unione dello zucchero ad un fosfato (passaggio1) a spese di una
molecola di ATP (investimento energetico). La fosforilazione attiva lo zucchero, rendendolo
idoneo a partecipare alle successive reazioni, in cui i fosfati sono rimossi e trasferiti ad altri
accettori. Il glucosio-6-fosfato si trasforma in fruttosio-6-fosfato e quindi in fruttosio-
1,6,bisfosfato a spese di una seconda molecola di ATP (passaggi 2,3).
Il bisfosfato con sei atomi di carbonio è scisso in due monofosfati con tre atomi di carbonio
(passaggio 4), che inizializza per la prima reazione esoergonica a cui si accoppia la formazione di
ATP.
L’ATP si forma fondamentalmente con due diverse modalità., entrambe illustrate da una
reazione chimica della glicolisi.
-Via indiretta: La trasformazione della gliceraldeide-3-fosfato in 3-fosfoglicerato (passaggi 6,7).
La reazione nel suo insieme è un’ossidazione di un’aldeide ad un acido carbossilico e avviene in
due passaggi catalizzati da due diversi enzimi. Il primo di questi enzimi richiede un coenzima, il
NAD (nicotinammide-adenin-dinucleotide) per catalizzare la reazione. Il NAD ha un ruolo chiave
nel metabolismo energetico, accettando e donando elettroni.
La prima reazione è un’ossido-riduzione, in cui due elettroni ed un protone sono trasferiti dalla
gliceraldeide-3-fosfato (che viene ossidata) al NAD (che viene ridotto). La forma ridotta del
coenzima è NADH. Un enzima che catalizza questo tipo di reazioni è denominato deidrogenasi
(gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi).
Il NADH formato nella reazione si dissocia dall’enzima e viene sostituito dal NAD+.
Quindi la via indiretta per la formazione di ATP coinvolge NADH e una catena di trasporto degli
elettroni.
-Via diretta: nel secondo passaggio della trasformazione della gliceraldeide-3-fosfato in
3fosfoglicerato, un gruppo fosfato viene trasferito dall’1,3-bisfosfoglicerato all’ADP per formare
una molecola di ATP; la reazione è catalizzata dall’enzima fosfoglicerato chinasi.
Questa via diretta di formazione dell’ATP è una fosforilazione a livello del substrato, perché si
realizza con lo spostamento di un gruppo fosfato da uno dei substrati (in questo caso
1,3bisfosfoglicerato) all’ADP.

Le rimanenti reazioni della glicolisi (passaggi 8-10), che includono una seconda fosforilazione di
ADP a livello di substrato (passaggio 10).
La fosforilazione a livello del substrato dell’ADP illustra un aspetto importante dell’ATP, la cui
formazione non è quella endoergonica. L’ATP non è una molecola così energetica da non poter
essere prontamente sintetizzata da reazioni metaboliche. Un donatore più alto della scala pu
essere usato per fosforilare qualsiasi molecola situata più in basso nella scala.
Questo concetto di potenziale di trasferimento utile per paragonare qualsiasi serie di donatori e
accettori indipendentemente dal gruppo trasferito. Quelle molecole situate più in alto nella
scala (cioè con maggiore energia libera) sono molecole con minore affinità per il gruppo da
trasferire rispetto a quelle situate più in basso nella scala. Minore affinità, miglior donatore;
maggiore affinità, miglior accettore.

Una caratteristica importante della glicolisi è quella di generare un limitato numero di molecole
di ATP in assenza di ossigeno. Ne la fosforilazione a livello di substrato dell’ADP da parte
dell’1,3-bisfosfoglicerato né quella successiva da parte del fosfoenolpiruvato (reazione 10)
richiedono ossigeno molecolare.
La glicolisi pu essere considerata come una via anaerobica, infatti continua a produrre ATP in
assenza di ossigeno molecolare; due molecole di ATP sono prodotte per fosforilazione a livello
del substrato, per ogni molecola di gliceraldeide-3-fosfato ossidata a piruvato.

Dato che ogni molecola di glucosio produce due molecole di gliceraldeide-3-fosfato, si formano
quattro molecole di ATP per molecola di glucosio ossidata a piruvato.
D’altronde, due molecole di ATP per molecola di glucosio devono essere idrolizzate per
innescare la glicolisi, lasciando per la cellula un guadagno netto di due molecole di ATP per ogni
molecola di glucosio ossidata.

Glucosio + 2ADP + 2Pi + 2NAD+  2 piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O

Il piruvato, prodotto finale della glicolisi, è un composto chiave, perché si trova all’incrocio fra
via anaerobica (indipendente dall’ossigeno) e via aerobica (dipendente dall’ossigeno). In assenza
di ossigeno molecolare, il piruvato è coinvolto nella fermentazione. Quando l’ossigeno è
disponibile, il piruvato è ulteriormente catabolizzato nella respirazione aerobica.

FERMENTAZIONE:
Poiché le reazioni glicolitiche si verificano rapidamente, una cellula è in grado di produrre una
quantità significativa di ATP con questa via metabolica. Infatti una vasta quantità di cellule usa
la glicolisi per formare ATP.
Uno dei prodotti dell’ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato è NADH. La formazione del NADH
avviene a spese del NAD+, che si trova in piccole quantità nelle cellule, poiché è un reagente
richiesto in questo importante passaggio.
Le cellule sono capaci di rigenerare NAD+ con la fermentazione, il trasferimento di elettroni da
NADH a piruvato, prodotto finale della glicolisi, oppure ad un composto derivato dal piruvato.
La fermentazione ha luogo nel citosol di una cellula eucariotica. Per la maggior parte degli
organismi dipendenti da O2, la fermentazione è un mezzo alternativo per rigenerare NAD+
quando i livelli di O2 sono bassi, cosicchè la glicolisi pu continuare e mantenere la produzione
di ATP.
Il prodotto della fermentazione varia fra diversi tipi di cellula o fra diversi organismi (ad esempio
quando le cellule muscolari sono soggette a contrazioni ripetute, il livello di ossigeno è basso e
non sufficiente, così le cellule del muscolo rigenerano NAD+ convertendo il piruvato in lattato).
La fermentazione l’unica risorsa di energia metabolica in alcuni anaerobi. L’energia ottenuta
solamente della glicolisi è scarsa, se paragonata alla ossidazione completa del glucosio in
anidride carbonica e acqua.
Solo 2 molecole di ATP vengono formate dall’ossidazione del glucosio per glicolisi e
fermentazione; oltre il 90% dell’energia risiede nel prodotto della fermentazione.

Potere riducente:
L’energia usata per sintetizzare molecole biologiche complesse, come proteine, grassi e acidi
nucleici, deriva in gran parte dall’ATP generato dalla glicolisi e dalla catena di trasporto
degli elettroni. La sintesi di molti di questi composti, in particolare grassi ed altri lipidi,
richiede la riduzione di metaboliti, che avviene per trasferimento di elettroni con elevata
energia dal NADPH, strutturalmente simile al NADH ma contenente un ulteriore gruppo
fosfato. 
La riserva di NADPH di una cellula rappresenta il suo potere riducente, che è
un’importante misura del contenuto di energia utilizzabile dalla cellula.
Il NADP, forma ossidata del NADPH viene generato dal NAD+ con la reazione:
NAD+ + ATP  NADP+ + ADP

NADPH si pu allora formare per riduzione del NADP+. NADPH è un composto ad alta energia per
il suo alto potenziale di trasferimento degli elettroni.
Gli enzimi che hanno un ruolo riduttivo nelle vie anaboliche possiedono il NADPH come loro
coenzima, mentre quelli che funzionano come deidrogenasi nelle vie cataboliche hanno come
coenzima NAD+.
Un coenzima pu ridurre l’altro nella seguente reazione, catalizzata dall’enzima transidrogenasi

NADH + NADP+  NAD+ + NADPH

Quando l’energia è abbondante, la produzione di NADPH è favorita, fornendo una scorta di


elettroni necessari per la biosintesi di nuove macromolecole. Quando le risorse energetiche sono
scarse, la maggior parte degli elettroni ad alta energia del NADH è utilizzata per l’ATP e viene
prodotto NADPH in quantità appena sufficiente per far fronte alle richieste biosintetiche minime
della cellula.

Regolazione metabolica
La quantità di ATP presente nella cellula ad ogni istante è sorprendemente piccola. Con una
quantità così limitata è evidente che l’ATP non pu essere la molecola in cui viene depositata la
quantità maggiore di energia libera, le riserve energetiche della cellula sono invece
immagazzinate come polisaccaridi e grassi.
Quando i livelli di ATP diminuiscono, si attivano reazioni per incrementare la formazione di ATP
a spese delle riserve di energia. Similmente quando i livelli di ATP sono alti, sono inibite le
reazioni che di norma portano alla sua produzione.
Le cellule regolano queste importanti reazioni che liberano energia controllando alcuni enzimi
chiave in numerose vie metaboliche.
L’attività di un enzima pu essere modificata, se il suo sito attivo pu essere alterato. I due
meccanismi più comuni per alterare la struttura di un sito attivo dell’enzima sono la
modificazione covalente e la modulazione allosterica; entrambi hanno ruoli chiave nel regolare
l’ossidazione del glucosio.
-Alterazione dell’attività enzimatica per modificazione covalente: una modificazione covalente
degli enzimi come l’aggiunta o rimozione di fosfati, è un meccanismo generale per variare
l’attività. Gli enzimi che trasferiscono gruppi fosfato da altre proteine sono chiamati
proteinchinasi e regolano diverse attività, quali l’azione ormonale, la divisone cellulare e
l’espressione genica.
Vi sono due tipi diversi di protein-chinasi: una aggiunge gruppi fosfato a residui tirosinici
specifici in un substrato proteico, l’altro aggiunge fosfat a residui specifici di serina o treomina
del substrato.
-Modulazione allosterica dell’attività enzimatica: è un meccanismo per il quale l’attività di un
enzima è inibita o stimolata da un composto che si lega ad un sito, chiamato sito allosterico, che
è spazialmente distinto dal sito attivo dell’enzima. Il legame di un composto al sito allosterico
produce modificazioni conformazionali nella proteina che provocano l’alterazione della forma
del sito attivo. La funzione del particolare enzima e del particolare modulatore allosterico, il
cambiamento della conformazione del sito attivo pu stimolare o inibire la sua capacità di
catalizzare la reazione. La modulazione allosterica evidenzia lo stretto rapporto fra la struttura
molecolare e la funzione: minime modificazioni indotte dal modulatore allosterico nella
struttura dell’enzima ossono causare notevoli cambiamenti della sua attività.
Uno dei principali meccanismi utilizzati dalle cellule per interrompere le vie anaboliche di
montaggio è un tipo di modulazione allosterica detta inibizione a feedback, in cui l’enzima che
catalizza il primo passaggio di una via metabolica viene temporaneamente inattivato quando la
concentrazione del prodotto finale di quella via raggiunge un certo livello.

La separazione delle vie cataboliche da quelle anaboliche


La maggior parte delle cellule è capace di sintetizzare glucosio dal piruvato ed allo stesso tempo
ossida il glucosio come principale risorsa di energia chimica. Sebbene gli enzimi possano
catalizzare una reazione nei due sensi, le reazioni della gluconogenesi non possono procedere
semplicemente per inversione delle reazioni di glicolisi. La via glicolitica contiene tre reazioni
termodinamicamente irreversibili.
Se tutte le reazioni della glicolisi fossero reversibili, le due vie non potrebbero essere controllate
nella cellula indipendentemente l’una dall’altra quindi la cellula non potrebbe arrestare la
sintesi del glucosio e attivare la sua demolizione.
Se si confronta la via in cui il glucosio è degradato con la via in cui il glucosio è sintetizzato, si
nota che alcune reazioni sono identiche, sebbene vadano in direzioni opposte, mentre altre sono
molto diverse. Usando enzimi differenti per catalizzare diverse reazioni chiave nelle due vie
opposte, una cellula risolve il problema termodinamico e quello di controllo, ambedue connessi
alla capacità di sintetizzare e degradare la stessa molecola.
Tutto ci si chiarisce studiando più attentamente gli enzimi chiave:
- la fosfofruttochinasi, un enzima della glicolisi, catalizza la reazione:
Fruttosio-6-fosfato + ATP Fruttosio-1,6-bisfosfato + ADP
- Il fruttosio-1,6-bisfosfatasi, è un enzima della gluconeogenesi, che porta alla formazione di
fruttosio-6-fosfato con una semplice idrolisi
Fruttosio-1,6-bisfosfato + H2O Fruttosio-6-fosfato + Pi
I particolari enzimi della glicolisi e della gluconeogenesi sopra descrittisono enzimi chiave nelle
loro rispettive vie metaboliche. Questi enzimi sono regolati in parte da AMP ed ATP.
La concentrazione di AMP entro le cellule è inversamente correlata alla concentrazione di ATP:
quando i livelli di ATP sono bassi, quelli di AMP sono alti e viceversa. Concentrazioni elevate d
AMP segnalano ad una cellula che le sue riserve di ATP scarseggiano. L’ATP inoltre è anche un
inibitore allosterico, mentre l’AMP è un attivatore allosterico. Quando i livelli di ATP sono alti,
l’attività dell’enzima diminuisce e non si forma per glicolisi nessun’altra molecola di ATP;
quando i livelli di ADP e AMP sono alti rispetto a quelli di ATP, aumenta l’attività dell’enzima
per favorire la sintesi di ATP.
Al contrario, l’attività della fruttosio-1,6-bisfosfatasi, un enzima chiave della gluconeogenesi, è
inibita da elevati livelli di AMP.
L’AMPK controlla l’attività di altri enzimi aggiungendo gruppi fosfato a specifici residui di serina
o di treonina presenti nella loro struttura. L’AMPK è regolata allostericamente dall’AMP. Quando
la concentrazione di AMP aumenta, l’AMPK è attivata, e pu così fosforilare ed inibire enzimi
chiave coinvolti nelle vie anaboliche e, allo stesso tempo, fosforilare ed attivare enzimi chiave
dei processi catabolici. Il risultato ultimo dell’attivazione dellAMPK è una riduzione dell’attività
delle vie che consumano ATP ed un incremento dell’attività che producono ATP, il che
determina un innalzamento della concentrazione di ATP all’interno della cellula .
L’AMPK partecipa anche alla regolazione del bilancio energetico a livello dell’intero organismo.
Un calo dei livelli ematici di glucosio, ad esempio, agisce sull’ipotalamo stimolando il senso di
appetito; tale stimolazione sembra essere mediata dall’attivazione dell’AMPK nelle cellule
nervose ipotalamiche.
A causa del suo ruolo come termostato di energia, l’AMPK è diventata un bersaglio primario per
lo sviluppo di farmaci per il trattamento dell’obesità e del diabete.

LA MEMBRANA CELLULARE
Le cellule sono separate dall’ambiente esterno da una sottile e fragile struttura, detta
membrana plasmatica, il cui spessore è di soli 5-10nm. La membrana non è visibile al
microscopio ottico a causa della sua sottigliezza. Queste membrane cellulare, sono costituite da
un doppio strato lipidico.

Funzioni della membrana:


1-Compartimentazione: le membrane formano superfici continue e quindi delimitano dei
compartimenti chiusi. La membrana plasmatica racchiude il contenuto dell’intera cellula,
mentre le membrane dell’involucro nucleare e quelle citoplasmatiche delimitano differenti spazi
intracellulari. La compartimentazione mantenuta dalle membrane permette che attività
specializzate possano svolgersi senza interferenze esterne e che le attività cellulari possano
essere regolate indipendentemente le une dalle altre
2-Supporto fisico per attività biochimiche: Oltre a delimitare dei compartimenti, costituiscono
esse stesse un compartimento distinto. Grazie alla loro struttura, le membrane forniscono alla
cellula un’ampia impalcatura, all’interno della quale i vari componenti possono essere ordinati
per interagire in modo efficace.
3-Barriera con permeabilità selettiva: Le membrane impediscono il libero scambio di molecole
da un versante all’altro ma, allo stesso tempo, forniscono un mezzo di comunicazione tra i
compartimenti che separano. Favoriscono il movimento di elementi selezionati all’interno e
all’esterno dello spazio vivente che circoscrivono.
4-Trasporto di soluti: La membrana plasmatica contiene i “meccanismi” necessari per il
trasporto fisico di sostanze da un suo versante all’altro, spesso da una regione con bassa
concentrazione di soluto verso una in cui il soluto è molto più concentrato. Questi meccanismi
consentono alla cellula di accumulare sostanze come zuccheri e amminoacidi, necessarie per il
metabolismo. La membrana plasmatica è anche in grado di trasportare ioni specifici, stabilendo
quindi, gradienti ionici tra i due versanti, citoplasmatico ed extracellulare. Questa capacità è
fondamentale per le cellule nervose e muscolari.
5-Risposta a segnali esterni: La membrana plasmatica svolge un ruolo fondamentale nella
risposta di una cellula agli stimoli esterni, un processo noto come trasduzione del segnale. Le
membrane contengono dei recettori che si combinano con molecole specifiche (ligandi) con
struttura complementare. Tipi differenti di cellule possiedono membrane con tipi differenti di
recettori e, pertanto sono capaci di riconoscere e rispondere a ligandi diversi. L’interazione di
un recettore della membrana plasmatica con un ligando extracellulare pu determinare la
generazione di un nuovo segnale intracellulare da parte della membrana, che stimola o inibisce
le attività interne. Ad esempio segnali generati a livello della membrana plasmatica possono
indurre una cellula a sintetizzare una maggiore quantità di glicogeno, a prepararsi alla divisione
cellulare, a innescare il suicidio programmato (apoptosi) ecc..
6-Interazioni intercellulari: La membrana plasmatica degli organismi pluricellulari media le
interazioni fra una cellula e le sue vicine. Permette alle cellule di riconoscersi fra loro, di
aderire quando è il caso di scambiarsi materiali ed informazioni.
7-Trasferimento di energia: Le membrane sono strettamente coinvolte nei processi attraverso i
quali una forma di energia viene convertita in una forma diversa (trasferimento di energia). Le
membrane sono, inoltre, implicate nel trasferimento dell’energia chimica dai carboidrati e dai
grassi all’ATP. Negli eucarioti, l’apparato per queste conversioni di energia è localizzato a livello
delle membrane dei cloroplasti e dei mitocondri.
Storia della membrana:
Gorter e Grendel conclusero che la membrana plasmatica contenesse uno strato biomolecolare
di lipidi cioè un doppio strato lipidico.
Modello a mosaico fluido: è il dogma fondamentale della biologia delle membrane. Il doppio
strato lipidico rimane il nucleo centrale della membrana, ma l’attenzione è puntata sullo stato
fisico dei lipidi. Il doppio strato di una membrana a mosaico fluido è presente in una condizione
fluida e le singole molecole lipidiche possono muoversi lateralmente all’interno del piano della
membrana. Nel modello a mosaico fluido, la struttura e la disposizione delle proteine di
membrane differiscono da quelle ipotizzate nei modelli proposti in precedenza, in quanto in
questo modello le proteine sono disposte in un mosaico discontinuo di particelle ce penetrano
nel foglietto lipidico. Il modello a mosaico fluido considera le membrane cellulari come strutture
dinamiche le cui componenti sono mobili e capaci di entrare in contatto per partecipare a vari
tipi di interazioni transitorie o semipermanenti.

Composizione chimica delle membrane


Tutte le membrane sono associazioni lipo-proteiche nelle quali i componenti sono tenuti insieme
in uno strato sottile da legami non covalenti. La parte centrale della membrana consiste in un
foglietto lipidico organizzato in un doppio strato. Il doppio strato lipidico funge principalmente
da scheletro strutturale della membrana e costituisce la barriera che impedisce i movimenti
casuali delle molecole idrosolubili verso l’interno o l’esterno della cellula.
Le proteine di membrana svolgono invece la maggior parte delle funzioni specifiche. Il
rapporto fra lipidi e proteine in una membrana varia ampiamente a seconda del tipo di
membrana cellulare, del tipo di organismo e del tipo di cellula. Le differenze di rapporto tra
una membrana e l’altra possono essere messe in relazione con le particolari funzioni delle
singole membrane.
Le membrane contengono inoltre carboidrati, legati ai lipidi ed alle proteine.

Lipidi di membrana
Le membrane contengono un’ampia varietà di lipidi, tutti anfipatici, cioè contengono regioni
idrofile e regioni idrofobiche. Esistono 3 tipi principali: fosfogliceridi, sfingolipidi ed il
colesterolo.
- Fosfogliceridi: sono la maggior parte dei lipidi presenti nelle membrane; contengono un
gruppo fosfato. Dato che la maggior parte dei fosfolipidi di membrana è sintetizzata a
partire da uno scheletro di glicerolo, essi vengono detti fosfogliceridi. I fosfogliceridi delle
membrane hanno legato al gruppo fosfato un gruppo aggiunto, rappresentato principalmente
da colina (formando fosfatidilcolina), etanolammina (fosfatidiletanolammina , PE), serina
(fosfatilserina, PS) o inositolo (fosfatidilinositolo, PI). Ognuno di questi gruppi è idrofilo e di
ridotte dimensioni e, insieme al gruppo fosfato, forma una regione fortemente idrosolubile
posta ad un estremo della molecola, chiamata testa.
Le catene di acidi grassi sono invece idrocarburiche non ramificate, idrofobiche,
approssimativamente lunghe da 16 a 22 atomi di carbonio. Gli acidi grassi delle membrane
possono essere saturi, monoinsaturi (un doppio legame) o polinsaturi (più di un doppio
legame). I fosfogliceridi spesso contengono una catena di acido grasso
insaturo e una di acido grasso saturo. Con delle catene di acidi grassi ad una estremità della
molecola e una testa polare all’altra, tutti i fosfogliceridi mostrano proprietà decisamente
anfipatiche.
- Sfingolipidi: meno abbondanti; sono formati da sfingosina legata ad un acido grasso mediante
il suo gruppo amminico. Questa molecola è una ceramide. I diversi lipidi formati dalla
sfingosina possiedono altri gruppi esterificati al gruppo alcolico terminale della sfingosina. Se
il gruppo esterificato è un carboidrato, la molecola è detta glicolipide. Se il carboidrato
sostituente è uno zucchero semplice il glicolipide detto cerebroside mentre se è un
oligosaccaride è detto ganglioside. Tutti gli sfingolipidi hanno lunghe
catene idrocarburiche idrofobiche ad una estremità della molecola ed una regione
idrofilica all’altra, anch’essi sono anfipatici e abbastanza simili strutturalmente ai
fosfogliceridi.
Il sistema nervoso è particolarmente ricco di glicolipidi e giocano anche un ruolo
importante in alcune malattie infettive.
- Colesterolo: è un lipide non presente in tutte le membrane. Manca nelle membrane
plasmatiche. Le molecole di colesterolo sono orientate con il loro piccolo gruppo idrofilo
verso la superficie della membrana e la loro coda idrofoba inclusa nel doppio stato lipidico.
Gli anelli idrofobici di una molecola di colesterolo sono piani e rigidi, ed interferiscono con i
movimenti delle code di acidi grassi dei fosfolipidi.

Ogni tipo di membrana cellulare ha la sua composizione lipidica caratteristica, differente da ogni
altra per il tipo di lipidi, per la natura dei gruppi della testa polare e per i tipi particolari di
catene di acidi grassi.
La composizione lipidica pu determinare lo stato fisico di una membrana ed influenzare
l’attività di specifiche proteine di membrana. I lipidi di membrana costituiscono, inoltre, i
precursori di messaggeri chimici molto attivi che regolano le funzioni cellulari. La
presenza di un doppio foglietto di molecole lipidiche anfipatiche nelle membrane ha
conseguenze di notevole importanza sulla struttura e sulle funzioni della cellula.
Le catene idrocarburiche del doppio strato lipidico non sono mai esposte all’ambiente acquoso
circostante. Di conseguenza, le membrane non hanno mai un margine libero; sono sempre
strutture continue, ininterrotte. Ne risulta che le membrane formano un sistema continuo e
interconnesso che si ramifica all’interno della cellula. Grazie alla flessibilità del doppio strato
lipidico, le membrane sono deformabili e la loro forma generale pu cambiare quando è
necessario. Si pensa che il doppio strato lipidico faciliti la fusione o la gemmazione delle
membrane.
Il doppio strato lipidico è anche importante nel mantenere l’appropriata composizione interna di
una cellula nel separare le cariche elettriche tra i due versanti della membrana plasmatica.
Un’altra importante caratteristica del doppio strato lipidico è la sua capacità di autoassemblarsi;
le molecole fosfolipidiche si assemblano spontaneamente a formare le pareti di vescicole
sferiche riempite di liquido, dette liposomi. Le pareti dei liposomi sono costituite da un doppio
strato lipidico organizzato allo stesso modo del doppio strato lipidico di una membrana naturale.
I liposomi sono utilizzati come sistema di trasporto per veicolare all’interno del corpo molecole
di DNA o di farmaci, in quanto possono essere legati alla parete del liposoma, oppure inseriti ad
alta concentrazione nel lume dello stesso.
Il doppio strato lipidico è formato da due foglietti distinti che possiedono una composizione
lipidica caratteristica e differente, questo perché gli enzimi in grado di digerire i lipidi non
possono attraversare la membrana plasmatica e, di conseguenza, possono solamente digerire i
lipidi presenti nel foglietto esterno del doppio strato.
Rispetto al foglietto interno, quello esterno possiede una concentrazione relativamente
maggiore di PC (e sfingomielina) ed una bassa concentrazione di PE e PS. Possiamo quindi
pensare il doppio strato lipidico come costituito da due monostrati indipendenti, più o meno
stabili, che possiedono proprietà chimiche e fisiche differenti. Le diverse classi dei lipidi
mostrano caratteristiche differenti.
Tutti i glicolipidi della membrana plasmatica sono localizzati nel foglietto esterno, dove spesso
svolgono la funzione di recettori per ligandi extracellulari.
La fosfatidiletanolammina, più abbondante nel foglietto interno, tende a favorire la curvatura
della membrana, una proprietà importante nei processi di gemmazione e fusione della
membrana.
La fosfatidilserina, anch’essa più concentrata nel foglietto interno, possiede una carica netta
negativa a pH fisiologico, che la rende adatta a legare le cariche positive dei residui di lisina e
arginina.
Il fosfatidilinositolo, concentrato nel foglietto interno della membrana, gioca un ruolo
importante nel trasferimento degli stimoli dalla membrana plasmatica all’interno del
citoplasma.

Carboidrati di membrana
Nella membrana plasmatica delle cellule eucariotiche si trovano anche i carboidrati. Più del 90%
dei carboidrati di membrana è legato con legami covalenti alle proteine a formare glicoproteine,
i carboidrati rimanenti sono legati ai lipidi con legami covalenti a formare dei glicolipidi. Tutti i
carboidrati della membrana plasmatica sono rivolti verso l’ambiente extracellulare. Anche i
carboidrati delle membrane cellulari interne sono affacciati sul versante della membrana
opposto al citosol.
L’aggiunta di carboidrati, o glicosilazione, è la più complessa modificazione delle proteine.
Nelle glicoproteine, la componente glucidica è presente in forma di brevi oligosaccaridi
ramificati idrofili. Diversamente dai carboidrati ad elevato peso molecolare gli oligosaccaridi
legati alle proteine e ai lipidi di membrana possono avere una struttura e una composizione
molto varia.
Questi carboidrati che sporgono dalla membrana svolgono un’importante funzione nel mediare le
interazioni di una cellula con il suo ambiente e nello smistamento delle proteine di membrana ai
diversi comportamenti cellulari.
I carboidrati dei glicolipidi della membrana plasmatica degli eritrociti, determinano se il tipo di
sangue di un individuo è A, B, AB o 0.

Proteine di membrana: struttura e funzioni


Ogni proteina di membrana è orientata in una posizione ben definita rispetto al citoplasma,
pertanto le proprietà di una delle due superfici della membrana sono nettamente diverse da
quelle dell’altra. Questa asimmetria di membrana pu essere definita come “lateralità” di
membrana.
Le proteine di membrana possono essere suddivise in tre classi in base al loro rapporto con il
doppio strato lipidico:
1) Proteine Integrali: penetrano nel doppio strato lipidico; sono infatti dette proteine
transmembrana ed hanno perci domini che sporgono sia dal lato extracellulare, sia da
quello citoplasmatico della membrana.
2) Proteine Periferiche: situate completamente all’esterno del doppio strato lipidico, o sulla
superficie extracellulare o su quella citoplasmatica. Queste proteine si legano alla
superficie della membrana mediante legami non covalenti.
3) Proteine ancorate ai Lipidi: si localizzano all’esterno del doppio strato lipidico, sul
versante extracellulare o su quello citoplasmatico, ma sono legate covalentemente a una
molecola lipidica situata nel doppio strato.

Proteine integrali di membrana


Sono anfipatiche come i fosfolipidi del doppio strato, ed hanno porzioni idrofiliche, sia porzioni
idrofobiche.
Le porzioni di una proteina integrale di membrana che si trovano all’interno del doppio strato
lipidico hanno tendenzialmente un carattere idrofobico. I residui amminoacidi di questi domini
transmembrana formano interazoni di Van der Waals con le catene di acidi grassi del doppio
strato, fissando la proteina nella parte lipidica della membrana. Così si conserva
l’impermeabilità della membrana e la proteina è mantenuta in contatto diretto con le
circostanti molecole lipidiche.
Alcune grandi famiglie di proteine integrali di membrana presentano un canale interno che
forma un passaggio idrofilo attraverso il doppio strato lipidico. Il rivestimento interno di questi
canali contiene in genere residui idrofili localizzati in punti strategici ed essenziali.
Le proteine integrali possono muoversi lateralmente all’interno della membrana.
La sequenza amminoacidica di una proteina pu essere rapidamente dedotta dalla sequenza
nucleotidica di un gene isolato. Questi segmenti proteici inseriti nella membrana, solitamente
chiamati domini transmembrana, possiedono una struttura semplice e sono costituiti da una
catena di circa 20 amminoacidi, prevalentemente apolari che attraversano il cuore del doppio
strato lipidico formando una α-elica.
Conoscendo la sequenza amminoacidica di una proteina integrale di membrana, è solitamente
possibile identificarne i segmenti transmembrana attraverso un grafico di idrofobicità. Questo
approccio fornisce una media dell’idrofobicità di una piccola porzione del polipeptide e
garantisce che uno o pochi amminoacidi polari nella sequenza non alternino il profilo dell’intera
porzione polipeptidica.
Non tutte le proteine integrali di membrana contengono α-eliche transmembrana. Alcune
contengono un canale relativamente grande localizzato all’interno di un anello di foglietti, che
attraversano la membrana e che sono organizzati a formare un cilindro (o barile). Solamente
nelle membrane esterne dei batteri, dei mitocondri e dei cloroplasti.
Proteine periferiche di membrana
Sono associate alla membrana mediante legami elettrostatici deboli. Di solito possono essere
solubilizzate estraendole con soluzioni ad elevata concentrazione salina, che indeboliscono le
interazioni elettrostatiche che permettono alle proteine periferiche di rimanere ancorate alla
membrana. La distinzione fra proteine integrali e periferiche è sottile, perché molte proteine di
membrana sono formate da diversi polipeptidi, alcuni dei quali penetrano nel doppio strato
lipidico mentre altri rimangono in posizione periferica.
Sulla faccia interna (citosolica) della membrana formano una rete fibrillare che agisce come uno
“scheletro” di membrana. Queste proteine forniscono un supporto meccanico alla membrana e
siti di ancoraggio per le proteine integrali di membrana.
Le proteine periferiche hanno normalmente una relazione chimica con la membrana, dato che
possono essere reclutate in membrana o liberate da essa a seconda delle condizioni prevalenti.

Proteine di membrana ancorate ai lipidi


Si distinguono diversi tipi di proteine di membrana ancorate ai lipidi. Molte proteine di
membrana presenti sulla superficie esterna della membrana plasmatica si legano alla membrana
tramite un corto e complesso oligosaccaride legato ad una molecola di fosfatidilinositolo,
inserito nel foglietto interno del doppio strato lipidico. Proteine di membrana periferiche che
presentano questo legame glicosil-fosfatidilinositolo (GPI) sono chiamate proteine ancorate al
GPI.
Una deficienza nella sintesi del GPI rende i globuli rossi suscettibili a lisi (pu provocare un tipo
di anemia, l’emoglobinuria parossitica notturna).
Un altro gruppo di proteine presenti sul versante citosolico della membrana plasmatica è
ancorato alla membrana da lunghe catene idrocarburiche incluse nel foglietto interno del doppio
strato lipidico.

Si è dimostrato che almeno 2 proteine che sono associate alla membrana plasmatica in questo
modo (Src e Ras) sono coinvolte nella trasformazione di una cellula normale in una tumorale.

LIPIDI E FLUIDITA’ DELLA MEMBRANA


Lo stato fisico dei lipidi di una membrana si pu descrivere in base alla loro fluidità (o viscosità)
Fluidità: misura della facilità di scorrimento
Viscosità: misura della resistenza allo scorrimento
Se la temperatura del doppio strato è mantenuta relativamente calda (circa 37°), i lipidi sono in
uno stato relativamente fluido e nel doppio strato lipidico, le molecole conservano un
orientamento specifico;
Gli assi maggiori delle molecole rimangono sostanzialmente paralleli, ma i singoli fosfolipidi sono
capaci di ruotare intorno al loro asse e di muoversi lateralmente nel piano del doppio strato. Se
la temperatura si abbassa lentamente, si raggiunge un punto in cui si verifica un netto
cambiamento nella natura del doppio strato. I lipidi, dal loro normale stato cristallino liquido, si
trasformano in un gel cristallino congelato nel quale il movimento delle catene di acidi grassi dei
fosfolipidi è molto limitato.
La temperatura al quale si verifica questo cambiamento è detta temperatura di transizione, e
dipende dalla capacità delle molecole lipidiche di addensarsi fra loro, capacità che a sua volta,
dipende dal tipo di lipidi da cui è formato il doppio strato. Di conseguenza, i fosfolipidi con
catene sature possono disporsi affiancati e addensati fra loro in modo molto più stretto di
quanto possano fare quelli che contengono catene insature. Quanto maggiore è il grado di
insaturazione degli acidi grassi del doppio strato, tanto più bassa sarà la temperatura necessaria
per far gelificare il doppio strato.
Un altro fattore che influenza la fluidità delle membrane è la lunghezza delle catene di acidi
grassi: più queste sono corte, più bassa sarà la loro temperatura di fusione. Lo stato fisico di una
membrana è influenzato anche dalla presenza di colesterolo; a causa del loro orientamento
all’interno del doppio strato, le molecole di colesterolo rompono lo stretto impaccamento delle
catene di acidi grassi ed interferiscono con la loro mobilità. La presenza di colesterolo tende a
ridurre le temperature di transizione nette e crea una condizione di fluidità intermedia. Il
colesterolo tende ad aumentare la stabilità e a diminuire la permeabilità della membrana.
L’importanza e il mantenimento della fluidità della membrana
La fluidità della membrana fornisce un perfetto compromesso fra una struttura rigida e ordinata,
in cui la mobilità sarebbe assente, ed un liquido non viscoso completamente fluido, in cui i
componenti della membrana non potrebbero essere orientati e l’organizzazione strutturale ed il
supporto meccanico sarebbero assenti.
Inoltre consente che avvengano interazioni all’interno di essa: per esempio, rende possibile
l’assemblaggio di gruppi di proteine di membrana in punti particolari nella membrana stessa, per
formare strutture specializzate (giunzioni intercellulari ecc..).
Grazie alla fluidità della membrana, le molecole che interagiscono tra loro possono avvicinarsi,
dar luogo alle reazioni necessarie e separarsi.
Inoltre gioca un ruolo fondamentale nell’assemblaggio della membrana stessa.
Le membrane che originano solo da membrane preesistenti ed il loro accrescimento avviene
mediante l’inserimento di lipidi e proteine nella matrice fluida del foglietto membranoso. Molti
dei processi cellulari fondamentali (es: movimento, accrescimento, divisione) dipendono dal
movimento dei componenti della membrana e probabilmente non sarebbero possibili se le
membrane fossero strutture rigide e non fluide.

La temperatura interna della maggior parte degli organismi oscilla con il variare della
temperatura dell’ambiente esterno. Dato che per molte attività è necessario che le membrane
di una cellula rimangano allo stato fluido, le cellule rispondono ai cambiamenti di condizioni
modificando il tipo di fosfolipidi di cui sono costituite le membrane. Il mantenimento della
fluidità della membrana è un esempio di omeostasi cellulare.
La risposta iniziale di emergenza è mediata da enzimi che sono in grado di rimodellare le
membrane, rendendo le cellule più resistenti al freddo. Il rimodellamento è ottenuto
1.Desaturando i legami semplici nelle catene degli acidi grassi, per dar luogo alla formazione di
doppi legami. La desaturazione è catalizzata da enzimi chiamati desaturasi.
2.Rimescolando le catene tra molecole fosfolipidiche differenti per formare fosfolipidi con 2
acidi grassi insaturi, i quali abbassano di molto la temperatura di fusione del doppio strato. Il
rimescolamento è compiuto da enzimi chiamati fosfolipasi, che staccano l’acido grasso dalla
struttura portante di gliceroo, e dall’enzima aciltransferasi, che lo trasferiscono ad un altro
fosfolipide.
Come risultato dell’attività di questi diversi enzimi, le proprietà fisiche delle membrane di una
cellula vengono adattate alle condizioni ambientali correnti.
La cellula inoltre cambia i tipi di fosfolipidi che sintetizza, favorendo quelli che contengono una
maggiore quantità di acidi grassi insaturi.

Zattere (raft) lipidiche


Vedi becker x integrare
Sono placche costituite da colesterolo e sfingolipidi. Si pensa possano fungere da piattaforme
galleggianti che concentrano specifiche proteine, organizzando in tal modo la membrana in
compartimenti funzionali. Per esempio, si ritiene che le zattere lipidiche forniscano un ambiente
locale favorevole che faciliti l’interazione tra i recettori di superficie cellulare con altre
proteine di membrana nel processo di trasmissione di segnali dallo spazio extracellulare verso
l’interno della cellula.

La natura dinamica della membrana plasmatica


Come già detto il doppio strato lipidico è in uno stato relativamente fluido. Quindi, un
fosfolipide si pu spostare lateralmente all’interno di un foglietto con grande facilità (un
fosfolipide pu diffondere da un estremo all’altro di una cellula batterica in 1-2 secondi,
diversamente ore o giorni affinché una molecola di fosfolipide si sposti da un foglietto all’altro).
Di tutti i movimenti che un fosfolipide pu effettuare, il suo flip-flop verso l’altro versante della
membrana è il più limitato, in quanto è necessario che la testa idrofilica del lipide passi
attraverso la regione idrofobica del foglietto interno della membrana, passaggio svantaggioso
termodinamicamente.
Per questo le cellule contengono degli enzimi che intervengono nello spostare attivamente certi
fosfolipidi da un foglietto all’altro. Questi enzimi giocano un ruolo nel determinare quindi
l’asimmetria dei lipidi e possono inoltre, invertire la bassa velocità di movimento
transmembrana passivo.
Visto che i lipidi costituiscono la matrice entro la quale sono inserite le proteine integrali di
membrana, lo stato fisico dei lipidi è un fattore fondamentale per definire la mobilità delle
proteine integrali.

Fusione cellulare
La fusione cellulare è una tecnica mediante la quale è possibile unire due tipi diversi di cellule,
oppure cellule di due specie diverse, per formare una singola cellula con un citoplasma comune
ed un’unica membrana plasmatica continua. Le cellule sono indotte a fondersi l’una con l’altra
rendendo la loro superficie esterna “appiccicosa”, in modo che le loro membrane plasmatiche
aderiscano l’una all’altra.
Si possono indurre le cellule a fondersi in diversi modi.

Mobilità delle proteine:


Le proteine sono molecole enormi e per questo il loro movimento all’interno del doppio strato
lipidico è limitato.
-Alcune proteine di membrana si muovono casualmente attraverso tutta la membrana, sebbene
generalmente ad una velocità molto minore rispetto a quella che si osserverebbe in un doppio
strato lipidico artificiale
-Alcune proteine di membrana non riescono a muoversi e sono considerate immobili -In
alcuni casi, si trova che una proteina si muove in maniera altamente direzionale (non
casualmente) versa l’una o l’altra parte della cellula
-Nella maggior parte degli esperimenti, si è osservato che la maggioranza delle specie proteiche
evidenzia un movimento casuale (browniano) all’interno della membrana con velocità
paragonabili a quella della diffusione libera.

Mobilità lipidi:
A differenza delle proteine, i fosfolipidi sono piccole molecole che costituiscono la tessitura del
doppio strato lipidico, ma anche il loro movimento è limitato. Esse sono confinate per brevi
periodi di tempo e poi saltano da un’area confinata all’altra.

Domini della membrana e la polarità cellulare:


La maggior parte delle membrane mostra una larga variabilità nella composizione proteica e
nella mobilità, specialmente in quelle cellule dove le diverse aree della superficie cellulare
hanno funzioni differenti.

Il movimento di molecole attraverso le membrane cellulari


La membrana plasmatica ha una duplice funzione. Da un lato deve trattenere le molecole in
soluzione nella cellula in modo che esse non filtrino semplicemente nell’ambiente esterno,
mentre dall’altro lato, deve consentire i necessari scambi di sostanze verso l’interno e verso
l’esterno della cellula.
Il doppio strato lipidico della membrana è perfettamente adatto per evitare che la cellula perda
soluti polari e dotati di carica.
Il movimento di sostanze attraverso la membrana pu avvenire fondamentalmente in due modi:
in modo passivo, per diffusione, oppure in modo attivo per mezzo di un processo di trasporto che
richiede energia. Entrambi portano ad un flusso netto di un particolare ione o composto. Il
termine flusso netto indica che il movimento della sostanza verso l’interno della cellula (flusso
in ingresso) e quello verso l’esterno (flusso in uscita) non sono in equilibrio, ma che uno è
maggiore rispetto all’altro.

La diffusione è un processo spontaneo nel quale una sostanza si muove da una regione ad elevata
concentrazione ad una a bassa concentrazione, annullando alla fine la differenza di
concentrazione fra le due regioni. La diffusione dipende dall’agitazione termica casuale dei
soluti ed è un processo esoergonico guidato da un aumento di entropia.
Se il soluto è un elettrolita, si deve anche considerare la differenza globale di carica fra i due
compartimenti.
Tanto maggiore è la differenza di carica fra i due compartimenti, tanto più elevata sarà la
differenza di energia libera. Pertanto, la propensione di un elettrolita a diffondere tra due
compartimenti dipende da due gradienti: un gradiente chimico, determinato dalla differenza di
concentrazione della sostanza fra i due compartimenti, e un gradiente di potenziale elettrico,
dovuto alla differenza di carica. Queste differenze nel loro insieme, danno origine al gradiente
elettrochimico.

Affinché una sostanza priva di carica (non elettrolita) possa diffondere passivamente attraverso
una membrana plasmatica, è necessario che siano soddisfatte due condizioni: la sostanza deve
essere presente a concentrazione più elevata su un lato della membrana rispetto all’altro e la
membrana deve essere permeabile a quella particolare sostanza.
Una membrana pu essere permeabile ad un dato soluto perché:
1) Il soluto pu passare direttamente attraverso il doppio strato lipidico
2) Il soluto pu attraversare un poro acquoso che attraversa la membrana
La diffusione semplice è condizionata dalla polarità di un soluto. Una misura della polarità è
data dal suo coefficiente di ripartizione, ossia il rapporto fra la sua solubilità in un solvente
apolare (tipo olio vegetale) e quella in acqua, quando il solvente apolare e l’acqua sono
miscelati insieme.
La penetrazione nella membrana è tanto più veloce quanto maggiore è la solubilità nei lipidi.
Un altro fattore che determina la velocità di penetrazione di un composto attraverso una
membrana sono le sue dimensioni: a parità di coefficiente di ripartizione, la molecola più
piccola tende a penetrare attraverso il doppio strato lipidico di una membrana più rapidamente
di quella più grande.
Molecole molto piccole, prive di carica, attraversano rapidamente le membrane cellulari. Mentre
le molecole polari più grandi, come gli zuccheri, gli amminoacidi e i composti intermedi
fosforilati, manifestano una scarsa penetrabilità nella membrana.
Quindi il doppio strato lipidico della membrana plasmatica fornisce un’efficace barriera che
trattiene questi metaboliti essenziali evitando che diffondano fuori dalla cellula.
Alcune di queste molecole, tipo zuccheri e amminoacidi, devono entrare nella cellula dal circolo
sanguigno ma non possono farlo per semplice diffusione, ma devono essere disponibili alcuni
meccanismi che ne consentono il passaggio attraverso la membrana plasmatica.

Le molecole di acqua si muovono attraverso una membrana cellulare molto più rapidamente di
ioni disciolti o di piccoli soluti organici polari, che non sono in grado di attraversare la
membrana.
Per questa differenza nella capacità di penetrazione dell’acqua rispetto ai soluti, le membrane
vengono dette semipermeabili. L’acqua si sposta facilmente attraverso una membrana
semipermeabile da una regione a concentrazione inferiore di soluto ad una regione a
concentrazione di soluto più elevata (processo di osmosi).
Il compartimento in cui la concentrazione di soluto è più elevata è definito ipertonico rispetto a
quello con concentrazione di soluto inferiore, che è detto ipotonico.
Quando una cellula è posta in una soluzione ipotonica, essa assorbe acqua per osmosi e si gonfia.
Viceversa quando una cellula è posta in una soluzione ipertonica, perde rapidamente acqua per
osmosi e si restringe. Questi 2 processi di rigonfiamento e restringimento sono in genere
transitori.
Il volume cellulare è controllato dal rapporto fra la concentrazione dei soluti all’interno della
cellula e quella presente nell’ambiente extracellulare.
Una volta che la concentrazione interna dei soluti eguaglia quella esterna, i fluidi interni ed
esterni sono isotonici e non si verifica alcun movimento netto di acqua verso l’interno o verso
l’esterno delle cellule.
L’osmosi è un fenomeno importante in un gran numero di funzioni corporee (es nel tratto
digerente).
Se una cellula vegetale viene posta in un mezzo ipertonico, il suo volume si contrae e la
membrana plasmatica si stacca dalla parete cellulare circostante, processo chiamato plasmolisi.
Molte cellule sono molto più permeabili all’acqua di quanto non si possa spiegare con la semplice
diffusione attraverso il doppio strato lipidico. Fu identificata una proteina che pensarono
potesse essere il canale per l’acqua della membrana eritrocitaria. Il gruppo di ricerca aveva
scoperto una famiglia di piccole proteine integrali, dette acquaporine, che permettono il
movimento passivo di acqua da un lato all’altro della membrana plasmatica. Ogni subunità di
acquaporina (hanno 4 subunità) contiene un canale centrale, rivestito principalmente da residui
amminoacidi idrofobi, che è altamente specifico per le molecole d’acqua. Gli ioni H+ non sono
capaci di penetrare attraverso questi pori aperti.
In prossimità del suo punto più stretto, la parete del canale dell’acquaporina possiede una
coppia di cariche positive posizionate in modo ben preciso in modo tale che attraggano gli atomi
di ossigeno delle molecole di acqua quando esse attraversano il punto stretto della proteina.
Questa interazione riorienta la molecola di acqua centrale e le impedisce di mantenere i legami
idrogeno che normalmente la legano alle altre molecole di acqua adiacenti.
Questo riorientamento ha l’effetto di rimuovere il ponte che normalmente dovrebbe permettere
ai protoni di spostarsi da una molecola d’acqua all’altra.
Le acquaporine sono particolarmente abbondanti nelle cellule in cui il passaggio dell’acqua gioca
un ruolo cruciale nell’attività fisiologica dei tessuti, come le cellule dei tubuli renali. L’ormone
vasopressina, che stimola la ritenzione idrica da parte dei dotti collaterali dei reni, agisce per
mezzo di una di queste proteine.

Diffusione di Ioni attraverso le membrane: Il doppio strato lipidico che costituisce lo strato
centrale delle membrane biologiche è fortemente impermeabile a sostanze con carica elettrica,
compresi i piccoli ioni come Na+, K+ ecc.. Il rapido movimento (conduttanza) di questi ioni
attraverso la membrana gioca un ruolo fondamentale in numerose attività cellulari, fra cui la
formazione e la propagazione di un impulso nervoso, la secrezione di sostanze nello spazio
extracellulare, la contrazione muscolare, la regolazione del volume cellulare ecc..
Le membrane contengono canali ionici, ossia aperture nelle membrane permeabili a determinati
ioni. Sono stati individuati un numero sbalorditivo di canal ionici, tutti formati da proteine
integrali di membrana che circondano un poro acquoso. Mutazioni nei geni codificanti i canali
ionici possono portare a molte gravi malattie. La maggior parte dei canali ionici è molto
selettiva nel consentire il passaggio, attraverso il poro, di un solo particolare tipo di ione. La
diffusione di ioni attraverso un canale è sempre “in discesa”, cioè da una condizione di elevata
energia verso una ad energia inferiore. La maggior parte dei canali ionici che sono stati
identificati pu esistere in una conformazione aperta o chiusa; Canali di questo tipo vengono
definiti canali a sbarramento. L’apertura e la chiusura dello sbarramento sono soggette a una
complessa regolazione fisiologica e possono essere indotte da vari fattori, a seconda del
particolare canale.
Si possono distinguere tre categorie principali di canali ionici a sbarramento:
1. Canali voltaggio-dipendenti, il cui stato conformazionale dipende da differenze nella
carica ionica sui due lati della membrana.
2. Canali ligando-dipendenti, il cui stato conformazionale dipende dal legame di una
specifica molecola (il ligando), che solitamente non è il soluto che passa attraverso il
canale.
Alcuni canali a controllo di ligando si aprono/chiudono in seguito al legame di un ligando
alla superficie esterna del canale; altri, invece, si aprono/chiudono in seguito al legame
di un ligando alla superficie interna del canale.
3. Canali a controllo meccanico, il cui stato conformazionale dipende da forze meccaniche
applicate alla membrana.

I canali ionici sono capaci di selezionare in maniera straordinaria gli ioni K+ dagli ioni Na+ e, allo
stesso tempo, permettono un’incredibilmente rapida conduttanza degli ioni K+ attraverso la
membrana:

Canali KcsA nei procarioti è costituito da 4 subunità che contengono due eliche (M1 e M2)
transmembrana e una regione del poro (P) all’estremità extracellulare del canale. La regione
P è costituita da una corta elica del poro che si estende per 1/3 del canale e da un’ansa non
elicoidale che forma il filtro di selettività, che permette solo il passaggio degli ioni K+.
La superficie interna del filtro di selettività contiene un pentapeptide altamente conservato, in
cui i gruppi carbonilici del suo scheletro creano cinque anelli successivi di atomi di ossigeno.
Ogni anello contiene quattro atomi di ossigeno (uno da ogni subunità).
Il filtro di selettività contiene quattro potenziali siti di legame per gli ioni K+ e uno ione K+
legato ad uno qualsiasi di questi siti occuperebbe il centro di un cubo avente 4 atomi di O in un
piano al di sotto e 4 atomi di O al di sopra. Quindi ogni ione K+ in uno di questi siti potrebbe
coordinarsi con otto atomi di O del filtro di selettività. Gli ioni Na+ nonostante siano più piccoli,
non possono superare la barriera energetica più elevata richiesta per entrare nel poro, in quanto
non possono interagire ottimamente con gli otto atomi di ossigeno necessari per stabilizzarlo nel
poro.
Anche se ci sono 4 potenziali siti di legame per il K+, solo 2 di questi sono occupati; si pensa
infatti che gli ioni potassio si muovano due per volta. L’entrata di un terzo K+ nel filtro di
selettività crea una repulsione elettrostatica che espelle lo ione legato all’estremità opposta
della fila.

Per gli eucarioti, sono stati isolati numerosi geni che codificano distinti canali
voltaggiodipendenti per il K+ (o Kv) ed è stata studiata attentamente l’anatomia molecolare
delle loro proteine. I canali Kv vegetali giocano un ruolo fondamentale nel bilancio idrico e
salino e sono coinvolti nella regolazione del volume cellulare. I canali kv animali sono invece
maggiormente conosciuti per il loro ruolo nella funzione di muscoli e nervi.
Le subunità dei canali Kv eucariotici contengono sei eliche associate alla membrana, denominate
da S1 a S6. Queste sei eliche possono essere raggruppate in due distinti domini funzionali:
1. Dominio del poro, che presenta la stessa architettura di base dell’intero canale batterico
e contiene il filtro di selettività che permette il passaggio degli ioni K+. Le quattro eliche
S6 rivestono gran parte del poro e la loro configurazione determina se lo sbarramento del
canale è aperto o chiuso.
2. Dominio voltaggio-sensibile: formato dalle eliche S1-S4 che avverte il voltaggio attraverso
la membrana plasmatica.
Si pensa che la presenza di fosfolipidi carichi negativamente sia importante nel mantenere la
struttura nativa delle proteine di membrana e nel promuovere la sua funzione come canale
voltaggio-sensibile.
Come il canale KcsA, un canale Kv eucariotico è costituito da quattro subunità omologhe
disposte simmetricamente intorno al porto centrale che permette il passaggio degli ioni. Il filtro
di selettività e, di conseguenza, il meccanismo presunto di selezione degli ioni K+ è virtualmente
identico a quello nelle proteine KcsA procariotiche ed in quelle Kv eucariotiche.
Lo sbarramento che porta all’interno di un canale Kv è formato dalle estremità interne delle
eliche S6 e si pensa che si apra e si chiuda in modo approssimativamente analogo a quello delle
eliche M2 del canale batterico.
L’elica S4, che contiene numerosi residui amminoacidici carichi positivamente distanziati lungo
la catena polipeptidica rappresenta l’elemento chiave del sensore di voltaggio.
In condizioni di riposo, il potenziale negativo della membrana mantiene l’elica S4 in una
conformazione tale per cui il poro risulta chiuso. Un cambiamento del potenziale verso un valore
più positivo esercita una forza elettrica sull’elica S4 facendola muovere in modo tale che i suoi
residui carichi positivamente si spostino da una posizione in cui erano esposti verso il citoplasma
ad una nuova posizione in cui sono esposti verso l’esterno della cellula. La capacità di percepire
il voltaggio è un processo dinamico il cui meccanismo non pu essere risolto mediamente
un’unica visualizzazione statica della proteina.
Il movimento dell’elica S4 in risposta alla depolarizzazione della membrana innesca una serie di
cambiamenti conformazionali all’interno della proteina che induce l’apertura dello sbarramento
all’estremità citoplasmatica del canale.
Una volta aperto lo sbarramento, più di dieci milioni di ioni potassio possono passare attraverso
il canale ogni secondo, una velocità paragonabile alla diffusione libera in soluzione. A causa
dell’abbondante flusso ionico, l’apertura di un numero relativamente piccolo di canali di K+ ha
un impatto significativo sulle proprietà elettriche della membrana. Dopo pochi millisecondi
dall’apertura del canale, il movimento di ioni K+ si arresta automaticamente per un meccanismo
noto come inattivazione.
I canali Kv eucariotici in genere contengono un’ampia struttura citoplasmatica la cui
composizione varia tra i diversi canali. L’inattivazione del canale si verifica in seguito al
movimento di un piccolo peptide di inattivazione che penzola dalla porzione citoplasmatica della
proteina. Quando uno di questi peptidi penzolanti si sposta sull’imboccatura del porto, il
passaggio degli ioni viene bloccato ed il canale è inattivato. In un momento successivo del ciclo,
il peptide d’inattivazione viene rilasciato e lo sbarramento del canale è chiuso. Il canale di
potassio pu esistere nei tre diversi stati: aperto, inattivato chiuso.
Vi sono molti diversi tipi di canali del potassio, ed è probabile che ogni singola cellula possiede
molti tipi di differenti canali del potassio che si aprono e si chiudono rispondendo a voltaggi
differenti.

La diffusione facilitata
In numerosi casi, la sostanza che deve diffondere si lega prima selettivamente ad una proteina
che attraversa la membrana, detta trasportatore facilitante, che agevola il processo di
diffusione. Si ritiene che il legame del soluto al trasportatore facilitante provochi un
cambiamento conformazionale della proteina, che espone il soluto sull’altro versante della
membrana, dal quale pu diffondere seguendo il suo gradiente di concentrazione.
La direzione del flusso netto dipende dalla concentrazione relativa della sostanza da trasportare
ai due lati della membrana.
La diffusione facilitata è simile per molti aspetti ad una reazione catalizzata da un enzima. I
trasportatori facilitanti, come gli enzimi, sono specifici per le molecole che trasportano. Come
gli enzimi inoltre, i trasportatori possiedono una cinetica di saturazione. La maggior parte dei
trasportatori facilitanti pu muovere attraverso la membrana solo da qualche centinaia a qualche
migliaia di molecole di soluto al secondo (contro i milioni di ioni al secondo dei canali ionici).
Un’altra importante caratteristica dei trasportatori facilitanti è che la loro attività pu essere
regolata. La diffusione facilitata è particolarmente importante nel mediare l’entrata e l’uscita
di soluti polari, come gli zuccheri e gli amminoacidi, che non possono penetrare nel doppio
strato lipidico.

Esempio di diffusione facilitata: il trasportatore del glucosio


Il glucosio è la principale fonte di energia diretta per l’organismo e la maggior parte delle cellule
possiede una proteina di membrana che facilita la diffusione del glucosio dal circolo sanguigno
all’interno della cellula. Una volta entrato nel citoplasma, il glucosio è rapidamente fosforilato,
abbassando quindi, la concentrazione intracellulare del glucosio; questo mantiene un gradiente
che favorisce la continua diffusione del glucosio entro la cellula. La specie umana possiede
almeno cinque proteine affini tra loro (isoforme) che svolgono la funzione di trasportatori
facilitanti per il glucosio. Queste isoforme, denominate da GLUT1 a GLUT5, si differenziano per
i tessuti in cui sono espresse, per le loro caratteristiche cinetiche e di regolazione.
L’insulina è un ormone prodotto dalle cellule endocrine del pancreas e gioca un ruolo chiave nel
mantenere costante il tasso ematico del glucosio. Un aumento del livello del glucosio nel sangue
induce la secrezione di insulina, che stimola il riassorbimento del glucosio da parte di alcune
cellule bersaglio, soprattutto cellule muscolari scheletriche e adipociti. Queste cellule sensibili
all’insulina condividono un’isoforma del trasportatore facilitante del glucosio, precisamente
GLUT4. Quando il livello di insulina è basso, queste cellule espongono sulla loro superficie
plasmatica un numero relativamente modesto di trasportatori e ne conservano la maggior parte
nelle membrane di vescicole citoplasmatiche. Quando la concentrazione di insulina aumenta in
conseguenza all’incremento di concentrazione di glucosio nel sangue, l’ormone agisce sulle
cellule bersaglio e stimola la fusione delle vescicole citoplasmatiche con la membrana
plasmatica; di conseguenza, i trasportatori si localizzano in membrana, dove possono legare il
glucosio e trasportarlo all’interno della cellula. La proteina stereospecifica accetta solo isomero
D.

Il trasporto attivo
La capacità di una cellula di generare rapide differenze nel gradiente di concentrazione
attraverso la membrana plasmatica pu derivare solo dal trasporto attivo.
Il trasporto attivo dipende da proteine integrali di membrana capaci di legare in modo selettivo
un particolare soluto e di spostarlo attraverso la membrana in seguito a modificazioni
conformazionali della proteina. Diversamente dalla diffusione facilitata, il movimento di un
soluto contro un gradiente di concentrazione richiede di essere accoppiato al rilascio di energia.
Quindi il movimento endoergonico di ioni o altri soluti attraverso la membrana contro un
gradiente di concentrazione è accoppiato ad un processo esoergonico, come l’idrolisi di ATP,
l’assorbimento della luce, il trasporto di elettroni o il flusso di altre sostanze secondo gradiente.
Le proteine che effettuano un trasporto attivo vengono spesso chiamate “pompe”.

L’enzima responsabile dell’idrolisi dell’ATP è la stessa proteina che era attiva nel trasporto degli
ioni potassio e sodio: l’enzima fu denominato ATPasi Na+/K+-dipendente o pompa sodio-
potassio. I sistemi di trasporto attivo trasferiscono gli ioni in una sola direzione. E’ proprio la
Na+/K+ATPasi ad essere responsabile del largo eccesso di ioni Na+ all’esterno della cellula e
dell’ampio eccesso di ioni K+ all’interno della cellula. Le cariche positive portate da questi due
cationi sono bilanciate dalle cariche negative portate da diversi anioni, cosicché i compartimenti
extracellulare ed intracellulare sono elettricamente neutri.
Gli ioni Cl- sono presenti a concentrazione maggiore all’esterno delle cellule, dove bilanciano gli
ioni Na+ extracellulari. L'abbondanza di ioni K+ intracellulari è bilanciata soprattutto
dall’eccesso di cariche negative portate dalle proteine e dagli acidi nucleici.
Per ogni molecola did ATP idrolizzata, tre ioni sodio sono pompati all’esterno, mentre due
ioni potassio sono pompati all’interno. Per questo rapporto la Na+/K+-ATPasi è elettrogenica,
ossia contribuisce in modo diretto alla separazione delle cariche ai due lati della membrana.
La Na+/K+ -ATPasi è un esempio di pompa ionica di tipo P (P sta per fosforilazione e sta ad
indicare che, durante il ciclo di attività della pompa, l’idrolisi dell’ATP porta al trasferimento
del gruppo fosfato rilasciato ad un residuo di acido aspartico della proteina di trasporto,
provocando un fondamentale cambiamento della sua conformazione.
Attività della proteina: deve prelevare gli ioni sodio o potassio da una regione in cui essi sono
presenti a bassa concentrazione; quindi la proteina deve avere un’affinità relativamente elevata
per tali ioni.
Successivamente, la proteina deve liberare gli ioni sul versante opposto della membrana, in un
ambiente con una concentrazione dello ione molto più elevata. Per fare questo, l’affinità della
proteina per questo ione deve diminuire. Pertanto, l’affinità per ciascuno ione sulle due facce
della membrana deve essere differente. Questo cambiamento nell’affinità della proteina si attua
grazie alla fosforilazione, che cambia la forma della molecola proteica. Il cambiamento
conformazionale della proteina serve, inoltre, ad esporre i siti di legame per gli ioni verso l’uno
o l’altro versante della membrana.
L’importanza della pompa sodio-potassio diventa evidente quando si considera che consuma
circa un terzo dell’energia prodotta dalla maggior parte delle cellule animali e circa due terzi
dell’energia prodotta dalle cellule nervose.

Altri sistemi di trasporto ionico


La pompa P meglio studiata è la Ca2+-ATPasi. La pompa del calcio è presente nelle membrane
del reticolo endoplasmatico, dove trasporta attivamente gli ioni calcio dal citoplasma al lume di
questo organello.
Il trasporto degli ioni calcio da parte di Ca2+ -ATPasi coinvolge grandi cambiamenti
conformazionali che accoppiano l’idrolisi dell’ATP a variazioni nell’accessibilità e nell’affinità
dei siti di legame per lo ione.
La pompa sodio-potassio è presente solo nelle cellule animali ed è un mezzo fondamentale per
mantenere il volume cellulare e come meccanismo per generare i rigidi gradienti degli ioni Na+ e
K+, che sono fondamentali nella generazione degli impulsi nelle cellule nervose e muscolari. Le
cellule epiteliali dello stomaco contengono una pompa di tipo P, la H+/K+-ATPasi, che secerne
nello stomaco una soluzione di acido concentrato (HCl). Quando si trova nello stato di riposo,
questa pompa è localizzata nelle membrane citoplasmatiche delle cellule parietali dello stomaco
e non è funzionale.
Quando il cibo entra nello stomaco, un messaggio ormonale stimola le cellule parietali e provoca
il movimento delle membrane contenenti la pompa verso la superficie apicale cellulare, dove si
fondono con la membrana plasmatica e iniziano a secernere acido. (gli acidi gastrici oltre a
svolgere le funzioni digestive, possono anche provocare acidità di stomaco).
Diversamente dalle pompe di tipo P, le pompe di tipo V utilizzano l’energia dell’ATP senza
passare attraverso la tappa intermedia di proteina fosforilata. Le pompe di tipo V trasportano
attivamente ioni idrogeno attraverso le membrane degli organelli e dei vacuoli citoplasmatici
(infatti V sta per vacuolo).
Le pompe di tipo V sono presenti nelle membrane che delimitano i lisosomi, i granuli di secreto e
i vacuoli delle cellule vegetali e mantengono basso il pH all’interno di questi compartimenti.
Pompe di tipo V si trovano anche nella membrana plasmatica di molte cellule (es: nella
membrana plasmatica delle cellule dei tubuli renali che aiuta a mantenere l’equilibrio acidobase
del corpo secernendo protoni nell’urina in via di formazione).
Le pompe di tipo V sono grandi complessi costituiti di numerose subunità simili a quelli dell’ATP
sinteasi.
Un altro gruppo di proteine che trasportano attivamente ioni è rappresentato dai trasportatori a
cassetta che legano l’ATP, comunemente indicati come trasportatori ABC, caratterizzati dal
fatto che tutti i membri di questa superfamiglia condividono un dominio omologo che lega l’ATP.

I POTENZIALI DI MEMBRANA E GLI IMPULSI NERVOSI


Tutti gli organismi rispondono attivamente agli stimoli esterni; questa proprietà viene definita
irritabilità.
Le cellule nervose, o neuroni, sono specializzate per la raccolta, la conduzione e la trasmissione
dell’informazione, codificata sotto forma di rapidi impulsi elettrici.
Il nucleo del neurone è situato in una regione espansa, detta corpo cellulare o pirenoforo, che è
il centro metabolico della cellula e il sito in cui è sintetizzato la maggior parte dei componenti
cellulari. Dal corpo cellulare della maggior parte dei neuroni si estendono una serie di sottili
estroflessioni, chiamate dendriti, che ricevono le informazioni in entrata dall’esterno,
generalmente da altri neuroni.
Dal corpo cellulare emerge anche una singola estroflessione, l’assone, che conduce gli impulsi in
uscita dal corpo cellulare verso le cellule bersaglio. Alcuni assoni possono estendersi per molti
metri all’interno del corpo di grandi vertebrati.
La maggior parte degli assoni si ramifica all’estremità in processi più piccoli, ognuno dei quali
finisce in un bottone terminale, una regione specializzata dove gli impulsi sono trasmessi dal
neurone alla cellula bersaglio. A livello cerebrale, molti neuroni possono terminare in migliaia di
bottoni terminali permettendo a queste cellule di comunicare con migliaia di potenziali cellule
bersaglio.
La maggior parte dei neuroni presenti nei vertebrati è avvolta da una guaina mielinica ricca di
lipidi.

Il potenziale di riposo
Quando fra due regioni, per esempio l’interno e l’esterno della membrana plasmatica, vi è un
eccesso di ioni positivi da un lato e un eccesso di ioni negativi dall’altro, si instaura un voltaggio,
o differenza di potenziale elettrico, tra i due punti.
È possibile misurare i voltaggi attraverso le membrane plasmatiche inserendo un microelettrodo
nel citoplasma di una cellula, posizionando un secondo elettrodo nel liquido extracellulare e
collegando i due elettrodi ad un voltmetro che misura la differenza di carica fra due punti. La
presenza di un potenziale di membrana non è esclusiva delle cellule nervose, in quanto tali
potenziali sono presenti in tutti i tipi di cellule e la loro ampiezza varia da -15 a -100mV. Per le
cellule non eccitabili, cioè per tutte le cellule tranne i neuroni e le cellule muscolari, questo
voltaggio è detto potenziale di membrana. In una cellula nervosa o muscolare invece è definito
come potenziale di riposo perché soggetto ad ampie variazioni.
L’ampiezza e la direzione del voltaggio fra due facce della membrana sono determinate dalla
differenza nelle concentrazioni dei diversi ioni su ogni lato della membrana e dalle relative
permeabilità.
La pompa Na+/K+-ATPasi trasporta ioni Na+ fuori dalla cellula e ioni K+ dentro la cellula,
stabilendo così ripidi gradienti di questi due ioni attraverso la membrana plasmatica.
La grande maggioranza dei canali ionici aperti nella membrana plasmatica di una cellula nervosa
a riposo è selettiva per il potassio; essi sono spesso indicati come canali di fuga o canali passivi
del K+.
I canali di fuga del K+ sono membri di una famiglia di canali per il K+ che sono privi del sensore
di voltaggio S4 e non possono rispondere ai cambiamenti di voltaggio.
Il flusso in uscita degli ioni K+ attraverso la membrana provoca un eccesso di cariche negative
sul lato citoplasmatico della membrana. Sebbene il gradiente di concentrazione transmembrana
favorisca il continuo efflusso di K+, il gradiente elettrico risultante dall’eccesso di cariche
negative all’interno della membrana favorisce la ritenzione di ioni K+ dentro la cellula. Quando
queste due forze opposte sono bilanciate, il sistema è all’equilibrio. Applicando l’equazione di
Nerst, si pu calcolare il potenziale di membrana (Vm) che sarebbe misurato all’equilibrio se la
membrana plasmatica di una cellula nervosa fosse permeabile solo agli ioni K+. Le misure del
voltaggio attraverso la membrana nervosa a riposo sono simili per segno e ampiezza (-70mV) al
potenziale di equilibrio del potassio. Il movimento degli ioni potassio attraverso la membrana è
considerato il fattore più importante per determinare il potenziale di riposo.

Il Potenziale d’azione
Il movimento di cariche positive verso l’interno della cellula riduce il potenziale di membrana,
rendendolo meno negativo. Poiché il cambiamento positivo del voltaggio della membrana
provoca una diminuzione della polarità tra i due lati della membrana, questo fenomeno è
definito depolarizzazione.
Se lo stimolo provoca una depolarizzazione della membrana di soli pochi mV (tipo da -70 a -
60mV) la membrana torna rapidamente al suo potenziale di riposo, non appena lo stimolo è
cessato.
Se invece lo stimolo depolarizza la membrana oltre un limite soglia, che si trova intorno ai -
50mV, allora si scatena una serie di eventi. Il cambiamento del voltaggio provoca l’apertura dei
canali del sodio a controllo di voltaggio e così gli ioni sodio diffondono liberamente nella cellula
secondo il loro gradiente di concentrazione e il loro gradiente elettrico. L’aumento di
permeabilità della membrana agli ioni Na+, insieme al corrispondente ingresso di cariche
positive, porta all’inversione per un breve periodo del potenziale di membrana, che raggiunge
un valore positivo di circa +40mV, molto prossimo al potenziale all’equilibrio per lo ione Na+.
Dopo circa 1 mese, i canali per il sodio si inattivano spontaneamente per la diffusione causale di
un peptide di inattivazione, arrestando un’ulteriore entrata di ioni sodio.
Allo stesso tempo, il cambiamento nel potenziale di membrana causato dal flusso in ingresso di
Na+ innesca l’apertura dei canali a controllo di voltaggio per il potassio. Come conseguenza, gli
ioni potassio si riversano fuori dalla cellula seguendo il loro ripido gradiente di concentrazione.
La diminuita permeabilità della membrana al Na+ e l’aumentata permeabilità al K+ riportano il
potenziale di membrana a un valore negativo, di circa -80mV, che è prossimo al potenziale di
equilibrio per il potassio. Il potenziale di membrana ampiamente negativo provoca la chiusura
dei canali a controllo di voltaggio per il potassio, il che riporta la membrana alla sua condizione
di riposo.
Collettivamente questi cambiamenti nel potenziale di membrana sono detti potenziale d’azione.
L’intera sequenza di cambiamenti durante il potenziale d’azione si svolge in soli 5 msec
ell’assone di calamaro e in meno di 1 msec in una cellula nervosa mielinizzata di mammifero. In
seguito a un potenziale d’azione, la membrana entra in un breve periodo refrattario durante il
quale non pu essere stimolata nuovamente e questo è dovuto al fatto che i canali del sodio
inattivati durante la fase iniziale del potenziale d’azione devono chiudersi prima di potere
riaprirsi in risposta a un altro stimolo.
Il cambiamento del canale ionico dallo stato inattivo a quello chiuso pu avvenire solo quando il
peptide di inattivazione si sposta dall’apertura del poro.
Ogni singolo potenziale d’azione coinvolge solamente una piccola percentuale degli ioni sui due
lati della membrana.
Eventuali cambiamenti drastici del potenziale di membrana sono causati dai movimenti di carica
in una direzione o nell’altra che risultano nei momentanei cambiamenti nella permeabilità degli
ioni Na+ e K+.
Gli ioni Na+ e K+ che attraversano la membrana durante un potenziale di azione sono alla fine
pompati indietro dalla Na+/K+-ATPasi. Anche se si inibisce la Na+/K+-ATPasi, un neurone pu
spesso continuare a lanciare migliaia di impulsi prima che il gradiente ionico stabilito
dall’attività della pompa si dissipi.
Una volta che la membrana di un neurone è depolarizzata al valore soglia, non è necessaria
alcuna ulteriore stimolazione perché si inneschi un potenziale d’azione d’intensità massima.
Questa caratteristica della funzione della cellula nervosa è nota come legge del tutto o nulla. La
depolarizzazione al di sotto della soglia è incapace di innescare un potenziale d’azione, mentre
la depolarizzazione che raggiunge il livello soglia innesca automaticamente la risposta massima.
Il potenziale d’azione non richiede energia, ma è il risultato del flusso di ioni secondo la
direzione dei loro rispettivi gradienti elettrochimici.
L’energia è richiesta dalla Na+/K+-ATPasi per generare i ripidi gradienti ionici attraverso la
membrana plasmatica ma, una volta realizzati i gradienti, i vari ioni sono pronti a fluire
attraverso la membrana non appena i rispettivi canali ionici si aprono.
Il movimento di ioni attraverso la membrana plasmatica di una cellula nervosa costituisce la base
della comunicazione neurale. Alcuni anestetici locali, come la procaina o la novocaina, agiscono
chiudendo i canali ionici nelle membrane delle cellule sensoriali e nervose. Fino a quando questi
canali rimangono chiusi, le cellule interessate sono incapaci di generare potenziali d’azione e
quindi incapaci di informare l’encefalo di eventi che avvengono a livello della pelle o dei denti.

Quando un potenziale d’azione è stato innescato, esso non rimane localizzato in un punto
particolare ma si propaga lungo la cellula come impulso nervoso fino ai terminali nervosi. Gli
impulsi nervosi si propagano lungo una membrana perché il potenziale d’azione in una zona
esercita un effetto sulla zona adiacente. L’ampia depolarizzazione che accompagna un
potenziale d’azione crea una differenza di carica lungo la superficie interna e quella esterna
della membrana plasmatica. Come conseguenza, gli ioni positivi si muovono verso il sito di
depolarizzazione sulla superficie esterna della membrana, mentre si allontanano da quel punto
sulla superficie interna. A causa di questo flusso locale di corrente, la membrana della regione
situata a valle del potenziale d’azione si depolarizza anch’essa. Poiché la depolarizzazione che
accompagna il potenziale d’azione è molto ampia, la membrana nella regione adiacente è
prontamente depolarizzata ad un livello superiore al valore soglia, evento che induce l’apertura
dei canali del sodio in questa regione adiacente, generando un altro potenziale d’azione. Così
una serie di potenziali d’azione procede per tutta la lunghezza dell’assone senza perdere di
intensità, ed arriva alla cellula bersaglio con la stessa intensità che aveva nel punto di origine.
Dal momento che tutti gli impulsi che viaggiano lungo un neurone hanno la stessa intensità,
stimoli più forti non possono produrre impulsi maggiori di quelli generati da stimoli più deboli.
La capacità di discriminare a livello sensoriale dipende da diversi fattori.
Uno stimolo più intenso attiva un numero maggiore di cellule nervose rispetto ad uno stimolo più
debole. Più forte è uno stimolo, maggiore sarà il numero degli impulsi generati.

La velocità della contrazione


Tanto maggiore è il diametro di un assone, quanto minore è la resistenza al flusso di corrente
locale e quanto più rapidamente un potenziale d’azione in un punto pu attivare le regioni
adiacenti della membrana.
La velocità di conduzione è aumentata dal momento in cui l’assone ha cominciato ad essere
avvolto in una guaina mielinica. Poiché è costituita da vari strati di membrane contenenti lipidi
è adatta ad impedire il passaggio di ioni attraverso la membrana plasmatica. Inoltre, quasi tutti i
canali ionici del sodio di un neurone avvolto da mielina si localizzano nelle zone in cui la guaina
è assente, dette nodi di Ranvier, situate tra due cellule di Schwann (nel sistema nervoso
periferico) o tra due oligodendrociti (nel sistema nervoso centrale adiacenti che formano la
guaina. Per questo i nodi di Ranvier sono le uniche regioni in cui il potenziale d’azione pu
svilupparsi. Un potenziale d’azione ad un nodo scatena un potenziale d’azione al nodo
successivo senza dovere attivare la membrana nel tratto interposto fra i due nodi. La
propagazione di un impulso con questo meccanismo è detta conduzione saltatoria.
L’importanza della mielinizzazione è drammaticamente evidente nella sclerosi multipla, una
malattia che porta al graduale deterioramento della guaina mielinica che circonda gli assoni in
varie regioni del sistema nervoso.

La trasmissione nervosa
I neuroni sono connessi alle loro cellule bersaglio da giunzioni specializzate, dette sinapsi. Le
due cellule non sono a contatto diretto ma sono separate da uno stretto intervallo chiamato
fessura sinaptica (o spazio sinaptico). Una cellula presinaptica (cellula recettoriale o neurone)
conduce impulsi verso una sinapsi e sul “lato ricevente” di una sinapsi si trova sempre una
cellula postsinaptica (cellula nervosa, muscolare o ghiandolare).
Sinapsi tra i rami terminali di un assone e una cellula muscolare scheletrica sono dette giunzioni
neuromuscolari.
Nell’estremità terminale degli assoni (i bottoni terminali) c’è la presenza di un gran numero di
vescicole sinaptiche che costituiscono i siti di raccolta per i trasmettitori chimici che agiscono
sulle cellule postsinaptiche.
L’acetilcolina e la norepinefrina (o noradrenalina) sono due fra i neurotrasmettitori più studiati
che trasmettono impulsi ai muscoli scheletrici ed al muscolo cardiaco.
La sequenza degli eventi che si verificano durante la trasmissione sinaptica sono:
Quando un impulso raggiunge un bottone terminale (fase 1), la conseguente depolarizzazione
provoca l’apertura dei canali del Ca2+ a controllo di potenziale di membrana plasmatica di
questa porzione della cellula nervosa presinaptica (fase 2). Gli ioni calcio sono normalmente
presenti ad una concentrazione molto bassa all’interno di un neurone. Quando i canali si aprono,
gli ioni calcio diffondono dal fluido extracellulare nei bottoni terminali del neurone, provocando
un aumento di più di mille volte della [Ca2+] all’interno di microdomini localizzati in prossimità
dei canali. L’elevata [Ca2+] innesca la rapida fusione di una o più vescicole sinaptiche con la
membrana plasmatica, provocando il rilascio delle molecole di neurotrasmettitore nella fessura
sinaptica (fase 3).
Una volta rilasciate le vescicole sinaptiche, le molecole di neurotrasmettitore diffondono
attraverso lo stretto spazio e si legano selettivamente alle molecole di recettore presenti sulla
membrana della cellula postsinaptica proprio in corrispondenza del bottone sinaptico (fase 4).
Una molecola di neurotrasmettitore pu avere effetti opposti a seconda del tipo di recettore
presente sulla membrana della cellula bersaglio a cui si lega:
1. Il trasmettitore legato pu innescare l’apertura di canali cationici nella membrana,
portando principalmente all’entrata di ioni sodio e ad una conseguente diminuzione del
potenziale di membrana, che diventa più positivo. La depolarizzazione della membrana
postsinaptica eccita la cellula, rendendola più propensa a rispondere a questo o a stimoli
successivi generando un proprio potenziale di azione
2. Il trasmettitore legato pu innescare l’apertura di canali anionici, provocando
principalmente un ingresso di ioni cloruro e rendendo più negativo (iperpolarizzato) il
potenziale di membrana. Questo riduce la probabilità che la cellula generi un potenziale
d’azione.
La maggior parte delle cellule nervose cerebrali riceve segnali sia eccitatori sia inibitori da molti
neuroni postsinaptici differenti. È la somma di questi eventi opposti che determina se un
neurone postsinaptico genererà o meno un impulso.
Tutti i bottoni terminali di un dato neurone rilasciano lo stesso neurotrasmettitore che per pu
avere un effetto stimolatorio su una particolare membrana postsinaptica ed un effetto inibitorio
su un’altra.
Esempi: l’acetilcolina inibisce la contrattilità delle cellule cardiache ma stimola quella delle
fibre muscolari scheletriche. Nel cervello, il glutammato è il principale neurotrasmettitore
eccitatorio, mentre il GABA (gamma-amminobutirrico) è il principale neurotrasmettitore
inibitorio.
Numerosi anestetici generali agiscono legandosi al recettore per il GABA ed aumentano l’attività
del principale interruttore di spegnimento del cervello.

Plasticità Sinaptica
Le sinapsi sono più che semplici siti di connessione fra neuroni adiacenti; esse sono strutture
fondamentali per la trasmissione degli impulsi in tutto il sistema nervoso. Le sinapsi agiscono
come cancelli sistemati lungo i diversi percorsi nervosi, che consentono ad alcune informazioni
codificate di passare da un neurone all’altro, ne bloccano altre oppure le reindirizzano in altre
direzioni. Mostrano una notevole dinamicità conosciuta come “plasticità sinaptica”, che è
particolarmente importante durante l’infanzia e l’adolescenza, quando i circuiti neurali del
cervello evolvono verso la loro configurazione matura.
La plasticità sinaptica è più facilmente osservata in esperimenti condotti su neuroni
dell’ippocampo. Quando i neuroni ippocampali sono ripetutamente stimolati in un breve periodo
di tempo, le sinapsi che connettono questi neuroni a quelli vicini si “rinforzano” per un processo
noto come potenziamento a lungo termine (LTP) che pu durare giorni, settimane o per un
periodo più lungo.
Le ricerche per comprendere l’LTP si sono focalizzate sul recettore NMDA, uno dei tanti tipi di
recettori che legano il neurotrasmettitore eccitatorio glutammato. Quando il glutammato si lega
ad un recettore postsinaptico NMDA, esso induce all’apertura di un canale cationico all’interno
del recettore che permette il flusso di ioni Ca2+ all’interno del neurone postsinaptico,
innescando una cascata di cambiamenti biochimici che portano al “rinforzo” della sinapsi. Le
sinapsi che vanno incontro all’LTP sono capaci di trasmettere stimoli più deboli e di evocare
risposte più intense nelle cellule postsinaptiche.
Si pensa che molte malattie del sistema nervoso, fra cui la miastenia grave, il morbo di
Parkinson, la schizofrenia abbiano le loro radici nel funzionamento non corretto delle sinapsi.

LA RESPIRAZIONE AEROBICA E IL MITOCONDRIO


Organismi anaerobi: organismi che catturavano e utilizzavano l’energia attraverso meccanismi
metabolici indipendenti dall’ossigeno (anaerobi), come la glicolisi e la fermentazione. I primi
aerobi hanno dato origine a tutti i procarioti e gli eucarioti ossigeno-dipendenti oggi viventi.
Negli eucarioti, l’utilizzazione dell’ossigeno come meccanismo per estrarre energia ha luogo in
un organello specializzato, il mitocondrio.

Struttura e funzione dei mitocondri


I mitocondri possono presentarsi con caratteristiche morfologiche molto diverse. In alcuni casi
possono apparire come singole entità con una forma a fagiolo mentre in altri casi possono
presentarsi come reticoli tubulari fortemente ramificati ed interconnessi.
I mitocondri sono organelli dinamici la cui forma pu essere modificata drasticamente. Inoltre, si
possono fondere tra loro oppure dividersi in due.
L’equilibrio tra fusione e scissione è probabilmente il maggior determinante nel numero totale
dei mitocondri, nella lunghezza di essi e nel grado di interconnessioni. Quando la fusione
diventa più frequente della scissione, i mitocondri tendono a diventare più allungati ed
interconnessi, mentre quando la scissione diventa predominante si ha la formazione di
mitocondri più numerosi e distinti.
Un certo numero di malattie neurologiche ereditarie sono causate da mutazioni in geni che
codificano per componenti del macchinario di fusione mitocondriale.
I mitocondri sono meglio conosciuti per il loro ruolo nel generare l’ATP che è usato per guidare
la maggior parte delle attività della cellula che richiedono energia. Per svolgere questa
funzione, i mitocondri sono associati spesso con goccioline d’olio contenenti acidi grassi, da cui
derivano materiali grezzi da ossidare.
Oltre al metabolismo energetico, i mitocondri sono coinvolti anche in altre attività non
strettamente correlate al metabolismo energetico: rappresentano i siti di sintesi di numerose
sostanze, come certi amminoacidi e gruppi eme; giocano un ruolo vitale importanza nella
cattura e rilascio degli ioni calcio, che sono essenziali per innescare molte attività cellulari, e
insieme al reticolo endoplasmatico svolgono un ruolo molto importante nel regolare la
concentrazione di Ca2+ nel citosol; anche il processo di morte cellulare è regolato in gran parte
da eventi che si verificano a livello dei mitocondri.

Membrane mitocondriali
Il margine esterno del mitocondrio contiene due membrane: la membrana mitocondriale esterna
e la membrana mitocondriale interna. La membrana mitocondriale esterna racchiude
completamente il mitocondrio e ne rappresenta il confine esterno. La membrana mitocondriale
interna è suddivisa in due domini interconnessi. Uno di questi, chiamato membrana delimitante
interna, si estende appena sopra l’altra membrana mitocondriale, formando un rivestimento
esterno a doppia membrana. La membrana delimitante interna è particolarmente ricca in
proteine implicate nell’importo di proteine mitocondriali.
L’altro dominio della membrana mitocondriale interna si estende verso l’interno dell’organello
con una serie di invaginazioni membranose, chiamate creste. Il ruolo dei mitocondri come
trasduttori di energia è strettamente correlato con le membrane.
Le creste generano una superficie di membrana molto grande che ospita i componenti richiesti
per la respirazione aerobica e la produzione di ATP.
La membrana delimitante interna e le membrane delle creste sono unite l’una alle altre con
sottili connessioni, chiamate giunzioni delle creste.
Le membrane mitocondriali dividono questo organello in due compartimenti ripieni di fluido, uno
al centro del mitocondrio, detto matrice, e un secondo tra membrana esterna e membrana
interna, detto spazio intermembrana.
La matrice ha consistenza di gel, dovuta ad un’alta concentrazione di proteine idrosolubili. Le
proteine dello spazio intermembrana sono conosciute meglio per il loro ruolo nell’iniziare il
processo di apoptosi.
Le membrane esterna ed interna hanno proprietà molto differenti.
La membrana esterna è formata per circa il 50% da lipidi e contiene una curiosa miscela di
enzimi interessati ad attività estremamente diverse, come l’ossidazione dell’adrenalina, la
degradazione del triptofano e l’allungamento degli acidi grassi.
La membrana interna invece, contiene più di 100 diversi tipi di polipeptidi ed ha un alto
rapporto proteine/lipidi (1 molecola di proteine per ogni 15 fosfolipidi); è praticamente priva di
colesterolo e ricca di un insolito fosfolipide, la cardiolipina. La cardiolipina svolge un ruolo
importante nel facilitare l’attività delle proteine coinvolte nella sintesi dell’ATP.
Si ritiene che la membrana mitocondriale esterna sia derivata dalla membrana esterna in alcune
cellule batteriche, poiché ambedue le membrane contengono porine, proteine integrali che
formano ampi canali circondati da una palizzata di foglietti β. Le porine della membrana
mitocondriale esterna sono in grado di chiudersi reversibilmente a seconda delle condizioni della
cellula. Quando i canali delle porine sono ben aperti, la membrana è permeabile alle molecole
come l’ATP, il NAD e il coenzima A, che hanno un ruolo chiave nel metabolismo energetico
all’interno del mitocondrio.
Al contrario, la membrana mitocondriale interna è altamente impermeabile e tutte le molecole
e ioni hanno bisogno di trasportatori specifici per entrare all’interno della matrice.
L’architettura della membrana interna e l’evidente fluidità del suo doppio strato lipidico
facilitano quella interazione tra i componenti che è richiesta per la produzione di ATP.

Matrice mitocondriale: oltre a diversi enzimi, la matrice mitocondriale contiene ribosomi e


parecchie molecole di DNA a doppio filamento, in genere circolari. I mitocondri possiedono
quindi un loro materiale genetico (anche se limitato) e i macchinari per sintetizzare i loro RNA e
proteine. Questo DNA non cromosomico è importante perché codifica per un piccolo numero di
polipeptidi mitocondriali (13 nell’uomo) che vengono integrati nella membrana mitocondriale
interna. Il DNA mitocondriale umano codifica anche per 2 RNA e per 22 tRNA che vengono
utilizzati per la sintesi proteica all’interno dell’organello.
L’RNA polimerasi mitocondriale è un enzima costituito da una singola subunità, simile per molti
aspetti a quella di alcuni virus batterici (batteriofagi).

IL METABOLISMO OSSIDATIVO NEL MITOCONDRIO


A cominciare dal glucosio, le prime tappe del processo di ossidazione vengono attuate dagli
enzimi della glicolisi, localizzati nel citosol.
Solo una piccola porzione dell’energia libera contenuta nel glucosio viene resa disponibile per la
cellula durante la glicolisi, abbastanza per la sintesi netta di due molecole di ATP per molecola
di glucosio ossidata. La maggior parte dell’energia resta immagazzinata nel piruvato. I due
prodotti finali della glicolisi (piruvato e NADH) possono essere metabolizzati in due modi diversi,
a seconda del tipo di cellula in cui essi sono stati prodotti e a seconda della presenza o assenza
di ossigeno.
In presenza di ossigeno, gli organismi aerobi sono in grado di estrarre grandi quantità di energia
addizionale dal piruvato e dal NADH prodotti dalla glicolisi, tanto da sintetizzare altre 30
molecole di ATP. Questa energia è prodotta nei mitocondri.
Le molecole di piruvato prodotte dalla glicolisi sono trasportate attraverso la membrana
mitocondriale interna nella matrice, dove vengono decarbossilate per formare gruppi acetile a
due atomi di carbonio (-CH3COO2). Il gruppo acetile forma poi un complesso con il
coenzima A per formare l’acetil CoA.
La decarbossilazione del piruvato ed il trasferimento del gruppo acetile al CoA sono catalizzati
dal complesso multienzimatico gigante della piruvato deidrogenasi.
Il ciclo degli acidi tricarbossilici (ATC) o Ciclo di Krebs
Una volta formato, l’acetil CoA entra in una via ciclica detta ciclo degli acidi tricarbossilici (ATC)
o Ciclo di Krebs.
Il primo passo del ciclo degli ATC è la condensazione del gruppo acetile a due atomi di carbonio
con l’ossalacetato a quattro atomi per formare una molecola di citrato, a sei atomi di carbonio.
Durante il ciclo, la catena della molecola del citrato viene accorciata, un carbonio alla volta,
rigenerando la molecola a quattro atomi di carbonio dell’ossalacetato, che pu tornare a
condensarsi con un altro acetil CoA. Sono i 2 atomi di carbonio rimossi durante il ciclo degli ATC
(che erano stati introdotti con il gruppo acetile) ad essere completamente ossidati fino ad
anidride carbonica.
Nel ciclo degli ATC, avvengono quattro reazioni in cui una coppia di elettroni viene trasferita da
un substrato ad un coenzima accettore di elettroni. Tre di queste reazioni riducono il NAD+ a
NADH, una riduce il FAD in FADH2.
L’equazione complessiva per le reazioni del ciclo degli ATC è:
Acetil CoA + 2H2O + FAD + 3 NAD+ + GDP + Pi  2CO2 + FADH2 + 3NADH + 3H+ + GTP+HS—CoA
Il ciclo degli ATC è la via metabolica principale per la cellula. I metaboliti di questo ciclo sono gli
stessi composti prodotti dalla maggior parte delle vie cataboliche della cellula. Ad esempio,
l’acetil CoA è un importante prodotto finale di molte vie cataboliche, compresa la degradazione
degli acidi grassi, che vengono decomposti in unità di due atomi di carbonio alla volta.
Questi composti a due atomi di carbonio entrano nel ciclo degli ATC come acetil CoA.
Tutte le macromolecole che la cellula utilizza a scopo energetico (polisaccaridi, grassi e
proteine) vengono decomposte in metaboliti del ciclo degli ATC.
Il mitocondrio, rappresenta quindi il centro per le tappe finali del metabolismo energetico, a
partire da materiali di qualsiasi natura.
E’ evidente dal risultato netto dell’equazione del ciclo degli ATC che i prodotti principali delle
reazioni sono i coenzimi ridotti FADH2 e NADH. Il NADH è, insieme al piruvato, anche uno dei
prodotti principali della glicolisi. I mitocondri non sono per in grado di importare il NADH che si
forma nel citosol della glicolisi.
I suoi elettroni sono utilizzati invece per ridurre un metabolita a basso peso molecolare che pu o
entrare nel mitocondrio (per una via detta navetta del malato-aspartato) e ridurre il NAD+ a
NADH oppure trasferire i suoi elettroni al FAD (attraverso una via detta navetta del
glicerolfosfato) producendo così FADH2.
Entrambi i meccanismi consentono di spostare gli elettroni dal NADH citosolico alla catena di
trasporto degli elettroni mitocondriale ed essere utilizzato per la formazione di ATP.

Le tappe che usano questi coenzimi ridotti per produrre ATP sono principalmente 2:
1° TAPPA: Gli elettroni ad alta energia vengono passati dal FADH2 o dal NADH attraverso una
serie di trasportatori di elettroni che formano la catena di trasporto degli elettroni localizzata
nella membrana mitocondriale interna. Il passaggio degli elettroni nella catena respiratoria
avviene tramite reazioni che rilasciano energia. L’energia rilasciata durante il trasporto degli
elettroni viene immagazzinata sotto forma di gradiente protonico tra i due lati della membrana.
Gli elettroni a bassa energia vengono trasferiti ad un accettore finale di elettroni, l’ossigeno
molecolare (O2), che viene ridotto ad acqua.
2° TAPPA: Il ritorno controllato dei protoni (H+) attraverso la membrana, mediante un enzima
che sintetizza ATP, produce energia necessaria a far procedere la reazione endoergonica che
porta alla fosforilazione dell’ADP con formazione di ATP.
Ogni coppia di elettroni trasferita dal NADH all’ossigeno attraverso la catena di trasporto degli
elettroni rilascia energia sufficiente a formare circa tre molecole di ATP. Ogni coppia rilasciata
dal FADH2 ne libera abbastanza da formare circa due molecole di ATP. Se si sommano tutti gli
ATP che si formano da una molecola di glucosio, completamente catabolizzata attraverso la
glicolisi e il ciclo degli ATC, il guadagno netto è al massimo di 36 ATP (che comprendono anche il
GTP formatosi ad ogni giro del ciclo ATC).
IL RUOLO DEI MITOCONDRI NELLA SINTESI DELL’ATP
I mitocondri estraggono energia da materiali organici e la immagazzinano temporaneamente
sotto forma di energia elettrica. Più esattamente, l’energia estratta dai substrati viene
utilizzata per produrre un gradiente ionico tra i due lati della membrana mitocondriale interna.
Esso rappresenta una forma di energia che pu essere sfruttata per produrre lavoro. L’uso di
gradienti ionici come forma di energia facilmente spendibile richiede diversi componenti, che
comprendono un sistema per generare il gradiente, una membrana capace di mantenere il
gradiente e un meccanismo che possa sfruttare il gradiente in modo tale da poter produrre
lavoro.
I mitocondri utilizzano il gradiente tra i due lati della loro membrana interna per attuare diverse
attività che richiedono energia, la più notevole è la sintesi dell’ATP.
Quando la formazione dell’ATP dovuta all’energia che è liberata dagli elettroni rimossi durante
l’ossidazione di substrati, il processo è detto fosforilazione ossidativa. Nel corpo umano la
fosforilazione ossidativa pota alla sintesi di più di 160kg di ATP al giorno.

Potenziali di ossido-riduzione
I vari agenti ossidanti possono essere ordinati secondo la loro affinità per gli elettroni: tanto è
maggiore è l’affinità, tanto più forte è l’agente ossidante. Anche gli agenti riducenti possono
essere ordinati secondo la loro affinità per gli elettroni: tanto minore è l’affinità tanto più forte
è l’agente riducente. 

Gli agenti riducenti vengono classificati secondo il loro potenziale di trasferimento di elettroni;
le sostanze che hanno un alto potenziale di trasferimento di elettroni (es NADH) sono forti
riducenti, mentre quelli con basso potenziale (H2O) sono riducenti deboli.
Gli agenti ossidanti e quelli riducenti vanno a coppia, come il NAD+ e NADH, che differiscono nel
numero di elettroni. Forti riducenti sono accoppiati ad ossidanti deboli e viceversa.
Per una determinata coppia viene misurato il potenziale di ossido-riduzione (o potenziale redox)
relativo ad una qualche coppia standard, che convenzionalmente è H+—H2.
Il potenziale redox standard (E0) per una data coppia viene definito come il voltaggio prodotto
da una emicella, in cui ognuno dei membri della coppia è presente a concentrazione standard in
condizioni standard.
Alle coppie i cui agenti riducenti sono migliori donatori di elettroni vengono attribuiti potenziali
redox negativi.
Tanto è maggiore la differenza dei potenziali redox standard tra le due coppie, tanto più, a
condizioni standard, la reazione progredisce verso la formazione di prodotti, prima che sia
raggiunto lo stato di equilibrio.
Nel mitocondrio, gli elettroni vengono trasferiti al NAD+ o FAD da diversi substrati del ciclo degli
ATC, e cioè da isocitrato, α-chetoglutarato, malato e succinato.

Trasporto degli Elettroni


Le molecole di NADH che si formano nella matrice si dissociano dalla loro rispettiva deidrogenasi
e si legano alla NADH deidrogenasi, una proteina integrale della membrana interna del
mitocondrio. Diversamente dagli altri enzimi del ciclo degli ATC, la succinato deidrogenasi,
l’enzima che catalizza la formazione del FADH2 è un componente della membrana mitocondriale
interna. In entrambi i casi, gli elettroni ad alta energia associati col NADH o FADH2 vengono
trasferiti attraverso una serie di specifici trasportatori di elettroni che costituiscono la catena di
trasporto degli elettroni (o catena respiratoria) della membrana mitocondriale interna.

Tipo di trasportatori di elettroni


La catena di trasporto degli elettroni è formata da cinque tipi di trasportatori di elettroni legati
alla membrana: flavoproteine, citocromi, atomi di rame, ubichinone e proteine ferro-zolfo. Con
l’eccezione dell’ubichinone, tutti i centri redox che accettano e cedono elettroni nella catena
respiratoria sono gruppi prostetici, cioè composti di natura non amminoacidica associati a
proteine.
- Le flavoproteine: consistono in un polipeptide strettamente legato ad uno di due gruppi
prostetici simili, il flavin adenin dinucleotide (FAD) e il flavin mononucleotide (FMN). Le
principali flavoproteine dei mitocondri sono la NADH deidrogenasi della catena di
trasporto degli elettroni e la succinato deidrogenasi del ciclo degli ATC.
- I citocromi: sono proteine che contengono gruppi eme. Nella catena di trasporto degli
elettroni sono presenti almeno tre specie di citocromi a,b,c, differenti l’uno dall’altro
per sostituzioni nel gruppo eme.
- Tre atomi di rame: inseriti in un unico complesso proteico della membrana mitocondriale
interna accettano e donano un singolo elettrone alla volta, alternandosi tra gli stati di
ossidazione Cu2+ e Cu3+.
- L’ubichinone (UQ o coenzima Q): è una molecola liposolubile contenente una lunga
catena idrofobica formata da cinque subunità isoprenoidi. Ogni ubichinone è capace di
accettare e di donare due elettroni e due protoni. La molecola parzialmente ridotta è il
radicale libero ubisemichinone, quella completamente ridota è l’ubichinolo (UQH2).
L’ubichinone rimane all’interno del doppio strato lipidico della membrana, nel quale è in
grado di diffondere lateralmente.
- Le proteine ferro-zolfo: sono proteine contenenti ferro in cui gli atomi di ferro non sono
posti all’interno di un gruppo eme, ma sono invece legati strettamente ad atomi di zolfo
inorganico come parte di un centro ferro-zolfo. I centri più comuni contengono due o
quattro atomi di ferro e zolfo, legati alla proteina tramite residui di cisteina. L’intero
complesso è in grado di accettare o di donare soltanto un singolo elettrone. Nei
mitocondri sono state identificate più di una dozzina di proteine ferro-zolfo.

I trasportatori della catena di trasporto degli elettroni sono disposti spazialmente in ordine di
potenziale redox crescente. Ogni trasportatore è ridotto dall’acquisto di elettroni dal
trasportatore precedente e, successivamente, è ossidato dalla cessione di elettroni al
trasportatore che segue. Così, gli elettroni passano da un trasportatore al successivo, perdendo
energia mentre si muovono in discesa lungo la catena.
L’’accettore finale di questo passamano è l’O2, che accetta gli elettroni ormai privi di energia
ed è ridotto ad acqua.
L’identificazione dei composti ossidati e di quelli ridotti in presenza di vari inibitori permette di
determinare la sequenza dei trasportatori.
La tendenza degli elettroni ad essere trasferiti da un trasportatore all’altro dipende dalla
differenza di potenziale tra i due centri redox, ma la velocità di trasferimento dipende
dall’attività catalitica delle proteine coinvolte.

Complessi di trasporto degli elettroni: Quando la membrana mitocondriale interna è trattata con
detergenti, si possono isolare i diversi trasportatori di elettroni come componenti di quattro
complessi distinti, asimmetrici, che attraversano completamente la membrana, definiti come
complessi I, II, III, IV.
Ognuno di questi quattro componenti pu avere una funzione diversa nella via ossidativa nel
complesso. Due componenti della catena di trasporto, il citocromo c e l’ubichinone, non fanno
parte di nessuno dei quattro complessi. Si pensa che questi due si muovano all’interno o lungo la
membrana, funzionando come navetta per gli elettroni tra i grossi complessi proteici,
relativamente immobili. Una volta giunti all’interno di uno dei grandi complessi multiproteici, si
ritiene che gli elettroni viaggino lungo vie definite, tra centri di ossido-riduzione adiacenti, le
cui posizioni relative sono fisse.
Quando il NADH è il donatore di elettroni, questi entrano nella catena respiratoria attraverso il
complesso I, che trasferisce gli elettroni all’ubichinone generando l’ubichinolo. A differenza del
NADH, che pu diffondere lontano dalla sua deidrogenasi solubile, il FADH2 rimane legato
covalentemente alla succinato deidrogenasi, un componente del complesso II.
Quando il donatore è il FADH2, gli elettroni sono passati direttamente all’ubichinone, saltando
l’estremità a monte della catena, che ha un potenziale redox troppo negativo per accettare gli
elettroni meno energetici di flavin-nucleotide.
Ci sono tre siti in cui il trasferimento degli elettroni si accompagna ad un grande rilascio di
energia libera. Ognuno di questi siti d’accoppiamento è posto fra due trasportatori che fanno
parte di uno dei tre complessi I, III e IV.
Questi tre complessi proteici sono spesso conosciuti come pompe protoniche. La traslocazione
dei protoni da parte di questi complessi di trasporto degli elettroni produce il gradiente
protonico che rende possibile la sintesi dell’ATP. La capacità dei complessi I, III e IV di agire
come unità indipendenti traslocatrici di protoni pu essere dimostrata dalla loro purificazione,
seguita dall’incorporazione separata in vescicole lipidiche artificiali. In presenza di un donatore
di elettroni adatto, queste vescicole contenenti proteine sono capaci di accettare elettroni e di
traslocare protoni attraverso la loro membrana.
Complesso I (o NADH deidrogenasi): Rappresenta l’ingresso alla catena di trasporto degli
elettroni, dato che catalizza il trasferimento di una coppia di elettroni dal NADH all’ubichinone
(UQ) per formare l’ubichinolo (UQH2). Il complesso I dei mammiferi contiene 45 diversi subunità;
Sette subunità (tutti polipeptidi idrofobici che si estendono completamente attraverso la
membrana) sono codificate da geni mitocondriali e sono omologhe ai polipeptidi batterici. Il
complesso I include una flavoproteina contenente FMN che ossida NADH, almeno sette diversi
centri ferro-zolfo e due molecole legate di ubichinone.
Complesso II (o succinato deidrogenasi): è costituito da quattro polipeptidi: due subunità
idrofobiche che ancorano la proteina nella membrana e due subunità idrofiliche che
comprendono l’enzima del ciclo degli ATC succinato deidrogenasi. Il complesso II fornisce una
via per traslocare elettroni a “bassa energia” dal succinato al FAD e all’ubichinone.
Il complesso II inoltre, contiene un gruppo eme, che si pensa attragga gli elettroni rilasciati,
prevedendo, quindi, la formazione di specie radicaliche di superossido dannose. Il trasferimento
di elettroni attraverso il complesso II non è accompagnato dalla traslocazione di protoni.
Complesso III (o citocromo bc1): catalizza il trasferimento di elettroni dall’ubichinolo al
citocromo c. Si pensa che per ogni paio di elettroni trasferiti attraverso il complesso III, quattro
protoni vengono pompati attraverso la membrana. I protoni vengono rilasciati nello spazio
intermembrana in due tappe separate.
I due protoni derivano dalla molecola di ubichinolo che entra nel complesso. Due ulteriori
protoni vengono rimossi dalla matrice e trasportati attraverso la membrana come facenti parte
di una seconda molecola di ubichinolo. Tre delle subunità del complesso III contengono gruppi
redox: il citocromo b contiene due diversi gruppi eme, con differenti potenziali redox, il
citocromo c1 e una proteina ferro-zolfo. Il citocromo b è l’unico polipeptide del complesso ad
essere codificato da un gene mitocondriale.
Complesso IV (o citocromo c ossidasi): La tappa finale del trasporto degli elettroni in un
mitocondrio è il trasferimento successivo di elettroni dal citocromo c ridotto all’ossigeno,
secondo la reazione:
2 cyt c²⁺ + 2 H⁺ + ½ O₂  2 cty c³⁺ + H₂O

Per ridurre un’intera molecola di O₂

4 cyt c²⁺ + 4 H⁺ + O₂  4 cty c³⁺ + 2 H₂O


La riduzione dell’ossigeno è catalizzata dal complesso IV, un enorme assemblaggio di polipeptidi,
più comunemente chiamato citocromo-ossidasi. La citocromo-ossidasi è stato il primo
componente della catena di trasporto degli elettroni che si è capito funzionare come una pompa
protonica.
L’aggiunta di citocromo c ridotto nel mezzo viene accompagnata dall’espulsione degli ioni H⁺
dalle vescicole, misurata come una caduta del pH circostante. Sia dentro un liposoma sia nella
membrana mitocondriale interna, la traslocazione di protoni è associata a cambiamenti
conformazionali generati dal rilascio di energia che accompagna il trasferimento degli elettroni.
Per ogni molecola di O₂ ridotta dalla citocromo ossidasi, si pensa che 8 protoni vengano presi
dalla matrice; quattro vengono consumati nella condensazione di due molecole d’acqua e gli
altri quattro protoni vengono trasferiti al di là della membrana e rilasciati nello spazio
intermembrana.
La reazione complessiva è quindi:

4 cyt c²⁺ + 8 H⁺ (della matrice) + O₂  4 cty c³⁺ + 2 H₂O + 4 H⁺ (del citosol)


Citocromo-ossidasi: questa enorme molecola è composta da 13 subunità. Tre polipeptidi del
complesso sono codificati dal genoma mitocondriale e contengono tutti e quattro i centri redox
della proteina.
Il movimento degli elettroni attraverso i centri redox della citocromo-ossidasi avviene così: gli
elettroni vengono trasferiti, uno alla volta, dal citocromo c, attraverso un centro rame
bimetallico (CuA) della subunità II, ad un gruppo eme (eme a) della subunità I. Da qui, gli
elettroni vengono passati ad un centro redox situato nella subunità I che contiene un secondo
eme (eme a₃) ed un secondo atomo di rame (CuB).
Il ricevere i primi due elettroni riduce il centro bnucleare a₃-CuB. Una volta che il centro
binucleare ha accettato il suo secondo elettrone, una molecola di O₂ si lega al centro. Il doppio
legame della molecola O=O è poi spezzato appena gli atomi di ossigeno accettano una coppia di
elettroni dal centro binucleare ridotto a₃-CuB, formando un anione perossido O₂²⁻. Lo ione
perossido è il componente a maggiore energia della reazione e reagisce immediatamente,
estraendo un terzo elettrone o dallo stesso eme o da un residuo di amminoacido adiacente.
Contemporaneamente, il centro binucleare accetta due protoni dalla matrice, rompendo il
legame covalente O—O e riducendo uno degli atomi di ossigeno.
Il passaggio di un quarto elettrone e l’entrata di due ulteriori protoni dalla matrice portano alla
formazione di due molecole d’acqua.
Per ogni protone rimosso dalla matrice, resta un eccesso di carica negativa (sotto forma di un
OH⁻), contribuendo così direttamente alla formazione del gradiente elettrochimico tra i due lati
della membrana mitocondriale interna.
I protoni prelevati dalla matrice vengono utilizzati in due modi completamente diversi. Per ogni
molecola di O₂ che viene ridotta a 2H₂O dalla citocromo-ossidasi:
1)Quattro ioni H⁺ vengono consumati nella reazione chimica
2)Quattro ulteriori ioni H⁺ vengono trasportati attraverso la membrana mitocondriale.
I primi quattro protoni possono essere considerati dei “protoni-substrato” e gli altri quattro dei
“protoni-pompati”. Il movimento di entrambi i gruppi di protoni contribuisce al gradiente
elettrochimico transmembrana.

TRASLOCAZIONE DEI PROTONI E LA CREAZIONE DI UNA FORAZA MOTRICE PROTONICA


Abbiamo visto che l’energia libera rilasciata durante il trasporto degli elettroni è utilizzata per
spostare i protoni della matrice nello spazio intermembrana e nel citosol. La traslocazione dei
protoni attraverso la membrana interna è un processo elettrogenico (produce un voltaggio),
perché ha come risultato l’accumulo di un maggior numero di cariche positive nello spazio
intermembrana e nel citosol, e di maggior numero di cariche negative all’interno della matrice.
Quindi, bisogna considerare due componenti nel gradiente protonico.
Uno dei componenti è la differenza di concentrazione tra gli ioni idrogeno da un lato della
membrana rispetto all’altro lato, e questo è un gradiente di pH (ΔpH).
L’altro è il voltaggio (ψ) che deriva dalla separazione di carica tra i due lati della membrana. Un
gradiente che abbia una componente di concentrazione (chimica) ed una elettrica (voltaggio) è
detto gradiente elettrochimico. L’energia presente in ambedue le componenti del gradiente
elettrochimico dei protoni pu essere combinata ed espressa come forza motrice protonica (Δp),
detta anche forza proton-motrice.
Δp = ψ – 59 ΔpH
Il contributo alla forza proton-motrice, rispettivamente, del potenziale elettrico e del gradiente
di pH dipende dalle proprietà di permeabilità della membrana interna.
Se la differenza di concentrazione dei protoni è molto grande, potrebbe compromettere
l’attività degli enzimi citoplasmatici.
Il DNP disaccoppia i processi dell’ossidazione del glucosio e della fosforilazione dell’ADP. Per via
di questa sua proprietà, il DNP si usa molto in laboratorio per inibire la formazione di ATP.
Questo veleno disaccoppia l’ossidazione e la fosforilazione perché si combina con i protoni e,
esseno liposoluble, trasporta i protoni attraverso la membrana mitocondriale interna secondo il
loro gradiente elettrochimico. Il mantenimento della forza proton-motrice richiede che la
membrana mitocondriale interna rimanga altamente impermeabile ai protoni, altrimenti il
gradiente prodotto dal trasporto degli elettroni viene immediatamente dissipato dalla
retrodiffusione dei protoni nella matrice, rilasciando energia sotto forma di calore.
La membrana mitocondriale interna di alcune cellule contiene delle proteine che agiscono come
agenti disaccoppianti endogeni (naturali); queste proteine, chiamate, proteine disaccoppianti (o
UCP), abbondano soprattutto nel grasso bruno dei mammiferi, che ha la funzione di produrre
calore durante l’esposizione a basse temperature. Nell’uomo, anche i bambini si basano su
depositi di grasso bruno per mantenere la temperatura corporea (la maggior parte di queste
cellule contenenti grasso bruno vengono poi perse con la crescita).
IL MACCHINARIO PER LA SINTESI DI ATP
L’idrolisi dell’ATP è la reazione inversa della sua formazione. Le sfere F₁ (fattore
d’accoppiamento 1) contengono il sito catalitico in cui avviene normalmente la sintesi dell’ATP.
Bisogna ricordare che:
1. Gli enzimi non hanno effetto sulla costante d’equilibrio della reazione che catalizzano;
2. Gli enzimi sono in grado di catalizzare sia le reazioni dirette sia quelle inverse; Di
conseguenza, la direzione di una reazione catalizzata da enzimi, ad ogni momento, dipende
dalle condizioni prevalenti.

ATP sinteasi:
La sfera F₁ è il sito catalitico dell’enzima che fabbrica l’ATP nel mitocondrio, ma questo non è
tutto. L’enzima sintetizzante l’ATP, che è detto ATP sinteasi, è un complesso proteico a forma
di fungo formato da due componenti principali: una testa sferica F₁ e una sezione basale, detta
F₀, inclusa nella membrana interna.
Le due porzioni sono connesse sia da uno stelo centrale che da uno periferico. Le teste F₁
dell’ATP sinteasi batterica e mitocondriale hanno una struttura altamente conservata;
entrambe contengono cinque polipeptidi α₃β₃δγε. Le subunità α e β sono disposte alternate
dentro la testa F₁, in un modo che ricorda gli spicchi d’arancia.
Ogni F₁ contiene tre siti catalitici per la sintesi di ATP, uno su ogni subunità β e la subunità γ si
estende dall’estremità della testa F₁ attraverso l’asse centrale e si congiunge con la base F₀.
La porzione F₀ dell’ATP sinteasi richiede nella membrana e consiste in tre polipeptidi differenti e
le subunità nell’anello c sono circa 10-14.
La base F₀ contiene un canale attraverso il quale i protoni sono condotti dallo spazio
intermembrana alla matrice. La presenza di questo canale è dimostrata attraverso esperimenti
in cui la membrana mitocondriale è ridotta in frammenti che si chiudono in vescicole
membranose dette particelle submitocondriali. Le particelle submitocondriali intatte,
contengono ATP sinteasi nella membrana, sono capaci di ossidare substrati, di generare un
gradiente di protoni e di sintetizzare ATP.

La teoria del cambio di legame


1. L’energia rilasciata dal movimento dei protoni non viene usata direttamente per la
fosforilazione dell’ADP, ma principalmente per cambiare l’affinità di legame nel sito
attivo dell’ATP. È stato dimostrato che una volta che l’ADP
e il Pi si trovano legati all’interno del sito catalitico dell’ATP sinteasi, i due reagenti
condensano rapidamente e formano una molecola di ATP saldamente ancorata, senza
bisogno di ulteriore energia.
La reazione sarà: ADP legato all’enzima + Pi legato all’enzima  ATP legato all’enzima + H₂O
avendo una costante di equilibrio prossima a 1 (ΔG° = 0) pu avvenire senza aggiunta di energia.
Questo non significa che l’ATP si possa formare dall’ADP senza dispendio energetico. Piuttosto,
che per la fosforilazione in se stessa è invece richiesta energia per il rilascio del prodotto dal
sito catalitico, a cui è saldamente ancorato.
2. Ogni sito attivo progredisce successivamente attraverso tre distinte conformazioni che
hanno diverse affinità per il substrato e per il prodotto.
Ogni testa F₁ contiene tre siti catalitici, uno per ognuna delle tre subunità β. Questi tre
siti catalitici mostrano diverse proprietà chimiche e sono presenti in diverse
conformazioni, che li porta ad avere diversa affinità per i nucleotidi. Ad ogni dato
momento, un sito si trova nella conformazione L (“loose” = lassa), in cui ADP e Pi sono
legati in maniera lassa; un secondo sito è nella conformazione T (“tight” = stretta), nella
quale i nucleotidi (ADP + Pi o ATP prodotto) sono legati strettamente; un terzo sito è
nella conformazione O (“open” = aperta) che, data la sua scarsa affinità per i nucleotidi,
permette il rilascio dell’ATP.
Nonostante le differenze tra i tre siti catalitici, Boyer dimostr che tutte le molecole di
ATP prodotte da un enzima attivo sono sintetizzate dallo stesso meccanismo catalitico.
Cioè sembrava che tutti e tre i siti catalitici dell’enzima stessero operando
identicamente. Boyer propose che ognuno dei tre siti catalitici passasse in sequenza
attraverso le conformazioni L, T e O.
3. L’ATP è sintetizzato per catalisi rotazionale, in cui una parte dell’ATP sinteasi ruota
rispetto all’altra. Per spiegare i cambiamenti sequenziali della conformazione in ognuno
dei siti catalitici , Boyer propose che le subunità α e β che formano un anello esagonale
di subunità all’interno della testa F₁ ruotassero rispetto all’asse centrale. In questo
modello, detto catalisi rotazionale, il movimento di rotazione è impresso dal passaggio
dei prodotti attraverso la membrana per il canale che si trova nella base F₀. Quindi
secondo questo modello, l’energia elettrica accumulata nel gradiente protonico viene
trasformata in energia meccanica dallo stelo rotante, e viene trasformata nell’energia
chimica accumulata nell’ATP.

Nei siti catalitici delle tre subunità β, sono state trovate strutture che corrispondono alle
conformazioni L, T ed O. Si evidenzi che la subunità γ dell’enzima era prettamente posizionata
all’interno dell’ATP sinteasi in modo da trasmettere i cambiamenti conformazionali dal settore
F₀ sulla membrana ai siti catalitici dell’F₁.
L’estremità apicale della subunità γ è altamente asimmetrica e, ad ogni dato istante, le sue
diverse parti interagiscono con le diverse subunità β, inducendole ad assumere le diverse
conformazioni (L, T e O). Quando la subunità γ ruota, ogni sito di legame su questa subunità
interagisce successivamente con le tre subunità β di F₁. Durante un singolo ciclo catalitico, la
subunità γ ruota completamente di 360°, facendo passare in sequenza ogni sito catalitico
attraverso le tre conformazioni L, T e O.
La condensazione di ADP e Pi a formare ATP avviene nella conformazione T.
Diversi esperimenti hanno provato che l’ATP sinteasi opera come un motore rotante.

Fasi del meccanismo del “cambio di legame” per la sintesi di ATP:


All’inizio del ciclo, il sito è nello stato aperto (O) e i substrati ADP e Pi stanno entrando nel sito.
Nella tappa 1, il movimento dei protoni attraverso la membrana induce il passaggio della
conformazione lassa (L), in cui i substrati sono lassamente legati.
Nella tappa 2, il movimento di ulteriori protoni induce il passaggio alla conformazione stretta
(T), in cui l’affinità per i substrati aumenta, attaccandoli strettamente al sito catalitico. Nella
tappa 3, l’ADP e Pi attaccati saldamente condensano spontaneamente a formare una molecola
di ATP saldamente legata (in questa tappa non è necessario un cambio conformazionale);
Nella tappa 4, il movimento di protoni aggiuntivi induce il passaggio alla conformazione aperta
(O), in cui l’affinità per l’ATP è molto minore, il che permette al prodotto di essere rilasciato
dal sito. Una volta che l’ATP si è dissociato, il sito catalitico è disponibile per
il legame col substrato e il ciclo si ripete.

Ruolo della porzione F₀ nell’ATP sinteasi


È stato dimostrato che:
1. Le subunità c della base F₀ si dispongono in un anello all’interno del doppio strato
lipidico;
2. L’anello c è saldato alla subunità γ dello stelo;
3. Il movimento secondo gradiente dei protoni attraverso la membrana guida la rotazione
dell’anello della subunità c;
4. La rotazione dell’anello c di F₀ crea la forza di torsione (momento di torsione) che
produce la rotazione dell’annessa subunità γ, che porta alla sintesi e al rilascio di ATP.

Si pensa che le subunità b siano componenti strutturali primarie dell’ATP sinteasi. Le due
subunità b allungate formano uno stelo periferico che connette le porzioni F₀ e F₁ dell’enzima e
si pensa che, assieme alla subunità δ di F₁, sorreggano le subunità α ₃β₃ in una posizione fissa,
mentre le subunità γ ruota all’interno del centro del complesso.
La rotazione dell’anello c dell’F₀ durante la sintesi dell’ATP è stata dimostrata
sperimentalmente in preparazioni di membrane, confermando sia l’anello c che la subunità γ
agiscono come rotori durante l’attività dell’enzima. Ogni subunità c è costruita come una
forcina: contiene due eliche transmembrana connesse da un’ansa idrofilica che si proietta verso
la testa F₁. Si pensa che le anse polari situate sulla sommità della subunità c formino un sito di
legame per la base delle subunità γ e ε, che assieme costituiscono un “piede” che è attaccato
all’anello c. Di conseguenza, la rotazione dell’anello c è la forza motrice che fa ruotare la
subunità γ connessa.
Le subunità che compongono l’anello c si spostano successivamente oltre una subunità
stazionaria a e che i protoni sono presi uno alla volta dallo spazio intermembrana da ogni
subunità c e trasportati per un giro completo prima di essere rilasciati nella matrice. In questo
modello, ogni subunità a ha due mezzi canali che sono fisicamente separati (sfalsati) l’uno
dall’altro. Un mezzo canale conduce dallo spazio intermembrana (citosolico) all’interno della
subunità a, mentre l’altro porta dall’interno della subunità a alla matrice.
Si suppone che ogni protone si sposti dallo spazio intermembrana attraverso il mezzo canale e si
leghi ad un residuo di acido aspartico carico negativamente, situato alla superficie ella subunità
c contigua.
Questo legame genera un cambiamento conformazionale nella subunità c e la induce a ruotare
approssimativamente di 30° in senso antiorario. Questo movimento allinea la subunità
successiva dell’anello (che aveva ricevuto il protone in precedenza) col secondo mezzo canale
della subunità a. Una volta in posizione, l’acido aspartico libera il protone che aveva attaccato,
che diffonde nella matrice.
In seguito alla dissociazione del protone, la subunità c ritorna alla sua conformazione originale
ed è pronta ad accettare un altro protone dallo spazio intermembrana e a ripetere il ciclo.
L’acido aspartico di ogni subunità c si comporta quindi come un trasportatore rotante di protoni.
Il protone salta sulla “ruota” ad una determinata stazione di salita ed è trasportato per un giro
prima di essere liberato ad una determinata stazione di discesa. Il movimento dell’anello è
alimentato dai cambiamenti conformazionali associati all’acquisto e al rilascio sequenziale di
protoni da parte del residuo di acido aspartico di ogni subunità c.
La traslocazione di 12 protoni (ipotizzando 12 subunità) porta alla rotazione completa di 360°
dell’anello c e della subunità γ, ed alla sintesi e al rilascio di tre molecole di ATP.

La forza proton-motrice
Per ottenere l’energia necessaria per le loro attività, i mitocondri si avvalgono di una sorgente
alternativa, la forza proton-motrice. Per esempio, la forza motrice protonica guida l’assunzione
dell’ADP e del Pi nei mitocondri in cambio di ATP e H+, rispettivamente.
In altri casi invece, la forza motrice protonica pu essere utilizzata come sorgente di energia: per
“trascinare” gli ioni calcio all’interno del mitocondrio; per fornire energia agli eventi che
portano alla fusione mitocondriale; per far si che specifici polipeptidi possano entrare nel
mitocondrio.
I livelli di ATP svolgano un ruolo importante nel controllo della velocità della glicolisi e del calcio
degli ATC, regolando l’attività di alcuni enzimi chiave. All’interno del mitocondrio, il livello di
ADP è una chiave che determina il ritmo respiratorio.
Quando i livelli di ADP sono bassi, i livelli di ATP sono in genere elevati e non c’è bisogno che
venga ossidato dell’altro substrato per fornire gli elettroni per la catena respiratoria. In queste
condizioni, vi è poca sintesi di ATP, di modo che i protoni non possano rientrare di nuovo nella
matrice mitocondriale attraverso l’ATP sinteasi. Ci porta ad un accumulo della forza motrice
protonica, che a sua volta inibisce le reazioni di pompaggio protonico della catena di trasporto
degli elettroni e il consumo di ossigeno da parte della citocromo-ossidasi. Quando il rapporto
ATP/ADP diminuisce, il consumo di ossigeno aumenta bruscamente.

I PEROSSISOMI
Sono semplici vescicole circondate da membrana, che spesso contengono un nucleo denso,
cristallino, formato da enzimi ossidativi. I perossisomi (o microcorpi) sono organelli
multifunzionali, che contengono più di 50 enzimi che partecipano ad attività molto diverse tra
loro, come l’ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga (VLCFA) e la sintesi dei
plasmalogeni, che sono una non usuale classe di fosfolipidi del tessuto nervoso, in cui uno degli
acidi grassi è legato al glicerolo da un legame etereo, invece che da un legame esterico. I
plasmalogeni sono molto abbondanti nelle membrane mieliniche che isolano gli assoni nel
cervello. Alterazioni della sintesi di plasmalogeni possono portare a gravi malattie neurologiche.
Condividono diverse proprietà con i mitocondri: entrambi si duplicano per scissione da organelli
preesistenti; entrambi importano delle proteine già formate dal citosol; entrambi sono
impegnati nel metabolismo ossidativo.
Questi organelli sono stati chiamati “perossisomi” perché sono il sito di formazione e di
degradazione del perossido di idrogeno (H₂O₂), un agente ossidante tossico e altamente reattivo.

I SISTEMI DELLE MEMBRANE CITOPLASMATICHE: STRUTTURA, FUNZIONE E TRAFFICO DI


MEMBRANA
All’inizio del XX secolo si scoprì l’esistenza di una estesa rete di membrane all’interno del
microplasma, ma solo negli anni ’40 i biologi iniziarono a rendersi conto dei diversi insiemi di
strutture membranose presenti nel citoplasma della maggioranza delle cellule eurcariotiche; gli
studiosi osservarono vescicole delimitate da membrana di diametro variabile contenenti
materiale di differente densità elettronica, lunghi canali delimitati da membrane che si
ramificano nel citoplasma per formare una rete interconnessa di canali e pile di sacchi appiattiti
delimitati da membrane, dette cisterne.
Divenne evidente che il citoplasma delle cellule eucariotiche era suddiviso in vari compartimenti
distinti delimitati da barriere costituite da membrane. Le strutture membranose del citoplasma
componevano organelli distinti che potevano essere identificati nelle diverse cellule. Ognuno
dei vari organelli contiene un particolare complemento di proteine ed è specializzato per
particolari tipi di attività.
Sebbene ciascuno di questi organelli membranosi abbia la sua propria struttura e funzione, il
loro insieme costituisce il sistema delle endomembrane che è interconesso strutturalmente e
funzionalmente.
(I mitocondri ed i cloroplasti non sono parte di questo sistema interconnesso).

Gli organelli del sistema di endomembrane sono elementi di una rete dinamica e integrata in cui
i materiali sono trasportati avanti e indietro da un distretto all’altro della cellula. Per la maggior
parte i materiali sono trasportati da un organello all’altro in piccole vescicole di trasporto
rivestite di membrana, che si formano per gemmazione da un compartimento di membrana
donatore.
Queste vescicole di trasporto si muovono nel citoplasma secondo direzioni precise, spesso spinte
da proteine motrici lungo binari formati da microtubuli del citoscheletro. Quando esse
raggiungono la loro destinazione, si fondono con la membrana di un compartimento accettore
differente, che riceve sia il carico solubile della vescicola che l’imballaggio membranoso. Cicli
ripetuti di gemmazione e fusione trasportano il materiale secondo percorsi recisi all’interno
delle cellule
Sono stati identificati molti di questi percorsi nel citoplasma. Si pu distinguere una via
biosintetica in cui le proteine sono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico, modificate nel
passaggio attraverso il commplesso di Golgi e trasportate da questo alle varie destinazioni quali
la membrana plasmatica, i lisosomi ecc.
Questa via è definita anche come la via secretoria, dal momento che molte delle proteine
sintetizzate nel reticolo endoplasmatico sono destinate ad essere secrete al di fuori della
cellula.
Le attività secretorie delle cellule si possono dividere in due tipi: costitutive e regolate.
Durante la secrezione costitutiva, i materiali sono trasportati, in vescicole secretorie, dai loro
siti di sintesi e scaricati nello spazio extracellulare in maniera continua. La maggior parte delle
cellule svolge una secrezione costitutiva, processo che contribuisce non solo alla formazione
della matrice extracellulare, ma anche alla formazione della stessa membrana plasmatica.

Durante la secrezione regolata, i materiali che devono essere secreti sono accumulati in
comparti delimitati da membrana e scaricati soltanto in risposta ad uno stimolo appropriato (ad
esempio, avviene nelle cellule endocrine che rilasciano ormoni e nelle cellule nervose che
rilasciano neurotrasmettitori).
In alcune di queste cellule, i materiali che devono essere secreti sono accumulati in grossi
granuli di secrezione, densamente impacchettati e rivestiti di membrana.
Proteine, lipidi e polisaccaridi complessi sono trasportati attraverso la cellula lungo percorsi di
secrezione o di biosintesi.
Mentre la via secretoria trasporta materiale al di fuori della cellula, la via endocitica funziona in
direzione opposta. Seguendo la via endocitica, i materiali si muovono dalla superficie esterna
della cellula verso i compartimenti cellulari, come gli endosomi e i lisosomi, situati all’interno
del citoplasma .
Entrambi i tipi di trasporto richiedono un definito quadro del traffico, per assicurare che i
materiali indirizzati a differenti destinazioni siano consegnati correttamente.
Le proteine di membrana devono essere indirizzate a particolari organelli, quali un lisosoma o
una cisterna del Golgi. Questi vari tipi di “carico” – proteine di secrezione, enzimi lisosomali e
proteine di membrana – sono invitati a destinazioni cellulari predeterminate attraverso l’uso di
specifici “indirizzi” o segnali di smistamenti che sono codificati nella sequenza amminoacidica
della proteina oppure negli oligosaccaridi legati. I segnali di smistamento, a loro volta, sono
riconosciuti da specifici recettori della membrana o del rivestimento superficiale delle vescicole,
assicurando che la proteina sia trasportata alla giusta destinazione.
Per la maggior parte il macchinario responsabile di questo complesso sistema di distribuzione
consiste di proteine solubili che sono reclutate alla superficie di membrana specifica dove
svolgono l’attività a loro assegnata.

RETICOLO ENDOPLASMATICO
Il reticolo endoplasmatico (RE) è diviso in due ampie categorie: il reticolo endoplasmatico
rugoso (RER) e il reticolo endoplasmatico liscio (REL). Entrambi compongono un sistema di
membrane che racchiude uno spazio, o lume, che è separato dal citosol circostante. La
composizione dello stato luminale o cisternale all’interno delle membrane del reticolo
endoplasmatico è del tutto differente da quella dello spazio citosolico che le circonda. I due
tipi di RE presentano molte proteine in comune e svolgono alcune attività comuni, come la
sintesi di certi lipidi e di colesterolo. Allo stesso tempo molte proteine si trovano solo in un tipo
di RE. Quindi, i due tipi di RE presentano importanti differenze strutturali e funzionali. Il
reticolo endoplasmatico rugoso ha ribosomi legati alla superficie citosolica, mentre quello liscio
non presenta ribosomi associati. Il RER appare come un organello composto da estese
membrane e sacche appiattite (cisterne). Il RER è continuo con la membrana esterna
dell’involucro lineare, la quale presenta anch’essa ribosomi sulla sua superficie citosolica. Le
membrane del REL sono tipicamente molto curvate e tubulari e formano un sistema di canali
interconnessi che si diramano nel citoplasma. Quando le cellule sono omogeneizzate, il REL si
frammenta in vescicole dalla superficie liscia, mentre il RER in vescicole dalla superficie rugosa.
Tipi diversi di cellule hanno quantità marcatamente differenti di un tipo di RE o dell’altro, a
seconda dell’attività della cellula.

Reticolo Endoplasmatico Liscio


È molto esteso in alcuni tipi cellulari, incluso il muscolo scheletrico, i tubuli renali e le ghiandole
endocrine che producono steroidi. Le funzioni del REL includono:
- Sintesi degli ormoni steroidei nelle cellule endocrine delle gonadi e della corteccia
surrenale
- Detossificazione nel fegato di un gran numero di composti organici, fra cui per esempio,
barbiturici ed etanolo. La detossificazione è svolta da un sistema di enzimi che
trasferiscono l’ossigeno (ossigenasi), tra cui la famiglia del citocromo P450. Questi enzimi
sono caratteristici per la mancanza di specificità del substrato, essendo capaci di ossidare
migliaia di composti idrofobici differenti che convertono in derivati più idrofilici, più
facilmente escreti. Gli effetti non sono sempre positivi. I citocromi P450 metabolizzano
molti farmaci da prescrizione e variazioni genetiche di questi enzimi fra gli esseri umani
possono spiegare le differenze che si riscontrano da individuo a individuo nell’efficacia e
negli effetti collaterali di molti farmaci.
- Sequestro di ioni calcio nel citoplasma nelle cellule. Il rilascio regolato di Ca²⁺ dal REL di
cellule muscolari scheletriche o cardiache (reticolo sarcoplasmatico nel caso di quelle
muscolari) attiva la contrazione.
Reticolo Endoplasmatico Rugoso
Le prime ricerche sulla funzione del RER furono effettuate su cellule che secernono grandi
quantità di proteine, come le cellule acinose del pancreas o le cellule del rivestimento del tubo
digerente che secernono muco.
Gli organelli di tali cellule epiteliali secernenti sono disposti nella cellula in modo da produrre
una polarità distinta da una parte all’altra. Il nucleo ed un gran numero di cisterne del RER sono
localizzati vicino alla superficie basale della cellula, che è rivolta verso il circolo sanguigno. Il
complesso di Golgi è situato nella regione centrale della cellula.
Il citoplasma all’estremità apicale della cellula contiene granuli di secrezione, il cui contenuto
pronto per essere rilasciato nel dotto all’arrivo di un appropriato segnale.
La polarità di queste cellule epiteliali ghiandolari riflette il flusso di prodotti secretori attraverso
la cellula, dal loro sito di sintesi al loro sito di secrezione. Il RER è il punto di partenza della via
biosintetica: è il sito della sintesi delle proteine, delle catene di carboidrati e dei fosfolipidi che
viaggiano attraverso i compartimenti membranosi della cellula.

Sintesi di proteine sui ribosomi legati a membrane o sui ribosomi liberi


Esperimenti hanno mostrato che le proteine sono sintetizzati in due luoghi distinti all’interno
della cellula.
1. Alcuni polipeptidi sono sintetizzati sui ribosomi attaccati alla superficie citosolica delle
membrane del RER. Questi comprendono: proteine secrete dalla cellula, proteine
intregrali di membrana e proteine solubili che risiedono all’interno dei compartimenti del
sistema delle endomembrane, che includono RE, complesso di Golgi, lisosomi, endosomi,
vescicoli e vacuoli vegetali.
2. Altri polipeptidi sono sintetizzati sui ribosomi “liberi”, cioè quelli che non aderiscono al
RE, e successivamente rilasciati nel citosol. Questa classe comprende: proteine destinate
a rimanere nel citosol, le proteine periferiche della superficie interna delle membrane,
proteine che sono trasportate al nucleo e proteine che devono essere incorporate in
perossisomi, cloroplasti e mitocondri.

Il sito di sintesi di una proteina si è determinato dalla sequenza di amminoacidi nella porzione
Nterminale del polipeptide, che è la prima parte ed emergere dal ribosoma durante la sintesi
proteica. Questo suggerisce che
1. Le proteine di secrezione contengono una speciale sequenza segnale alla loro estremità
N-terminale, che dirige il polipeptide emergente ed il ribosoma alla membrana del RE.
2. Il polipeptide si muove nelle cisterne del RE attraverso un canale acquoso proteico della
membrana RE. Gli autori proposero che il polipeptide si muovesse attraverso la
membrana, man mano che veniva sintetizzato, cioè. Co-taduzionalmente.
Questa proposta è chiamata ipotesi di segnale ed è stata sostenuta da un gran numero di prove
sperimentali.

Sintesi delle proteine secretorie, lisosomali o del vacuolo vegetale sui ribosomi legati alle
membrane
La sintesi del polipeptide inizia dopo che un RNA messaggero si lega ad un ribosoma libero, cioè
che non è legato ad una membrana citoplasmatica. Si pensa che tutti i ribosomi siano identici. I
polipeptidi che devono essere assemblati sui ribosomi legati alle membrane contengono una
sequenza segnale, che include una successione di 6-15 residui amminoacidici idrofobici, che
indirizza il polipeptide nascente alle membrane del RE e porta alla compartimentazione del
polipeptide all’interno del lume del RE.

Non appena emerge dal ribosoma, la sequenza segnale idrofobica è riconosciuta da una
particella di riconoscimento del segnale (SRP) che nelle cellule dei mammiferi contiste di 6
distinti polipeptidi ed una piccola molecola di RNA (RNA 7S).
L’SRP si lega sia alla sequenza segnale presente sulla catena polipeptidica nascente sia al
ribosoma (tappa 1) arrestando temporaneamente una ulteriore sintesi del polipeptide.
Il legale al RE avviene attraverso almeno due interazioni distinte: una tra l’SRP e il recettore per
l’SRP (tappa 2), l’altra tra il ribosoma e il traslocone (tappa 3). Il traslocone è un canale
delineato da proteine immerso nella membrana del RE attraverso il quale il polipeptide nascente
è in grado di muoversi nel suo spostamento dal citosol al lume del RE.
Una volta che il complesso catena nascente-ribosoma-SRP i lega alla membrana del RE (fase 2)
l’SRP è rilasciata dal suo recettore, il ribosoma si attacca all’estremità citosolica del traslocone
e la sequenza segnale del polipeptide nascente è inserita nello stretto canale acquoso del
traslocone (tappa 3). 

Il polipeptide nascente è poi traslocato attraverso l’anello del poro idrofobico e nel lume del RE
(tappa 4). Poiché l’anello del poro è considerevolmente più piccolo di quello della catena
polipeptidica ad α-elica, si presume che il poro si espanda quando la catena nascente attraversa
il canale.
Una volta che è terminata la traduzione e il polipeptide completo è passato attraverso il
traslocone, il ribosoma legato alla membrana è rilasciato dalla membrana del RE e il tappo viene
reinserito nel canale.
Diverse tappe della sintesi e del traffico di proteine secretorie sono regolate dal legame o
dall’idrolisi del GTP. Le proteine che legano il GTP (o proteine G) giocano un ruolo regolatorio
chiave in molti processi cellulari. Le proteine G possono esistere almeno in due conformazioni
alternative, una attiva legata al GTP e l’altra inattiva legata al GDP. Le forme legate al GTP o al
GDP di una proteina G presentano conformazioni diverse, e quindi diversa possibilità di legare
altre proteine. A causa di queste diverse proprietà di legame, le proteine G possono agire da
“interruttori molecolari”, accendendo o spegnendo specifici processi; la proteina che lega il GTP
di solito accende il processo, mentre l’idrolisi del GTP lo spegne.

Come una proteina neosintetizzata viene processata nel RE


Appena un polipeptide nascente entra nelle cisterne del RER, si trova ad interagire con una
moltitudine di enzimi localizzati sia nella membrana che nel lume del RER. La porzione
Nterminale contenente il peptide segnale viene rimossa dalla maggior parte dei polipeptidi
nascenti, ad opera di un enzima proteolitico, la peptidasi del segnale. I carboidrati vengono
aggiunti alla proteina nascente per mezzo dell’enzima oligosaccariltrasferasi. Sia la peptidasi del
segnale che la olgosaccariltrasferasi sono proteine integrali di membrane che risiedono in
prossimità del traslocone ed agiscono sulle proteine nascenti quando esse entrano nel lume del
RE.
Il lume del RER la sede principale dell’elaborazione delle proteine. Per svolgere le sue funzioni,
il lume del RER contiene delle proteine chaperon, che riconoscono e si legano alle proteine non
ripiegate o ripiegate male e danno loro l’opportunità di assumere la corretta struttura
tridimensionale (nativa). Il lume del RE contiene vari enzimi coinvolti nel processamento delle
proteine, tra cui, la proteina disolfuro isomerasi (PDI). Le proteine entrano nel lume del RE con i
loro residui di cisteina nello stato ridotto, ma lasciano il compartimento con molti dei loro
residui legati l’un l’altro come disulfudi ossidati.
Il reticolo endoplasmatico è idealmente concepito come una porta d’ingresso per il percorso
biosintetico della cellula. La sua membrana costituisce un’ampia superficie alla quale si possono
attaccare molti ribosomi. Il lume delle cisterne del RE costituisce un ambiente ristretto che
favorisce il ripiegamento e l’assemblaggio delle proteine, ed un compartimento in cui le
proteine di secrezione, quelle lisosomali e quelle dei vacuoli vegetali possono essere segregate
dalle altre proteine neosintetizzate. La segregazione delle proteine neosintetizzate nelle
cisterne del RE le sottrae dal citosol e consente che siano modificate e spedite verso la loro
destinazione finale sia fuori dalla cellula sia all’interno di uno degli organelli membranosi del
citoplasma.

Sintesi delle proteine integrali di membrana su ribosomi legati alle membrane


Anche le proteine integrali di membrana, tranne quelle dei mitocondri e dei cloroplasti, vengono
sintetizzate sui ribosomi associati alle membrane del RE. Queste proteine di membrana vengono
trasferite nel RE mentre vengono sintetizzate (co-traduzionalmente) utilizzando lo stesso
meccanismo che utilizzano per la sintesi delle proteine di secrezione e per le proteine
lisosomali. Per , diversamente dalle proteine di secrezione e dalle proteine lisosomali che
attraversano interamente la membrana del RE durante la traslocazione, le proteine integrali
contengono uno o più segmenti idrofobici transmembrana che sono direttamente deviati dal
canale del traslocone nel doppio strato lipidico.
Il traslocone ha una conformazione a forma di clessidra con un solco o commessura lungo un lato
della parete dove il canale pu aprirsi e chiudersi. Si pensa che quando un polipeptide passa
attraverso il traslocone, questo cancello laterale si apra e si chiuda continuamente dando a
ciascun segmento del polipeptide nascente un’opportunità di spostarsi in base alle sue proprietà
di solubilità, o nel compartimento acquoso entro il canale del traslocone o nel circostante core
idrofobico del doppio strato lipidico. Quei segmenti del polipeptide nascente che sono
sufficientemente idrofobici si “dissolveranno” spontaneamente nel bilayer lipidico per diventare
infine segmenti transmembrana di una proteina integrale di membrana.
Più il segmento è idrofobico, maggiore è la possibilità che esso passi attraverso la parete del
traslocone e si integri come un segmento transmembrana del bilayer.
Le proteine che attraversano la membrana una sola volta possono avere un orientamento, con
l’estremità N-terminale che si affaccia sul citosol o sul lume del RE. Il fattore più comune che
determina l’allineamento delle proteine di membrana è la presenza di residui amminoacidici
carichi positivamente all’estremità citosolica di un segmento transmembrana.
Durante la sintesi delle proteine di membrana, si pensa che sia il rivestimento interno del
traslocone ad orientare il polipeptide nascente, in modo che l’estremità più positiva si affacci
verso il citosol.
Nelle proteine che attraversano più volte la membrana, i segmenti transmembrana adiacenti
solitamente hanno orientamento opposto. Per queste proteine, la disposizione all’interno della
membrana è determinata dalla direzione in cui è inserito il primo segmento transmembrana.

Biosintesi delle membrane nel RE


Le membrane non si originano ex novo ma si pensa che derivino solo da membrane preesistenti.
Le membrane crescono quando le proteine neosintetizzate e i lipidi sono inseriti nelle membrane
del RE già esistenti. I componenti di membrana si muovono dal Re ad ogni altro compartimento
della cellula. Quando una membrana si muove da un compartimento ad un altro, le sue proteine
e i suoi lipidi sono modificati da enzimi che risiedono nei vari compartimenti cellulari. Queste
modificazioni contribuiscono a conferire ad ogni compartimento membranoso una propria
peculiare composizione ed una distinta identità.
Le membrane sono asimmetriche: i due strati fosfolipidici (foglietti) della membrana hanno
differente composizione. Questa asimmetria è stabilita inizialmente nel RE, quando lipidi e
proteine vengono incorporati in maniera differente nei due strati. L’asimmetria è mantenuta
quando la membrana passa da un compartimento al successivo per gemmazione e per fusione.
Come risultato, i domini situati sulla superficie citosolica delle membrane del RE possono essere
identificati sulla superficie citosolica delle vescicole di trasporto, sulla superficie citosolica delle
cisterne del Golgi e sulla superficie interna (citoplasmatica) della membrana plasmatica. Il lume
del RE è molto simile allo spazio extracellulare per molte caratteristiche, come la sua elevata
concentrazione di Ca²⁺, e abbondanza di proteine con legami disolfuro e il suo contenuto di
carboidrati.

Sintesi dei lipidi di membrana: la maggior parte dei lipidi di membrana è sintetizzata nel reticolo
endoplasmatico. Le maggiori è sintetizzata nel RE. Le maggiori eccezioni sono rappresentate da:
- Sfingomieline e dai glicolipidi, la cui sintesi inizia nel RE ed è completata nel complesso
di Golgi;
- Da alcuni lipidi particolari delle membrane di mitocondri e cloroplasti, che sono
sintetizzati da enzimi che risiedono in quelle membrane.
Alcune di queste molecole lipidiche vengono trasportate più tardi nel foglietto opposto grazie ad
enzimi detti flippasi. I lipidi sono trasportati dal RE al complesso di Golgi e verso la membrana
plasmatica come parte del doppio strato che costituisce le pareti delle vescicole di trasporto.

Il fatto che le membrane di organelli differenti abbiano una composizione in lipidi marcatamente
differente indica che mentre la membrana pasa attraverso la cellula avvengono dei
cambiamenti, che sono dovuti a diversi fattori:
1. Tappa 1: la maggior parte degli organelli membranosi possiede enzimi che modificano i
lipidi già presenti nella membrana, cambiando un tipo di fosfolipide in un altro (es:
fosfatidilserina in fosfatidilcolina);
2. Tappa 2: quando le vescicole gemmano da un compartimento, alcuni tipi di fosfolipidi
possono essere inclusi preferenzialmente nella membrana di vescicole che si stanno
formando mentre altri tipi possono essere escusi;
3. Tappa 3: le cellule contengono proteine in grado di trasportare fosfolipidi la cui funzione
è quella di trasportare fosfolipidi specifici attraverso il citosol acquoso da un
compartimento di membrana ad un altro tipo. Questi enzimi possono facilitare il
passaggio di specifici fosfolipidi dal RE ad altri organelli. Ci è di fondamentale
importanza nel trasporto dei lipidi a mitocondri e cloroplasti, che non sono parte del
normale flusso di membrane lungo la via biosintetica.

Glicosilazione nel reticolo endoplasmatico rugoso


Quasi tutte le proteine prodotte sui ribosomi legati alla membrana – siano componenti integrali
di membrana, enzimi lisosomali o parti della matrice extracellulare – diventano glicoproteine. I
gruppi carboidratici hanno un ruolo chiave nella funzionalità di molte glicoproteine, in
particolare come siti di legame nella loro interazione con altre macromolecole, come avviene in
molti processi cellulari.
Inoltre, aiutano la proteina cui sono attaccati a ripiegarsi correttamente. Le sequenze di
zuccheri che compongono gli oligosaccaridi delle glicoproteine sono altamente specifiche;
L’aggiunta di zuccheri ad una catena oligosaaccaridica in crescita è catalizzata da un gruppo di
enzimi legati a membrane chiamati glicosiltrasferasi, enzimi che trasferiscono uno specifico
monosaccaride da uno zucchero nucleotidico, come il GDP-mannosio, all’estremità in crescita
della catena carboidratica.
La sequenza secondo la quale gli zuccheri vengono trasferiti durante l’assemblaggio di un
oligosaccaride dipende dalla sequenza delle glicosiltrasferasi che intervengono nel processo.
Questa, a sua volta, deriva dalla disposizione degli enzimi specifici all’interno delle varie
membrane del percorso secretorio. Così l’organizzazione degli zuccheri nelle catene
oligosaccaridiche di una glicoproteina dipende dalla localizzazione spaziale di particolari enzimi
lungo la catena di montaggio.
Il segmento basale o nucleo costitutivo di ciascuna catena di carboidrati non è assemblato sulla
proteina stessa, ma è montato indipendentemente su un trasportatore lipidico e poi trasferito,
in blocco, a specifici residui di asparagina del polipeptide. Questo trasportatore lipidico,
chiamato dolicol fosfato, una molecola incorporata nella membrana del RE.
Gli zuccheri sono aggiunti alla molecola di dolicol fosfato uno alla volta, da glicosiltrasferasi di
membrana, iniziando dalla tappa 1, che nelle cellule di mammifero inizia con il trasferimento di
N-acetilglucosamina 1-fosfato, seguito dal trasferimento di un’altra N-acetilglucosamina, poi di
nove unità di mannosio e infine di tre di glucosio. Questo blocco di 14 zuccheri è poi trasferito
dall’enzima oligosaccariltrasferasi del RE, dal dolicolo fosfato al polipeptide nascente (tappa
10).
Subito dopo il trasferimento al polipeptide nascente la catena oligosaccaridica subisce
progressive modificazioni. Queste modificazioni iniziano nel RE attraverso la rimozione
enzimatica di due dei tre residui terminali di glucosio da parte delle glicosidasi (tappa 1). Questo
è un passaggio chiave nella vita di una glicoproteina neosintetizzata in cui essa è vagliata da un
sistema di controllo di qualità che determina se essa sia adatta o meno a muoversi verso il
successivo compartimento della via biosintetica.
Per iniziare questo processo ogni glicoproteina, i cui oligosaccaridi contengono un singolo
glucosio residuo, si lega ad una proteina chaperon, come calnexina o calreticulina (tappa 2). Il
glucosio residuo viene rimosso enzimaticamente dalla glucosidasi II e ci porta al rilascio della
glicoproteina (tappa 3).
Se a questo stadio la glicoproteina non ha ancora completato il suo ripiegamento o se non è
piegata correttamente, viene riconosciuta da un “enzima di monitoraggio” (detto GT), che
aggiunge nuovamente un singolo residuo di glucosio ad uno dei residui di mannosio
dell’estremità esposta dell’oligosaccaride appena generato (tappa 4). GT riconosce le proteine
ripiegate in modo incompleto o scorretto perché queste mostrano residui amminoacidi idrofobici
che sono assenti in quelle ripiegate correttamente. Una volta che il residuo di glucosio viene
aggiunto, la glicoproteina “etichettata” viene riconosciuta dalle stesse proteine chaperon del
RE, che le danno un’altra possibilità di ripiegarsi correttamente (tappa 5). 

Dopo un po’ di tempo, assieme alla proteina chaperon, il residuo di glucosio viene rimosso e
l’enzima di monitoraggio verifica nuovamente se è stata raggiunta la corretta struttura
tridimensionale.
Se la proteina non è ancora completamente ripiegata o piegata male, viene aggiunto un altro
residuo di glucosio ed il processo si ripete finchè, alla fine, la glicoproteina o è ripiegata
correttamente e prosegue per la sua via (tappa 6), oppure resta ripiegata male e viene distrutta.
La decisione di distruggere la proteina difettosa è controllata da un enzima ad azione lento nel
RE, che taglia un residuo di mannosio da una estremità esposta di un oligosaccaride di una
proteina che è stata nel RE per un lungo periodo.
Una volta che uno o più di questi residui di mannosio sono stati rimossi (tappa 7), la proteina non
pu più essere riciclata ed è invece definitivamente inviata alla degradazione (tappa 8).
Fasi della sintesi del segmento base di un oligosaccaride legato all’N nel RER: i primi sette
zuccheri (5 mannosi e 2 residui NAG) sono trasferiti uno alla volta al dolicol-PP sul lato
citosolico della membrana del RE (tappa 1-2). A questo punto, il dolicolo con il suo
oligosaccaride attaccato ruota apparentemente attraverso la membrana 3 (tappa 3) e i restanti
zuccheri (4 residui di mannosio e tre di glucosio) sono attaccati al lato luminale della
membrana. Questi ultimi zuccheri sono attaccati uno alla volta al lato citosolico della
membrana all’estremità della molecola del dolicol fosfato (come nelle tappe 4 e 7) che, quindi,
passa attraverso la membrana (tappe 5 e 8) e cede il suo zucchero alla estremità crescente della
catena oligosaccaridica (tappe 6 e 9). Una volta che l’oligosaccaride è completamente
assemblato, viene trasferito enzimaticamente al residuo di asparagina del polipeptide nascente
(tappa 10). Il dolicol-PP ripassa attraverso la membrana (tappa 11) ed è pronto per trasferire di
nuovo gli zuccheri (tappa 12 e 13).

Meccanismi che assicurano l’eliminazione delle proteine non correttamente ripiegate


Le proteine non correttamente ripiegate non sono distrutte nel RE, ma nel citoplasma mediante
un processo di traslocazione inversa. Non è ancora chiaro se le proteine ripiegate male siano
riportate indietro nel citosol attraverso i trasloconi o attraverso un canale di dislocazione
separato di identità incerta.
Una volta arrivate nel citosol, le catene oligosaccaridiche sono rimosse e le proteine non
correttamente ripiegate sono distrutte nei proteasomi (macchine che degradano le proteine).
Questo processo si chiama degradazione associata al RE e assicura che le proteine aberranti non
siano trasportate ad altri siti della cellula, ma ci pu anche avere conseguenze negative.
In certe condizioni, le proteine non correttamente ripiegate possono generarsi nel RE a velocità
maggiore di quella con cui possono essere esportate nel citoplasma. L’accumulo di proteine non
correttamente ripiegate, potenzialmente letale per la cellula, scatena un “piano d’azione”
generale all’interno della cellula conosciuto come risposta alle proteine non ripiegate (unfolded
protein response, upr).
Il RE contiene sensori proteici che monitorano la concentrazione di proteine non correttamente
ripiegate nel lume del RE. I sensori sono normalmente mantenuti in uno stato inattivo da
chaperoni molecolari, in particolare le BiP. Nel caso in cui si abbia accumulo di proteine non
correttamente ripiegate, le molecole BiP del lume del RE sono reclutate come chaperoni per tali
proteine, il che rende i chaperoni incapaci di inibire i sensori.
L’attivazione dei sensori porta ad una moltitudine di segnali trasmessi sia nel nucleo che nel
citoplasma che portano:
- All’espressione di centinaia di geni diversi che codificano per proteine che hanno la
potenzialità di alleviare le condizioni stressanti all’interno del RE. Questi includono geni
che codificano per 1) chaperoni molecolari presenti nel RE che possono aiutare le
proteine non correttamente ripiegate a raggiungere lo stato nativo; 2) proteine coinvolte
nel trasporto di proteine al di fuori del Re; 3) proteine coinvolte nella distruzione
selettiva di proteine anormali.
- Alla fosforilazione di una proteina chiave (eIFα) richiesta per la sintesi proteica. Questa
modificazione inibisce la sintesi proteica e riduce il flusso di proteine neosintetizzate nel
RE. Ci permette alla cellula di rimuovere quelle proteine che sono già presenti nel lume
del RE.
La UPR è più che un meccanismo di sopravvivenza per la cellula; essa include anche l’attivazione
della via che porta alla morte cellulare. Si pensa che la UPR fornisca alla cellula un meccanismo
per contrastare le condizioni stressanti. Se queste misure correttive non hanno successo, si
innesca la via della morte cellulare e la cellula è distrutta.

DAL RE AL COMPLESSO DI GOLGI: LA PRIMA TAPPA DEL TRASPORTO VESCICOLARE


I siti di fuoriuscita dalle cisterne del RER sono privi di ribosomi e sono i siti dove si formano le
prime vescicole di trasporto nella via biosintetica.
Marcando le proteine di secrezione con la proteina GFP, si è scoperto che, appena dopo la loro
gemmazione delle membrane del RE, le vescicole di trasporto si fondono tra di loro a formare
vescicole più grandi e tubuli interconnessi nella regione tra il RE e il complesso di Golgi. Questa
regione è stata chiamata ERGiC (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment) e la
serie di vescicole e tubuli che vi si formano sono chiamati VTC. Una volta formati, i VTC si
allontanano dal RE e vanno verso il complesso di Golgi. Il movimento dei VTGs avviene lungo
binari composti da microtubuli.

IL COMPLESSO DI GOLGI
Ha una morfologia caratteristica che consiste di cisterne membranose appiattite a forma di disco
con bordi dilatati, associate a vescicole e tubuli. Le cisterne sono disposte in pile ordinate e
sono curvate in modo da assomigliare ad una tazza poco profonda. Una pila di cisterne del Golgi
ne contiene di solito meno di otto.
Una singola cellula pu contenere da poche a parecchie migliaia di pile, a seconda del tipo. Le
pile di cisterne del Golgi nelle cellule di mammifero sono interconnesse da tubuli membranosi
per formare un grande complesso unico simile ad un nastro adiacente al nucleo cellulare.
Molte di queste vescicole presentano un rivestimento proteico peculiare
Il complesso di Golgi è diviso in diversi compartimenti distinti per funzionalità, disposti secondo
un asse che va dalla faccia cis o di entrata, la più vicina al RE, alla faccia trans o di uscita, dalla
parte opposta della pila.
La faccia più cis dell’organello si compone di una rete di tubuli interconnessi detta rete cis del
Golgi (CGN). Si pensa che la CGN funzioni principalmente come stazione di smistamento che
distingue fra le proteine da rispedire indietro al RE e quella a cui è permesso di continuare fino
alla stazione seguente del Golgi.
La massa del complesso di Golgi è composta da larghe cisterne appiattite, che si dividono in:
cisterne cis, mediali e trans. La faccia più trans dell’organello contiene una rete distinta di
tubuli e di vescicole chiamate rete trans del Golgi (TGN). Anche la TGN è un centro di
smistamento. Le proteine sono segregate nel TGN in differenti tipi di vescicole che si dirigono
verso la membrana plasmatica o verso varie destinazioni intracellulari. Si pensa che gli elementi
membranosi del complesso di Golgi siano meccanicamente sostenuti da uno scheletro (o
impalcatura) di membrana composto da una varietà di proteine, tra cui membri delle famiglie
della spettrina, anchirina e actina.
L’impalcatura del Golgi pu essere fisicamente legata a proteine motrici che dirigono il
movimento di vescicole e tubuli che entrano ed escono dal complesso di Golgi. Si pensa che un
gruppo diverso di proteine fibrose formi una “matrice” di Golgi, che gioca un ruolo chiave del
disassemblaggio e riassemblaggio del complesso di Golgi durante la mitosi.
Il complesso di Golgi non è uniforme nella sua composizione da un’estremità all’altra. Le
differenze nella composizione dei compartimenti di membrana che si osservano tra la faccia cis
e quella trans riflettono il fatto che il complesso di Golgi è soprattutto un impianto di
lavorazione. Le proteine di membrana neosintetizzate, così come le proteine di secrezione e
quelle lisosomali, lasciano il RE ed entrano nel complesso di Golgi nella sua faccia cis e poi
viaggiano attraverso la pila, le proteine neosintetizzate nel RER vengono modificate in sequenza
in modi specifici.

La glicosilazione nel complesso di Golgi


Il complesso di Golgi svolge un ruolo chiave nell’assemblaggio dei carboidrati che fanno parte
delle glicoproteine e dei glicolipidi.
Quando le proteine solubili e le glicoproteine di membrana neosintetizzate attraversano le
cisterne cis e quelle mediali della pila del Golgi, anche la maggior parte dei residui di mannosio
vengono rimossi dagli oligosaccaridi di base ed altri zuccheri vengono aggiunti in sequenza da
varie glicosiltrasferasi.
Nel complesso di Golgi, così come nel RER, la sequenza in cui gli zuccheri sono incorporati negli
oligosaccaridi è determinata dalla disposizione spaziale delle specifiche glicosiltrasferasi che
entrano in contatto con la proteina neosintetizzata mentre si muove attraverso la pila del Golgi.
Diversamente dalle glicosilazioni che avvengono nel RE, in cui viene assemblato un singolo
oligosaccaride di base, le tappe di glicosilazione che avvengono nel complesso di Golgi sono
varie e producono domini di carboidrati dalla sequenza molto diversa.
Diversamente dagli oligosaccaridi legati all’N, la cui sintesi comincia nel RE, quelli fissati alle
proteine da legami con l’ossigeno sono assemblati interamente all’interno del complesso di
Golgi.
Il complesso di Golgi è anche il luogo della sintesi della maggior parte dei polisaccaridi complessi
della cellula, compresi le catene di glucosaminoglicani dei proteoglicani, le pectine e
l’emicellulosa trovati nelle pareti cellulari delle piante.

Il movimento di materiali attraverso il complesso di Golgi


Fino alla metà degli anni ’80, generalmente si pensava che le cisterne del Golgi fossero strutture
transitorie. Si supponeva che si formassero alla faccia cis della pila per fusione dei trasportatori
membranosi provenienti dal RE e dall’ERGIC e che ogni cisterna si muovesse fisicamente
dall’estremità cis verso quella trans della pila, cambiando composizione mentre progrediva.
Questo è noto come modello della maturazione delle cisterne poiché ogni cisterna matura nella
cisterna seguente lungo la pila.
Da metà degli anni ’80 alla fine degli anni ’90, il modello di maturazione in movimento del Golgi
è stato in gran parte abbandonato e sostituito da un modello alternativo, che ipotizzava che le
cisterne di una pila del Golgi rimanessero sul posto come compartimenti stabili. In questo
modello conosciuto come modello del trasporto vescicolare, il carico (cioè le proteine di
secrezione, lisosomali e di membrana) viene trasportato attraverso la pila del Golgi, dal CGN al
TGN, in vescicole che gemmano dalla membrana di un compartimento e si fondono con un
compartimento adiacente più avanti lungo la pila. La sua accettazione è dovuta in gran parte a
due tipi di osservazioni:
1. Ciascuna delle varie cisterne del Golgi di una pila ha una popolazione distinta di enzimi
residenti.
2. Nelle foto al microscopio elettronico si possono osservare un gran numero di vescicole
che gemmano dai margini delle cisterne del Golgi. All’interno della cellula, le vescicole
che portano il carico gemmino dalle cisterne cis e si fondano con le cisterne situate ad
una posizione più trans nella pila.
Entrambi i modelli della funzione del Golgi sono presi in considerazione, ma negli ultimi anni
l’opinione generale si è spostata nuovamente verso il modello di maturazione delle cisterne.
Diversi dei motivi principali di questo ripensamento sono degni di nota:
- Il modello di maturazione delle cisterne prevede un complesso di Golgi altamente
dinamico in cui i principali elementi dell’organello, le cisterne, sono continuamente
formati alla faccia cis e dispersi alla faccia trans. La reale esistenza del complesso di
Golgi stessa dipende infatti dal continuo afflusso di trasportatori dal RE all’ERGIC. Come
previsto dal modello di maturazione delle cisterne, quando la formazione dei
trasportatori dal RE è bloccata mediante il trattamento di cellule con farmaci specifici o
mediante l’uso di mutanti temperatura-sensibili, il complesso di Golgi scompare. Quando
i farmaci sono rimossi o le cellule mutanti riportate ad una temperatura permissiva, il
trasporto RE-Golgi è ripristinato ed il complesso di Golgi si riassembla rapidamente.
- Alcuni materiali che vengono prodotti nel reticolo endoplasmatico e viaggiano attraverso
il complesso di Golgi rimangono all’interno delle cisterne del Golgi e non compaiono mai
all’interno delle vescicole di trasporto associate al Golgi.
- Fino a metà degli anni ’90 si supponeva che le vescicole di trasporto si movessero sempre
in avanti (in senso anterogrado), cioè da un’origine cis a una destinazione più trans.
Molte evidenze hanno indicato per che alcune vescicole si muovono all’indietro (in senso
retrogrado), cioè da una membrana donatrice trans verso una membrana accettrice cis.
- Esperimenti su cellule di lievito gemmate vive, hanno mostrato che la composizione di
una cisterna individuale del Golgi pu variare nel tempo – da una contenente proteine del
Golgi precoci (cis) ad una contenente proteine del Golgi tardive (trans). I risultati non
sono compatibili con il modello del trasporto vescicolare. Resta ancora capire se questi
risultati ottenuti in lievito possano essere estesi o meno ad un complesso di Golgi di un
mammifero, che ha una struttura più complessa.
Una versione corrente del modello di maturazione delle cisterne riconosce un ruolo per le
vescicole di trasporto che, si è dimostrato, si originano dalle membrane del Golgi. In questo
modello, tuttavia, queste vescicole di trasporto non spostano il carico in senso anterogrado, ma
trasportano invece in senso retrogrado gli enzimi residenti nel Golgi.
Le molecole di VSVG sono presenti all’interno delle cisterne, ma sono assenti nelle adiacenti
vescicole (frecce), il che indica che il carico è trasportato in direzione anterograda all’interno
delle cisterne in via di maturazione, ma non all’interno delle vescicole di trasporto.
A differenza della proteina del carico VSVG, le molecole di mannosidasi II si trovano sia nelle
cisterne che nelle vescicole ad esse associate (frecce), il che è a favore della teoria secondo cui
queste vescicole sono utilizzate per il trasporto degli enzimi presenti nel complesso di Golgi in
direzione retrograda.
Diverse cisterne del Golgi in una pila possono avere un’unica identità. Un enzima come la
mannosidasi II, per esempio, che rimuove residui di mannosio dagli oligosaccaridi ed in gran
parte si limita alle cisterne mediali, pu essere riciclato tornando indietro nelle vescicole di
trasporto mentre ogni cisterna si muove verso l’estremità trans della pila. La controversia
comunque non è stata ancora risolta.

Tipi di vescicole di trasporto e loro funzioni


La via biosintetica di una cellula eucariotica consiste in una serie di organelli distinti delimitati
da membrana che funzionano nella sintesi, nella modificazione e nello smistamento delle
proteine solubili e di membrana fino alla loro corretta destinazione nella cellula.
I materiali sono trasportati fra i vari compartimenti da vescicola (o altri trasportatori delimitati
da membrana), che gemmano dalle membrane donatrici e si fondono con le membrane
accettrici. La maggior parte di queste gemme è coperta, sulla superficie citosolica, da uno
strato elettron-denso che appare con struttura indistinta. Questo strato scuro consiste di un
rivestimento proteico formato da proteine solubili che si accumulano sul versante citosolico
della membrana donatrice nei siti dove avviene la gemmazione.
L’assemblaggio è iniziato dall’attivazione di una piccola proteina G che è specificamente
reclutata al sito. 

Ogni gemma rivestita si distacca a formare una vescicola rivestita.
I rivestimenti proteici hanno almeno due funzioni distinte:
1) Fungono da dispositivo meccanico che induce la membrana a curvarsi e a formare una
vescicola in gemmazione
2) Costituiscono un meccanismo per la selezione dei componenti che devono essere
trasportati nella vescicola. Questi componenti includono a) il carico da trasportare
consistente di proteine di secrezione, lisosomali e di membrana e b)il macchinario
richiesto per indirizzare e far ancorare la vescicola alla membrana ricevente.
Nei due casi meglio compresi, il rivestimento proteico è composto di due strati proteici distinti:
uno esterno di impalcatura che forma la rete per il rivestimento, e uno interno di adattatori che
servono principalmente per legare il carico della vescicola. Gli adattatori sono in grado di
selezionare specifiche molecole carico mediante la loro affinità specifica per le “code”
citosoliche delle proteine integrali che risiedono nella membrana donatrice.
Sono state identificate parecchie categorie distinte di vescicole rivestite ; esse sono distinte in
base alle proteine che compongono il loro rivestimento , al loro aspetto al microscopio
elettronico ed al loro ruolo nel traffico cellulare. I tre tipi di vescicole rivestite meglio
studiati sono:
1. Le vescicole rivestite da COPII: spostano i materiali dal RE in avanti verso l’ERGIC ed il
complesso di Golgi (l’ERGIC è il compartimento intermedio situato fra il RE ed il
complesso di Golgi. COP è una sigla che indica le proteine di
rivestimento; dall’inglese “coat proteins”.
2. Le vescicole rivestite da COPI: spostano il materiale in un senso retrogrado: ( 1)
dall’ERGIC e dalle pile del Golgi all’indietro verso il RE e (2) dalle cisterne trans del Golgi
alle cisterne cis del Golgi.
3. Le vescicole rivestite da clatrina: spostano il materiale dal TGN verso gli endosomi, i
lisosomi ed i vacuoli delle cellule vegetali. Esse portano anche i materiali della
membrana plasmatica ai compartimenti citoplasmatici lungo la via endocitica e sono
anche coinvolte nel traffico dagli endosomi e dai lisosomi.

Le vescicole rivestite da COPII: trasporto del carico dal RE al complesso di Golgi


Le vescicole rivestite da COPII mediano la prima tappa del viaggio lungo il percorso biosintetico –
dal RE all’ERGIC ed al CGN. Il rivestimento di COPII contiene varie proteine. Gli anticorpi
antiproteine del rivestimento di COPII bloccano la gemmazione delle vescicole dalle membrane
del RE, ma non hanno effetto sul movimento del carico in altre fasi del percorso di secrezione.
Si pensa che i rivestimenti di COPII selezionino e concentrino determinati componenti che
trasportano. Certe proteine integrali di membrana del RE vengono selettivamente catturate
perché contengono i segnali “di esportazione dal RE” come parte della loro coda citosolica.
Questi segnali interagiscono specificamente con le proteine COPII del rivestimento della
vescicola. Parecchi tipi di proteine di membrana sono incluse in questo gruppo, compresi (1) gli
enzimi che agiscono nelle fasi successive nella via biosintetica, quali la glicosiltrasferasi del
complesso di Golgi, (2) proteine della membrana addette all’aggancio e alla fusione della
vescicola al compartimento bersaglio e (3) proteine della membrana che possono legare un
carico solubile (come proteine di secrezione).
Fra le proteine del rivestimento di COPII c’è una piccola proteina G, detta Sar1, che è reclutata
specificamente a livello della membrana del RE. Sar1 gioca un ruolo regolatorio, iniziando la
formazione di vescicole e regolando l’assemblaggio del rivestimento della vescicola. 

Nella fase 1 Sar1 è reclutata a livello della membrana RE nella forma legata al GDP ed è indotta
a scambiare il GDP per una molecola di GTP. In seguito al legame con GTP Sar1 va incontro ad un
cambiamento conformazionale che porta la sua α-elica N-terminale ad inserirsi nel foglietto
citosolico del bilayer RE (tappa 2). Questo evento provoca il piegamento del bilayer lipidico,
importante nella conversione di una membrana appiattita in una vescicola sferica. Il piegamento
della membrana è probabilmente aiutato da una variazione nell’impaccamento dei lipidi che
compongono i due foglietti dei bilayer.
Nella tappa 3 Sar1-GTP ha reclutato due polipeptidi addizionali del rivestimento COPII, Sec23 e
Sec24, che si legano come un dimero “a forma di banana”. Data la sua forma ricurva il dimero
Sec23-Sec24 fornisce un’ulteriore pressione sulla superficie della membrana per aiutarla a
ripiegarsi ulteriormente in una gemma curvata. Sec24 funziona anche come proteina adattatrice
primaria del rivestimento COPII che interagisce specificamente con i segnali di esportazione dal
RE localizzati nella coda citosolica delle proteine di membrana destinate ad essere indirizzate al
complesso di Golgi.
Nella tappa 4 le subunità rimanenti del rivestimento COPII, Sec13 e Sec31, si legano alla
membrana a formare l’impalcatura del rivestimento proteico. L’impalcatura Sec13-31 si
assembla in un reticolo relativamente semplice in cui ogni vertice è formato dalla convergenza
di quattro Sec13-Sec31.
Una volta che l’intero rivestimento COPII è assemblato, la gemma si separa dalla membrana del
RE nella forma di una vescicola rivestita da COPII. Prima che la vescicola rivestita possa fondersi
con la membrana bersaglio, il rivestimento proteico deve essere disassemblato ed i relativi
componenti liberati nel citosol.
Il disassemblaggio è innescato dall’idrolisi del GTP legato che produce una subunità Sar1-GDP,
che ha minore affinità per la membrana della vescicola. La dissociazione della Sar1-GDP dalla
membrana è seguita dal rilascio delle altre subunità di COPII.

Le vescicole rivestite da COPI: trasporto retrogrado delle proteine indietro verso il RE


Sono state identificate per la prima volta in esperimenti in cui le cellule sono state trattate con
molecole simili nella struttura al GTP ma che non possono essere idrolizzate. In queste
condizioni, le vescicole rivestite da COPI si accumulano all’interno della cellula e possono essere
isolate dalle cellule omogeneizzate per centrifugazione in gradiente di densità. Le vescicole
rivestite da COPI si accumulano in presenza di un analogo non idrolizzate del GTP perché, come
le loro controparti di COPII, il rivestimento contiene una proteina che si lega al GTP, detta ARF1,
il cui GTP legato deve essere idrolizzato prima che il rivestimento si possa disassemblare. Le
vescicole rivestite da COPI mediano il trasporto retrogrado delle proteine. Le vescicole rivestite
da COPI sono state implicate nel trasporto di (1) enzimi del Golgi, in direzione da trans a cis e
(2) enzimi del RE e dell’ERGIC e dal complesso di Golgi, indietro verso il RE.

Ritenzione e recupero delle proteine residenti nel RE: Le proteine vengono mantenute in un
determinato organello tramite una combinazione di due meccanismi:
1. La ritenzione delle molecole residenti che sono escluse dalle vescicole di trasporto. La
ritenzione pu essere basata principalmente sulle proprietà fisiche della proteina. Ad
esempio, proteine solubili che fanno parte di grandi complessi o proteine di membrana
con piccoli domini transmembrana non entrano in una vescicola di trasporto;
2. Il recupero delle molecole “sfuggite” che vengono riportate di nuovo nel comparto in cui
risiedono normalmente.
Le proteine che normalmente risiedono nel RE, sia quelle del lume che quelle della membrana,
contengono alla loro estremità C-terminale corte sequenze di amminoacidi che servono da
segnali di recupero, assicurando il loro ritorno al RE se dovessero essere accidentalmente
trasportate in avanti verso l’ERGIC o il complesso di Golgi.
Il recupero delle proteine del RE “sfuggite” da questi comparti viene effettuato da recettori
specifici che catturano le molecole e le restituiscono al RE in vescicole rivestite da COPI. Le
proteine solubili del lume del RE (come la proteindisolfuroisomerasi e le proteine chaperon che
facilitano il ripiegamento) possiedono tipicamente il segnale di recupero “lys-asp-glu-leu” (o
KDEL nella nomenclatura a singola lettera).Queste proteine sono riconosciute e riportate al RE
dal recettore KDEL, una proteina integrale di membrana che si sposta dalla porzione cis del Golgi
ai compartimenti del RE. Se da una proteina del RE viene eliminata la sequenza KDEL, la
proteina non è restituita al RE ma trasportata in avanti attraverso il complesso di Golgi. Al
contrario, quando una cellula viene geneticamente modificata per esprimere una proteina
lisosomale o di secrezione contenente un segnale KDEL aggiunto all’estremità C-terminale,
quella proteina viene restituita al RE ma trasportata in avanti attraverso il complesso di Golgi.
Al contrario, quando una cellula viene geneticamente modificata per esprimere una proteina
lisosomale o di secrezione contenente un segnale KDEL aggiunto all’estremità C-terminale,
quella proteina viene restituita al RE invece di essere indirizzata alla sua giusta destinazione.

Anche le proteine della membrana dal RE, hanno un segnale di recupero all’estremità
Cterminale che si lega al rivestimento di COPI, facilitando il loro ritorno al RE.
Ogni compartimento di membrana nella via biosintetica pu avere il suo proprio e unico segnale
di recupero, il che ci aiuta a capire come pu ogni compartimento mantenere la sua propria e
particolare composizione di proteine malgrado il movimento costante delle vescicole dentro e
fuori da quel compartimento.

Superamento del complesso di Golgi: smistamento delle proteine al TGN


È importante che una cellula sia capace di distinguere fra le varie proteine che produce. Una
cellula pancreatica, per esempio, deve separare gli enzimi digestivi neosintetizzati, che vengono
secreti in un dotto, dalle molecole di adesione cellulare di una nuova sintesi, che sono destinate
alla membrana plasmatica, dagli enzimi lisosomali, che sono destinati ai lisosomi.
Questo si realizza grazie al fatto che la cellula smista la proteine destinate a luoghi differenti in
differenti carrier rivestiti da membrana. Lo smistamento delle proteine ha luogo nell’ultimo dei
compartimenti del Golgi, la rete trans Golgi (TGN), che funziona come un importante bivio per il
trasporto di materiali lungo il percorso di secrezione. Il percorso post-Golgi meglio conosciuto è
quello che trasporta gli enzimi lisosomali.

Smistamento e trasporto di enzimi lisosomali: le proteine lisosomali sono sintetizzate sui


ribosomi legati alla membrana del RE e trasportate al complesso del Golgi insieme ad altri tipi di
proteine. Una volta entrate nelle cisterne del Golgi, le proteine solubili lisosomali vengono
riconosciute da enzimi che in due tappe catalizzano l’aggiunta di un gruppo fosfato a certi
zuccheri mannosio delle catene di carboidrati legate all’azoto. Così gli enzimi lisosomali
possiedono residui di mannosio fosforilati che funzionano come segnali di riconoscimento. Gli
enzimi lisosomali che portano questo segnale di mannosio-6-fosfato sono riconosciuti e
“catturati” dai recettori per il mannosio 6 fosfato (MPR), che sono proteine integrali di
membrana che attraversano le membrane del TGN.
Gli enzimi lisosomali sono trasportati dal TGN in vescicole rivestite da clatrina. La struttura delle
vescicole rivestite di clatrina è rilevante per il processo di endocitosi. I rivestimenti di queste
vescicole contengono
(1) Una gabbia esterna a nido d’ape composta dalla proteina clatrina, che forma un’impalcatura
strutturale e (2) un guscio interno composto da complessi proteici detti adattatori, che coprono
la superficie della membrana vescicolare che si affaccia sul citosol. Il termine adattatore
descrive una molecola che si lega fisicamente a due diverse tipologie di materiale. Gli enzimi
lisosomali sono scortati dal TGN da una famiglia di adattatori proteici di nuova scoperta chiamati
GGA.
Una molecola di GGA presenta diversi domini, ognuno capace di agganciare una proteina diversa
coinvolta nella formazione delle vescicole. Le estremità estreme degli adattatori GGA si legano
ad una molecola di clatrina, arrestando l’impalcatura di clatrina sulla superficie della vescicola.
Sulla loro superficie interna, gli adattatori GGA si legano ad un segnale di smistamento nelle
code citosoliche dei recettori per il mannosio-6-fosfato.
I MPR, a loro volta, si legano agli enzimi lisosomali solubili all’interno del lume della vescicola.
Come risultato di queste interazioni con gli adattatori GGA, i MPR della membrana del TGN e gli
enzimi lisosomali del lume del TGN si concentrano nelle vescicole rivestite da clatrina. Come
nella formazione delle vescicole COPI e COPII, la formazione delle vescicole rivestite da clatrina
comincia con il reclutamento sulla membrana di una piccola proteina che lega il GTP, come ad
es ARF1, che prepara il terreno per il legame di altre proteine di rivestimento. Dopo che la
vescicola è gemmata al TGN, perde il rivestimento di clatrina e la vescicola priva di rivestimento
procede verso la sua destinazione, che pu essere un endosoma precoce, un endosoma tardivo o
un vacuolo vegetale. Prima che raggiungano uno di questi organelli i MPR si dissociano dagli
enzimi lisosomali e ritornano al TGN per effettuare un altro ciclo di trasporto di enzimi
lisosomali.

Smistamento e trasporto di proteine non lisosomali: le proteine lisosomali non sono i soli
materiali che siano esportati dal TGN. Le proteine della membrana destinate alla membrana
plasmatica ed i materiali secretori destinati all’esportazione della cellula vengono trasportati
dal TGN ma i meccanismi sono ancora poco conosciuti. Secondo un modello recente, questi
trasportatori membranosi sono prodotti quando il TGN si frammenta in vescicole e tubuli di
diverse dimensioni.
Questo modello combacia con il modello di maturazione delle cisterne, che propone che le
cisterne del complesso di Golgi si muovano continuamente verso il TGN, dove dovrebbero
disperdersi per permettere la maturazione continua delle pile del Golgi. Si pensa che le proteine
che sono esportate dalla cellula mediante un processo di secrezione regolata, come nel caso
degli enzimi digestivi e degli ormoni, formino aggregati che poi vengono accumulati in grossi
granuli secretori densamente impacchettati. Questi aggregati sono apparentemente trattenuti
come granuli secretori gemmati dai margini della regione trans delle cisterne del Golgi e dal
TGN. In alcune cellule, sono osservabili lunghi tubuli che lasciano il TGN mediante proteine
motrici che operano lungo i binari dei microtubuli. Questi tubuli si suddividono, quindi, in una
serie di vescicole o granuli per fissione delle membrane. Una volta lasciato il TGN, il contenuto
dei granuli secretori diviene più concentrato. Infine, i granuli secretori sono poi immagazzinati
nel citoplasma finché i loro contenuti sono rilasciati in seguito a stimolazione della cellula da
parte di un ormone o di un impulso nervoso.
Il trasporto delle proteine integrali di membrana verso la membrana plasmatica sembra
dipendere per lo più da segnali di smistamento nei domini citoplasmatici delle proteine di
membrana.
Le proteine della membrana plasmatica di cellule non polarizzate, quali i fibroblasti ed i globuli
bianchi, possono non richiedere particolari segnali di smistamento. Queste proteine possono
semplicemente essere trasportate dal TGN alla superficie cellulare in vescicole della via
secretoria costitutiva.

Indirizzamento delle vescicole verso un particolare compartimento


La fusione della vescicola richiede interazioni specifiche fra differenti membrane. Per esempio,
vescicole del RE si fondono con l’ERGIC o con la rete cis del Golgi e non con le cisterne trans. La
fusione selettiva è uno dei fattori che assicura un flusso altamente direzionale attraverso i
compartimenti membranosi della cellula.
Si pensa che una vescicola contenga specifiche proteine associate alla sua membrana che
governano la fusione potenziale e la destinazione di quella vescicola.
Le tappe che intercorrono tra la gemmazione e la fusione della vescicola sono:
1. Movimento della vescicola verso il compartimento bersaglio specifico: in molti casi, le
vescicole di membrana devono spostarsi per distanze considerevoli attraverso il
citoplasma, prima di raggiungere il loro obiettivo finale. Si pensa che questi tipi di
movimenti siano diretti dai microtubuli, che si comportano come dei binari che
trasportano dei vagoncini carichi lungo un percorso definito fino ad una determinata
destinazione.
2. Ormeggio delle vescicole al compartimento bersaglio: si ritiene che il contratto iniziale
tra la vescicola di trasporto e la sua membrana bersaglio, come una cisterna del Golgi,
sia mediato da proteine di ormeggio. Sono stati descritti due gruppi di proteine di
ormeggio: quelle con forma a bacchetta, proteine fibrose in grado di formare un ponte
molecolare tra due membrane poste a distanza considerevole, e grandi complessi
multiproteici che mantengono le due membrane in più stretta vicinanza tra loro. Si
suppone che l’ormeggio sia la fase iniziale del processo di fusione della vescicola che
richiede specificità fra la vescicola e il compartimento bersaglio. Parte di questa
specificità pu essere conferita da una grande famiglia di piccole proteine G denominate
Rab. Queste proteine passano ciclicamente dallo stato attivo, quando legano GTP, a
quello inattivo in cui sono legate a GDP. Legate a GTP si associano alle membrane
attraverso un’ancora lipidica. Nell’uomo sono stati identificati più di 60 diversi geni
Rab, e queste proteine sono il gruppo più vario coinvolto nel traffico vescicolare. Rab
differenti sono associate con diversi compartimenti di membrana. Così ogni
compartimento ha una sua propria identità di superficie, richiesta per reclutare le
proteine coinvolte nell’indirizzamento specifico. Si pensa che le Rab, nel loro stato GTP
legato, reclutino specifiche proteine citosoliche di ormeggio a superfici di membrana
specifiche. Le proteine Rab giocano anche un ruolo fondamentale nella regolazione
dell’attività di numerose proteine coinvolte in altri aspetti del traffico vescicolare
incluse le proteine motrici che muovono le vescicole membranose attraverso il
citoplasma.
3. Attacco delle vescicole al compartimento bersaglio: ad un certo punto durante il
processo che conduce alla fusione della vescicola, le membrane della vescicola e del
compartimento bersaglio si affiancano strettamente giustapposte l’una all’altra, in
seguito all’interazione tra le regioni citosoliche delle proteine integrali delle due
membrane. Le proteine più importanti che si agganciano in queste interazioni sono dette
SNARE e costituiscono una famiglia di proteine integrali di membrana con più di 35
membri, localizzati in specifici comparti subcellulari. Anche se le SNARE variano molto in
struttura e dimensione, tutte contengono un segmento nel loro dominio citosolico
chiamato motivo SNARE, che consiste di 60-70 amminoacidi capaci di formare un
complesso con un altro motivo SNARE. Le SNARE sono divise in due categorie, v-SNARE,
che sono incorporate nelle membrane delle vescicole di trasporto durante la
gemmazione, e t-SNARE, che sono situate nelle membrane dei compartimenti bersaglio.
Le SNARE meglio studiate sono quelle che mediano l’attracco delle vescicole sinaptiche
alla membrana presinaptica durante il rilascio dei neurotrasmettitori. In questo caso, la
membrana plasmatica della cellula nervosa contiene due t-SNARE, la sintaxina e la
SNAP-25, mentre la membrana della vescicola sinaptica contiene una singola v-SNARE, la
sinaptobrevina. Appena la vescicola plasmatica e la membrana presinaptica si avvicinano
l’una all’altra, le molecole di t-SNARE e di v-SNARE delle membrane giustapposte
interagiscono tra loro per formare dei fasci a quattro filamenti. Ogni fascio consiste di 4
α-eliche che insieme formano un fascio strettamente intrecciato che tira i due doppi
strati lipidici adiacenti in una associazione molto stretta. Si pensa che la formazione di
questi fasci elicoidali a 4 filamenti avvenga anche tra altre SNARE in altri siti della cellula
dove le membrane devono fondersi. È interessante notare che le SNARE della vescicola
sinaptica e della membrana presinaptica sono i responsabili del botulismo e del tetano.
Queste tossine mortali agiscono come proteasi che tagliano le SNARE e quindi bloccano il
rilascio dei neurotrasmettitori causando paralisi.
4. Fusione fra la vescicola e la membrana bersaglio: quando vescicole lipidiche artificiali
(liposomi) contenenti t-SNARE sono mescolate con liposomi contenenti v-SNARE
purificate, i due tipi di vescicole si fondono l’uno con l’altro, ma non cono loro stesse.
Questo indica che t- e v-SNARE costituiscono gli strumenti minimi richiesti per la fusione
delle membrane di diversi compartimenti ma molti esperimenti suggeriscono che
l’interazione fra v- e t-SNARE è necessaria ma non sufficiente di per sé a determinare la
fusione della membrana all’interno di una cellula. Il fascio a quattro
filamenti della SNARE resta bloccato in una conformazione inattiva da interazioni con
altre proteine accessorie. Vescicole in questo stadio restano attraccate alla membrana e
sono pronte a riversare i loro contenuti quasi istantaneamente quando ricevono un
segnale di attivazione, come un aumento della concentrazione di Ca²⁺. A prescindere
dalla modalità di regolazione, quando il doppio strato lipidico delle due membrane si
fonde, le SNARE che prima sporgevano dalle membrane separate si trovano ora nella
stessa membrana. La dissociazione del complesso di SNARE a quattro filamenti è opera di
una proteina citosolica a forma di ciambella, detta NSF, che si attorciglia attorno al
fascio di SNARE e lo spezza in due utilizzando energia fornita dall’idrolisi di ATP.

L’abilità di una particolare vescicola di fondersi con la membrana bersaglio è determinata da


una specifica combinazione di proteine interagenti, comprese le proteine di ormeggio, Rab e
SNARE che possono essere assemblate in quel sito della cellula. Insieme queste interazioni
multiple fra diversi tipi di proteine forniscono un elevato livello di specificità, assicurando che
ogni compartimento membranoso possa essere selettivamente riconosciuto.

ESOCITOSI
La fusione di una vescicola secretoria o di un granulo secretorio con la membrana plasmatica e la
conseguente estrusione dei suoi contenuti è chiamata esocitosi.
L’esocitosi si verifica probabilmente in maniera piuttosto continua nella maggior parte delle
cellule, quando proteine ed altri materiali sono destinati alla membrana plasmatica o allo spazio
extracellulare.
I casi meglio studiati sono quelli che si verificano nel corso della secrezione regolata, ad esempio
il rilascio di neurotrasmettitori nella fessura sinaptica. È stato visto che l’arrivo di un impulso
nervoso al bottone terminale di un neurone porta ad un aumento nell’afflusso di Ca²⁺ ed al
successivo rilascio di molecole del neurotrasmettitore per esocitosi. In questo caso, la fusione è
regolata da una proteina che lega il calcio (sinaptotagmina) presente nella membrana della
vescicola sinaptica. In altri tipi di cellule, l’esocitosi è solitamente innescata dal rilascio di Ca²⁺
da depositi citoplasmatici. Si pensa che il contatto tra la vescicola e la membrana plasmatica
porti alla formazione di un piccolo “poro di fusione” circondato da proteine.
Alcuni pori di fusione possono semplicemente richiudersi, ma nella maggior parte dei casi il poro
si dilata rapidamente per formare un’apertura per l’estrusione del contenuto della vescicola.
Indipendentemente dal meccanismo, quando una vescicola citoplasmatica si fonde con la
membrana plasmatica, la superficie luminale della membrana della vescicola diventa parte della
superficie esterna della membrana plasmatica, mentre la superficie citosolica della membrana
della vescicola diventa parte della superficie interna della membrana plasmatica.

I LISOSOMI
Funzionano come organelli digestivi nella cellula animale. Un tipico lisosoma contiene circa
cinquanta diversi enzimi idrolitici, prodotti nel RER ed indirizzati a questi organelli. Considerati
tutti insieme, gli enzimi lisosomali sono in grado di idrolizzare pressoché ogni tipo di
macromolecola biologica. Gli enzimi di un lisosoma hanno in comune una proprietà importante:
tutti hanno l’attività ottimale a pH acido e sono, quindi, delle idrolasi acide. Il pH ottimale di
questi enzimi è correlato con il basso pH del compartimento lisosomale che è di circa 4,6. La
membrana lisosomale contiene una varietà di proteine integrali altamente glicosilate che
probabilmente proteggono la membrana dagli attacchi degli enzimi contenuti all’interno.
Esempio – Lisosomi delle cellule Kupffer (cellula fagocitaria del fegato): i lisosomi di una
cellula di Kupffer hanno una forma irregolare ed una densità elettronica variabile che rendono
difficoltosa l’identificazione di questi organelli soltanto in base alla morfologia.
La presenza all’interno della cellula di un sacchetto di enzimi litici, ci aiuta a capire le sue
funzioni. Il loro ruolo più studiato è la degradazione delle sostanze portate nella cellula
dall’ambiente esterno.
I lisosomi hanno anche un ruolo chiave nel turnover (ricambio) degli organelli, cioè, nella loro
distruzione regolata e sostituzione. Durante questo processo chiamato autofagia, un organello è
circondato da una doppia membrana in modo da costituire una struttura detta autofagosoma. La
membrana esterna si fonde poi con un lisosoma formando un autofagolisosoma in cui l’organello
inglobato è degradato ed i prodotti di degradazione sono resi disponibili per la cellula. La
cellula così ricava energia, per mantenersi in vita, cannibalizzando i suoi stessi organelli. Quindi
l’autofagia aiuta l’organismo a proteggersi da pericoli intercellulari, che vanno da anormali
aggregati proteici a batteri invasori.
Se l’autofagia è bloccata in una particolare area del cervello, quella regione del sistema nervoso
va incontro ad una perdita massiva di cellule nervose. Questo conferma l’importanza
dell’autofagia nel proteggere le cellule del cervello dai continui danni a proteine e organelli che
avvengono nel corpo della vita di queste cellule a lunga vita.
Una volta che il processo digestivo nell’autofagolisosoma è stato completato, l’organello diventa
un corpo residuo. A seconda del tipo di cellula, il contenuto dei corpi residui pu essere
eliminato dalla cellula per esocitosi o pu essere trattenuto nel citoplasma indefinitamente come
granulo di lipofuscina, che aumentano di numero a mano a mano che un individuo invecchia.

Vacuoli delle cellule vegetali:


Il 90% del volume di molte cellule vegetali è occupato da un singolo vacuolo centrale ripieno di
liquido e circondato da una sola membrana. I vacuoli delle cellule vegetali svolgono un ampio
spettro di funzioni essenziali.
I vacuoli possono anche contenere composti tossici. Alcuni di questi composti fanno parte
dell’arsenale di armi chimiche che sono rilasciate quando la cellula è danneggiata. Altri
composti tossici sono invece il sottoprodotto di reazioni metaboliche.
La membrana che circonda il vacuolo, detta tonoplasto, contiene alcuni sistemi di trasporto
attivo che pompano ioni nel compartimento del vacuolo ad una concentrazione molto più alta di
quella che si trova nel citoplasma o nel fluido extracellulare. L’acqua entra nel vacuolo per
osmosi.
I vacuoli delle piante sono anche siti di digestione intracellulare, non dissimili dai lisosomi che
sono assenti nelle piante.
Molte delle proteine del vacuolo vegetale sono sintetizzate su ribosomi legati alla membrana del
RER, trasportate attraverso il complesso di Golgi e smistare nella faccia trans del Golgi prima di
essere inviate al vacuolo.

ENDOCITOSI
È quel processo attraverso il quale la cellula internalizza recettori di superficie e ligandi
extracellulari. La fagocitosi è l’assunzione di materiale corpuscolato.
Pu essere divisa in due categorie: generalizzata e quella mediata da recettori.
1. L’endocitosi generalizzata (o pinocitosi) porta all’assunzione non specifica di fluidi
extracellulari. Tutte le molecole, grandi o piccole, che sono presenti nel liquido entrano
nella cellula. L’endocitosi generalizzata rimuove anche porzioni della membrana
plasmatica e pu essere rivolta al riciclaggio di membrana tra superficie cellulare e
compartimenti interni.
2. L’endocitosi mediata da recettori (RME) porta all’assunzione di specifiche molecole
extracellulari (ligandi), dopo che si sono legate ai recettori sulla faccia esterna della
membrana plasmatica.

Endocitosi mediata da recettori e ruolo delle fossette rivestite:


L’endocitosi mediata da recettori fornisce un mezzo per l’assunzione selettiva ed efficiente di
macromolecole che possono essere presenti a concentrazioni relativamente basse nei fluidi
extracellulari.
Le cellule hanno recettori per l’assunzione di molti differenti tipi di ligandi, che comprendono
ormoni, fattori di crescita, enzimi e proteine plasmatiche. I ligandi che entrano nella cellula
mediante l’RME si legano ai recettori che si trovano in aree conosciute come fossette rivestite.
Una fossetta rivestita sulla membrana plasmatica si invagina nel citoplasma per formare una
vescicola rivestita che si distacca dalla membrana plasmatica. Per capire il meccanismo della
formazione di vescicole rivestite, dobbiamo esaminare la struttura molecolare del rivestimento
di clatrina.
Il rivestimento “setoloso”, quando si osserva dalla parte citoplasmatica mostra una rete di
poligoni che assomigliano ad un nido di api. La costruzione geometrica del rivestimento deriva
dalla struttura delle unità di clatrina. Ciascuna molecola di clatrina è costituita da tre catene
presenti e tre catene leggere unite a formare una struttura a tre gambe chiamate trischelio. I
trischeli hanno una disposizione sovrapposta.
Ciascuna gamba del trischelio di clatrina si estende verso l’esterno lungo due lati del poligono.
Le molecole di clatrina si sovrappongono in modo tale che ciascun vertice di un poligono
contiene un centro di uno dei tricheli componenti.
Le vescicole rivestite che si formano durante l’endocitosi contengono anche uno strato di
adattatori posti tra il reticolo di clatrina e la superficie della vescicola rivolta verso il citosol.
L’adattatore meglio studiato relativamente all’endocitosi clatrina-mediata è AP2. Gli adattatori
AP2 che vengono incorporati nelle vescicole che gemmano dalla membrana plasmatica
contengono subunità multiple che hanno diverse funzioni. La subunità µ degli adattatori AP2 si
attacca in modo specifico alle code citoplasmatiche dei recettori di membrana, portando alla
concentrazione di questi particolari recettori – e al legame delle loro molecole del carico – nella
vescicola rivestita emergente. La subunità β-adaptina degli adattatori AP2 invece si lega e
recluta le molecole di clatrina del reticolo sovrapposto.
Ci sono spiccate differenze tra la similarità tra i rivestimenti COPII e di clatrina delle vescicole.
Entrambi i rivestimenti contengono due strati distinti: uno scheletro esterno geometrico ed uno
strato interno di proteine adattatrici. Le strutture delle impalcature esterne, sono molto
diverse; le subunità del reticolo di clatrina si sovrappongono molto, mentre quelle del reticolo
COPII non si sovrappongono affatto.
Una vescicola rivestita pu contenere più di due dozzine di proteine accessorie che formano una
rete dinamica di molecole interagenti. Queste proteine hanno ruoli poco chiari nel reclutamento
del carico, nell’assemblaggio del rivestimento, nell’invaginazione della membrana,
nell’interazione con le componenti del citoscheletro, nel rilascio di vescicole e nel distacco del
rivestimento delle membrane. La più studiata di queste proteine è la dinamina.
La dinamina una proteina che lega il GTP necessario per il rilascio della vescicola rivestita da
clatrina dalla membrana su cui si forma. La dinamina si autoassembla formando una collana
intorno al collo di una fossetta rivestita invaginata, immediatamente prima che essa si stacchi
dalla membrana.
Si pensa che la dinamina agisce come un enzima in grado di utilizzare l’energia chimica del GTP
per generare forze meccaniche.

Anche i fosfolipidi della membrana della vescicola giocano un ruolo importante. Gruppi fosfato
possono essere addizionati in differenti posizioni dell’anello glucidico del fosfolipide
fosfatidilinositolo (PI), convertendoli in fosfoinositidi. Sono stati identificati sette diversi
fosfoinositidi. Gli anelli fosforilati di questi fosfoinositidi risiedono nella superficie della
membrana, dove possono essere riconosciuti e legati da particolari proteine. Fosfoinositidi
differenti sono concentrati in diversi compartimenti di membrana, il che contribuisce a dare a
ciascun compartimento una “identità di superficie” unica.

PERCORSO ENDOCITICO
Le molecole assunte da una cellula mediante endocitosi sono convogliate in un definito percorso
endocitico. Si distinguono due diversi tipi di recettori che sono soggetti ad endocitosi:
- un gruppo di recettori di mantenimento (housekeeping), che sono responsabili
dell’assunzione di materiali che saranno utilizzati dalla cellula. Esempi: recettori per la
transferrina e per le LDL (Low Density Lipoprotein, proteine a bassa densità), che
mediano il trasporto alle cellule, rispettivamente del ferro e del colesterolo.
L’endocitosi di questo gruppo di recettori è seguita dal trasporto del materiale legato,
come ferro e colesterolo, alla cellula, e dal ritorno del recettore sulla superficie cellulare
per un ulteriore ciclo di assunzione.
- un gruppo di recettori di segnale, responsabili del legame di ligandi extracellulari che
portano messaggi che cambiano l’attività della cellula. Questi ligandi, che includono
ormoni come insulina e fattori di crescita (es: EGF), si legano ai recettori presenti sulla
superficie innescando una risposta fisiologica all’interno della cellula.
L’endocitosi di questo secondo gruppo di recettori è spesso seguita dalla distruzione del
recettore, un processo chiamato regolazione negativa dei recettori, che ha l’effetto di
ridurre la sensibilità della cellula a ulteriori stimolazioni da parte dell’ormone o del
fattore di crescita. La regolazione negativa dei recettori è un meccanismo attraverso il
quale le cellule regolano la loro capacità di rispondere a messaggi extracellulari. I
recettori di segnale sono di solito marcati per l’endocitosi e per la successiva distruzione
mediante il legame covalente di una “etichetta” alla coda citoplasmatica del recettore
mentre risiedono sulla superficie cellulare. L’etichetta è una piccola proteina chiamata
ubiquitina.
Le proteine di membrana che non vanno normalmente incontro ad endocitosi vengono
internalizzate se ad esse viene aggiunta una coda di ubiquitina.
Dopo l’internalizzazione, i materiali contenuti nelle vescicole vengono trasportati ad una rete
dinamica di tubuli e vescicole conosciuti nel loro insieme come endosomi, che rappresentano
centri di distribuzione lungo il percorso endocitico. Gli endosomi sono ulteriormente divisi in
due classi: gli endosomi precoci, tipicamente localizzati nelle regioni periferiche della cellula
e gli endosomi tardivi, caratteristicamente localizzati in una parte più interna della cellula, più
vicino al nucleo. Gli endosomi precoci maturano progressivamente divenendo tardivi; questa
trasformazione è associata ad una riduzionedel pH, uno scambio di proteine Rab e ad altri
cambiamenti nella morfologia interna e nella struttura. Questi cambiamenti si verificano
quando il versante esterno della membrana dell’endosoma forma gemme nella sua superficie
luminale, che si invaginano verso l’interno creando delle vescicole che si ammassano
all’interno dell’endosoma tardivo. A causa di queste vescicole interne, gli endosomi tardivi
sono anche detti corpi multivescicolari (MVBs). I recettori assunti tramite endocitosi sono
trasportati in vescicole endocitiche agli endosomi precoci, che funzionano come stazioni di
smistamento che dirigono diversi tipi di recettori e ligandi lungo diversi percorsi.
I recettori di mantenimento tipicamente si dissociano dai loro ligandi come risultato dall’alta
concentrazione di H⁺ dell’endosoma precoce. I recettori sono, quindi, concentrati in
compartimenti tubulari specializzati dell’endosoma precoce, che rappresentano centri di
riciclaggio. Le vescicole che gemmano da questi tubuli riportano i recettori di membrana alla
membrana plasmatica per ulteriori cicli di endocitosi.
Invece, i ligandi che sono stati rilasciati dai loro recettori (es. LDL) vengono concentrati in un
compartimento di smistamento prima di essere spediti ad un endosoma tardivo ed infine ad un
lisosoma, dove avviene il processamento finale.
I recettori di segnale con le loro etichette attaccate non ritornano alla membrana, ma sono
invece riconosciuti da una serie di complessi proteici (complessi ESCRT) che smistano i recettori
nelle membrane che danno vita alle vescicole interne degli endosomi tardivi. Infine, gli
endosomi tardivi contenenti queste vescicole intraluminali si fondono ad un lisosoma, il che
porta alla degradazione dei contenuti dell’endosoma da parte degli enzimi lisosomali.

Le molecole di LDL ed il metabolismo del colesterolo:


il colesterolo è usato dalle cellule animali come parte essenziale delle loro membrane
plasmatiche e come precursore degli ormoni steroidi. Il colesterolo è una molecola idrofobica
che è trasportata nel sangue come parte di enormi complessi lipoproteici, come le lipoproteine a
bassa densità LDL. Ogni particella di LDL contiene una parte centrale con circa 1500 molecole di
colesterolo esterificate da acidi grassi a lunga catena. La parte centrale è circondata da un
singolo strato di fosfolipidi, ed una singola copia di una grande proteina, chiamata apoliproteina
B-100, che si lega specificamente ai recettori per LDL sulla superficie della cellula. I recettori
per LDL sono trasportati alla membrana plasmatica dove vengono concentrati in fossette
rivestite anche in assenza del ligando LDL.
Una volta che l’LDL si è legata alla fossetta rivestita, la fossetta si invagina per formare una
vescicola rivestita, il rivestimento di clatrina si disassembla e i recettori per LDL passano
attraverso l’endosoma precoce e sono riciclati di nuovo sulla membrana plasmatica.
Allo stesso tempo, le particelle di LDL sono portate agli endosomi tardivi e ai lisosomi, dove la
componente proteica è degradata ed il colesterolo è rilasciato per essere usato dalla cellula
nella formazione della membrana o in altri processi metabolici (per esempio la sintesi di ormoni
steroidei).
Il livello di LDL nel sangue è correlato al manifestarsi dell’arterosclerosi, una condizione
caratterizzata dalla formazione di placche sulle pareti arteriose, le quali riducono il flusso
sanguigno attraverso i vasi e determinano la formazione di coaguli nel sangue, che sono la causa
principale d’infarto del miocardio.
Le LDL non sono gli unici agenti trasportatori di colesterolo nel sangue. Le HDL (High Density
Lipoproteins, proteine ad alta densità) sono fatte in modo simile, ma contengono una proteina
diversa (apoliproteina A-I) e svolgono un differente ruolo fisiologico nell’organismo. Le LDL
servono soprattutto a portare le molecole di colesterolo dal fegato (dove sono sintetizzate e
impacchettate) alle cellule dell’organismo, attraverso il circolo sanguigno. Le HDL portano il
colesterolo nella direzione opposta. L’eccesso di colesterolo è trasferito alla membrana
plasmatica delle cellule direttamente alle particelle di HDL circolanti, che portano il
colesterolo al fegato per l’escrezione.
Alti livelli ematici di HDL sono associati con una diminuzione del rischio di malattie cardiache
per questo le HDL vengono usate con il termine “colesterolo buono”.

FAGOCITOSI
La fagocitosi (cibarsi della cellula) è un processo che si verifica ampiamente in pochi tipi di
cellule specializzate nell’assunzione di particelle relativamente grandi dall’ambiente. Organismi
eterotrofi unicellulari, come le amebe e i ciliati, si alimentano intrappolando particelle di cibo
ed organismi più piccoli, avvolgendoli all’interno di pieghe della membrana plasmatica. Le
pieghe si fondono per formare un vacuolo (o fagosoma) che si distacca dalla membrana
plasmatica. Il fagosoma si fonde con un lisosoma ed il materiale è digerito all’interno del
risultante fagolisosoma.
Nella maggior parte degli animali superiori la fagocitosi è un meccanismo di protezione piuttosto
che di nutrizione. I mammiferi possiedono una varietà di fagociti “professionali”, che
comprendono i macrofagi e i neutrofili, la cui funzione è di andare in giro nel circolo sanguigno e
per i tessuti per fagocitare organismi estranei, cellule danneggiate e morte e detriti.
Una volta all’interno del fagocita, i microrganismi possono essere uccisi dagli enzimi lisosomali o
da radicali liberi dell’ossigeno generati all’interno del lume del fagosoma.
L’inglobamento di materiale particolato durante la fagocitosi è mediato dall’attività contrattile
di microfilamenti contenenti actina posti al di sotto della membrana plasmatica. Non tutti i
batteri ingeriti dai fagociti vengono distrutti; infatti alcune specie “dirottano” i meccanismi
fagocitari per la propria sopravvivenza.
Si è scoperto recentemente che se il fagosoma diviene molto acido, il batterio è in grado di
mantenere il proprio pH fisiologico, malgrado l’abbassamento del pH del mezzo circostante.

ASSUNZIONE POST-TRADUZIONALE DI PROTEINE DA PARTE DI PEROSSISOMI, MITOCONDRI E


CLOROPLASTI
Il traffico di proteine all’interno della cellula è governato da segnali di smistamento, come il
peptide segnale delle proteine di secrezione o i gruppi di mannosio fosfato degli enzimi
lisosomali e da recettori che riconoscono questi segnali e trasportano la proteina che li contiene
al compartimento adeguato.
Quattro dei principali organelli cellulari – nucleo, mitocondri, cloroplasti e perossisomi –
importano le proteine tramite le membrane che li circondano.
Le proteine importate da questi organelli contengono le sequenze amminoacidiche che servono
da indirizzi e vengono riconosciute dai recettori sulla membrana esterna dell’organello. Le
proteine di questi organelli sono importate post-traduzionalmente, cioè, dopo la loro completa
sintesi su ribosomi liberi nel citosol.

Assunzione delle proteine da parte dei perossisomi


I perossisomi sono organelli molto semplici che hanno soltanto due subcompartimenti in cui una
proteina importata pu essere localizzata: la membrana di contorno o la matrice interna. Le
proteine destinate ad un perissosoma possiedono un segnale d’indirizzo perossisomale (PTS), che
pu essere un PTS per una proteina della matrice perossisomale o un mPTS per una proteina della
membrana perossisomale.
Sono stati identificati vari recettori per i PTS e vari PTS ed mPTS.
Il recettore PTS accompagna la proteina perossisomale attraverso la membrana e poi nella
matrice, per poi tornare nel citosol per scortare un’altra proteina.
I perossisomi possono in qualche modo importare le proteine perossisomali dalla matrice nella
loro conformazione ripiegata nativa, anche quelle che sono costituite da diverse subunità.

Assunzione delle proteine da parte dei mitocondri


I mitocondri hanno quattro subcompartimenti in cui le proteine possono essere trasportate: una
membrana mitocondriale esterna (OMM), una membrana mitocondriale interna (IMM), uno spazio
intermembrana e la matrice.
La vasta maggioranza delle proteine dell’organello è codificata dal genoma nucleare,
sintetizzata nel citosol e importata post-traduzionalmente. Le proteine della matrice
mitocondriale e della membrana mitocondriale interna, insieme costituiscono la grande
maggioranza delle proteine destinate a quest’organello.
Le proteine mitocondriali contengono sequenze segnale che le indirizzano alla loro sede. La
maggior parte delle proteine della matrice mitocondriale presenta una sequenza rimovibile che
funge da etichetta (detta presequenza), localizzata all’estremità N-terminale della molecola che
contiene parecchi residui carichi positivamente. Invece, la maggior parte delle proteine
destinate alla IMM contiene sequenze interne che fungono da etichette che restano come parte
della molecola.
Per poter entrare in un mitocondrio, la proteina, per prima cosa, deve essere presentata al
mitocondrio, in uno stato non ripiegato. Varie proteine chaperon sono coinvolte nel preparare i
polipeptidi all’assunzione nei mitocondri, compresa quella che dirige specificamente le proteine
mitocondriali verso la superficie citosolica della OMM. La OMM contiene un complesso
d’importazione delle proteine, il complesso TOM, che include: recettori che riconoscono e
legano le proteine mitocondriali e canali delineati da proteine attraverso i quali i polipeptidi non
ripiegati vengono traslocati attraverso la membrana esterna.
Le proteine che sono destinate alla IMM o alla matrice devono passare attraverso lo spazio
intermembrana ed agganciare un secondo complesso d’importazione delle proteine, localizzato
nella IMM, chiamato complesso TIM. La IMM contiene due principali complessi TIM: TIM22, che si
lega alle proteine integrali della IMM e le inserisce nel doppio strato lipidico e il TIM23, che si
lega alle proteine con una pre-sequenza N-terminale, che include tutte le proteine della matrice
le trasferisce attraverso la IMM nel compartimento interno acquoso della matrice.
Il movimento nella matrice è alimentato dal potenziale elettrico tra i due lati della IMM, che
agisce sul segnale d’indirizzo carico positivamente.
Una volta entrato nella matrice, il polipeptide interagisce con le proteine chaperon
mitocondriali che mediano l’entrata nel compartimento acquoso.
Si pensa che queste proteine fungono da motori generatori di forza che usano l’energia derivata
dall’idrolisi dell’ATP per “tirare” attivamente il polipeptide non ripiegato attraverso il poro di
traslocazione. Secondo un’altra teoria, queste proteine chaperon aiutano la diffusione del
polipeptide attraverso la membrana. La diffusione è un processo casuale in cui una molecola
pu muoversi in qualsiasi direzione possibile.
Appena il polipeptide entra ancora di più nella matrice, si lega ripetutamente alla proteina
chaperon che ogni volta gli impedisce di retrodiffondere. Questo meccanismo d’azione della
proteina chaperon viene chiamato diffusione controllata e si dice che la proteina chaperon
agisce come una valvola Browniana. 

Valvola inteso come strumento che permette il movimento soltanto in una direzione; Browniano
implica invece la diffusione casuale.
Gli studi hanno suggerito che entrambi i meccanismi d’azione dello chaperon sono
probabilmente utilizzati ed agiscono in maniera cooperativa. A prescindere dal meeccanismo di
penetrazione, il polipeptide, una volta raggiunta la matrice, consegue la sua conformazione
nativa dopo la rimozione enzimatica della presequenza.
Assunzione delle proteine da parte dei cloroplasti
I cloroplasti hanno sei subcompartimenti in cui le proteine possono essere trasportate: un
involucro esterno e uno interno di membrana, uno spazio tra le membrane, lo stroma, la
membrana dei tilacoidi ed il lume tilacoidale.
La grande maggioranza delle proteine del cloroplasto è importata dal citosol;
Le membrane dell’involucro esterna ed interna contengono distinti complessi di traslocazione
(complessi Toc e Tic), che lavorano insieme durante l’importazione;
Le proteine chaperon contribuiscono al dispiegamento dei polipeptidi nel citosol e al
ripiegamento delle proteine nel cloroplasto.
La maggior parte delle proteine destinate al cloroplasto è sintetizzata con una sequenza
Nterminale rimovibile (peptide di transito).
Il peptide di transito oltre ad indirizzare un polipeptide ad un cloroplasto fornisce un indirizzo
che localizza il polipeptide ad uno dei vari subcompartimenti possibili all’interno dell’organello.
Tutte le proteine che traslocano attraverso l’involucro del cloroplasto contengono un dominio di
indirizzo stromatico che fa parte del loro peptide di transito, e garantisce che il polipeptide
entrerà nello stroma.
Una volta nello stroma, il dominio di indirizzo stromatico è rimosso da una proteasi e quei
polipeptidi che appartengono alla membrana del tilacoide o al lume del tilacoide portano un
segmento supplementare nel loro peptide di transito, il dominio di trasferimento nel tilacoide,
che detta l’ingresso nei tilacoidi.
Molte delle proteine che risiedono all’interno delle membrane tilacoidali sono codificate da geni
del cloroplasto e sintetizzate su ribosomi associati a membrane nel cloroplasto.

ESPRESSIONE GENICA: DALLA TRASCRIZIONE ALLA TRADUZIONE


I risultati dei vari esperimenti erano chiari: un gene specifico portava le informazioni per la
costruzione di un dato enzima. Questa conclusione divent famosa come l’ipotesi “un gene – un
enzima”.
Una volta compreso che gli enzimi sono spesso composti da più di una catena polipeptidica,
ciascuna delle quali è codificata da un gene diverso, il concetto venne ridefinito “un gene – una
catena polipeptidica”.
Un singolo gene genera spesso una varietà di polipeptidi diversi come risultato dello splicing
alternativo.
Si è dimostrato che una mutazione in un singolo gene aveva provocato una singola sostituzione
nella sequenza amminoacidica nella singola proteina.

Esiste un intermediario tra un gene e il suo polipeptide: l’RNA messaggero (mRNA), che è
costituito come copia complementare di uno dei due filamenti di DNA che costituiscono un gene.
La sintesi di un RNA da uno stampo di DNA si chiama trascrizione. Dal momento che la sua
sequenza nucleotidica è complementare a quella del gene dal quale viene trascritto, l’mRNA
conserva le medesime informazioni del gene stesso.
L’uso dell’RNA messaggero permette alla cellula di separare il depositario dell’informazione dal
processo di utilizzazione dell’informazione stessa. Mentre il gene fa parte di una enorme
molecola di DNA che rimane nel nucleo, le sue informazioni possono essere trasmesse ad un
RNA molto più piccolo e mobile che è in grado di passare nel citoplasma. Quando è nel
citoplasma, l’mRNA pu servire da stampo per dirigere l’incorporazione di amminoacidi in un
ordine ben preciso, codificato dalla sequenza nucleotidica del DNA e dell’mRNA. Inoltre, l’uso
dell’RNA messaggero permette ad una cellula di amplificare enormemente la sua attività
sintetica. Una molecola di DNA pu servire come stampo per la formazione di molte molecole di
RNA, ognuna delle quali pu essere usata per la sintesi di un grande numero di catene
polipeptidiche. Le proteine sono sintetizzate nel citoplasma attraverso un processo molto
complesso, chiamato traduzione.
La traduzione, richiede la partecipazione di molti componenti diversi, tra cui i ribosomi (che
sono componenti non specifici). Queste complesse “macchine” citoplasmatiche possono essere
programmate, come un calcolatore, per tradurre le informazioni codificate da qualsiasi RNA. I
ribosomi sono costituiti da RNA e proteine. Gli RNA di un ribosoma si chiamano RNA ribosomali
(rRNA) e ognuno e trascritto da uno dei filamenti di DNA di un gene. Gli rRNA forniscono un
supporto strutturale e catalizzano reazioni chimiche in cui gli amminoacidi sono legati
covalentemente l’uno all’altro.
Gli RNA transfer (tRNA) costituiscono una terza classe di RNA richiesta durante la sintesi delle
proteine e sono necessari per tradurre le informazioni contenute nella sequenza nucleotidica di
un mRNA nella sequenza di amminoacidi di un polipeptide.
Sia gli rRNA che i tRNA devono le loro attività alle loro complesse strutture secondaria e
terziaria.
Diversamente dal DNA, gli RNA si ripiegano in complesse forme tridimensionali, notevolmente
diverse da un tipo di RNA all’altro.
Come le proteine, gli RNA sono in grado i svolgere molte funzioni, perché possono assumere una
grande varietà di forme, e il loro ripiegamento dipende dalla formazione di regioni che hanno
coppie di basi complementari.
Regioni con basi appaiate formano tipicamente degli “steli” a doppio filamento (e a doppia
elica), connessi ad “anse” a filamento singolo. A differenza del DNA, l’RNA contiene spesso
coppie di basi non convenzionali e basi azotate modificate. Queste regioni peculiari spesso
fungono da siti di riconoscimento per proteine e altri RNA, promuovono il ripiegamento dell’RNA
ed aiutano a stabilizzare la struttura della molecola.
L’appaiamento delle basi fra diverse molecole di RNA svolge un ruolo fondamentale nella gran
parte delle attività in cui sono coinvolti gli RNA.
Le cellule eucariotiche producono una pletora di altri RNA, che hanno anche un ruolo cruciale
nel metabolismo cellulare.; questi includono i piccoli RNA nucleari (snRNA), i piccoli RNA
nucleolari (snoRNA), i piccoli RNA interferenti (siRNA) e i micro RNA (miRNa).
Il nostro genoma sembra possa codificare centinaia di questi minuscoli microRNA ma non se ne
conoscono le funzioni.

Trascrizione nelle cellule procariotiche ed eucariotiche


La trascrizione è un processo nel quale un filamento di DNA fornisce le informazioni per la sintesi
di un filamento di RNA. Gli enzimi responsabili della trascrizione in eucarioti e procarioti sono
chiamati RNA polimerasi-DNA dipendenti o RNA polimerasi.
Questi enzimi, sono in grado di assemblare nucleotidi, uno alla volta, in una catena lineare di
RNA la cui sequenza è complementare a uno dei filamenti di DNA, che funge da stampo.
Il primo passo nella sintesi di un RNA è l’associazione della polimerasi con lo stampo di DNA.
Il sito al quale si lega una molecola di RNA polimerasi prima di iniziare la trascrizione viene
definito promotore. Le RNA polimerasi non sono in grado da sole di riconoscere i promotori, ma
richiedono l’intervento di proteine addizionali dette fattori di trascrizione. Oltre a fornire un
sito di legame per la polimerasi, il promotore contiene le informazioni che determinano quale
dei due filamenti di DNA verrà trascritto e il sito nel quale inizierà la trascrizione.
L’RNA polimerasi si muove lungo il filamento stampo di DNA in direzione 3’  5’. Man mano che
la polimerasi avanza, il DNA viene temporaneamente srotolato e la polimerasi assembla un
filamento complementare di RNA, che cresce dal suo terminale 5’ (in direzione 5’  3’).
L’RNA polimerasi catalizza la reazione:
RNAn + NTP  RNAn+1 + PPi
nella quale i ribonucleosidi trifosfati (NTP) vengono idrolizzati in nucleosidi monofosfati e sono
polimerizzati in una catena covalente. Le reazioni che portano alla sintesi di proteine e di acidi
nucleici si realizzano in condizioni nelle quali praticamente non c’è alcuna reazione in senso
contrario. Questa condizione si ottiene accoppiando la trascrizione ad una seconda reazione:
Ppi  2 Pi
catalizzata da un enzima diverso, una pirofosfatasi. In questa reazione, il pirofosfato (PPi)
prodotto nella prima reazione, è idrolizzato a fosfato inorganico (P), rilasciando una grande
quantità di energia e rendendo l’incorporazione dei nucleotidi essenzialmente irreversibile.

La polimerasi, avanzando lungo lo stampo di DNA, inserisce il nucleotide complementare nella


catena nascente di RNA. Un nucleotide è incorporato nel filamento di RNA se è in grado di
formare un appaiamento stereochimico appropriato con il nucleotide del filamento di DNA in
trascrizione.
Appena la polimerasi ha oltrepassato una certa regione del DNA, la doppia elica del DNA si
riforma.
Di conseguenza, la catena dell’RNA non rimane associata al proprio stampo come un ibrido di
DNA-RNA.
Le RNA polimerasi sono in grado di incorporare da circa 20 a 50 nucleotidi al secondo in una
molecola di RNA in formazione, e molti geni in una cellula sono trascritti simultaneamente da
numerose polimerasi.

Le RNA polimerasi sono capaci di formare degli RNA straordinariamente lunghi; per questo
l’enzima deve rimanere attaccato al DNA per lunghi tratti (processività dell’enzima). Allo stesso
tempo, l’enzima deve essere associato in modo sufficientemente debole, così da potersi
muovere, a livello dello stampo, da nucleotide a nucleotide.

Sebbene le polimerasi siano dei motori piuttosto potenti, questi enzimi non si muovono
necessariamente in maniera continua, ma possono arrestarsi in certi siti lungo lo stampo, per
vari periodi. In alcuni casi, come quando è stato incorporato un nucleotide sbagliato, una
polimerasi bloccata deve digerire l’estremità 3’ del trascritto neosintetizzato e risintetizzare la
porzione mancante prima di essere in grado di riprendere il suo movimento. Sono stati
identificati diversi fattori di allungamento che aumentano la capacità dell’enzima di superare
questi blocchi.

Trascrizione nei procarioti: i batteri contengono un solo tipo di RNA polimerasi, composta da
cinque subunità che sono strettamente associate per formare il nucleo (core) enzimatico. Se
questo nucleo enzimatico è purificato dalle cellule batteriche ed aggiunto ad una soluzione di
molecole di DNA batterico e di ribonucleosidi trifosfati, l’enzima si lega al DNA e sintetizza
l’RNA. Le molecole di RNA prodotte dalla polimerasi purificata per , non sono le stesse di quelle
che si trovano all’interno della cellula, perché l’enzima si lega a siti casuali del DNA, siti che
nella cellula sarebbero stati ignorati. Se invece, viene aggiunto all’RNA polimerasi un
polipeptide accessorio purificato, chiamato fattore sigma (σ), prima che l’RNA polimerasi si leghi
al DNA, la trascrizione inizia nei siti appropriati.
Quando il fattore σ si lega al nucleo enzimatico, l’affinità dell’enzima per i promotori per il DNA
aumenta, mentre si riduce la sua affinità per il DNA in generale.
Si ritiene quindi che l’enzima completo possa scivolare liberamente sul DNA, finché non
riconosce e lega una regione promotrice appropriata.
Quando il fattore σ interagisce con il promotore, le pinze dell’enzima afferrano la doppia elica
del DNA sottostante, situata all’interno del canale. L’enzima poi separa (o delimita) i due
filamenti di DNA nella regione circostante il sito di inizio. La separazione dei filamenti rende lo
stampo accessibile al sito attivo dell’enzima, che risiede nella parete posteriore del canale.
L’inizio della trascrizione sempre complicata, visto che una RNA polimerasi solitamente effettua
diversi tentativi infruttuosi per assemblare un trascritto di RNA. Una volta che 10-12 nucleotidi
sono stati incorporati con successo nel trascritto nascente, l’enzima subisce un notevole
cambiamento conformazionale e viene trasformato in un complesso di allungamento della
trascrizione, che è in grado di muoversi processivamente lungo il DNA.
La formazione di un complesso di allungamento è generalmente seguita dal rilascio del fattore σ.
I promotori sono i siti del DNA che legano l’RNA polimerasi; quelli batterici si trovano nella
regione di un filamento di DNA subito a monte del sito di inizio della sintesi di RNA. Queste
porzioni di DNA precedenti il sito di inizio (verso l’estremità 3’) sono dette a monte di quel sito.
Le porzioni di DNA che lo seguono (verso l’estremità 5’) sono dette a valle di quel sito.
L’analisi delle sequenze di DNA a monte di un gran numero di geni batterici indica la presenza di
due brevi tratti che sono simili da un gene all’altro. Uno di questi tratti è a circa 35 basi a monte
del sito d’inizio e tipicamente si trova come sequenza TTGACA, definita come una sequenza
consenso, il che indica che è la versione più comune di una sequenza conservata, ma che
esistono alcune variazioni da un gene all’altro.
La seconda sequenza conservata si trova 10 basi a monte del sito d’inizio ed è presente come la
sequenza di consenso TATAAT. Questo sito promotore, chiamato Pribnow box, è responsabile
dell’identificazione del nucleotide preciso in cui inizia la trascrizione.
Le cellule batteriche possiedono una varietà di diversi fattori σ, che riconoscono differenti
versioni della sequenza promotrice. Il fattore σ⁷⁰ (noto come fattore σ housekeeping), inizia la
trascrizione della maggior parte dei geni.
Fattori σ alternativi iniziano la trascrizione di un piccolo numero di geni specifici che
partecipano ad una risposta comune.
Così come la trascrizione inizia in punti specifici sul cromosoma, allo stesso modo termina
quando viene raggiunta una specifica sequenza di nucleotidi. In circa metà dei casi, una proteina
ad anello, chiamata rho, è richiesta per la terminazione della trascrizione batterica. Rho
circonda l’RNA neosintetizzato e si muove lungo il filamento verso la polimerasi, dove separa il
trascritto di RNA dal DNA a cui è legato.
In altri casi, la polimerasi interrompe la trascrizione quando raggiunge una sequenza di
terminazione e libera la catena completa di RNA senza la necessità di fattori addizionali.

Trascrizione e maturazione dell’RNA negli eucarioti


Le cellule eucariotiche posseggono tre distinti enzimi di trascrizione all’interno del nucleo,
ciascuno responsabile della sintesi di un diverso gruppo di RNA. Questa è una chiara differenza
con i procarioti.
È evidente dagli studi effettuati che le RNA polimerasi sono enzimi costituiti da diverse subunità.
Le RNA polimerasi dei tre domini di viventi condividono alcune subunità ad esempio la struttura
fondamentale del core catalitico è identica.
Una delle principali differenze fra la trascrizione nei procarioti e quella degli eucarioti è la
necessità di questi ultimi di un’ampia varietà di proteine accessorie o fattori di trascrizione.
Queste proteine svolgono un ruolo in tutti gli aspetti dei processi di trascrizione, dal legame
della polimerasi allo stampo di DNA, all’inizio della trascrizione, all’allungamento e alla
terminazione.
I tre tipi principali di RNA (mRNA, rRNA e tRNA) derivano da molecole di RNA precursore, che
sono considerevolmente più lunghe rispetto al prodotto “maturo” di RNA.
L’iniziale molecola di RNA precursore è equivalente in lunghezza a quella totale del DNA
trascritto, e si chiama trascritto primario, o pre-RNA. Il segmento corrispondente di DNA sul
quale un trascritto primario viene costituito è chiamato unità di trascrizione. I trascritti primari
non esistono all’interno della cellula come RNA nudo, ma appena sintetizzati vengono associati a
proteine. I trascritti primari hanno un’esistenza effimera, perché vengono elaborati (o
processati) in RNA più piccoli e funzionali da una serie di reazioni del tipo “taglia e incolla”. Il
processamento, o maturazione, dell’RNA richiede una varietà di piccoli RNA e delle loro proteine
associate.
Sintesi e maturazione degli rRNA e tRNA
Le cellule eucariotiche possiedono milioni di ribosomi, ciascuno dei quali contiene diverse
molecole di rRNA, assieme a dozzine di proteine ribosomali.
I ribosomi sono così numerosi che nella maggior parte delle cellule più dell’80% dell’RNA consiste
di rRNA.
Per fornire alla cellula un così rande numero di trascritti, le sequenze di DNA che codificano
l’rRNA sono di solito ripetute centinaia di volte. Questo DNA (rDNA) è tipicamente raggruppato
in una o in poche regioni del genoma. Il genoma umano contiene cinque raggruppamenti di
rDNA, ognuno localizzato su un cromosoma diverso. In una cellula che non si sta dividendo
(interfase), gli rDNA sono raggruppati a livello di una o più strutture nucleari dalla forma
irregolare, chiamate nucleoli, che determinano la produzione di ribosomi.
La gran parte del nucleolo è costituita da subunità ribosomali che conferiscono al nucleolo un
aspetto granulare. All’interno di questa massa granulare, ci sono una o più zone rotondeggianti
composte soprattutto da materiale fibrillare, che si ritiene sia costituito da stampi di rDNA e
trascritti di rRNA nascenti

Sintesi del precursore dell’rRNA


Immagini al microcopio elettronico mettono in evidenza diversi aspetti dell’attività nucleolare
della sintesi dell’rRNA
1. si notano diversi geni per l’rRNA, situati uno dopo l’altro lungo una singola molecola di
DNA, rivelando così una disposizione a tandem dei geni per l’rRNA ripetuti.
2. Ognuna delle varie fibrille che si espande dal DNA come un ramo di un albero è un
trascritto di rRNA nascente. Il granulo scuro alla base di ogni fibrilla rappresenta la
molecola di RNA polimerasi I, che è responsabile della formazione di quel trascritto. La
lunghezza delle fibrille aumenta gradualmente da una estremità del tronco dell’albero
all’altra. Le fibrille più corte sono molecole di RNA con meno nucleotidi, attaccate alle
molecole di polimerasi legate al DNA più vicino al sito di inizio della trascrizione. Più
lunga è la fibrilla, più si è vicini al completamento della trascrizione. Il tratto di DNA
tra le fibrille di RNA più corte e quelle più lunghe corrisponde ad una singola unità di
trascrizione. Il promotore si trova proprio a monte del sito di inizio della trascrizione.
3. Si pu osservare che i trascritti di RNA nascente contengono gruppi di particelle associate.
Queste particelle sono composte da RNA e proteine che lavorano insieme per convertire i
precursori di rRNA nei loro prodotti finali e nell’assemblarli nelle subunità ribosomali.
Questi eventi di maturazione avvengono mentre la molecola di RNA viene sintetizzata.
4. Si pu anche osservare che la regione della fibra di DNA tra unità di trascrizione adiacenti
è priva di catene di RNA nascente. Questa regione viene chiamata spaziatore non
trascritto, appunto perché non viene trascritta, e sono presenti in vari gruppi di geni
ripetuti in serie, compresi quelli dei tRNA e degli istoni.

Maturazione dell’rRNA precursore


I ribosomi eucariotici contengono quattro distinti rRNA: tre nella subunità maggiore e uno nella
subunità minore. Nell’uomo, la subunità maggiore contiene una molecola di RNA 28S, una 5,8S e
una 5S, mentre la subunità minore contiene una molecola di RNA 18S.
Tre di questi rRNA (28S, 18S e il 5,8S) sono prodotti dal taglio di un unico trascritto primario
(pre-rRNA) ad opera di varie nucleasi. L’rRNA 5S è sintetizzato da un RNA precursore diverso, al
di fuori del nucleolo.
I pre-rRNA sono caratterizzati da un gran numero di nucleotidi metilati e dalla presenza di
residui di pseudouridina. Nell’uomo, prima che avvenga il taglio del precursore dell’rRNA,
vengono aggiunti oltre 100 gruppi metilici ai gruppi ribosio della molecola, e circa 95 residui di
uridina sono chimicamente convertiti in pseudouridina. Tutte queste modificazioni avvengono
dopo che i nucleotidi ono stati incorporati nell’RNA nascente, ossia sono modificazioni
posttrascrizionali. I nucleotidi modificati sono localizzati in posizioni specifiche e raggruppati
all’interno di porzioni della molecola che sono state conservate nel corso dell’evoluzione dei
vertebrati. Tutti i nucleotidi modificati nel pre-rRNA restano come parti del prodotto finale,
mentre le regioni non modificate sono scartate nel corso della maturazione. La funzione dei
gruppi metilici e delle pseudouridine non è chiara.
Si ritiene che questi nucleotidi modificati possano proteggere regioni del pre-rRNA dal taglio
enzimatico, favorire l’avvolgimento dell’rRNA nelle strutture tridimensionali definitive e/o
favorire le interazioni dell’rRNA con altre molecole.

La maturazione del pre-rRNA si realizza grazie all’aiuto di un gran numero di piccoli RNA
nucleolari (small nucleolar RNA o snoRNA), assemblati insieme a particolari proteine a costituire
particelle chiamate piccole ribonucleoproteine nucleari (snoRNP).
Le snoRNP iniziano ad associarsi con l’rRNA precursore prima che questo sia completamente
trascritto. La prima partitcella di RNP che si attacca al trascritto di pre-RNA contiene lo snoRNA
U3 e più di due dozzine di proteine differenti. Questo grosso componente del macchinario di
maturazione dell’rRNA catalizza la rimozione dell’estremità 5’ del trascritto. Alcuni degli altri
tagli enzimatici si ritiene siano catalizzati dal cosiddetto “exosoma”, un apparato di
degradazione dell’RNA costituito da circa una dozzina di esonucleasi diverse.
Di recente è stata scoperta una classe diversa di snoRNA, presenti in concentrazioni minori, che
possono essere suddivisi in due gruppi in base alla loro funzione e alla somiglianza nelle
sequenze nucleotidiche.
I membri del primo gruppo (detti snoRNA box C/D) determinano quali nucleotidi nel pre-RNA
avranno il ribosio metilato, mentre i membri dell’altro gruppo (detto snoRNA box H/ACA)
determinano quali uridine saranno convertite in pseudouridine.
Entrambi i gruppi di sno RNA contengono tratti relativamente lunghi (da 10 a 21 nucleotidi)
complementari a regioni del trascritto di rRNA. Questi snoRNA forniscono un eccellente esempio
del principio del principio che acidi nucleici a singolo filamento aventi sequenze nucleotidiche
complementari sono in grado di formare ibridi a doppio filamento.
In questo caso, ciascun snoRNA si lega ad una porzione specifica del pre-rRNA per formare un
duplex RNA-RNA. Lo snoRNA legato poi guida un enzima, una metilasi o una pseudouridilasi,
all’interno della snoRNP, in modo da modificare un particolare nucleotide del pre-rRNA.
Nell’insieme, sono presenti all’incirca 200 diversi snoRNA, uno per ognuno dei siti del pre-rRNA il
cui ribosio è metilato o in cui una uridina viene convertita in pseudouridina.
Se il gene che codifica uno di questo snoRNA è deleto, uno dei nucleotidi del pre-rRNA non viene
modificato enzimaticamente
Il nucleo non è soltanto il sito di elaborazione di rRNA, ma anche quello di montaggio delle sue
subunità ribosomali. Due tipi di proteine si associano con l’RNA durante la sua elaborazione: le
proteine ribosomali, che rimangono nelle subunità dei ribosomi, e le proteine accessorie, che si
associano in modo transitorio con gli rRNA intermedi e che sono necessarie solo per la
maturazione.
All’interno di questo secondo gruppo vi sono più di una decina di RNA elicasi, enzimi che aprono
regioni dell’RNA a doppia elica. Questi enzimi sono verosimilmente coinvolti nei numerosi
riarrangiamenti strutturali che avvengono durante la formazione del ribosoma, incluse
l’associazione e dissociazione degli snoRNA.

Sintesi e maturazione dell’rRNA 5S


Una molecola di rRNA 5S è presente come componente della subunità maggiore del ribosoma sia
dei procarioti che degli eucarioti. Negli eucarioti, le molecole di rRNA 5S sono codificate da un
gran numero di geni identici, separati dai geni degli altri rRNA e localizzati all’esterno del
nucleolo. Dopo la sintesi l’RNA 5S è trasportato nel nucleolo per riunirsi agli altri componenti
coinvolti nell’assemblaggio delle subunità ribosomali I geni per l’RNA 5S sono trascritti dalla RNA
polimerasi III.
Fra le tre RNA polimerasi, la RNA polimerasi III è abbastanza particolare, dato che si lega ad un
sito promotore situato all’interno della parte di gene che viene trascritta.
Se il promotore interno di un gene per l’rRNA 5S viene inserito in un’altra regione del genoma, il
nuovo sito diventa uno stampo per la trascrizione da parte dell’RNA polimerasi III.

Gli tRNA
Si stima che le cellule di animali e piante abbiano circa 50 specie diverse di tRNA, ciascuna
codificata da una sequenza di DNA che è ripetuta più volte all’interno del genoma.
Il grado di ripetizione varia da organismo ad organismo.
I tRNA sono sintetizzati da geni che si trovano in piccoli gruppi (cluster) sparsi nel genoma. Un
singolo cluster contiene generalmente copie multiple differenti geni per il tRNA e, viceversam la
sequenza di DNA che codifica un dato tRNA si trova generalmente in più di un cluster.
Il DNA all’interno di un cluster (tDNA) è composto in gran parte da sequenze spaziatrici che non
vengono trascritte, mentre le sequenze codificanti per i tRNA sono situate ad intervalli irregolari
in ripetizioni a tandem.
I tRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi III e la sequenza promotrice è presente all’interno
della parte codificante del gene, anziché all’estremità 5’. Il trascritto primario di una molecola
di RNA transfer è più grande del prodotto finale e tratti del precursore localizzati su entrambe le
estremità 5’ e 3’ (e in alcuni casi anche al suo interno devono essere rimossi.
Inoltre, numerose basi devono essere modificate. Uno degli enzimi coinvolti nell’elaborazione
dei pre-tRNA è una endonucleasi denominata ribonucleasi P, presente sia nelle cellule batteriche
che eucariotiche e costituita sia da RNA che da proteine.
È la subunità a RNA della ribonucleasi P a catalizzare il taglio del pre-tRNA.
SINTESI E MATURAZIONE DEGLI RNA MESSAGGERI
Tutti i precursori degli mRNA eucariotici sono sintetizzati dalla RNA polimerasi II, un enzima
composto da 12 diverse subunità che è notevolmente conservato dal lievito ai mammiferi.
L’RNA polimerasi II lega il promotore in cooperazione con una serie di fattori generali di
trascrizione (general transcription factors, GTF), per formare un complesso di preinizio (PIC).
Queste proteine sono definite fattori generali di trascrizione dal momento che le stesse sono
richieste per il corretto avvio della trascrizione di differenti tipi di geni in un’ampia varietà di
organismi diversi.
Gli elementi del promotore che determinano l’assemblaggio del PIC si trovano all’estremità 5’ di
ciascuna unità di trascrizione, sebbene l’enzima stabilisca interazioni ad entrambi i lati del sito
di inizio della trascrizione.
I promotori meglio studiati sono quelli associati con geni tessuto-specifici altamente espressi: il
gene dell’ovalbumina, codificante per l’albume dell’uovo di pollo, e i geni delle globine,
codificanti per le catene dell’emoglobina.
Una regione cruciale del promotore di tali geni si trova tra 24 e 32 basi a monte del sito di inizio
della trascrizione. Questa regione spesso contiene una sequenza consenso che è identica o molto
simile all’oligonucleotide 5’-TATAAA-3’, conosciuto anche come TATA box.
Il primo passo nell’assemblaggio del complesso di preinizio è il legame di una proteina, detta
proteina che lega TATA (TBP) che riconosce specificamente il TATA box dei promotori
eucariotici. Una polimerasi eucariotica purificata non è in grado di riconoscere direttamente un
promotore e non pu iniziare una trascrizione accurata per proprio conto.
TBP è una subunità di un complesso proteico molto più grande, detto TFIID (fattore di
trascrizione per la polimerasi II, frazione D).
Il legame TBP ad un promotore per la polimerasi II provoca una profonda distorsione nella
conformazione del DNA.
TBP si inserisce nel solco della doppia elica, facendo piegare la molecola di DNA per più di 80°
nel sito di interazione DNA-proteina. Mentre il TBP lega TATA, altre subunità del complesso TFIID
si legano ad altre regioni del DNA, inclusi alcuni elementi che si trovano a valle del sito di inizio
della trascrizione.
Il legame TFIID è importante per l’assemblaggio del complesso pre-inizio completo, che si ritiene
avvenga in diversi passaggi. La presenza di tre GTF (TBP di TFIID, TFIL e TFIIB) legati al
promotore fornisce l’impalcatura per il successivo legame dell’enorme RNA polimerasi costituita
da più subunità, con il suo TFIIF attaccato.
Una volta che l’RNA polimerasi-TFIIF è in posizione, un altro paio di GTP (TFIE e TFIIH) si unisce
al complesso e trasforma la polimerasi nella macchina di trascrizione selettiva.
TIFIIH è il solo GTF noto con azione enzimatica. Una delle sue subunità funziona come chinasi
per fosforilare l’RNA polimerasi, mentre altre due subunità di questa proteina funzionano come
enzimi che srotolano il DNA (elicasi).
L’attività di DNA elicasi è richiesta per separare i filamenti di DNA del promotore, permettendo
alla polimerasi di accedere al filamento stampo. Una volta che inizia la trascrizione, alcuni dei
GTF (incluso TFIID) possono essere lasciati dietro, a livello del promotore, mentre altri sono
rilasciati dal complesso. Finchè il TFIID rimane legato al promotore, molecole addizionali di RNA
polimerasi si possono attaccare al sito promotore e iniziare nuovi cicli di trascrizione senza
interruzione.
Il dominio carbossi-terminale (CTD) della subunità maggiore dell’RNA polimerasi II è composto da
una sequenza di sette amminoacidi (-Tyr1 –Ser2 –Pro3 –Thr4 –Ser5 –Pro6 –Ser7) ripetuta diverse
volte.
Nell’uomo il CTD è composto da 52 ripetizioni di questo eptapeptide. Tutti i sette residui
dell’eptapeptide possono essere enzimaticamente modificati in vari modi: per esempio, le serine
in posizione 2 e 5, sono i principali bersagli per la fosforilazione da parte di specifiche chinasi.
L’RNA polimerasi che si assembla nel complesso di pre-inizio non è fosforilata, mentre lo stesso
enzima impegnato nella trascrizione è molto fosforilato; tutti i gruppi fosfato sono localizzati nel
CTD. La fosforilazione del CTD viene catalizzata da almeno quattro differenti chinasi, incluso il
TFIIH che fosforila i residui di serina in posizione 5.
La fosforilazione della polimerasi da parte del TFIIH potrebbe servire a promuovere la
separazione dell’enzima dai GTF e/o dal promotore, permettendo all’enzima di staccarsi dal
complesso di pre-inizio e muoversi lungo lo stampo di DNA. Mentre l’RNA polimerasi si muove
lungo il gene per trascriverlo, un’altra chinasi (P-TEFb) fosforila il CTD nella serina in posizione
2. Questo cambiamento nel quadro di fosforilazione faciliti il reclutamento di fattori proteici
addizionali coinvolti nella maturazione dell’RNA e nella terminazione della trascrizione. In
questo modo, il CTD agisce come una piattaforma per il processo dinamico di aggiunta e
sottrazione di fattori richiesti per la formazione di un mRNA maturo.
Si stima che una RNA polimerasi II in allungamento potrebbe contenere più di 50 componenti.
La terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II non è ancora ben chiara.. Una
RNA polimerasi II, infatti, in corso di trascrizione pu viaggiare ad una distanza variabile e molto
più estesa a valle del punto che darà origine al terminale 3’ dell’mRNA maturo.
Nel complesso, la RNA polimerasi II ed i suoi GTF sono sufficienti per promuovere un livello di
trascrizione basale dalla maggior parte dei promotori in vitro.
Una varietà di specifici fattori di trascrizione è in grado di legarsi a numerosi siti nelle regioni
regolatrici del DNA. Questi fattori specifici possono determinare se un complesso di pre-inizio si
assembla ad un particolare promotore oppure no, la velocità con cui la polimerasi inizia nuovi
cicli di trascrizione da un particolare promotore.

STRUTTURA DEGLI mRNA


Tutti gli RNA messaggeri condividono alcune proprietà:
1. Contengono una sequenza di nucleotidi codificanti per uno specifico polipeptide
2. Si trovano nel citoplasma
3. Sono associati ai ribosomi quando sono tradotti
4. La maggior parte degli mRNA contiene un tratto non codificante, cioè una porzione che
non partecipa all’assemblaggio degli amminoacidi.
5. Gli mRNA eucariotici presentano modificazioni particolari alle loro estremità 5’ e 3’,
modificazioni assenti sia nei messaggeri procariotici che nei tRNA ed rRNA. L’estremità 3’
di quasi tutti gli mRNA eucariotici presenta una stringa di adenosine che forma una coda
di poli(A), mentre l’estremità 5’ ha un cappuccio di guanosina metilata.

I geni interrotti
Dopo la scoperta degli hnRNA, si pensava che fossero i precursori degli mRNA citoplasmatici. Non
si riusciva per a spiegare la differenza di grandezza tra le due specie: gli hnRNA erano molto più
grandi degli mRNA.
Grandi segmenti vengono rimossi da entrambe le estremità 5’ e 3’ di vari intermedi nella
maturazione dell’rRNA per produrre i prodotti finali, ossia rRNA maturi.
Gli mRNA costituiscono una popolazione talmente eterogenea che risultava impossibile seguire le
tappe nell’elaborazione di una singola specie di mRNA.
Analisi importanti rivelarono che la sequenza leader al 5’ non è complementare ad una sequenza
ripetuta e neanche complementare ad un tratto continuo di nucleotidi nello stampo del DNA.
Invece, la sequenza leader è trascritta da tre segmenti distinti e separati di DNA. Le regioni di
DNA tra questi blocchi, definite sequenze interposte, sono in qualche modo mancanti nell’mRNA
corrispondente. Si poteva concludere che la presenza di sequenze interposte fosse una
particolarità presente nei genomi virali, ma questa osservazione fu presto estesa anche ai geni
cellulari.
Le sequenze interposte furono presto scoperte in altri geni e divenne evidente che la presenza di
geni con sequenze interposte (geni interrotti) è la regola piuttosto che l’eccezione. Le parti di
un gene interrotto che contribuiscono al prodotto di RNA maturo sono definite esoni, mentre le
sequenze interposte sono definite introni. I geni interrotti sono molto numerosi negli eucarioti.
Gli introni sono stati trovati in tutti i tipi di geni, inclusi quelli che codificano per il tRNA e rRNA.
Una ipostesi sul come questi geni con introni sono in grado di produrre gli RNA messaggeri privi
di queste sequenze era che le cellule producessero un trascritto primario corrispondente
all’intera unità di trascrizione, e che le porzioni dell’RNA corrispondenti agli introni nel DNA
fossero in qualche modo rimosse. Questa spiegazione chiariva anche perché le molecole di
hnRNA sono molto più grandi di quelle di mRNA da loro prodotte.

La ricerca sull’RNA nucleare a quel tempo era ormai avanzata al punto che la dimensione di
alcuni precursori di mRNA (pre-mRNA) poteva essere determinata.
Filamenti singoli e complementari del DNA sono in grado di legarsi specificamente l’uno all’altro.
Inoltre, anche le molecole di RNA e DNA a singolo filamento sono capaci di appaiarsi l’una
all’altra, purché presentino sequenze nucleotidiche complementari: questa è la base della
tecnica dell’ibridazione DNA-RNA (il complesso DNA-RNA si chiama ibrido.
Tilghman e i suoi collaboratori usarono il microscopio elettronico per esaminare un frammento di
DNA contenente il gene per la globina idratato con l’RNA 15S per la globina. Si osserv che
l’ibrido era costituito da un doppio filamento continuo DNA-RNA. Invece, quando lo stesso
filamento di DNA venne incubato in presenza dell’mRNA maturo 10S per la globina, si osserv che
un grande segmento di DNA al centro della regione codificante sporgeva per formare un’ansa a
doppio filamento. L’ansa derivava da un grande introne nel DNA che non era complementare ad
alcuna parte dell’mRNA maturo della globina.
Era quindi evidente che il pre-mRNA 15S doveva contenere segmenti corrispondenti agli introni
dei geni, che venivano rimossi durante la formazione dell’mRNA maturo 10S.
Studi successivi hanno rilevato che gli esoni sono formati in genere da circa 150 nucleotidi; al
contrario, i singoli introni contengono mediamente 3.500 nucleotidi. Ci spiega perché le
molecole di hnRNA sono molto più lunghe di quelle degli mRNA:.
C’è quindi una forte evidenza che la formazione dell’mRNA nelle cellule eucariotiche avviene
attraverso la rimozione di sequenze interne di ribonucleotidi da un pre-mRNA più grande.

LA MATURAZIONE DEGLI RNA MESSAGGERI EUCARIOTICI


L’RNA polimerasi II assembla un trascritto primario che è complementare al DNA dell’intera
unità di trascrizione. Questo trascritto viene poi elaborato nel nucleo per formare un mRNA
maturo che è trasportato nel citoplasma.
Gli RNA trascritti si associano con proteine e con particelle più grandi quando è ancora in atto il
processo di sintesi. Queste particelle, formate da proteine e da ribonucleoproteine,
comprendono gli agenti responsabili della conversione del trascritto primario nell’RNA
messaggero maturo. Questo processo di conversione richiede l’aggiunta del cappuccio
all’estremità 5’ e della coda poli(A) all’estremità 3’ del trascritto, e la rimozione degli introni
interposti.

Le estremità 5’ di tutti gli mRNA possiedono inizialmente un trifosfato derivato dal primo dal
primo nucleoside trifosfato che è stato incorporato nel sito d’inizio della sintesi di RNA. Una
volta che l’estremità 5’ di un precursore di mRNA è stata sintetizzata, diverse attività
enzimatiche agiscono su questa estremità della molecola. All’inizio, l’ultimo dei tre fosfati è
rimosso, convertendo il terminale 5’ in un difosfato (passaggio 1). Poi viene aggiunto un GMP con
orientamento invertito, in modo tale che l’estremità 5’ di una guanosina viene ad essere di
fronte all’estremità 5’ della catena di RNA (Passaggio 2).
Come risultato, i primi due nucleosidi sono uniti da un peculiare ponte trifosfato 5’ – 5’. Alla
fine, la guanosina invertita è metilata nella posizione 7 della sua base guanina, mentre il
nucleotide sul lato interno del ponte trifosfato è metilato nella posizione 2’ del ribosio
(passaggio 3). L’estremità 5’ dell’RNA contiene ora un cappuccio (cap) di metilguanosina. Queste
modificazioni enzimatiche all’estremità 5’ del trascritto primario avvengono molto velocemente,
mentre la molecola di RNA è ancora nelle sue iniziali fasi di sintesi.
Infatti, gli enzimi per la reazione di incappucciamento (capping) sono reclutati sul trascritto
primario dal CTD della polimerasi.
Il cappuccio di metilguanosina all’estremità 5’ dell’mRNA contiene una successione di residui di
adenosina che forma una coda di poli(A). Man mano che diversi mRNA furono sequenziati,
divenne evidente che la coda di poli(A) si trova invariabilmente circa 20 nucleotidi a valle di una
sequenza AAUAAA, che nel trascritto primario funge da sito di riconoscimento per l’assemblaggio
di un complesso di proteine che effettuano le reazioni di maturazione all’estremità 3’
dell’mRNA. Una volta assemblato, il complesso di maturazione del poli(A) è fisicamente
associato con la RNA polimerasi mentre essa sintetizza il trascritto primario.
Tra le proteine presenti nel complesso di maturazione, vi è una endonucleasi che taglia il
premRNA a valle del sito di riconoscimento e in seguito, un enzima chiamato poli(A) polimerasi,
aggiunge circa 250 adenosine senza bisogno di uno stampo.
La coda di poli(A), assieme alle proteine associate, protegge l’mRNA da una prematura
degradazione ad opera delle esonucleasi.

SPLICING DELL’RNA: La rimozione degli introni dal pre-mRNA


Tutte le parti di un trascritto primario corrispondenti alle sequenze interposte del DNA (introni)
devono essere rimosse in un processo chiamato slicing dell’RNA.
Affinché il processo di splicing possa avvenire, devono essere introdotte delle rotture nel
filamento di RNA a livello dell’estremità 5’ e 3’ di ciascun introne (siti di splicing), e gli esoni
situati a ciascun lato dei siti di splicing devono essere uniti covalentemente. È importante che
questo processo si verifichi con precisione, visto che un’eventuale aggiunta o perdita di un solo
nucleotide ad una qualsiasi delle giunzioni di splicing causerebbe una traduzione errata
dell’mRNA ottenuto-
Gli introni tipicamente si estendono per migliaia di nucleotidi e spesso contengono segmenti
interni che presentano corrispondenza con la sequenza consenso; ci nonostante la cellula non
riconosce questi segmenti interni come segnali di splicing e, di conseguenza, li ignora.
I segnali addizionali che permettono al macchinario di splicing di distinguere fra esoni ed introni
sembra vengano forniti da sequenze specifiche dette enhancer esonici per lo splicing o ESE,
localizzate all’interno degli esoni. Modificazioni nella sequenza di DNA all’interno di un sito di
splicing o di un ESE possono portare all’inclusione di un introne o all’esclusione di un esone. Si
ritiene che circa il 15% delle malattie umane ereditarie siano dovute a mutazioni che alterano lo
splicing del pre-mRNA.
Ci sono degli introni capaci di auto-splicing, come gli introni del gruppo I e del gruppo II. Gli
introni del gruppo II si ripiegano in una struttura complessa e vanno incontro ad un processo di
auto-splicing formando una struttura intermedia, chiamata a cappio. Il primo passaggio dello
splicing di questi introni è il taglio del sito di splicing al 5’ (passaggio 1), seguito dalla
formazione di un cappio mediante un legame covalente tra l’estremità 5’ dell’introne ed un
residuo di adenosina prossimo all’estremità 3’ dell’introne (passaggio 2).
Il successivo taglio del sito di splicing al 3’ rilascia il cappio e permette alle estremità tagliate
degli esoni di essere unite covalentemente (passaggio 3).
Le tappe che avvengono durante la rimozione degli introni da molecole di pre-RNA nelle cellule
animali sono simili a quelle seguite dagli introni del gruppo II. La differenza principale sta nel
fatto che il pre-mRNA non è in grado di realizzare da sé il processo di splicing, ma necessita di
diversi piccoli RNA nucleari (snRNA) e delle loro proteine associate. Man mano che ciascuna
grande molecola di hnRNA è trascritta, essa viene associata ad una varietà di proteine a
formare una ribonucleoproteina nucleare eterogenea (hnRPN), che rappresenta il substrato per
le reazioni di maturazione successive. La maturazione avviene quando ogni introne del pre-
mRNA si associa con un complesso macromolecolare detto spliceosoma, formato da varie
proteine e da una serie di particelle ribonucleoproteiche diverse, dette snRPN (pronunciato
snurp) poiché formate da snRNA legati a specifiche proteine. Gli spliceosomi non sono presenti
nel nucleo in uno stato precostituito, ma sono invece assemblati quando le loro snRNP si legano
al pre-mRNA. Una volta assemblato l’apparato dello spliceosoma. Le snRNP svolgono le reazioni
di taglio degli introni dal trascritto e riuniscono le estremità degli esoni. Gli introni escissi sono
degradati dal nucleo.
Nel complesso, la rimozione di un introne richiede diverse particelle snRNP: snRNP U1, snRNP
U2, snRNP U5 e la snRNP U4/U6 che contiene gli snRNA U4 e U6 legati insieme.
Oltre al suo snRNA, ogni snRNP contiene almeno una decina di proteine diverse. Una famiglia,
chiamata proteine Sm, è presente in tutte le snRNP. Queste proteine si legano l’una all’altra e
ad un sito conservato su ogni snRNA (eccetto l’U6) a formare il nucleo della snRNP.
Le altre proteine delle snRNP sono invece uniche di ciascuna particella.
I diversi riarrangiamenti tra molecole di RNA che avvengono durante l’assemblaggio di uno
spliceosoma sono probabilmente mediati da RNA elicasi ATP-dipendenti presenti all’interno delle
snRNP. Le RNA elicasi possono svolgere RNA appaiati, permettendo all’RNA liberato di legarsi a
nuovi partner. Le elicasi dello spliceosoma sono anche ritenute mediare il distacco degli RNA da
proteine legate.
Almeno otto diverse elicasi sono implicate nello splicing del pre-mRNA nel lievito.
Il fatto che i pre-mRNA subiscano lo splicing grazie al verificarsi della stessa serie di reazioni
chimiche che avvengono quando gli introni del gruppo II realizzano il processo di auto-splicing e
che gli snRNA richiesti per lo splicing del pre-mRNA assomiglino molto a parti degli introni del
gruppo II, suggerì che gli snRNA, e non le proteine, fossero i componenti catalicamente attivi
delle snRNP. Se così fosse, lo spliceosoma agirebbe come un ribozima e le proteine
giocherebbero vari ruoli supplementari, come mantenere un’adeguata struttura tridimensionale
dell’snRNA.
Dei vari snRNA che partecipano allo splicing dell’RNA, U6 è considerato il candidato più
probabile per le reazioni catalitiche. Inoltre, Prp8 contiene un dominio con attività di RNasi che
potrebbe essere ben adatto per tagliare il pre-mRNA.
Sequenze situate all’interno degli esoni (enhancer esonici per lo splicing ESE), giocano un ruolo
nel riconoscimento degli esoni da parte dell’apparato di splicing. Gli ESE servono da sito di
legame per la famiglie di proteine SR, che legano l’RNA (chiamate così per l’alto numero di
dipeptidi di serina S ed arginina R). si ritiene che le proteine SR formino reti di interazioni che
circondano i confini introne/esone e favoriscano il reclutamento delle snRNP al sito di splicing.
Le proteine SR, cariche positivamente, possono anche legare elettrostaticamente i gruppi
fosfato carichi negativamente che sono aggiunti al cTD della polimerasi quando inizia la
trascrizione. Come risultato, l’assemblaggio dell’apparato di splicing agli introni avviene
contemporaneamente alla sintesi degli introni da parte della polimerasi. Si ritiene che il CTD
recluti un’ampia varietà di fattori di maturazione. Infatti, gran parte dell’apparato richiesto per
la maturazione dell’mRNA e l’esportazione nel citoplasma viaggia assieme alla polimerasi come
parte di una enorme “fabbrica dell’mRNA”. Dal momento che la maggior parte dei geni contiene
un certo numero di introni, le reazioni di splicing devono verificarsi ripetutamente in un singolo
trascritto primario.
Gli introni sono rimossi secondo un determinato ordine, generando specifici intermedi di
maturazione la cui dimensione è compresa tra quella del trascritto primario e quella dell’mRNA
maturo.

La scoperta che gli RNA siano in grado di catalizzare reazioni chimiche ha portato all’ipotesi che
né il DNA né le proteine fossero presenti durante le prime fasi dell’evoluzione della vita.
Durante questo periodo, le molecole di RNA svolgevano due funzioni: servivano come materiale
genetico e catalizzavano le reazioni chimiche, incluse quelle richieste per la replicazione
dell’RNA. La vita durante questo stadio pu essere descritta come “mondo a RNA”. Solo ad uno
stadio ulteriore dell’evoluzione, le funzioni di deposito di informazione e di catalisi vennero
trasferite, rispettivamente, a DNA e alle proteine, lasciando all’RNA la funzione principale di
intermediario nel flusso dell’informazione genetica.
Gli introni devono rimuovere le sequenze interposte dai loro trascritti, quindi presentano anche
alcuni vantaggi per la cellula. Lo splicing dell’RNA è uno dei passaggi nel corso della formazione
dell’mRNA che è soggetto a regolazione da parte delle cellule. Molti trascritti primari possono
effettuare due o più percorsi diversi di maturazione, cosicchè una sequenza che agisce come
introne in un percorso diventa un esone in un percorso alternativo. Con questo fenomeno,
chiamato splicing alternativo, il medesimo gene pu codificare polipeptidi diversi.
Lo spostamento di “moduli” genetici tra geni non correlati, un processo chiamato exon shuffing
(rimescolamento di esoni) è fortemente favorito dalla presenza di introni, che agiscono come
spaziatori inerti tra gli esoni. I riarrangiamenti genetici richiedono rotture nelle molecole di
DNA, che possono avvenire all’interno di introni senza causare mutazioni che potrebbero
danneggiare l’organismo.

I PICCOLI RNA NON CODIFICANTI ED IL SILENZIAMENTO INDOTTO DALL’RNA


Il fenomeno dell’interferenza dell’RNA mediata da dsRNA è un esempio del fenomeno del
silenziamento indotto dall’RNA, in cui piccoli RNA, che normalmente agiscono insieme a
proteine, sono in grado di inibire l’espressione genica in vari modi. Si ritiene che l’RNAi si sia
evoluta coem un tipo di “sistema immunitario genetico” per proteggere gli organismi dalla
presenza di materiale genetico estraneo. L’RNAi probabilmente si è evoluta come un
meccanismo per bloccare la replicazione dei virus e/o per inibire il movimento dei trasposoni
all’interno del genoma, poiché entrambi questi processi potenzialmente nocivi possono
coinvolgere la formazione di intermedi di RNA a doppio filamento. Le cellule possono
riconoscere i dsRNA come “non desiderati” perché tali molecole non sono prodotte dalle normali
attività genetiche della cellula.
L’RNA a doppio filamento che avvia la risposta è dapprima tagliato in frammenti più piccoli (21-
23 nucleotidi) a doppio filamento, chiamati piccoli RNA interferenti (small interfering RNA o
siRNA), ad opera di una ribonucleasi, denominata Dicer.
Questi piccoli dsRNA vengono poi caricati in un complesso (pre-RISc) che contiene un membro
della famiglia proteica Argonauta. Le proteine Argonauta hanno un ruolo cruciale in tutte le vie
di silenziamento dell’RNA note.
Nel processo RNAi, uno dei filamenti dell’RNA duplex (filamento passeggero) viene tagliato in
due pezzi e poi si dissocia dal pre-RISC. L’altro filamento dell’RNA duplex (filamento guida)
viene incorporato assieme alla proteina Argonauta ad esso associata, in un complesso proteico
chiamato RISC. Sono state identificate diverse varietà di RISC, contraddistinte dalla particolare
proteina Argonauta presente in ciascuna di esse. Nelle cellule animali, i complessi RISC che
contengono un siRNA tipicamente includono la proteina Argonauta denominata Ago2. Il
complesso RISC fornisce il macchinario che permette ai minuscoli siRNA di legarsi ad un RNA che
presenti una sequenza complementare. Una volta legato, l’RNA bersaglio viene tagliato in un
sito specifico dell’attività ribonucleasica della proteina Ago2. Perci il siRNA agisce come una
guida per dirigere il complesso verso un RNA bersaglio complementare, che viene poi distrutto
da un partner proteico. Ciascun siRNA pu orchestrare la distruzione di numerose copie dell’RNA
bersaglio, che pu essere trascritto virale, un RNA trascritto da un trasposone o un
retrotrasposone, oppure un mRNA endogeno scelto selettivamente da un ricercatore. Si ritiene
che in genere i vertebrati non utilizzino RNAi come difesa contro i virus, basandosi invece su un
sistema immune ben sviluppato.
Quando un dsRNA viene aggiunto a cellule di mammifero in coltura o iniettato direttamente nel
corpo di un mammifero, esso generalmente avvia una risposta globale che inibisce la sintesi
proteica in generale.
Per evitare questa risposta globale aspecifica, i ricercatori si sono dedicati all’uso di dsRNA
molto piccoli. Infatti si è scoperto che il trattamento di cellule di mammifero con dsRNA lunghi
21 nucleotidi non attiva l’inibizione globale della sintesi proteica. Inoltre inibiscono la sintesi di
una specifica proteina codificata da un mRNA con sequenza nucleotidica complementare ad essi.
Le proteine codificate da altri mRNA non sono colpite.
In tal modo, è possibile inattivare (know out), o abbattere fortemente (know down), l’attività di
un gene di interesse, utilizzando i dsRNA per distruggere gli mRNA che esso genera, e definire le
anomalie cellulari che risultano dalla deficienza della proteina corrispondente.

MicroRNA: piccoli RNA che regolano l’espressione genica


Negli ultimi anni, è risultato evidente che sia le piante che gli animali producono centinaia di
piccolissimi RNA, detti microRNA (miRNA), che, a causa delle loro dimensioni ridotte, sono
rimasti ignoti per lungo tempo. Gli miRNA specifici, come lin-4 e let-7, sono sintetizzati soltanto
in determinati momenti dello sviluppo o in determinati tessuti di una pianta o di un animale, e si
ritiene che svolgano un ruolo regolativo.
Le dimensioni dei miRNA, grosso modo 21 nucleotidi, ricadono nello stesso intervallo di
dimensioni dei siRNA coinvolti nell’RNAi.
I miRNA sono prodotti da un macchinario di elaborazione simile a quello responsabile della
formazione dei siRNA. I miRNA ed i siRNA potrebbero essere considerati “cugini”, poiché
entrambi agiscono nelle vie di silenziamento post-trascrizionale dell’RNA. Ci sono, tuttavia,
importanti differenze. Un siRNA deriva dal prodotto a doppio filamento di un virus o di un
elemento trasponibile ed è diretto contro gli stessi trascritti da cui ha avuto origine. Invece, un
miRNA è codificato da un segmento convenzionale del genoma ed è diretto contro uno specifico
mRNA come parte di un normale programma cellulare. I siRNA servono principalmente per
mantenere l’integrità del genoma mentre i miRNA servono principalmente per regolare
l’espressione genica.
Il miRNA è sintetizzato dalla RNA polimerasi II in forma di un trascritto primario con un
cappuccio al 5’ ed una coda poli(A). Questo trascritto primario si ripiega su sé stesso per formare
un pre-miRNA (lungo RNA a forcina), che viene tagliato all’interno del nucleo da un enzima
chiamato Drosha, formando un precursore più corto ripiegato su sé stesso a forcina (pre-miRNA).
Il pre-miRNA è esportato nel citoplasma, dove dà origine al piccolo miRNA a doppio filamento. Il
miRNA è ritagliato dal pre-miRNA da Dicer, la stessa ribonucleasi responsabile della formazione
dei siRNA.
Il miRNA a doppio filamento viene associato ad una proteina Argonauta, assieme alla quale l’RNA
duplex viene svolto, ed infine uno dei filamenti singoli è incorporato in un complesso RISC. Un
tipico miRNA è parzialmente complementare ad una regione nel 3’ UTR dell’mRNA bersaglio ed
agisce da inibitore traduzionale, proprio come quelli originariamente scoperti nei nematodi.
Alcuni miRNA dirigono il taglio dell’RNA legato piuttosto che inibirne la traduzione. I miRNA che
dirigono il taglio dell’mRNA tendono ad essere perfettamente complementari al loro mRNA
bersaglio.
Stime recenti suggeriscono che gli esseri umani potrebbero codificare migliaia di specie diverse
di miRNA. Circa un terzo degli RNA messaggeri umani contiene sequenze complementari a
presunti miRNA, il che suggerisce il grado di coinvolgimento di questi piccoli RNA regolativi nel
controllo dell’espressione genica negli organismi superiori. Un singolo miRNA pu legarsi a
dozzine o addirittura centinaia di mRNA differenti. A loro volta, molti mRNA differenti, il che
suggerisce che i miRNA potrebbero agire in varie combinazioni per una “regolazione fine” del
livello di espressione genica.
I miRNA sono implicati in numerosi processi, tra cui l’organizzazione del sistema nervoso, il
controllo della proliferazione e della morte cellulare, il differenziamento di vari tipi cellulari e
lo sviluppo di foglie e fiori nelle piante.

PiRNA: piccoli RNA che funzionano nelle cellule germinali


Il movimento degli elementi trasponibili comporta un rischio per il genoma, poiché esso pu
alterare l’attività di un gene in cui l’elemento si sia casualmente inserito.
Se questo evento di trasposizione avvenisse in una cellula germinale, ovvero una cellula che
possiede la capacità di originare gameti, allora l’evento ha la potenzialità di colpire ogni cellula
in un individuo della generazione successiva. Si sono infatti evoluti meccanismi specializzati per
sopprimere il movimento degli elementi trasponibili nelle cellule germinali.
Studi recenti indicano che le cellule germinali degli animali esprimono una classe distinta di
piccoli RNA, gli RNA interagenti con piwi (piRNA), in grado di sopprimere il movimento degli
elementi trasponibili nelle cellule germinali. I piRNA derivano il loro nome dalle proteine con cui
si associano, le proteine PIWI che costituiscono una sottoclasse della famiglia Argonauta. I ruoli
delle proteine PIWI sono stati ben caratterizzati nei moscerini della frutta, dove la delezione di
queste proteine causa difetti nella soppressione del movimento dei trasposoni nelle
cellule germinali che a sua volta porta ad incapacità di formare gameti maturi- I
piRNA e le proteine ad essi associate sono richiesti anche per la formazione di gameti
funzionanti nei mammiferi, ma i ruoli sono ancora poco chiari.
Ci sono diverse differenze tra i piRNA e i siRNA/miRNA:
- I piRNA sono più lunghi e si estendono per 24-32 nucleotidi;
- La maggior parte dei piRNA di mammifero mappa in un piccolo numero di ampi loci
genomici, alcuni dei quali codificano per migliaia di piRNA differenti;
- La formazione dei piRNA non coinvolge la formazione di dsRNA precursori né il taglio da
parte della ribonucleasi Dicer. Invece la biogenesi dei piRNA sembra dipendere
dall’attività endonucleasica della proteina PIWI, che agisce su un lungo trascritto
primario a singolo filamento.

Esistono anche altri RNA non codificanti che sono stati scoperti negli ultimi decenni.
Tutti gli RNA sintetizzati da una cellula o da un organismo costituiscono il suo trascrittoma.
Solo nell’ultimo decennio è venuta alla luce l’esistenza dei siRNA, miRNA e piRNA, ed è
probabile che altri tipi di piccoli ncRNA non siano stati ancora identificati. È stato anche
identificato un certo numero di lunghi ncRNA e questi probabilmente sono solo una piccola
parte.

IL CODICE GENETICO
Le parole del codice, o codoni, per gli amminoacidi sono triplette di nucleotidi.
Il numero di parole che possono essere composte usando un alfabeto contenente quattro
differenti lettere, corrispondenti alle quattro possibili basi che possono essere presenti in un
dato sito del DNA (o dell’mRNA).
Con una lettera possono essere formate 4 possibili parole, 16 (4²) con due lettere e 64 (4³) con
tre lettere.
Dal momento che ci sono 20 differenti amminoacidi (parole) che devono essere specificati, i
codoni devono contenere almeno 3 nucleotidi (lettere) in sequenza.
Oltre alla proposta del codice a triplette, si pensava che fosse sovrapposto. Ma era un idea
errata.
Il codice non era sovrapposto e ogni nucleotide era parte di un solo codone.
Poiché un codice a triplette ha la capacità di specificare 64 differenti amminoacidi, mentre in
realtà ce ne sono solo 20, ci si chiede quale sia la funzione delle altre 44 triplette. Se qualcuna
di queste 44 triplette codificasse per amminoacidi, allora almeno alcuni degli amminoacidi
sarebbero specificati da più di un codone. Un codice di questo tipo viene chiamato degenerato.
Il codice è altamente degenerato dal momento che quasi tutti i 64 possibili codoni specificano
amminoacidi. Solo 3 non lo fanno (3 su 64) e hanno invece una specifica funzione di
“punteggiatura”: sono riconosciuti dal ribosoma come codoni di terminazione e causano la fine
della letteratura del messaggio.
Gli stessi amminoacidi potevano essere codificati da differenti sequenze di basi, fatto che
avrebbe reso il codice degenerato.

La corrispondenza fra amminoacido e codone è chiaramente un fenomeno non casuale. Le


mutazioni spontanee che causano cambiamenti a livello di singole basi in un gene spesso non
producono cambiamenti nella sequenza amminoacidica della corrispondente proteina. Un
cambiamento nella sequenza nucleotidica che non altera la sequenza amminoacidica è detto
sinonimo, mentre un cambiamento che determina una sostituzione amminoacidica è detto non
sinonimo.
Generalmente i cambiamenti sinonimi non alterano il fenotipo di un organismo, non sono
selezionati né positivamente né negativamente della selezione naturale.
I geni che posseggono un eccesso di sostituzioni non sinonime nelle regini codificanti hanno
presumibilmente subito l’influenza della selezione naturale.
Il carattere di “salvaguardia” del codice va al di là della sua degenerazione. La relazione fra
codoni e amminoacidi è tale che amminoacidi simili tendono ad essere specificati da codoni
simili.
Di conseguenza, una mutazione che determini la sostituzione di una base in uno di questi codoni
porterà a rimpiazzare un residuo idrofobico con un altro. Inoltre, le somiglianze più evidenti tra
i codoni corrispondenti ad amminoacidi correlati si verificano nei primi dei due nucleotidi della
tripletta, mentre la maggiore variabilità si verifica nel terzo nucleotide.

La decodificazione dei codoni: il ruolo degli RNA transfer


Gli acidi nucleici e le proteine rappresentano due linguaggi scritti utilizzando tipi diversi di
lettere. Questa è la ragione per cui la sintesi proteica è detta anche traduzione.
La traduzione richiede che l’informazione codificata nella sequenza nucleotidica di un mRNA sia
decodificata e utilizzata per dirigere l’assemblaggio degli amminoacidi in una catena
polipeptidica. La decodificazione dell’informazione di un mRNA è possibile grazie agli RNA
transfer, che agiscono come adattatori. Da un lato, ogni tRNA è legato ad uno specifico
amminoacido (es: aa-tRNA), mentre dall’altro, lo stesso tRNA in grado di riconoscere un
particolare codone nell’mRNA.
L’interazione tra codoni successivi nell’mRNA e gli specifici aa-tRNA porta alla sintesi di un
polipeptide con una sequenza di amminoacidi ordinata.

Struttura dei tRNA


Tutti i tRNA hanno una lunghezza simile, tra 73 e 93 nucleotidi, e tutti hanno una percentuale
significativa di basi insolite che risultano da modificazioni enzimatiche di una delle quattro basi
standard dopo che una di esse era stata incorporata nella catena di RNA, cioè mediante una
modificazione post-trascrizionale. Inoltre, tutti i tRNA hanno in una parte della molecola
sequenze di nucleotidi che erano complementari a sequenze nucleotidiche situate in altre parti
della molecola.
Grazie a queste sequenze complementari, i diversi tRNA si potevano ripiegare in modo simile per
formare una struttura che nelle due dimensioni poteva essere rappresentata come un trifoglio.
Le basi insolite, concentrate a livello delle anse, non permettono la formazione di legami
idrogeno in queste regioni e funzionano come potenziali siti di riconoscimento per varie
proteine.
Tutti i tRNA maturi hanno la tripletta CCA alla loro estremità 3’. Questi tre nucleotidi possono
essere codificati nel gene per il tRNA (in molti procarioti) o addizionati enzimaticamente (negli
eucarioti).
In questo ultimo caso un singolo enzima addiziona tutti e tre i nucleotidi nell’ordine appropriato
senza l’ausilio di uno stampo di DNA o RNA.
I tRNA si ripieegano in una struttura terziaria unica e ben definita. I tRNA sono costituiti da due
doppie eliche organizzate a formare una struttura a L rovesciata. Le basi che si trovano a livello
dei siti comparabili in tutte le molecole di tRNA sono particolarmente importanti nel generare la
struttura terziaria a forma di L.
Questa forma comune a tutti i tRNA rispecchia il fatto che tutti prendono parte alla stessa serie
di reazioni durante la intesi proteica.
Comunque, ogni tRNA ha caratteristiche uniche che lo distinguono da altri tRNA, e queste
caratteristiche permettono ad un amminoacido di essere legato enzimaticamente al tRNA
appropriato.
Gli RNA transfer traducono una sequenza di codoni di un mRNA in una sequenza di residui
amminoacidici.
L’informazione contenuta nell’mRNA è decodificata attraverso la formazione di coppie di basi
tra sequenze di basi complementari presenti negli RNA transfer e su quelli dei messaggeri. La
parte del tRNA che partecipa a questa interazione specifica con il codone dell’mRNA è una
sequenza di tre nucleotidi, chiamati anticodone, che si trova nell’ansa centrale della molecola
di tRNA. Questa ansa è invariabilmente composta da sette nucleotidi, di cui i tre centrali
formano l’anticodone. L’anticodone è situato ad un’estremità della molecola di tRNA a forma di
L, dalla parte opposta a quella dove è attaccato l’amminoacido.
Le somiglianze maggiori tra i codoni che specificano lo stesso amminoacido si trovano nei primi
due nucleotidi della tripletta, mentre la massima variabilità in questi stessi codoni si ha nel
terzo nucleotide della tripletta.
Ipotesi del vacillamento (wobble): suggerì che mentre i requisiti sterici tra l’anticodone del tRNA
ed il codone dell’mRNA sono molto forti per le basi nelle prime due posizioni, essi sono più
flessibili per la terza posizione. Come risultato, due codoni che specificano lo stesso
amminoacido e che sono diversi solamente a livello della base della terza posizione, possono
usare lo stesso tRNA nella sintesi proteica. Questa ipotesi di Crick si rivel corretta.
L’attivazione degli amminoacidi: durante la sintesi di una proteina, è assolutamente necessario
che ogni molecola di tRNA sia attaccata all’amminoacido corretto. Gli amminoacidi sono legati
covalentemente alle estremità 3’ dei loro tRNA appropriati da un enzima chiamato
amminoaciltRNA sinteasi.
Gli organismi in genere contengono 20 amminoacil-tRNA sinteasi differenti, una per ciascuno dei
20 amminoacidi che sono incorporati nelle proteine. Ciascuna sinteasi è in grado di “caricare”
tutti i tRNA appropriati per quell’amminoacido.
Le amminoacil-tRNA sinteasi sono un notevole esempio della specificità delle interazioni fra
proteine ed acidi nucleici. Devono esistere certe caratteristiche comuni tra tutte le specie di
tRNA che specificano per un certo amminoacido per permettere ad una singola amminoacil-tRNA
sinteasi di riconoscere tutti questi tRNA. Informazioni sulle caratteristiche strutturali dei tRNA
che permettono loro di venire selezionati, o rifiutati, come substrati sono derivate
principalmente da due tipi di studio:
1. Determinazione della struttura tridimensionale di questi enzimi mediante cristallografia
ai raggi X, che permette ai ricercatori di identificare quali siti sul tRNA prendono
contatto diretto con la proteina.
2. Esperimenti per determinare quali cambiamenti nei tRNA fanno si che la molecola possa
essere amminoacilata da una sinteasi non appropriata.
Le amminoacil-tRNA sinteasi catalizzano la seguente reazione in due passaggi:
1° passaggio: ATP + amminoacido  amminoacil-AMP + Ppi
2° passaggio: amminoacil-AMP + tRNA  amminoacil-tRNA + AMP
L’energia è consumata durante la sintesi della proteina, ma non viene utilizzata nella
formazione dei legami peptidici. Nel secondo passaggio, l’enzima trasferisce il suo amminoacido
legato all’estremità 3’ del tRNA appropriato. Qualora la sinteasi fissi un amminoacido sbagliato
sul tRNA, si attiva un meccanismo di correzione di bozze (proofreding) dell’enzima in modo tale
che il legame tra l’amminoacido e il tRNA venga reciso.
Gli amminoacidi non naturali non sono generati da modificazioni dei normali amminoacidi dopo
la loro incorporazione nel polipeptide, ma sono codificati direttamente nel mRNA. Questa
“espansione” del codice genetico generalmente coinvolge l’utilizzo di un tRNA modificato
geneticamente che riconosce uno dei codoni di stop e una amminoacil-tRNA sinteasi che
riconosce specificamente l’amminoacido non naturale.
L’amminoacido non naturale viene quindi incorporato nella catena polipeptidica laddove nel
mRNA è presente quel particolare codone di stop.
TRADUZIONE DELL’INFORMAZIONE GENETICA
La sintesi delle proteine, o traduzione, è l’attività di sintesi più complessa che si verifica nella
cellula. L’assemblaggio di una proteina richiede tutti i vari tRNA con i rispettivi amminoacidi
legati, i ribosomi, l’RNA messaggero, un certo numero di proteine con differenti funzioni, cationi
e GTP.
La complessità non è sorprendente se consideriamo che la sintesi proteica richiede
l’incorporazione di ciascuno dei 20 differenti amminoacidi in una sequenza precisa.
La sintesi di una catena polipeptidica pu essere divisa in tre fasi distinte: l’inizio della catena,
l’allungamento della catena e la terminazione.

1° FASE: INIZIO
Un ribosoma, una volta legato ad un mRNA, si muove lungo l’mRNA da un codone al successivo,
ossia in blocchi consecutivi di tre nucleotidi. Per garantire che siano lette le triplette
appropriate, il ribosoma si attacca ad mRNA in un sito specifico, chiamato codone di inizio, che
è specificato come AUG.
Il legame a questo codone automaticamente pone il ribosoma nell’appropriato modulo di lettura
(reading frame), così che esso legge correttamente l’intero messaggio da quel punto in poi.
Passaggio 1: La subunità minore del ribosoma si porta sul codone di inizio
Un mRNA non si lega ad un ribosoma intero, ma alle subunità maggiore e minore in fasi separate.
Il passaggio più importante della fase di inizio è costituito dal legame della subunità ribosomale
minore alla prima sequenza AUG nell’RNA messaggero, che serve da codone di inizio. L’inizio
della sintesi richiede fattori di inizio. Alcuni passaggi infatti richiedono l’aiuto di proteine
solubili, chiamate fattori di inizio (IF nei procarioti; eIF negli eucarioti). Le cellule procariotiche
hanno bisogno di tre fattori di inizio: IF1, IF2 e IF3, che legano la subunità 30S (passaggio 1). IF2
lega GTP richiesta per legare il primo amminoacil-tRNA. IF3 impedisce che la subunità maggiore
(50S) si leghi prematuramente alla subunità 30S, facilitando anche l’entrata dell’aa-tRNA
iniziale.
IF1 promuove l’attacco della subunità 30S all’mRNA e pu impedire che l’aa-tRNA si inserisca nel
sito errato sul ribosoma .
Passaggio 2: Il primo aa-tRNA si inserisce sul ribosoma
Se si esamina il significato dei codoni si pu notare che AUG non è solo un codone di inizio; esso è
anche l’unico codone che specifica la metionina. La metionina è sempre il primo amminoacido
incorporato all’estremità N-terminale di una catena polipeptidica nascente (nei procarioti, la
metionina iniziale porta un gruppo formile, divenendo N-formilmetionina). Nella gran parte dei
casi, la metionina (o N-formil-metionina) viene poi rimossa enzimaticamente. Le cellule
possiedono due distinti metionil-tRNA: uno usato per iniziare la sintesi proteica (tRNA iniziatore
chiamato tRNAfMet nei procarioti e tRNAiMet negli eucarioti) e l’altro (tRNAMet) per incorporare
i residui di metionina all’interno di un polipeptide. Il tRNA iniziatore amminoacilato entra nel
complesso di pre-inizio legandosi sia al codone AUG dell’mRNA che al fattore di inizio IF2
(passaggio 2). IF1 e IF3 sono rilasciati.

Passaggio 3: Assemblaggio del complesso di inizio completo


Una volta che il t-RNA iniziatore è legato al codone AUG e IF3 è stato rilasciato, la subunità
maggiore si unisce al complesso ed il GTP legato a IF2 viene idrolizzato (passaggio 3). L’idrolisi
di GTP probabilmente causa un cambiamento conformazionale nel ribosoma, richiesto per il
rilascio di IF2-GDP.

Inizio della traduzione negli eucarioti: le cellule eucariotiche richiedono almeno 12 fattori di
inizio, per un totale di oltre 25 catene polipeptidiche. Parecchi fra questi eIF legano la subunità
40S, preparando la stessa subunità a legarsi all’mRNA. Anche il tRNA iniziatore, legato alla
metionina, si attacca alla subunità 40S prima di interagire con l’mRNA. Il tRNA iniziatore si
inserisce nel sito P della subunità minore in associazione con e IF2-GTP. Successivamente la
subunità minore del ribosoma, con i suoi fattori di inizio associati ed il tRNA caricato è pronta
per cercare l’estremità 5’ dell’mRNA, che porta il cappuccio di metilguanosina.
Il complesso 43S viene inizialmente indirizzato verso l’mRNA con l’aiuto di un gruppo di fattori di
inizio che sono già legati all’mRNA. Tra questi fattori eIF4E si lega al cappuccio dell’estremità 5’
dell’mRNA eucariotico; eIF4A si muove lungo l’estremità 5’ del messaggio rimuovendo tutte le
regioni a doppio filamento che interferirebbero con lo scorrimento del complesso 43S lungo
l’mRNA; eIF4G serve da collegamento tra l’estremità 5’ incappucciata e quella 3’ poliadenilata
dell’mRNA. eIF4G converte un mRNA lineare in un messaggio circolare.
Una volta che il complesso 43S si è legato all’estremità 5’ dell’mRNA, il complesso lungo il
messaggio finchè raggiunge una sequenza riconoscibile di nucleotidi che contiene il codone di
inizio AUG. Una volta che il complesso 43S ha raggiunto il codone AUG appropriato, eIF2-GTP
viene idrolizzato, eIF2-GDP viene rilasciato e la subunità maggiore (60S) si unisce al complesso
per completare la fase di inizio.

Il ruolo dei ribosomi


I ribosomi sono macchine molecolari. Durante la traduzione, un ribosoma va incontro ad un ciclo
ripetitivo di cambiamenti meccanici guidati dall’energia rilasciata dall’idrolisi di GTP. Il
ribosoma si muove lungo un “nastro” di RNA contenente informazioni codificate. I ribosomi sono
quindi macchine programmabili: l’informazione conservata nell’mRNA determina la sequenza
degli amminoacil-tRNA che il ribosoma usa nella traduzione.
Gli RNA ribosomali svolgono numerosi ruoli importanti, selezionando i tRNA, assicurando
l’accuratezza della traduzione, legando fattori proteici e polimerizzando gli amminoacidi. Ogni
ribosoma ha tre siti di associazione per le molecole di RNA transfer. Questi tre siti, denominati
sito A (amminoacidico), sito P (peptidico), e sito E (exit, di uscita), ricevono ciascun tRNA in
passaggi successivi del ciclo di allungamento.
I tRNA si legano a questi siti e riempono lo spazio tra le due subunità ribosomali. L’estremità
dell’anticodone del tRNA legato contatta la subunità minore, che svolge un ruolo chiave nella
decodificazione delle informazioni contenute nell’mRNA.
L’estremità del tRNA legato che porta l’amminoacido contatta la subunità maggiore, che ha un
ruolo catalitico nella formazione del legame peptidico. Altre caratteristiche strutturali rivelate
dagli studi ad alta risoluzione includono:
1. L’interfaccia tra le subunità minore e maggiore forma una cavità relativamente spaziosa
che è delimitata quasi esclusivamente da RNA. Il lato della subunità minore rivolto verso
questa cavità è delimitato nella sua lunghezza da un’elica continua a doppio filamento di
RNA. Le superfici delle due subunità rivolte una verso l’altra contengono i siti di legame
per l’mRNA e per il tRNA in arrivo, e quindi rivestono gande importanza per il
funzionamento del ribosoma.
2. Anche il sito attivo, dove gli amminoacidi sono legati covalentemente l’uno all’altro, è
costituito da RNA. Questa porzione catalitica della subunità maggiore giace in una
profonda fenditura, che protegge il legame peptidico appena formato dall’idrolisi da
parte del solvente acquoso;
3. L’mRNA è situato in uno stretto canale che scorre lungo il collo della subunità maggiore,
passando attraverso i siti A, P ed E. Prima di entrare nel sito A, l’mRNA è privato di
qualsiasi struttura secondaria da una attività elicasica del ribosoma.
4. Una galleria corre attraverso tutta la subunità maggiore, iniziando dal sito attivo. Questa
galleria fornisce una via di passaggio per la traslocazione del polipeptide in allungamento
attraverso il ribosoma.
5. La maggior parte delle proteine delle subunità ribosomali ha siti multipli di legame
all’RNA ed è disposta in modo da stabilizzare la complessa struttura terziaria degli rRNA.

2° FASE: ALLUNGAMENTO
Passaggio 1: Selezione dell’amminoacil-tRNA
Quando il tRNA iniziatore è localizzato nel sito P, il ribosoma è pronto per accettare il secondo
amminoacil-tRNA nel sito. A vuoto: questo è il primo passaggio della fase di allungamento. Prima
che il secondo amminoacil-tRNA possa effettivamente legarsi all’mRNA nel sito A, esso deve
combinarsi con un fattore di allungamento proteico legato a GTP. Questo fattore è detto EF-Tu
(o Tu) nei procarioti ed EFF1α negli eucarioti. EF-Tu è necessario per indirizzare l’amminoacil-
tRNA al sito A del ribosoma. Solo quello che ha l’anticodone complementare al codone
dell’mRNA situato nel sito A sarà intrappolato dal ribosoma.
Quando l’amminoacil-tRNA – Tu – GTP appropriato si è legato al codone dell’mRNA, il GTP viene
idrolizzato e il complesso Tu-GDP viene rilasciato, lasciando l’aa-tRNA legato al sito A del
ribosoma. La rigenerazione di Tu-GTP dal Tu-GDP rilasciato richiede anche un altro fattore di
allungamento, il fattore EF-Ts.

Passaggio 2: Formazione del legame peptidico


Alla fine del primo passaggio, i due amminoacidi, legati ai loro rispettivi tRNA, sono giustapposti
in una posizione tale che possono reagire l’uno con l’altro. Il secondo passaggio nel ciclo di
allungamento è la formazione di un legame peptidico tra questi due amminoacidi. La formazione
del legame peptidico avviene quando il gruppo amminico dell’aa-tRNA situato nel sito A reagisce
con il gruppo carbonile dell’amminoacido legato al tRNA del sito P, spiazzando il tRNA del sito P.
Come risultato di questa reazione, il tRNA legato al secondo codone nel sito A ha un dipeptide
attaccato, mentre il tRNA del sito P è deacilato. La formazione del legame peptidico avviene
spontaneamente, senza bisogno di energia esterna. La reazione è catalizzata dalla peptidil
transferasi, un componente della subunità maggiore del ribosoma.

Passaggio 3: Traslocazione
La formazione del primo legame peptidico lascia un’estremità della molecola di tRNA nel sito A
ancora attaccata al suo codone complementare sull’mRNA e l’altra estremità della molecola
attaccata al dipeptide. Il tRNA del sito P è ora privo dell’amminoacido. Il passaggio successivo è
la traslocazione, caratterizzato da un notevole cambiamento di posizione fra le due subunità del
ribosoma. Il ribosoma si sposta di tre nucleotidi lungo l’mRNA in direzione 5’  3’.
La traslocazione è accompagnata dallo spostamento del dipeptidil-tRNA dal sito A al sito P del
ribosoma, legato ancora mediante legami idrogeno al secondo codone dell’mRNA, e dal
movimento del tRNA deacilato dal sito P al sito E.
La traslocazione è guidata da modifiche conformazionali in un altro fattore di allungamento (EFG
nei procarioti ed EF2 negli eucarioti), dovute all’idrolisi del GTP legato ad esso. Dopo questa
reazione, EF-G-GDP si stacca dal ribosoma.

Passaggio 4: Rilascio del tRNA deacilato


Il tRNA deacilato lascia il ribosoma, liberando il sito E.
Per ogni ciclo di allungamento, almeno due molecole di GTP sono idrolizzate: una durante la
selezione dell’amminoacil-tRNA e una durante la traslocazione. Ogni ciclo di allungamento
richiede circa un ventesimo di secondo, la maggior parte impiegata nella scelta dell’aa-tRNA dal
citosol circostante.
Una volta che il peptidil-tRNA si è spostato dal sito P mediante la traslocazione, il sito A è
ancora una volta libero per far entrare un altro amminoacil-tRNA, in questo caso uno il cui
anticodone è complementare al terzo codone.
Una volta che il terzo tRNA caricato si è legato all’mRNA nel sito A, il dipeptide dal tRNA del sito
P viene trasferito all’amminoacido sul tRNA nel sito A, formando il secondo legame peptidico e,
quindi, un tripeptide attaccato al tRNA del sito A. il tRNA nel sito P è ancora una volta privo di
amminoacido. La formazione del legame peptidico è seguita dalla traslocazione del ribosoma al
quarto codone e dal rilascio del tRNA deacilato, e il ciclo è pronto per ricominciare.

La particolare sequenza di codoni nell’mRNA che è utilizzata dal ribosoma (il modulo di lettura)
è fissata nel momento in cui il ribosoma si lega al codone di inizio, durante la fase di inizio della
traduzione. Tra le mutazioni più deleterie, vi sono quelle in cui una singola base è aggiunta o
rimossa dal DNA. Queste mutazioni sono definite mutazioni frameshift (scivolamento del modulo
di lettura), e portano all’assemblaggio di sequenze di amminoacidi completamente anormali a
partire dal punto di maturazione fino alla fine del polipeptide.

3° FASE: TERMINAZIONE
3 dei 64 possibili codoni trinucleotidici funzionano da codoni di stop, la cui funzione è di
interrompere la formazione del polipeptide, invece di codificare un altro amminoacido. Non
esiste alcun tRNA i cui anticodoni siano complementari ai codoni di stop. Quando il ribosoma
raggiunge uno di questi codoni (UAA, UAG o UGA), il segnale viene letto in modo da bloccare
ogni ulteriore allungamento e liberare il polipeptide legato all’ultimo tRNA.
La terminazione richiede la presenza di fattori di rilascio (RF) che possono essere distinti in tre
gruppi:
- RF di classe I, che riconoscono i codoni di stop nel sito A del ribosoma;
- RF di clase II, che sono proteine leganti GTP (proteine G) i cui ruoli non sono ancora
chiari
I batteri hanno due classi di fattori di rilascio RF1 e RF2.
Le cellule eucariotiche hanno uno F di classe I, che riconosce tutti i codoni di stop.

Gli RF di I classe entrano nel sito A del ribosoma, dove un tripeptide conservato ad una estremità
del fattore di rilascio si ritiene interagisca direttamente con il codone di stop nel sito A. il
legame estero che lega la catena polipeptidica nascente al tRNA viene quindi idrolizzato e il
polipeptide completo è rilasciato dal ribosoma. A questo punto, l’idrolisi del GTP legato all’RF di
classe II (RF3 o eRF3) porano al rilascio dell’RF di classe I dal sito A del ribosoma. I passaggi
finali della traduzione includono il rilascio del tRNA deacilato dal sito P, la dissociazione
dell’mRNA dal ribosoma, e il disassemblaggio del ribosoma nelle due subunità maggiore e minore
in preparazione ad un nuovo ciclo di traduzione.
Questi passaggi finali richiedono una serie di fattori proteici.

La sorveglianza dall’mRNA ed il controllo di qualità


Dal momento che i tre codoni di terminazione si possono facilmente generare da cambiamenti di
una singola base a livello di molti altri codoni, ci si pu aspettare l’insorgenza di mutazioni che
producono un codone di stop all’interno di un gene. Mutazioni di questo tipo, chiamate
mutazioni nonsenso, sono ritenute responsabili di circa il 30% delle malattie ereditarie
nell’uomo. Le cellule possiedono un meccanismo di sorveglianza dell’mRNA in grado di rilevare
la presenza di messaggi con un codone di stop prematuro. Nella maggior parte dei casi, gli mRNA
contenenti tali mutazioni sono tradotti solo una volta prima di essere riconosciuti e
selettivamente distrutti mediante NMD (Nonsense-meditated decay).
L’NMD protegge le cellule dalla produzione di proteine tronche e non funzionali.
Quando un introne viene rimosso da uno spliceosoma, un complesso di proteine viene depositato
sul trascritto 20-24 nucleotidi a monte della giunzione esone-esone appena formata. Questo
agglomerato di proteine, chiamato complesso di giunzione esonica (EJC), rimane associato
all’mRNA fino a che esso non viene tradotto. In un normale mRNA, il codone di terminazione è
tipicamente presente nell’ultimo esone e EJC è appena a monte di quel sito.
Quando un mRNA viene sottoposto al suo primo ciclo di traduzione, si pensa che EJC venga
rimosso dal ribosoma mentre esso avanza.
Durante la traduzione di un mRNA che contiene un codone di stop prematuro: il ribosoma si
ferma nel sito della maturazione e poi si dissocia, lasciando attaccato all’mRNA ogni EJC
presente a valle del sito di terminazione prematuro. Così, la presenza di uno o più EJC su un
mRNA tradotto serve come un “marchio” di identificazione che indica che quell’mRNA come un
trascritto difettivo. Questo a sua volta mette in moto una serie di eventi che portano alla
distruzione enzimatica del messaggio aberrante.
La NMD è conosciuta principalmente per il suo ruolo nell’eliminazione degli mRNA trascritti da
geni mutanti, come quelli responsabili della fibrosi cistica o della distrofia muscolare.

POLIRIBOSOMI
Quando un mRNA impegnato nel processo di traduzione è analizzato al microscopio, si vede
sempre un certo numero di ribosomi legati lungo il filamento. Questo complesso di ribosomi e
mRNA viene definito poliribosoma o polisoma. Ciascuno dei ribosomi si assembla dalle sue
subunità a livello del codone di inizio e poi si muove verso l’estremità 3’ dell’mRNA fino a
raggiungere un codone di terminazione.
Non appena ciascun ribosoma si è mosso per un tratto sufficientemente grande dal codone di
inizio, un nuovo ribosoma si lega all’mRNA e inizia la sua attività di traduzione.
La traduzione simultanea dello stesso mRNA da parte di numerosi ribosomi fa aumentare di
molto la velocità della sintesi proteica all’interno della cellula.
L’organizzazione tridimensionale e l’orientamento dei ribosomi all’interno di un polisoma libero
è molto ordinata.
Ciascun ribosoma è orientato in modo che il rispettivo polipeptide nascente è situato sulla sua
superficie esterna verso il citosol. Questo orientamento in grado di determinare la massima
distanza fra le catene nascenti, minimizzando la possibilità che le catene nascenti interagiscano
fra loro ed eventualmente si aggreghino.
Si ritiene che alcuni polisomi fossero coinvolti nella sintesi di proteine di membrana e/o di
organelli nel momento in cui la cellula è stata fissata. All’interno di ciascun polisoma, i ribosomi
appaiono organizzati ad ansa circolare o a spirale sulla superficie della membrana del reticolo
plasmatico.
A differenza delle cellule eucariotiche, nelle quali la trascrizione si verifica nel nucleo e la
traduzione nel citoplasma, con numerosi passaggi intermedi interposti tra i due processi, i
processi corrispondenti nelle cellule procariotiche sono strettamente accoppiati.
La sintesi di un mRNA procede nella stessa direzione nella quale si muovono i ribosomi quando
traducono quel determinato messaggio, cioè dall’estremità 5’ all’estremità 3’. Di conseguenza,
non appena una molecola di RNA comincia ad essere sintetizzata, l’estremità 5’ è disponibile per
il legame con i ribosomi.

IL NUCLEO ED IL CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE GENICA

IL NUCLEO DI UNA CELLULA EUCARIOTICA


Il nucleo di una cellula è importante essendo deposito e sede di utilizzo dell’informazione
genetica. Ha per una morfologia poco distinta. Il suo contenuto si presenta come una massa di
materiale viscoso e amorfo, racchiusa da un involucro nucleare che costituisce il confine tra il
nucleo e il citoplasma. All’interno del nucleo di una tipica cellula in interfase (non mitotica) vi
sono:
- I cromosomi, presenti come fibre nucleoproteiche molto estese, definite cromatina;
- Uno o più nucleoli, strutture elettrondense di forma irregolare in cui avviene la sintesi
dell’RNA ribosomale e l’assemblaggio dei ribosomi;
- Il nucleoplasma, una sostanza fluida in cui sono disciolti i soluti del nucleo; - La
matrice nucleare, una rete fibrillare contenente proteine.

Involucro nucleare
Separa il materiale genetico dal citoplasma circostante. Consiste di 2 membrane cellulari,
disposte parallelamente l’una all’altra. Le membrane funzionano come una barriera che
impedisce il passaggio di ioni, soluti e macromolecole tra il nucleo e il citoplasma. Le due
membrane si fondono in corrispondenza di alcuni siti, per formare pori circolari contenenti una
complessa associazione di proteine.
Una cellula di mammifero contiene circa diverse migliaia di pori nucleari.
In genere la membrana nucleare esterna è tappezzata di ribosomi ed è in continuità con la
membrana del RER. Lo spazio tra le membrane nucleari è in continuità con il lume del RE. La
superficie interna dell’involucro nucleare delle cellule animali è legata tramite proteine
integrali di membrana ad una sottile rete fibrillare chiamata lamina nucleare, che agisce da
supporto strutturale per l’involucro nucleare e serve da sito di attacco per le fibre di cromatina
alla periferia del nucleo.
I filamenti della lamina nucleare sono composti da polipeptidi chiamati lamine. L’integrità dei
filamenti intermedi che compongono la lamina nucleare è regolata da processi di fosforilazione
delle lamine da parte di una specifica chinasi.
Mutazioni in uno dei geni delle lamine (LMNA) sono responsabili di diverse malattie umane,
inclusa una rara forma di distrofia muscolare in cui le cellule muscolari contengono nuclei
estremamente fragili. Altre mutazioni a carico della lamina A sono state correlate ad una
patologia chiamata sindrome della progenia di Hutchinson-Gilford (HGPS), caratterizzata da
invecchiamento precoce e morte durante l’adolescenza per infarto o ictus.
La lamina nucleare è un importante fattore determinante dell’architettura nucleare.

Mutazione sinonima: mutazione che ha generato un codone diverso, ma codificante per lo stesso
amminoacido.
Poro nucleare e suo ruolo nello scambio nucleo-citoplasmatico
L’involucro nucleare è la barriera fra il nucleo ed il citoplasma, ed i pori nucleari sono le vie di
passaggio attraverso tale barriera.
L’involucro nucleare è un centro di attività per il movimento di RNA e proteine tra nucleo e
citoplasma in entrambe le direzioni. La replicazione e la trascrizione del materiale genetico
presente nel nucleo richiedono la partecipazione di un gran numero di proteine che vengono
sintetizzate nel citoplasma e trasportate attraverso l’involucro nucleare.
Gli mRNA, i tRNA e le subunità ribosomali prodotti nel nucleo, devono essere trasportati
attraverso l’involucro nucleare nella direzione opposta. Alcuni composti, come gli snRNA dello
spliceosoma, si muovono in entrambe le direzioni: essi sono sintetizzati nel nucleo, assemblati in
particelle ribonucleoproteiche (RNP) nel citoplasma e quindi inviati di nuovo nel nucleo, dove
partecipano alla maturazione dell’mRNA.
Materiali voluminosi, come le particelle d’oro e le subunità ribosomali, sono in grado di passare
attraverso i pori nucleari, si suppone quindi che i pori siano canali aperti, ma non è così. I pori
nucleari contengono una struttura intricata, chiamata complesso del poro nucleare (CPN), che
riempie il poro come un tappo, sporgendo sia verso il citoplasma che verso il nucleoplasma. Il
CPN è un enorme complesso sopramolecolare che presenta una simmetria ottagonale dovuta
alla ripetizione per otto volte di specifiche strutture. I CPN contengono solo circa 30 proteine
differenti, le nucleoproteine; ciascuna è presente in almeno 8 copie, in accordo con la
simmetria ottagonale del CPN.
Il CPN non è una struttura statica, infatti molte delle sue componenti proteiche sono sostituite
da nuove copie in pochi secondi o minuti.
Esiste una sottoclasse di nucleoproteine che contiene nella sua sequenza amminoacidica, un gran
umero di ripetizioni fenilanina-glicina (FG). Le ripetizioni FG sono concentrate in una particolare
regione della molecola chiamata dominio FG. I domini FG hanno una struttura disordinata che
conferisce loro una organizzazione estesa e flessibile.
I domini FG formano una rete o setaccio idrofobico che impedisce il passaggio per semplice
diffusione delle macromolecole più grandi tra il nucleo e il citoplasma.
Venne scoperto in inghilterra che la nucleoplasmina (molto diffusa negli anfibi) contiene un
breve segmento amminoacidico vicino all’estremità C-terminale che agisce da segnale di
localizzazione nucleare (NLS). Questa sequenza consente ad una proteina di passare attraverso i
pori nucleari ed entrare nel nucleo. Un tipico NLS è costituito da due brevi sequenze costituite
da amminoacidi carichi positivamente.
Il trasporto delle proteine nel nucleo simile al trasporto di altre proteine destinate ad uno
specifico organulo, come un mitocondrio o un perossisoma. La proteina possiede un preciso
“segnale” che viene riconosciuto da uno specifico recettore che la indirizza all’organulo di
destinazione.
Esiste una famiglia di proteine che funzionano come recettori di trasporto, in grado di
trasportare le macromolecole attraverso l’involucro nucleare: all’interno di questa famiglia
troviamo le importine, che trasportano le macromolecole dal citoplasma al nucleo e le esportine
che trasportano le macromolecole dal nucleo al citoplasma.
L’importazione ha inizio quando la proteina da trasportare, contenente la sequenza NLS, si lega
ad un recettore per NLS eterodimerico e solubile, chiamato importina α/β, localizzato nel
citoplasma (tappa1).
Si ritiene che il ricettore di trasporto sia in grado di portare la proteina sulla superficie esterna
del nucleo, dove probabilmente si aggancia ai filamenti citoplasmatici che si estendono
dall’anello esterno del CPN (tappa2). Il complesso recettore-proteina si muove attraverso il poro
nucleare (tappa3), interagendo successivamente con diversi domini FG delle nucleoproteine FG.
Ora che la proteina è stata trasportata attraverso il CPN fin dentro il nucleo, entra in gioco un
altro fattore chiave: la proteina Ran (legante il GTP).
Ran pu esistere in forma attiva, legata al GTP, ed in forma inattiva, legata a GDP. Il ruolo di
Ran nella regolazione del trasporto nucleo-citoplasmatico si basa sulla capacità della cellula di
mantenere la concentrazione di Ran-GTP alta nel nucleo e molto bassa nel citoplasma. Il ripido
gradiente di Ran-GTP attraverso l’involucro nucleare dipende dalla compartimentazione di
alcune proteine accessorie. Una di queste proteine accessorie (RCC1) viene sequestrata nel
nucleo, dove promuove la conversione del Ran-GDP in Ran-GTP, così da mantenere elevati i
livelli nucleari di Ran-GTP.
Un’altra proteina accessoria, (RanGAP1) si trova nel citoplasma, dove promuove l’idrolisi del
Ran-GTP in Ran-GDP, così da mantenere bassi i livelli citoplasmatici di Ran-GTP. In questo
modo, l’energia liberata dall’idrolisi del GTP viene utilizzata per mantenere il gradiente di
Ran-GTP attraverso l’involucro lineare.
Il gradiente di Ran-GTP guida il trasporto nucleare mediante un processo che dipende solo da
una diffusione mediata da recettore; nessun tipo di proteina motrice o ATPasi è stato implicato
in questo processo.
Quando il processo importina-proteina entra nel nucleo, incontra una molecola di Ran-GTP, la
quale si lega al complesso e ne determina il disassemblaggio (tappa4).
La funzione dell’alta concentrazione di Ran-GTP nel nucleo è promuovere il disassemblaggio dei
complessi importati dal citoplasma. La proteina importata viene rilasciata nel nucleoplasma e
una porzione del recettore NLS viene riportata nel citoplasma insieme a Ran-GTP (tappa5). Una
volta nel citoplasma, la molecola di GTP legata a Ran viene idrolizzata, determinando il rilascio
di Ran-GDP dalla subunità β dell’importina. A questo punto, Ran-GDP viene riportata nel
nucleo, dove viene riconvertito nella forma legata al GTP, rendendosi disponibile per un nuovo
ciclo.
L’importina α vien invece trasportata nel citoplasma da un esportina.
Ran-GTP gioca un ruolo chiave nell’accompagnare le molecole fuori dal nucleo, così come fa
durante la loro importazione dal citoplasma.
Ran-GTP è essenzialmente confinato nel nucleo e promuove l’assemblaggio dei composti
esportati dal nucleo. Le proteine esportate dal nucleo contengono delle sequenze
amminoacidiche (segnali di esportazione nucleare o NES) riconosciute da recettori di trasporto, i
quali hanno il compito di convogliare tali proteine attraverso l’involucro nucleare verso il
citoplasma.
La maggior parte del traffico in questa direzione consiste di diversi tipi di molecole di RNA che
vengono sintetizzati nel nucleo ma che svolgono le loro funzioni nel citoplasma.
Nella maggior parte dei casi, questi RNA si muovono attraverso il CPN come ribonucleoproteine
(RPN). Il trasporto di rPN chiede l’attività di una RNA elicasi localizzata sui filamenti
citoplasmatici del CPN.
Solo mNA maturi (che hanno completato lo splicing) sono in grado di uscire dal nucleo.

I cromosomi e la cromatina
I cromosomi sembrano formarsi dal nulla all’inizio della mitosi e scompaiono di nuovo alla fine
della divisione cellulare.

Il compattamento del genoma: una tipica cellula umana contiene una quantità di DNA
corrispondente a circa 6,4 miliardi di coppie di basi, suddivisa in 46 cromosomi (in un corredo
diploide di cromosomi non replicati). Ciascun cromosoma non replicato contiene una singola
molecola di DNA: più grande è il cromosoma, più lungo è il DNA che esso contiene.

I nucleosomi (primo livello di organizzazione dei cromosomi): i cromosomi sono composti da DNA
e da proteine associate, che formano nel loro insieme la cromatina. Il compattamento ordinato
del DNA eucariotico dipende dagli istoni, un gruppo caratteristico di piccole proteine che
contengono un numero particolarmente elevato degli amminoacidi basici lisina ed arginina. Gli
istoni sono suddivisi in cinque classi, distinguibili per il loro rapporto arginina/lisina.
Gli istoni sono altamente conservati in quanto interagiscono con lo scheletro della molecola di
DNA, che è identica in tutti gli organismi; e sono molto conservati anche perché quasi tutti gli
amminoacidi di un istone sono coinvolti in interazioni con altre molecole, sia DNA che altri istoni
e di conseguenza, solo pochi amminoacidi di un istone possono essere sostituiti con altri
amminoacidi senza compromettere la funzionalità della proteina.
Il DNA cromosomico è protetto dall’attacco enzimatico, tranne che specifici siti che si trovano
ad intervalli regolari lungo la molecola.
Inizialmente si pensava che il DNA e gli istoni fossero organizzati in subunità ripetute, dette
nucleosomi. Oggi sappiamo che ogni nucleosoma contiene una particella centrale (core) formata
da 146 coppie di basi di DNA superavvolto (gira quasi 2 volte intorno ad un complesso a forma di
disco formato da otto molecole di istoni). Questo complesso consiste di due molecole di ciascuno
degli istoni H2A, H2B, H3 e H4 assemblati in un ottamero. L’ultimo istone, il tipo H, si chiama
istone di connessione ed è localizzato fuori dal core, legando una parte del DNA di connessione
(DNA linker) che unisce due particelle centrali (core) successive.
Le otto molecole istoniche che formano il core del nucleosoma sono organizzate in quattro
eterodimeri: due dimeri H2A-H2B e due dimeri H3-H4. La dimerizzazione delle molecole
istoniche è mediata dai loro domini C-terminali, che consistono principalmente di regioni ad
αelica ripiegate in una massa compatta nel core del nucleosoma. Il segmento N-terminale di
ciascun istone ha la forma di una lunga coda flessibile che si estende al di là della doppia elica
del DNA. Queste code sono sottoposte ad alcune modificazioni covalenti.
Oltre ai quattro istoni “convenzionali”, molte cellule sono in grado di sintetizzare versione
alternative degli istoni del core. Si ritiene che questi istoni svolgano funzioni specializzate. Il
DNA e gli istoni del core sono tenuti insieme da diversi tipi di legami non covalenti, tipo legami
ionici tra i gruppi fosfati carichi positivamente degli istoni. Le due molecole entrano in contatto
nel punto in cui il solco minore del DNA si affaccia interamente in direzione del nucleo istonico.
Nelle regioni comprese tra questi punti di contatto, le due molecole sono separate da uno spazio
considerevole, che potrebbe consentire l’accesso al DNA da parte dei fattori di trascrizione e di
altre proteine leganti il DNA.
Gli istoni sono piccole molecole che hanno per un ruolo critico nel determinare l’attività del
DNA con cui sono associate.
La cromatina è un componente cellulare importante nel quale gli istoni, le proteine regolatrici
ed un’ampia varietà di enzimi si muovono dentro e fori dal complesso nucleoproteico per
permettere funzioni complesse come la trascrizione, il compattamento, la replicazione, la
ricombinazione e il riparo del DNA.
La formazione dei nucleosomi rappresenta il primo importante livello nel processo di
compattamento: il rapporto di compattamento del DNA nel nucleosoma è di 7:1.

Livelli superiori di organizzazione della cromatina: l’avvolgimento della molecola di DNA intorno
a particelle core del nucleosoma rappresenta il primo livello di organizzazione della cromatina.
All’interno della cellula la cromatina non esiste in questo stato relativamente disteso a “collana
di perle”. Quando la cromatina è estratta dai nuclei e mantenuta ad una concentrazione ionica
fisiologica, si pu osservare una fibra di circa 30 nm di spessore, ma la sua struttura non è ancora
completamente definita. Esistono due possibili modelli che differiscono per la posizione relativa
dei nucleosomi lungo la fibra stessa. Gli studi più recenti sono a favore del modello a “zig-zag”
nel quale nucleosomi successivi sono impilati in file contigue e nucleosomi alternati sono impilati
nella stessa fila.
La struttura della fibra da 30nm aumenta di 6 volte il grado di compattamento del DNA, che
raggiunge complessivamente il valore di circa 40.
La formazione della fibra da 30nm dipende dall’interazione fra molecole istoniche di nucleosomi
vicini.
Gli istoni del core di nucleosomi adiacenti possono interagire l’uno con l’altro mediante le loro
code lunghe e flessibili. Ad esempio, alcuni studi strutturali hanno indicato che la coda
Nterminale della coda dell’istone H4 di una particella nucleosomica pu estendersi ed entrare in
contatto sia con il DNA linker che con il dimero H2A/H2B delle particelle adiacenti.
Si ritiene che queste interazioni possano mediare l’avvolgimento del filamento nucleosomico in
una fibra più spessa. Infatti, fibre di cromatina preparate con istoni privi di code non sono in
grado di ripiegarsi in fibre di ordine superiore.
Lo stadio successivo del processo di impacchettamento del DNA consiste nell’organizzazione
delle fibre di cromatina da 30nm in una serie di ampie anse superavvolte, dette domini, che
possono essere compattate in fibre più spesse (fino a 100nm). Le anse di DNA sono
apparentemente agganciate alla loro base a proteine che fanno parte della matrice (impalcatura
nucleare). Tra queste proteine, troviamo una topoisomerasi di tipo II che probabilmente regola il
grado di superavvolgimento del DNA. La topoisomerasi potrebbe anche agire svolgendo le
molecole di DNA di anse diverse quando queste risultino aggrovigliate tra loro.
Le anse di cromatina sono distese all’interno del nucleo e non possono essere visualizzate se non
in particolari condizioni.

Eterocromatina ed Eucromatina
Alla fine della mitosi, la maggior parte della cromatina che compone i cromosomi mitotici
altamente condensati torna ad una condizione più distesa, propria dell’interfase. Una piccola
parte invece rimane in forma condensata e compattata anche durante l’interfase ed è
localizzata alla periferia del nucleo e viene chiamata eterocromatina.
L’eucromatina invece è la cromatina che ritorna ad uno stato disperso.
L’eterocromatina si divide in due classi:
1. Eterocromatina costitutiva: che rimane nello stato condensato in tutti gli stadi del ciclo
cellulare di tutte le cellule, e rappresenta quindi DNA permanentemente silenziato. Il
DNA dell’eterocromatina costituitva consiste principalmente di sequenze ripetute e
contiene un numero relativamente basso di geni (questo per il fenomeno di effetto di
posizione). Si ritiene infatti, che l’eterocromatina contenga dei componenti la cui
influenza si propaghi ad una certa distanza lungo il cromosoma, modificando il
comportamento dei geni vicini.
La diffusione dell’eterocromatina lungo il cromosoma è bloccata in genere da speciali
sequenze di sbarramento (elementi di confine) nel genoma. L’eterocromatina costitutiva
serve anche ad inibire la ricombinazione genica tra sequenze ripetitive omologhe, che pu
portare a duplicazioni e delezioni del DNA.
2. Eterocromatina facoltativa: corrisponde a porzioni di cromatina che sono state
specificamente inattivate durante determinate fasi della vita di un organismo o in certi
tipi di cellule differenziate. Ad esempio si pu osservare nei mammiferi confrontando
cellule di femmine con quelle di maschi. Le cellule dei maschi contengono un piccolo
cromosoma Y ed un cromosoma X molto più grande, hanno quindi una singola copia della
maggior parte dei geni presenti sui cromosomi sessuali. Le femmine invece contengono 2
cromosomi X, ma solo uno di essi è trascrizionalmente attivo. L’altro viene condensato
sotto forma di corpo di Barr (ammasso di eterocromatina).

L’inattivazione del cromosoma.


Sui risultati ottenuti da alcuni studi venne proposto che:
- La condensazione di uno dei due cromosomi X in eterocromatina avviene nelle femmine
di mammifero durante i primi stadi di sviluppo embrionale e determini l’inattivazione dei
geni presenti su tale cromosoma;
- L’inattivazione del cromosoma X nell’embrione un processo casuale. Quindi, mentre il
cromosoma X paterno pu essere inattivato in una certa cellula dell’embrione, nella
cellula ad essa vicina pu essere inattivato il cromosoma X materno. Comunque, dal
momento in cui uno dei due cromosomi X viene inattivato in una data cellula, il suo stato
eterocromatico viene mantenuto in tutta la progenie di quella particolare cellula .
- La riattivazione del cromosoma X eterocromatico avviene nelle cellule germinali prima
dell’inizio della meiosi. Di conseguenza, entrambi i cromosomi X sono attivi durante
l’ovogenesi e tutti i gameti ricevono un cromosoma X eucromatico.

Queste ipotesi furono presto confermate. I cromosomi X di derivazione paterna e materna


possono contenere differenti alleli per uno stesso carattere, le femmine adulte sono in un certo
senso dei mosaici genetici, in quanto differenti alleli sono attivi in cellule diverse.
Il mosaicismo legato al cromosoma X si pu osservare nella colorazione a macchie della pelliccia
di alcuni animali, come i gatti “calico”. Nella specie umana, i geni per la pigmentazione non
sono localizzati sul cromosoma X perci non possono esistere donne “calico”.
L’inattivazione dell’X è determinata da una solo molecola di RNA non codificante, e non da una
proteina, trascritta da un gene (XIST nell’uomo) localizzato sul cromosoma X che viene
inattivato.
L’RNA di XIST è un trascritto di grandi dimensioni e questo lo rende diverso da altri RNA non
codificanti.
L’RNA di XIST non diffonde nel nucleoplasma, ma si accumula lungo il cromosoma poco prima
della sua inattivazione. Il gene XIST è necessario per dare inizio all’inattivazione, ma non serve
per mantenerla da una generazione cellulare alla successiva.

Il codice istonico e la formazione dell’eterocromatina


Le cellule contengono un considerevole corredo di enzimi in grado di aggiungere o rimuovere
determinati gruppi chimici su superfici residui amminoacidici delle code istoniche.
Il codice istonico propone che lo stato e l’attività di una determinata regione cromatinica
dipendano da modificazioni specifiche, o da una combinazione di modificazioni, sulle code degli
istoni di quella regione.
Quindi, il quadro di modificazioni presenti nelle code degli istoni del core rappresenta una
specie di codice che regola le proprietà di quei nucleosomi. Studi hanno indicato che le
modificazioni delle code istoniche possono influenzare la struttura e la funzione della cromatina
in due modi:
1. I residui modificati servono come sito d’ancoraggio per un gruppo specifico di proteine
non istoniche che quindi determina le proprietà e l’attività di un dato segmento di
cromatina.
2. I residui modificati alterano la modalità con cui le code istoniche dei nucleosomi vicini
interagiscono tra di loro e con il DNA al quale sono legati. Variazioni in questi tipi di
interazioni possono portare a cambiamenti dei livelli superiori di organizzazione della
cromatina.
La formazione della eterocromatina avviene durante l’inattivazione del cromosoma X. Gli
istoni possono essere modificati enzimaticamente mediante il legame covalente di gruppi
metile, acetile e fosfato. I gruppi metile sono aggiunti a residui di lisina o di arginina, i gruppi
acetile a residui di lisina e i gruppi fosfato a residui di serina. Ad ogni residuo di lisina possono
essere aggiunti uno o due gruppi metile e il numero di gruppi metile aggiunti pu regolare
l’attività del residuo con una proteina legante.
Alcune modificazioni sono associate a specifiche attività della cromatina, che ha portato al
concetto di “codice istonico”. Oltre ad enzimi che aggiungono questi gruppi chimici, ne esistono
anche altri che li rimuovono.

Il confronto tra i nucleosomi presenti nei domini eterocromatici e quelli presenti nei domini
eucromatici ha rivelato una marcata differenza, per esempio nelle modificazioni di un singolo
residuo di lisina 9 di H3. Il residuo di lisina in posizione 9 dell’istone H3 nei domini
eterocromatici è in gran parte metilato, mentre nei domini eucromatici tende a non essere
metilato, nonostante sia spesso acetilato. La rimozione dei gruppi acetile dagli istoni H3 e H4 è
uno dei passaggi iniziali nella conversione dell’eucromatina in eterocromatina.
La correlazione esistente tra la repressione trascrizionale e la deacetilazione degli istoni pu
essere osservata confrontando il cromosoma X inattivo eterocromatico delle cellule femminili,
che contiene istoni deacetilati, con il comosoma X attivo eucromatico, i cui istoni mostrano un
livello di acetilazione normale.
La deacetilazione degli istoni è accompagnata dalla metilazione della lisina 9 di H3, che è
catalizzata da un enzima (istone metiltransferasi) che sembra svolgere unicamente questa
funzione. Questo enzima, chiamato SUV39H1 nell’uomo, si trova localizzato nella
eterocromatina, dove sembra stabilizzare la natura eterocromatica della regione mediante la
sua attività di metilazione.
Con la formazione di una lisina mlo stato etilata in posizione #9, la coda dell’istone H3 diventa
capace di legarsi con alta affinità a proteine che contengono un particolare dominio, detto
cromodominio. Il genoma umano contiene almeno 30 proteine con cromodomini, delle quali la
più studiata è la proteina eterocromatica 1 (o HP1). HP1 è stata implicata nella
formazione e nel mantenimento della eterocromatina.
Alcuni studi suggeriscono che piccoli RNA giocano un ruolo importante nel far si che una
particolare regione del genoma vada incontro alla metilazione degli istoni e alla susseguente
formazione di eterocromatina.

La struttura di un cromosoma mitotico


Lo stato relativamente disperso della cromatina in una cellula in interfase favorisce le attività
tipiche dell’interfase, come la replicazione e la trascrizione del DNA. La cromatina di una cellula
in mitosi, invece, è nella sua forma più condensata, per favorire la trasmissione di un corredo di
DNA intatto a ciascuna cellula figlia. I cromosomi mitotici contengono un corredo completo del
materiale genetico di una cellula e sono facilmente osservabili.
Quando un cromosoma viene compattato durante la fase mitotica, esso assume una forma ben
distinta, determinata soprattutto dalla lunghezza della molecola di DNA di quel cromosoma e
dalla posizione del centromero.
I telomeri: ogni cromosoma contiene una molecola di DNA a doppio filamento singola e continua.
Ciascuna delle due estremità del filamento di DNA contiene un insolito tratto di sequenze
ripetute che, insieme ad un gruppo di proteine specializzate, forma una specie di “cappuccio”,
chiamato telomero. Nell’uomo, i telomeri contengono la sequenza TTAGGG AATCCC ripetuta da
500 a 5000 volte circa.
La sequenza telomerica è uguale in tutti i vertebrati e sequenze simili sono presenti in altri
organismi.
Questo fa ipotizzare che i telomeri abbiano una funzione conservativa in differenti organismi.
Sono state identificate diverse proteine leganti il DNA che sono in grado di associarsi
specificamente alla sequenza telomerica e che svolgono funzioni essenziali nel telomero. La
corta sequenza ripetuta di DNA dei telomeri serve anche da stampo per la sintesi di RNA non
codificanti le cui funzionisono ora oggetto di grande interesse.
Le DNA polimerasi che replicano il DNA non iniziano la sintesi di un filamento di DNA, ma possono
solo aggiungere nucleotidi all’estremità ‘3 di un filamento già esistente.
La replicazione ha inizio all’estremità ‘5 di ogni nuovo filamento a partire dalla sintesi di un
breve innesco a RNA (primer) (passaggio1) che viene successivamente rimosso (passaggio 2). A
causa di questo meccanismo e del processamento successivo (passaggio 3), l’estremità ‘5 di ogni
filamento di nuova sintesi è mancante di un breve segmento di DNA presente all’estremità ‘3 del
filamento stampo complementare. Come risultato, il filamento con l’estremità ‘3 sporge oltre il
filamento ‘5.
Il filamento sporgente è “ripiegato” sulla porzione a doppio filamento del telomero formando
un’ansa.
Si ritiene che questa conformazione protegga l’estremità telomerica del DNA.
Se le cellule non fossero in grado di replicare le estremità del proprio DNA, i cromosomi
diventerebbero sempre più corti ad ogni divisione cellulare (questa situazione è detta problema
della replicazione terminale). Il principale meccanismo attraverso il quale gli organismi hanno
risolto questo problema è un enzima, la telomerasi, che è in grado di aggiungere unità ripetute
all’estremità ‘3 del filamento sporgente, in modo che una DNA polimerasi pu utilizzare il
segmento ‘3 appena sintetizzato come stampo per riportare l’estremità ‘5 del filamento
complementare alla sua lunghezza originaria.
La telomerasi è una trascrittasi inversa che sintetizza DNA usando un RNA come stampo. A
differenza da altre trascrittasi, la telomerasi contiene anche l’RNA che utilizza come stampo. I
telomeri sono necessari per la completa replicazione dei cromosomi: formano un cappuccio che
protegge i cromosomi dalle nucleasi e da altri fattori destabilizzanti e impediscono che le
estremità dei cromosomi si fondano tra loro.
La telomerasi è assente nella maggior parte delle nostre cellule con alcune importanti eccezioni.
Le cellule germinali delle gonadi mantengono l’attività telomerasica e, quindi, i telomeri dei
loro cromosoi non si accorciano in seguito a divisione cellulare.
In modo analogo, le cellule staminali negli strati epidermici e intestinali e quelle emopoietiche
nel midollo osseo esprimono questo enzima, permettendo loro di continuare a dividersi per
generare la grande quantità di cellule differenziate richieste in questi organi.
L’importanza della telomerasi è indicata da una rara condizione in cui gli individui hanno bassi
livelli di telomerasi perché sono eterozigoti per il gene che codifica per l’RNA o per la subunità
proteica della telomerasi. Questi individui sviluppano patologie correlate all’incapacità del
midollo osseo di produrre a quantità di cellule sanguigne necessarie alla normale durata di vita
della specie umana.
L’accorciamento dei telomeri gioca un ruolo cruciale nella protezione dall’insorgenza di tumori,
limitando i cicli di replicazione di una potenziale cellula tumorale. Le cellule cancerose sono
cellule sfuggite al normale controllo della crescita cellulare nel corpo e dunque sono in grado di
dividersi indefinitamente.
A differenza delle cellule normali, circa il 90% dei tumori umani è costituito da cellule che
contengono una telomerasi attiva. Si ipotizza che la crescita dei tumori sia accompagnata da
un’attiva selezione delle cellule in cui sia avvenuta la riattivazione della telomerasi. La maggior
parte delle cellule tumorali è incapace di riattivare la telomerasi e muore, mentre le rare
cellule che esprimono l’enzima diventano “immortali”.
Chiaramente la telomerasi da sola non è in grado di indurre le cellule a diventare maligne, ma lo
sviluppo del cancro è un processo a più stadi, in cui nelle cellule insorgono spesso cromosomi
anormali, avvengono cambiamenti nell’adesione cellulare e si sviluppa la capacità di invadere
tessuti normali.
La divisione cellulare illimitata rappresenta solo una delle proprietà di una cellula cancerosa.

I centromeri
Ciascun cromosoma presenta una regione nella quale le superfici esterne sono fortemente
incavate. Questa zona di costrizione corrisponde al centromero del cromosoma. Il centromero
dei cromosomi umani contiene una sequenza lunga circa 170 coppie di basi (DNA α-satellite), che
si associa con proteine specifiche che la rendono diversa dal resto del cromosoma. Per esempio,
la cromatina centromerica contiene una caratteristica variante dell’istone H3, chiamata CENP-A.
Durante la formazione dei cromosomi mitotici, i nucleosomi del CENP-A si localizzano sulla
superficie esterna del centromero dove fungono da piattaforma per l’organizzazione del
cinetocore, che a sua volta, serve come sito d’attacco per i microtubuli che separano i
cromosomi durante la divisione cellulare. I cromosomi privi di centromero sono incapaci di
organizzare un cinetocore e vengono persi durante la divisione cellulare.
La sequenza del DNA di per sé non è un fattore determinante della struttura e della funzione del
centromero; infatti ad esempio 1 uomo su 2000 nasce con le proprie cellule contenenti un pezzo
di DNA in più che forma un minuscolo cromosoma aggiuntivo, detto cromosoma marcatore. In
alcuni casi, i cromosomi marcatori sono privi del DNA α-satellite, ma contengono comunque una
costrizione primaria ed un centromero funzionale che consente ai cromosomi duplicati di essere
normalmente segregati nelle cellule figlie ad ogni divisione cellulare.
Nei cromosomi marcatori, il centromero appare localizzato sempre nella stessa regione in tutte
le cellule di un individuo, indicando che la capacità di funzionare da sito di attacco viene
trasmessa ai cromosomi figli durante la divisione cellulare.

EPIGENETICA: L’ereditarietà non dipende solo dalle sequenze di DNA


Il DNAα-satellite non è necessario per lo sviluppo di un centromero. Infatti, nei centromeri dei
cromosomi marcatori sono state trovate dozzine di sequenze di DNA non correlate.
Non è il DNA che marca indelebilmente il sito come un centromero, ma la cromatina contenente
CENP-A che presente.
Non tutti i caratteri ereditari sono strettamente dipendenti dalle sequenze di DNA.
Un’ereditarietà di questo tipo è chiamata Epigenetica. L’inattivazione del cromosoma X è un
esempio di fenomeno epigenetico: i due cromosomi X possono avere sequenze identiche di DNA,
ma uno è inattivato e l’altro no.
Tuttavia, a differenza dell’ereditarietà genetica, uno stato epigenetico pu essere reversibile; i
cromosomi X vengono ad esempio riattivati prima della formazione dei gameti. Cambiamenti
inappropriati dello stato epigenetico sono associati a numerose malattie.
Quando il DNA di una cellula viene replicato, gli istoni che costituiscono i nucleosomi associati al
DNA, vengono distribuiti casualmente nelle cellule figlie assieme alle molecole di DNA. Di
conseguenza, ogni cellula riceve circa la metà degli istoni del core che erano associati con il
filamento parentale. L’altra metà degli istoni che si associano ai filamenti figli di DNA sono
reclutati a partire da molecole di istoni neosintetizzate. Si ritiene che le modificazioni presenti
nelle code degli istoni della cromatina parentale determinino quali modificazioni verranno
introdotte negli istoni di nuova sintesi aggiunti ai filamenti figli di DNA. Le modificazioni degli
istoni e quelle covalenti del DNA rappresentano due tipi di informazione epigenetica.

ORGANIZZAZIONE DEL NUCLEO


L’analisi del nucleo rivela per lo più masse disperse di cromatina ed uno o più nucleoli di forma
irregolare.
Grazie a ripetuti per , è stato chiaro che il nucleo è un compartimento organizzato. Per esempio,
le fibre di cromatina che costituiscono un determinato cromosoma interfasico non sono sparse a
caso nel nucleo, come gli spaghetti in una ciotola, ma sono concentrate in un territorio specifico
che si sovrappone più di tanto con i territori occupati dagli altri cromosomi. Anche se i geni
sono generalmente trascritti all’interno del proprio territorio, singole fibre cromatiniche possono
estendersi al di fuori di tali territori per distanze considerevoli. Inoltre, geni che risiedono su
cromosomi differenti, ma sono implicati nello stesso processo, possono avvicinarsi all’interno del
nucleo ed influenzarsi reciprocamente a livello di trascrizione. Un esempio di interrelazione tra
organizzazione nucleare e genica pu essere dato da una cellula colorata con un anticorpo
fluorescente diretto contro uno dei fattori proteici coinvolti nel processo di splicing del pre-
mRNA. Il macchinario coinvolto nel processo è concentrato all’interno di 20-50 domini irregolari
(speckles cioè graduali). Attualmente si ritiene che questi granuli rappresentino dei depositi
dinamici che forniscono i fattori di splicing a siti di trascrizione vicini.
I vari componenti del nucleo, inclusi i nucleoli e i granuli, sono compartimenti con un proprio
stato stazionario, ma dinamici, la cui esistenza dipende dalla loro continua attività. Se l’attività
viene bloccata, il compartimento scompare alla vista e i suoi materiali si disperdono nel
nucleoplasma.
Oltre ai nucleoli e ai granuli, al microscopio sono spesso visibili anche altri corpi nucleari (tipo
corpi di Cajal, GEM e MPL) che contengono un gran numero di proteine che si spostano
all’interno e all’esterno della struttura in modo dinamico. Questi corpi non sono delimitati da
membrana.

La matrice nucleare
Quando nuclei isolati vengono estratti con detergenti non ionici ad elevata concentrazione di Sali
in modo da rimuovere i lipidi e quasi tutti gli istoni e le proteine non istoniche della cromatina,
il DNA si presenta come un alone che circonda un corpo nucleare residuo. Se i filamenti di DNA
vengono quindi digeriti con la DNasi, la rimanente struttura possiede la stessa forma del nucleo
originale, ma è composta da una rete di sottili fibrille contenenti proteine che si intersecano
all’interno dello spazio nucleare.
Questa rete fibrillare insolubile è chiamata matrice nucleare.
La matrice nucleare funge sia da scheletro per mantenere la forma del nucleo o da impalcatura
sulla quale si organizzano le anse di cromatina; essa serve anche da sito di ancoraggio per molti
dei macchinari coinvolti nelle diverse attività del nucleo, come la trascrizione, la maturazione
dell’RNA e la replicazione.

IL CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI BATTERI


Una cellula batterica vive a diretto contatto con il suo ambiente, che in qualsiasi momento pu
andare incontro a profondi cambiamenti nella composizione chimica. In un determinato
momento un determinato composto pu essere presente, mentre in altri momenti lo stesso
composto pu essere assente.

L’operone batterico
Nei batteri, i geni che codificano per gli enzimi di una determinata via metabolica sono
generalmente raggruppati insieme nel cromosoma, in un complesso funzionale chiamato
operone. Tutti i geni di un operone sono controllati in modo coordinato mediante un
meccanismo.
Un tipico operone batterico è costituito da una serie di geni strutturali, da un gene regolatore e
da due regioni con funzioni di promotore e di operatore.
- I geni strutturali codificano per gli enzimi. I geni strutturali di un operone generalmente
sono disposti uno dopo l’altro e l’RNA polimerasi si muove da un gene strutturale al
successivo, trascrivendoli tutti in un unico mRNA. Questo lungo RNA viene poi tradotto in
polipeptidi distinti corrispondenti ai diversi enzimi della via metabolica. Di conseguenza,
l’accensione di un gene accende anche tutti i geni codificanti per gli enzimi di un dato
operone.
- Il promotore è il sito in cui la RNA polimerasi si lega al DNA prima di iniziare la
trascrizione;
- L’operatore, generalmente localizzato accanto o in parte sovrapposto al promotore,
serve da sito di legame per una proteina chiamata repressore. Il repressore è un esempio
di proteina regolatrice dei geni, che è in grado di riconoscere una sequenza nucleotidica
specifica del DNA e di legarsi ad essa con alta affinità. Le proteine che legano il DNA,
come i repressori batterici, hanno un ruolo fondamentale nel determinare se un
particolare segmento del genoma debba essere trascritto o meno.
- Il gene regolatore codifica per la proteina con funzione di repressore.
La chiave per il controllo dell’espressione dell’operone sta nel repressore. Quando il repressore
si lega all’operone, il promotore non è più disponibile per il legame alla polimerasi e la
trascrizione dei geni strutturali viene soppressa. La capacità del repressore di legarsi
all’operatore ed inibire la trascrizione dipende dalla conformazione della proteina, regolata
allostericamente dal composto chiave della via metabolica, come il lattosio o il triptofano. È la
concentrazione di questo metabolita chiave che determina se l’operone è attivo o inattivo in un
dato momento.

L’operone lac: l’interazione fra questi vari elementi è ben illustrata dall’operone lac, il gruppo
di geni che regola la produzione degli enzimi necessari per metabolizzare il lattosio nelle cellule
batteriche. L’operone del lattosio (lac) è un esempio di operone inducibile, cioè un operone in
cui la presenza di un metabolita chiave induce la trascrizione dei geni strutturali.L’operone lac
contiene tre geni strutturali in tandem:
- Il gene z, che codifica per la β-galattosidasi;
- Il gene y, che codifica per la galattoside permeasi, una proteina che permette l’ingresso
del lattosio nella cellula;
- Il gene a, che codifica per la tiogalattoside acetiltransferasi, un enzima il cui ruolo
fisiologico non è ancora chiaro.
In un operone inducibile, come l’operone lac, la proteina repressore è in grado di legarsi al DNA
solo in assenza di lattosio, che agisce come induttore.
Il rilascio del lattosio permette al repressore di legarsi all’operatore e questo blocca la
polimerasi, che non pu più raggiungere i geni strutturali, spegnendo così la trascrizione
dell’operone.

Controllo positivo tramite AMP ciclico: i repressori, come quelli degli operoni lac e trp,
esercitano la loro influenza mediante un controllo negativo, poiché l’interazione del DNA con
tale proteina inibisce l’espressione genica. L’operone lac è anche sotto un controllo positivo,
scoperto durante alcuni studi sul fenomeno dell’effetto del glucosio.
L’AMP ciclico (cAMP) venne identificato nelle cellule di E. coli. Si trov che la concentrazione di
cAMP nelle cellule era correlata alla presenza di glucosio nel terreno: maggiore era la
concentrazione di glucosio, minore era la concentrazione di cAMP.
Il meccanismo mediante il quale il cAMP annulla l’effetto del glucosio è ben compreso. Una
piccola molecola come il cAMP non è in grado di stimolare direttamente l’espressione di una
specifica batteria di geni. nei procarioti, come avviene nelle cellule eucariotiche, il cAMP agisce
legandosi ad una proteina, in questo caso la proteina recettore del cAMP (CRP). Da sola, la CRP è
incapace di legare il DNA; invece, il complesso cAMP-CRP riconosce e lega un sito specifico nella
regione di controllo di lac.
Il legame con la CRP determina un cambiamento nella conformazione del DNA, che rende
possibile la trascrizione dell’operone lac da parte della RNA polimerasi. La presenza del
complesso cAMP-CRP legato è necessaria quindi alla trascrizione dell’operone, anche quando è
presente il lattosio ed il repressore è inattivo. Fino a quando i livelli di glucosio sono elevati, la
concentrazione del cAMP resta al di sotto del livello necessario per promuovere la trascrizione
dell’operone.

L’operone trp
In un operone reprimibile, come l’operone per il triptofano (trp), il repressore non è in grado di
legare il DNA operatore da solo. Il repressore è quindi attivo come proteina legante il DNA solo
quando è complessato con un fattore specifico, come il triptofano. In assenza di questo fattore,
il sito operatore è disponibile per legare la RNA polimerasi, la quale trascrive i geni strutturali
dell’operone trp, consentendo la produzione degli enzimi che sintetizzano il triptofano. Se il
triptofano diventa disponibile, gli enzimi della via sintetica per questo amminoacido non sono
più necessari. In queste condizioni, l’aumento della concentrazione di triptofano determina la
formazione del complesso triptofano-repressore che blocca la trascrizione.

RIBOSWITCH
Si è trovato che proteine, come i repressori di lac e trp, non sono le sole molecole di regolazione
genica ad essere influenzate dall’interazione con piccoli metaboliti. È stato identificato un certo
numero di mRNA batterici che possono legare un piccolo metabolita, come la glucosamina o
l’adenina, con notevole specificità. Il metabolita si lega ad una regione non codificante
altamente strutturata al 5’ dell’mRNA. Una volta legati al metabolita, questi mRNA o riboswitch
(ribointerruttori) vanno incontro ad un cambiamento nella loro conformazione che permette loro
di alterare l’espressione di un gene coinvolto nella produzione di quel metabolita. La maggior
parte dei riboswitch sopprime l’espressione genica bloccando la terminazione della trascrizione
o dell’inizio della traduzione.
I riboswitch consentono alle cellule di regolare i livelli di espressione genica in risposta a
cambiamenti nella disponibilità di determinati metaboliti. I riboswitch agiscono senza la
partecipazione di cofattori proteici e rappresentano quindi un’altra eredità che deriva dal
mondo ancestrale a RNA.

CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI


Oltre a possedere un genoma contenente decine di migliaia di geni, le piante e gli animali
superiori sono composti da molti tipi di cellule differenti.
Anche se le singole cellule di un animale adulto non sono in grado di originare dei nuovi
individui, è stato dimostrato che i nuclei di cellule animali contengono tutta l’informazione
necessaria per lo sviluppo di un nuovo individuo.
Da alcuni esperimenti, risulta evidente che i nuclei di cellule specializzate contengono tutta
l’informazione genetica necessaria per il differenziamento di molti tipi cellulari diversi. Infatti,
ogni cellula del nostro corpo contiene un corredo completo di geni; le proprietà di una cellula
non dipendono quindi dalla presenza o assenza di certi gruppi di geni ma da come questi geni
vengono utilizzati.
Il successo di alcuni esperimenti di clonaggio ha portato alla conclusione che lo stato
trascrizionale di una cellula differenziata, che si basa sullo stato della sua cromatina, non è un
evento irreversibile.
Durante un esperimento di clonazione, il nucleo di una cellula specializzata è in grado di
bloccare l’espressione dei geni del tessuto di provenienza ed iniziare a esprimere selettivamente
quelli che sono importanti per l’oocita attivato, nel quale esso si è improvvisamente venuto a
trovare.
Un nucleo di una cellula prelevato da una cellula differenziata pu essere riprogrammato da
fattori che risiedono nel citoplasma del suo nuovo ambiente.
Una cellula umana possiede molto più DNA (6 miliardi di coppie di basi) sufficiente per codificare
diversi milioni di polipeptidi. Si stima che una tipica cellula di mammifero sintetizzi circa 5000
differenti polipeptidi ogni momento. Molti di questi polipeptidi sono sintetizzati praticamente da
tutte le cellule del corpo.
Ma ogni cellula contiene anche proteine che sono specifiche per quel particolare stato
differenziato. Sono queste proteine che conferiscono alla cellula le sue peculiari caratteristiche.
La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti è un processo straordinariamente
complesso e avviene soprattutto a tre livelli distinti:
1) I meccanismi di controllo a livello della trascrizione determinano quando e quanto spesso
un particolare gene deve essere trascritto;
2) I meccanismi di controllo a livello della maturazione determinano la via attraverso la
quale il trascritto primario di RNA (pre-mRNA) diventa un RNA messaggero maturo che pu
essere tradotto in un polipeptide.
3) I meccanismi di controllo a livello della traduzione determinano quando, quanto
frequentemente e per quanto tempo un particolare mRNA deve essere tradotto.

1) CONTROLLO A LIVELLO DELLA TRASCRIZIONE


La trascrizione differenziale dei geni è il meccanismo più importante mediante il quale le cellule
eucariotiche determinano quali proteine devono sintetizzare in ogni dato momento della loro
vita. Una gran quantità di evidenze indica che geni differenti vengono espressi nelle cellule
durante i diversi stadi dello sviluppo embrionale, così come nelle cellule dei diversi tessuti o in
cellule esposte a diversi stimoli.
Il microrray di DNA (nuova tecnologia che permette di studiare e affrontare meglio alcuni
aspetti), chiamato anche chip di DNA, pu fornire un differente tipo di ritratto visivo del
controllo a livello trascrizionale. È possibile infatti, analizzare i livelli di espressione di migliaia
di geni presenti in una data popolazione cellulare.
Attualmente sono in corso diversi studi che utilizzano i microrray di DNA per studiare i
cambiamenti nell’espressione genica che avvengono durante un’ampia varietà di fenomeni
biologici, quali la divisione cellulare e la trasformazione di una cellula normale in una cancerosa.
È anche possibile studiare la diversità degli RNA prodotti da una singola cellula tumorale, una
volta che i cDNA sono stati amplificati durante PCR.
I microrray di DNA, oltre a consentire l’analisi dell’espressione genica, hanno una potenzialità di
impiego molto vasta (possono essere utilizzati per determinare il grado di variabilità genetica
nella popolazione umana o per identificare gli alleli di cui un individuo è portatore in specifici
loci genici).

Il controllo trascrizionale è regolato dall’azione di un gran numero di proteine, chiamate fattori


di trascrizione. Queste proteine possono essere divise in due classi funzionali:
- fattori di trascrizione generali, che si legano al core del promotore in associazione con
l’RNA polimerasi;
- Fattori di trascrizione specifici, che si legano a vari siti regolativi di particolari geni.
Possono agire sia come attivatori trascrizionali, stimolando la trascrizione de gene
adiacente, che come repressori trascrizionali, inibendone la trascrizione. Gli attivatori
trascrizionali hanno la funzione di legare specifiche regioni regolative all’interno del DNA
e iniziare il reclutamento di un gran numero di complessi proteici che determinano la
reale trascrizione del gene.

Il controllo della trascrizione genica è un processo complesso influenzato da molte variabili, tra
cui l’affinità dei fattori di trascrizione per particolari sequenze del DNA e la capacità da parte
dei fattori di trascrizione legati a sequenze vicine del DNA, di interagire tra di loro. La regione
regolativa di un gene pu essere immaginata come un centro di integrazione per l’espressione di
quel gene. Cellule esposte a stimoli diversi rispondono sintetizzando differenti fattori di
trascrizione, che si legano a differenti siti sul DNA. Il grado di trascrizione di un determinato
gene dipende dalla particolare combinazione di fattori di trascrizione che si legano agli
elementi di regolazione a monte di quel gene.
Esiste un numero praticamente illimitato di possibili combinazioni nell’interazione fra queste
proteine.

Le cellule staminali hanno un particolare corredo di fattori di trascrizione, che sono necessari
per mantenere il loro stato pluripotente e autorinnovante.
Le cellule staminali embrionali (ES) compaiono molto precocemente durante lo sviluppo ed
inibiscono sia la capacità di auto-rinnovamento illimitato che la pluripotenza.
Sono quindi in grado di differenziare in tutti i diversi tipi cellulari del corpo.
Il processo di riprogrammazione della cellula non si completa nel giro di una singola generazione
cellulare, ma avviene gradualmente, mentre la cellula si divide in coltura. Non appena le cellule
vengono riprogrammate, i geni sono silenziati, mentre sono attivati geni endogeni che governano
la pluripotenza.
La riprogrammazione è accompagnata da una riorganizzazione della cromatina in modo tale che i
marcatori epigenetici (le modificazioni degli istoni e la metilazione del DNA) della cellula
differenziata vengano “cancellati” e siano installati i marcatori caratteristici della cellula ES.

Struttura dei fattori di trascrizione


I fattori di trascrizione contengono domini differenti che mediano aspetti diversi della funzione
della proteina. I fattori di trascrizione contengono in genere almeno due domini: un dominio di
legame al DNA, che lega una specifica sequenza di basi del DNA, e un dominio di attivazione,
che attiva la trascrizione interagendo con altre proteine.
Molti fattori di trascrizione contengono anche, una superficie che promuove il legame della
proteina con un’altra proteina con struttura identica o simile, così da formare un dimero. È
stato dimostrato che la formazione dei dimeri (fattore comune a tutti i fattori di trascrizione)
è importante nella regolazione dell’espressione genica.

I domini di legame al DNA della maggior parte dei fattori di trascrizione possono essere
raggruppati in diverse ampie classi i cui membri possiedono strutture (motivi) simili che
interagiscono con le sequenze del DNA. L’esistenza di diverse famiglie di proteine che legano il
DNA indica che l’evoluzione ha trovato differenti soluzioni al problema di costruire polipeptidi in
grado di legare la doppia elica del DNA.
La maggior parte di questi motivi contiene un segmento (in genere una α-elica) che è inserito nel
solco maggiore del DNA, dove riconosce la sequenza di coppie di basi che tappezzano il solco. Il
legame della proteina al DNA avviene mediante una specifica combinazione di forze di van der
walls, legami ionici e legami idrogeno che si stabiliscono fra i residui amminoacidi e le diverse
parti del DNA, compreso lo scheletro.
Fra i motivi più comuni presenti nelle proteine eucariotiche che legano il DNA, vi sono i
“zincfinger”, gli “helix-loop-helix”, i “leucine zipper”. Ciascuno di essi costituisce
un’impalcatura strutturale stabile, sulla quale le superfici della proteina, in grado di riconoscere
specificamente il DNA, possono essere correttamente posizionate per interagire con la doppia
elica.
- Motivo Zinc finger: motivo presente nella maggior parte dei fattori di trascrizione dei
mammiferi. Lo ione zinco di ciascun dito interagisce con due cisteine e due istidine.
Generalmente queste proteine hanno un certo numero di dita simili che agiscono in
maniera indipendente l’uno dall’altro e che sono distanziate fra loro in modo da
estendersi all’interno di solchi maggiori successivi nel DNA bersaglio.
- Motivo Helix-loop-helix (HLH): caratterizzato da due segmenti ad α-elica separati da
un’ansa interposta. Il dominio HLH è spesso preceduto da un tratto di amminoacidi
fortemente basici, le cui catene laterali cariche positivamente contattano il DNA e
determinano la specificità di sequenza del fattore di trascrizione. Le proteine contenenti
questo motivo bHLH (HLH basico) sono sempre presenti sotto forma di dimeri. Le due
subunità del dimero sono codificate da geni differenti, per cui la proteina è un
eterodimero. L’eterodimerizzazione aumenta la quantità di fattori di trascrizione diversi
che possono essere generati da un numero limitato di polipeptidi.
I fattori di trascrizione contenenti il motivo HLH sono importanti nel differenziamento di
alcuni tessuti, tra cui il muscolo scheletrico. Hanno anche un ruolo nel controllo della
proliferazione cellulare e sembrano essere implicati nella formazione di certi tipi di
tumori. Le traslocazioni cromosomiche possono generare geni anormali che pu portarle a
diventare cancerose. Geni codificanti per almeno quattro differenti proteine bHLH
(MYS, SCL, LYL-1 e E2A) sono stati identificati in traslocazioni cromosomiche che portano
allo sviluppo di specifici tipi di tumore. Il più diffuso è il linfoma di Burkitt, in cui il gene
MYCm localizzato sul cromosoma 8, è traslocato sul cromosoma 14, in un locus
contenente un sito di regolazione per un gene che codifica per parte di una molecola di
anticorpo.
- Motivo Leucine zipper: deve il suo nome al fatto che i residui di leucina sono presenti
ogni sette amminoacidi lungo un tratto ad α-elica. Due α-eliche di questo tipo sono in
grado di unirsi a formare una struttura avvolta a spirale nella quale le leucine di un’elica
sono vicine a quelle dell’altra elica, come in una cerniera. Perci le proteine con un
motivo leucine zipper esistono come dimeri. il motivo leucine zipper pu legare il DNA in
quanto esso contiene un tratto di amminoacidi basici presenti ad ogni lato della α-elica
contenente le leucine. Insieme, il segmento basico e la cerniera di leucine, formano un
motivo chiamato bZIP. Le porzioni ad α-elica delle proteine bZIP sono importanti per la
dimerizzazione, mentre il tratto adiacente di amminoacidi basici permette alla proteina
di riconoscere una specifica sequenza nucleotidica da parte del DNA AP-1.

Le sequenze di DNA coinvolte nel controllo della trascrizione


PEPCK è uno degli enzimi chiave della glucogenasi, la via metabolica che converte il piruvato in
glucosio. L’enzima viene sintetizzato nel fegato quando i livelli di glucosio sono bassi (tipo
quando trascorre troppo tempo tra un pasto e l’altro).
La sintesi dell’enzima viene poi bruscamente diminuita dopo l’ingresso di un alimento ricco in
carboidrati (tipo la pasta).
Il livello di sintesi dell’mRNA di PEPCK è controllato da diversi fattori di trascrizione, tra i quali
un buon numero di recettori per gli ormoni coinvolti nella regolazione del metabolismo dei
carboidrati.
La sequenza regolativa più vicina presente a monte del gene PEPCK è la TATA box, che è la
componente più importante del promotore del gene. Un promotore è la regione a monte di un
gene che ne regola l’inizio della trascrizione.
La regione del promotore che si estende approssimativamente dalla TATA box al sito di inizio
della trascrizione è chiamata core del promotore, che è il sito di assemblaggio del complesso di
pre-inizio, costituito dall’RNA polimerasi II e da una serie di fattori di trascrizione generali
necessari affinché un gene eucariotico possa essere trascritto.
Oltre la TATA box, sono presenti altre due sequenze promotrici, chiamate CAT box e GC box,
localizzate ancora più a monte del gene. Queste sono spesso necessarie ad una polimerasi per
iniziare la trascrizione del gene stesso. La CAAT e la GC box legano fattori di trascrizione (come
NF1 e SP1) presenti in molti tessuti ed ampiamenti convolti nell’espressione genica. CAAT e GC
box regolano la frequenza con cui la polimerasi trascrive il gene.
TATA, CAAT e GC box sono generalmente localizzate entro 100-150 coppie di basi a monte del
sito di inizio della trascrizione e per questa vicinanza possono essere definite elementi
prossimali del promotore.
Un numero significativo di geni di mammifero (forse il 50%) possiede più di un promotore
(promotori alternativi) che permettono l’inizio della trascrizione in siti diversi a monte di un
gene. I promotori alternativi sono in genere separati tra loro da molte basi in modo che i
trascritti primari prodotti dal loro uso differenziale siano notevolmente diversi nelle loro
estremità 5’. In alcuni casi, i promotori alternativi sono utilizzati in tessuti diversi, ma portano
alla sintesi dello stesso polipeptide. In altri casi, i promotori alternativi determinano la sintesi di
proteine correlate che differiscono nella sequenza amminoacidica N-terminale. In un certo
numero di casi, i promotori alternativi dirigono la trascrizione di mRNA che sono tradotti con
differenti quadri di lettura per produrre polipeptidi completamente diversi.
I ricercatori riescono a comprendere quali regioni del genoma interagiscono con un particolare di
trascrizione tramite diverse tecniche, come:
- Mappatura per delezione. viene determinata la capacità della cellula di trascrivere il DNA
transfettato.
- DNA footprinting. quando un fattore di trascrizione si lega ad una sequenza di DNA, esso
protegge tale sequenza dalla digestione con nucleasi. Dopo che la cromatna è stata
degradata, la proteina legata viene rimossa e vengono identificate le sequenze di DNA
protette.
- Analisi di localizzazione sull’intero genoma. Permette ai ricercatori di monitorare
simultaneamente tutti i siti del genoma che svolgono una particolare attività. L’obiettivo
è di identificare tutti i siti che sono legati da un dato fattore di trascrizione in una certa
condizione fisiologica.

Quando questi esperimenti sono condotti con fattori di trascrizione di mammiferi, una
percentuale significativa dei siti di legame sul DNA è localizzata a distanza considerevole dai
promotori genici noti. Si ipotizza che alcuni di questi siti siano coinvolti nella regolazione della
trascrizione di RNA non codificanti, come i microRNA.

Tra i diversi ormoni che influenzano l’espressione del gene PEPCK vi sono l’insulina, l’ormone
tiroideo, il glucagone e i glucocorticoidi. Tutti questi ormoni svolgono la loro azione attraverso
specifici fattori di trascrizione che legano il DNA. I siti in cui questi fattori di trascrizione legano
le regioni fiancheggianti il gene PEPCK sono chiamati lementi di risposta.
I glucocorticoidi sono un gruppo di ormoni steroidei (come il cortisolo) sintetizzati dalla
ghiandola surrenale. La secrezione dei glucocorticoidi è maggiore nelle situazioni di stress, come
quella che si ha durante il digiuno prolungato o in seguito ad un grave trauma fisico. Per poter
rispondere ai glucocorticoidi, una cellula deve possedere uno specifico recettore in grado di
legare l’ormone. Il recettore per i glucocorticoidi (GR) fa parte di una famiglia di recettori
nucleari e i membri di questa famiglia agiscono anche come fattori di trascrizione che legano il
DNA. Quando un ormone glucocorticoide entra in una cellula bersaglio, esso si lega ad una
proteina citosolica che agisce da recettore per i glucocorticoidi e ne cambia la conformazione
comportando l’esposizione di un segnale di localizzazione nucleare che facilita la traslocazione
del recettore nel nucleo.
Il recettore con l’ormone attaccato si lega ad una specifica sequenza del DNA, chiamata
elemento di risposta ai glucocorticoidi (GRE) localizzata a monte del gene PEPCK, attivando così
la trascrizione di questo gene. L’aumento nei livelli di PEPCK promuove la conversione degli
amminoacidi in glucosio. La stessa sequenza GRE è presente a monte di diversi geni su differenti
cromosomi. Di conseguenza, un singolo stimolo pu attivare simultaneamente tutti i geni
necessari per una risposta completa allo stress.
Gli elementi di risposta ai glucocorticoidi consistono di una sequenza simmetrica detta
palindromo perché i due filamenti hanno la stessa sequenza 5’ – 3’.
5’ – AGAACAnnnTGTTCT – 3’
3’ – TCTTGTnnnACAAGA – 5’
Il GRE consiste di due tratti definiti di nucleotidi separati da tre nucleotidi casuali.

Il GRE e altri elementi di risposta vengono considerati parte del promotore come elementi distali
del promotore.
L’espressione della maggior parte dei geni è anche controllata da elementi di DNA ben più
distanti, chiamati enhancer (intensificatori). Un enhancer si estende per circa 200 coppie di basi
e contiene siti di legame multipli per attivatori per attivatori trascrizionali sequenza-specifici.
Spostando gli enhancer da una zona all’altra del DNA o ruotandoli di 180° non si creano
interferenze con la capacità dei fattori di trascrizione ad essi legati di stimolare la trascrizione.
La rimozione di un enhancer pu far diminuire il fattore di trascrizione di 100 volte o più.
Enhancer diversi tipicamente legano gruppi differenti di fattori di trascrizione e rispondono
indipendentemente a stimoli di tipo diverso.
Sebbene gli enancer e i promotori possano essere separati da n gran numero di nucleotidi, si
ritiene che gli enhancer stimolino la trascrizione influenzando eventi che si verificano nel core
del promotore. Enhancer e core del promotore possono essere in posizione molto vicina grazie
alla capacità del DNA posto tra i due, di formare un’ansa. Il DNA pu formare un’ansa grazie
all’interazione delle proteine ad esso legate.
Un promotore ed i suoi enhancer sono isolati da alti elementi promotore/enhancer, mediante
specifiche sequenze di confine, chiamate insulator (isolatori).
Un attivatore trascrizionale legato ad un enhancer è in grado di stimolare l’inizio della
trascrizione a livello del promotore mediante l’aiuto di intermediari chiamati coattivatori. I
coattivatori sono grossi copmlessi che consistono di numerose subunità e possono essere distinti
in due principali gruppi funzionali:
1) Quelli che interagiscono con i componenti dell’apparato trascrizionale di base (i fattori di
trascrizione generali e l’RNA polimerasi II);
2) Quelli che agiscono sulla cromatina, convertendola da uno stato che è relativamente
inaccessibile all’apparato trascrizionale ad uno stato che è molto più disponibile alla
trascrizione .
Questi diversi tipi di coattivatori operano insieme in modo coordinato per attivare la trascrizione
di particolari geni in risposta a specifici segnali intracellulari.
Ciascun complesso di coattivatori opera in collegamento con un’ampia varietà di fattori di
trascrizione differenti.
1.Coattivatori che interagiscono con l’apparato trascrizionale di base
La trascrizione avviene attraverso il reclutamento e successiva cooperazione di grossi complessi
proteici .
Il TFIID, uno dei GTF necessari per l’inizio della trascrizione è costituito da una dozzina o più di
subunità differenti, chiamate TAF. Sembra che alcuni fattori di trascrizione influenzano eventi
che si verificano nel core del promotore mediante l’interazione con una o più subunità di TFIID.
Un altro coattivatore che comunica direttamente sia con i fattori di trascrizione legati ad
enhancer che con l’apparato trascrizionale di base è chiamato Mediatore (Mediator), che è un
enorme complesso formato da molte subunità, che interagisce direttamente con la RNA
polimerasi II. Il Mediatore è richiesto da un’ampia varietà di attivatori trascrizionali e pu essere
un elemento essenziale nella trascrizione della maggior parte i geni codificanti proteine.
2.Coativatori che alterano la struttura della cromatina
Nel nucleo di una cellula eucariotica il DNA non è nudo, ma è impacchettato attorno a ottameri
istonici a formare i nucleosomi.
Una volta legato al DNA, l’attivatore recluta un coattivatore in una regione della cromatina
destinata ad essere trascritta. Dopo essersi legato alla regione bersaglio, il coattivatore
determina l’acetilazione degli istoni del core dei nucleosomi vicini, creando così un sito di
legame per un complesso di rimodellamento della cromatina. L’azione combinata di questi
diversi complessi aumenta l’accessibilità del promotore ai componenti dell’apparato di
trascrizione, che si assembla sul sito in cui la trascrizione dovrà essere avviata.
Nota: I gruppi acetile vengono aggiunti a specifici residui di lisina degli istoni del core ed opera
di una famiglia di enzimi chiamati istone acetiltransferasi (HAT o KAT). Gli HAT agiscono quindi
modificando le code istoniche.
I complessi di rimodellamento della cromatina sono complessi che utilizzano l’energia rilasciata
dall’idrolisi dell’ATP per alterare la struttura della cromatina e consentire il legame dei fattori
di trascrizione ai siti di regolazione nel DNA. La macchina di rimodellamento della cromatina più
studiata sono i membri della famiglia SWI/SNF. I complessi SWI/SNF sono costituiti da 9-12
subunità, inclusa l’actina o sue proteine correlate. È stato proposto che l’actina potesse legare i
complessi di rimodellamento alla matrice nucleare. I complessi SWI/SNF vengono reclutati su
specifici promotori in diversi modi e una volta reclutati sul promotore, si ritiene che i complessi
di rimodellamento della cromatina rompano le interazioni fra istoni e DNA in modo da :
- promuovere la mobilità dell’ottamero istonico, così che possa scorrere lungo il DNA
localizzandosi in nuove posizioni
- cambiare la conformazione del nucleosoma rendendo quel sito più accessibile per il
legame da parte di proteine regolative
- facilitare la sostituzione all’interno dell’ottamero istonico di un istone standard del core
con una variante istonica che è correlata ad un’attiva trascrizione. - Dislocare
completamente l’ottamero istonico dal DNA.

Gli studi sulle cellule di lievito suggeriscono che la maggior parte dei geni condivide la stessa
struttura cromatinica e i nucleosomi non sono distribuiti casualmente lungo il DNA ma sono
ordinatamente posizionati. La regione libera da nucleosomi che fiancheggia il promotore
rappresenta probabilmente un fattore importante nel permettere l’accesso a queste regioni del
DNA da parte dei fattori regolativi.
Le regioni promotore della cromatina sono il bersaglio di un’ampia varietà di molecole tra cui gli
enzimi che modificano gli istoni e i complessi che rimodellano la cromatina.

Attivazione della trascrizione da parte delle polimerasi pronte all’azione


Le RNA polimerasi risultano legate anche ai promotori di molti geni che non sono in via di
trascrizione. Un RNA polimerasi situata su uno di questi geni “trascrizionalmente silenti” di fatto
inizia la sintesi della molecola di RNA, ma non riesce a passare alla fase di allungamento della
trascrizione e quindi il trascritto primario completo non viene mai prodotto. Le polimerasi
associate con questi geni trascrizionalmente silenti si possono pensare come ai blocchi di
partenza e pronte all’azione, ma in attesa di qualche evento regolativo ulteriore che le spinga
verso la fase produttiva nella quale il gene viene completamente trascritto.
Secondo un modello, le molecole di RNA polimerasi situate a valle dei promotori sono mantenute
in uno stato non produttivo (o di pausa) dal legame con fattori inibitori; l’inibizione è quindi
abrogata dalla fosforilazione di questi fattori da parte di chinasi. Questi studi hanno indicato che
la regolazione dell’espressione genica a livello della fase di allungamento della trascrizione
possa giocare un ruolo importante nel facilitare l’attivazione rapida di geni in risposta a segnali
di sviluppo o ambientali.

REPRESSIONE DELLA TRASCRIZIONE


Il controllo della trascrizione nelle cellule procariotiche si basa soprattutto sui repressori, cioè
su proteine che legano il DNA e bloccano la trascrizione del gene vicino.
Lo stato di acetilazione della cromatina è una proprietà dinamica; così come esistono enzimi
(HAT) che aggiungono gruppi acetile, esistono anche enzimi in grado di rimuoverli. La rimozione
dei gruppi acetile avviene ad opera degli enzimi chiamati istone deacetilasi (HDAC). Mentre gli
HAT sono associati con l’attivazione della trascrizione, gli HDAC sono associati con la repressione
della trascrizione. Gli HDAC sono presenti come subunità di complessi più grandi, chiamati
corepressori, che sono simili ai coattivatori, tranne per il fatto che essi sono reclutati su
specifici loci genici da fattori trascrizionali che determinano la repressione del gene bersaglio.
La progressione di molti tipi di cancro potrebbe dipendere dalla capacità delle cellule tumorali
di inibire l’attività di alcuni geni. un certo numero di farmaci anti-cancro agiscono inibendo gli
enzimi HDAC.
Studi recenti indicano che la rimozione dei gruppi acetile dalle code istoniche è accompagnata
da un’altra modificazione degli istoni: la metilazione del residuo di lisina in posizione #9 nelle
molecole di istone H3. Questa modificazione (H3K9me) è un evento chiave nella formazione
dell’eterocromatina e sembra che sia anche coinvolta in una repressione trascrizionale di tipo
più dinamico che avviene all’interno delle regioni eucromatiche del genoma.

Metilazione del DNA


I gruppi metile vengono aggiunti al DNA da una piccola famiglia di enzimi, chiamati DNA
metiltransferasi, codificati nell’uomo dai geni DNMT. Questa semplice modificazione chimica
serve come “etichetta” che consente ad alcune regioni del DNA di essere identificate ed
utilizzate in modo differente rispetto alle altre.
La maggior parte dei residui di metilcitosina presenti nel DNA è localizzata all’interno di
sequenze ripetute non codificanti, principalmente elementi trasponibili. Si ritiene che la
metilazione mantenga tali elementi in uno stato inattivo. Gli organismi che presentano DNMT
mutate tendono a mostrare una maggiore attività dei trasposoni, cosa che pu essere dannosa
per la salute dell’organismo.
La metilazione del DNA a livello delle regioni promotore è generalmente correlata alla
repressione genica. La metilazione del DNA serve più per mantenere un gene in uno stato
inattivo piuttosto che come meccanismo per l’inattivazione iniziale.
Il mantenimento dello stato represso è mediato da una classe di proteine, come MeCP2, che si
lega ai dinucleotidi CpG metilati presenti nelle regioni regolative chiave a monte dei geni.
Queste proteine si legano ai siti metilati del DNA e quindi reclutano dei complessi corepressori
con associate attività HDAC e SUV39H1. Questi enzimi agiscono sugli istoni rimuovendo gruppi
acetile e metilando i residui H3K9, rispettivamente, modificazioni che portano al
comportamento della cromatina e alla repressione genica.
Secondo questo schema, la metilazione del DNA serve da guida per orchestrare un secondo tipo
di alterazione epigenetica, la modificazione degli istoni.
Quadri anomali di metilazione del DNA sono spesso associati a patologie, ad esempio lo sviluppo
di tumori dipende spesso dalla metilazione aberrante e dal conseguente silenziamento di geni la
cui espressione normalmente sopprimerebbe la crescita tumorale.
La metilazione del DNA è un etichetta epigenetica relativamente stabile, ma la sua trasmissione
da una cellula alle cellule figlie è soggetta a regolazione.
Il primo importante cambiamento nel livello di metilazione avviene tra la fecondazione e le
prime divisioni dello zigote, quando il DNA perde le etichette di metilazione ereditate dalla
generazione precedente. Quando l’embrione si impianta nell’utero un’onda di nuove metilazioni
si diffonde tra le cellule, stabilendo un nuovo schema di metilazione lungo tutto il DNA. Una
volta che è stato stabilito lo schema di metilazione del DNA in una cellula, si ritiene che esso
venga trasmesso al DNA della cellula figlia mediante un enzima (Dnmt1) che metila i nuovi
filamenti del DNA secondo lo schema di metilazione dei filamenti parentali.
La metilazione del DNA non è un meccanismo universale per l’inattivazione dei geni eucariotici.
Un esempio dell’importanza del ruolo della metilazione nel silenziamento dell’espressione
genica si ha durante un processo epigenetico noto come imprinting genomico, un fenomeno
peculiare dei mammiferi.

Imprinting Genomico: l’imprinting pu essere considerato un fenomeno epigenetico, poiché le


differenze tra gli alleli sono ereditarie da un genitore o dall’altro, ma non sono basate su
differenze nella sequenza del DNA. Si ritiene che il genoma dei mammiferi contenga almeno 80
geni sottoposti ad imprinting e localizzati in diversi gruppi cromosomici.
Si ritiene che i geni diventino “imprinted” come risultato di una metilazione selettiva del DNA di
uno dei due alleli. Lo stato di metilazione dei geni imprinted non è modifcato dall’onda di
demetilazione e rimetilazione che si diffonde nell’embrione precoce. Di conseguenza, gli stessi
alleli che sono inattivi a causa dell’imprinting nelle uova fecondate saranno inattivi nelle cellule
del feto e nella maggior parte dei tessuti dell’adulto. Nelle cellule germinali, l’imprinting
ereditato dai genitori viene eliminato durante lo sviluppo precoce e poi ristabilito quando
l’individuo produce i propri gameti.
Devono esistere quindi, dei meccanismi mediante i quali specifici geni vengono selezionati per
l’inattivazione durante la formazione degli spermatozoi, mentre altri geni sono selezionati per
l’inattivazione durante la formazione degli oociti. Ciascuno dei gruppi genici imprinted produce
almeno un RNA non codificante. Questi RNA giocano un ruolo chiave nel controllare il
silenziamento dei geni vicini, codificanti proteine, in parecchi dei gruppi genici.
Alterazioni nello schema di imprinting sono state associate ad un certo numero di malattie
genetiche umane rare, in particolare quelle che coinvolgono un gruppo di geni imprinted
localizzati sul cromosoma 15, ad esempio la Sindrome di Prader-Willi (PWS), una malattia
neurologica ereditaria caratterizzata da ritardo mentale, obesità ed ipogonadismo. Questa
patologia spesso scompare quando il cromosoma 15 di origine paterna porta una delezione in
una piccola regione contenente i geni imprinted.
Sebene i geni siano generalmente imprinted per tutta la vita di un individuo, si conoscono casi in
cui l’imprinting pu essere perso.

CONTROLLO A LIVELLO DELLA MATURAZIONE DELL’RNA


Lo splicing alternativo regola l’espressione genica a livello della maturazione dell’RNA e fornisce
un meccanismo mediante il quale un singolo gene pu codificare per due o più proteine fra loro
correlate.
In molti casi esiste più di una via mediante la quale un certo trascritto primario pu essere
sottoposto a splicing. La particolare via di maturazione utilizzata pu dipendere dallo specifico
stadio di sviluppo o dallo specifico tipo cellulare o tessuto presi in considerazione. Nel caso più
semplice un particolare segmento pu essere eliminato dal trascritto oppure mantenuto come
parte dell’mRNA finale, sulla base dello specifico sistema di regolazione che opera nella cellula.
Nella maggior parte dei casi, le proteine prodotte da un certo gene mediante splicing alternativo
sono identiche per gran parte della loro lunghezza, ma differiscono per regioni chiave che
possono influire su proprietà importanti, come la loro localizzazione cellulare, il tipo di substrati
che esse possono legare o la cinetica delle loro attività catalitiche. Diversi fattori di trascrizione
vengono prodotti da geni che possono andare incontro a splicing alternativo, producendo così
varianti che possono determinare la via differenziativa intrapresa dalla cellula.
Lo splicing alternativo pu anche diventare molto complesso, permettendo un’ampia varietà di
differenti combinazioni dei possibili esoni dell’mRNA finale. Il meccanismo mediante il quale un
particolare esone viene incluso o escluso dipende soprattutto dal fatto che uno specifico sito di
splicing al 3’ o al 5’ venga riconosciuto dall’apparato di splicing come un sito da tagliare. Ci sono
molti fattori che possono influenzare la selezione di un sito come sito di splicing. Alcuni siti di
splicing sono stati descritti come deboli, il che indica che in determinate condizioni essi possono
essere aggirati dall’apparato di splicing.
Il riconoscimento e l’uso di siti di splicing deboli sono regolati da sequenze nell’RNA, inclusi gli
enhancer esonici di splicing, localizzati all’interno degli esoni la cui inclusione è regolata. Gli
enhancer esonici di splicing servono come siti di legame per specifiche proteine regolative. Se
una particolare proteina regolativa viene prodotta ed è attiva in una data cellula, tale proteina
potrà legare l’enhancer di splicing e reclutare i fattori di splicing necessari al 3’ o al 5’ del
vicino sito debole di splicing.
L’uso di questi siti di splicing determina l’inclusione dell’esone dell’mRNA.
Se la proteina regolativa non è presente ed attiva nella cellula, i siti di taglio vicini non vengono
riconosciuti e l’esone viene eliminato insieme agli introni che la fiancheggiano.
Lo splicing alternativo è difficile da studiare e si stima che più del 70% dei geni umani sia soggtto
a splicing alternativo.
Lo splicing alternativo ha la potenzialità di generare un vasto numero di polipeptidi correlati a
partire da un singolo gene.
Studi recenti suggeriscono che certi geni coinvolti nella funzione nervosa possono essere
sottoposti ad uno splicing alternativo molto esteso.

Editing dell’mRNA: un altro modo in cui la trascrizione genica pu essere regolata a livello
posttrascrizionale è attraverso le modificazioni (editing) dell’mRNA, che comportano il
cambiamento di uno specifico nucleotide in un altro, dopo che l’RNA è stato trascritto. Queste
modificazioni possono creare nuovi siti di splicing, generare codoni di stop o portare a
sostituzioni amminoacidiche. L’editing dell’RNA è particolarmente importante nel sistema
nervoso, dove un certo numero di messaggi mostrano una o più adenine (A) convertite in inosine
(I). Questa modificazione si basa sulla rimozione enzimatica di un gruppo amminico dal
nucleotide. L’Inosina è successivamente letta come una G (glutammato) dall’apparato di
traduzione. Il recettore del glutammato (che media la trasmissione delle sinapsi eccitatorie nel
cervello) è un prodotto dell’editing dell’RNA. La modificazione di A in I genera un recettore del
glutammato il cui canale interno è impermeabile agli ioni Ca²⁺.

CONTROLLO A LIVELLO DELLA TRADUZIONE


Il controllo a livello traduzionale comprende un’ampia varietà di meccanismi di regolazione che
agiscono sulla traduzione degli mRNA già trasportati dal nucleo al citoplasma. Fra i processi
inclusi in questo ambito di controllo vi sono:
1. La localizzazione degli mRNA in determinate parti della cellula
2. Se e quanto spesso un mRNA debba essere tradotto
3. La stabilità (emivita) dell’mRNA, una proprietà che determina per quanto tempo debba
essere tradotto.
I meccanismi di controllo a livello della traduzione generalmente operano tramite interazioni fra
specifici mRNA, varie proteine e microRNA presenti nel citoplasma. Gli mRNA contengono dei
segmenti non codificanti alle estremità 5’ e 3’, chiamati regioni non tradotte (UTR). Il segmento
5’-UTR si estende dal cappuccio di metilguanosina presente all’inizio dell’mRNA fino al codone
di inizio AUG, mentre il segmento 3’-UTR si estende dal codone di stop presente alla fine della
regione codificante fino alla coda poli(A) che viene aggiunta a quasi tutti gli mRNA eucariotici.
Le regioni UTR contengono sequenze nucleotidiche usate dalla cellula per attuare il controllo a
livello della traduzione.

Localizzazione citoplasmatica degli mRNA


La localizzazione di specifici mRNA in specifiche regioni del citoplasma è il più diffuso
meccanismo attraverso il quale le cellule stabiliscono domini citoplasmatici funzionalmente
distinti.
L’informazione che controlla la localizzazione citoplasmatica di un mRNA si trova nella regione
3’-UTR, ed è mediata da proteine che legano l’RNA e riconoscono sequenze di localizzazione
(zip-codes) presenti in questa regione del mRNA.
I microtubuli e le proteine motrici che usano i microtubuli come binari, giocano un ruolo chiave
nel trasporto delle particelle contenenti gli mRNA in precisi siti della cellula.
Si ritiene inoltre che i microfilamenti ancorino gli mRNA dopo che questi hanno raggiunto la loro
destinazione. La localizzazione degli mRNA avviene in tutti i tipi di cellule polarizzate. Ad
esempio, gli mRNA dell’actina sono localizzati vicino al margine guida di un fibroblasto in
movimento, che rappresenta il sito in cui le molecole di actina sono richieste per la
locomozione.
Durante il processo di localizzazione, la traduzione degli mRNA viene specificatamente inibita da
proteine associate.

Controllo della traduzione dell’mRNA


Molti importanti processi biologici dipendono da mRNA che sono stati sintetizzati
precedentemente e immagazzinati nel citoplasma in uno stato inattivo. Uno di questi è lo
sviluppo precoce di un embrione animale. Gli mRNA immagazzinati in un uovo non fecondato
rappresentano gli stampi per proteine che verranno sintetizzate durante i primi stadi dello
sviluppo e non vengono invece utilizzati dall’uovo. Gli RNA inattivi che sono immagazzinati in un
uovo hanno generalmente code di poli(A) accorciate.
L’inizio della traduzione di questi mRNA durante le prime fasi di sviluppo, coinvolge almeno due
eventi distinti: la rimozione di proteine inibitorie legate e l’aumento in lunghezza della coda di
poli(A), grazie ad un enzima presente nel citoplasma dell’uovo.
Sono stati identificati diversi meccanismi che regolano la frequenza di traduzione degli mRNA in
risposta al variare delle richieste cellulari. Alcuni di questi possono essere considerati ad ampio
spettro, perché influenzano la traduzione di tutti gli mRNA.
Quando una cellula umana è sottoposta a particolari condizioni di stress, viene attivata una
chinasi che fosforila il fattore di inizio eIF2, bloccando ogni ulteriore sintesi proteica. eIF2-GTP
recapita il tRNA iniziatore alla subunità minore del ribosoma, dopodiché viene convertito in
eIF2-GDP e rilasciato. La forma fosforilata di eIF2 non è in grado di scambiare il suo GDP con il
GTP, evento necessario affinchè eIF2 venga utilizzato per un nuovo ciclo di inizio della
traduzione.
Sono state identificate quattro differenti chinasi in grado di fosforilare lo stesso residuo di serina
della subunità eIF2α, evento necessario per inibire la traduzione. Ciascuna di queste chinasi
viene attivata da un diverso tipo di stress cellulare come shock termico, infezione virale ecc.
Diversi tipi di stress convergono inducendo lo stesso tipo di risposta.
Altri meccanismi agiscono alterando la frequenza di traduzione di mRNA specifici attraverso
l’azione di proteine che riconoscono elementi caratteristici nelle UTR di quei mRNA.

Controllo della stabilità dell’mRNA


Più a lungo un mRNA è presente in una cellula, più volte esso potrà servire da stampo per la
sintesi di un polipeptide.
Regolare la sopravvivenza di un mRNA diventa tanto importante quanto regolarne la sintesi.
La maggior parte degli mRNA eucariotici ha una vita relativamente lunga (al contrario di quelli
procariotici). L’emivita degli mRNA eucariotici è abbastanza variabile.
Specifici mRNA possono essere riconosciuti dall’apparato di controllo della cellula ed essere
sottoposti a trattamenti diversi.
In uno dei primi esperimenti venne dimostrato che gli mRNA privi di una coda di poli(A) erano
rapidamente degradati subito dopo l’iniezione in una cellula ospite, mentre gli stessi mRNA, ma
con una coda di poli(A), erano relativamente stabili. Questo suggerì che la stabilità di un mRNA è
correlata alla lunghezza della sua coda di poli(A).
Quando esce dal nucleo, un tipico mRNA contiene una coda di poli(A) di circa 200 residui di
adenosina (passaggio1). Mentre un mRNA permane nel citoplasma, la sua coda si riduce
gradualmente in lunghezza poiché viene rosicchiata da una deadenilasi. Si iniziano ad osservare
effetti sulla stabilità dell’mRNA quando la coda si riduce a circa 30 residui (passaggio 2)
portando a una degradazione dell’mRNA che avviene in due possibili vie:
1. La degradazione dell’mRNA inizia alla sua estremità 5’, dopo la rimozione della corta
coda di poli(A) all’estremità 3’ del messaggero. Una volta che la coda al 3’ è stata
rimossa (passaggio 3), l’mRNA viene privato del cappuccio al 5’ (passaggio 4) e quindi
degradato a partire dall’estremità 5’ verso l’estremità 3’ (passaggio5). La
deadenilazione, l’eliminazione del cappuccio e la degradazione 5’  3’ avviene
all’interno di piccoli granuli citoplasmatici transitori chiamati corpi di maturazione
(Pbodies). I P-bodies distruggono mRNA non voluti e possono anche funzionare da
depositi temporanei per mRNA che non devono essere tradotti.
2. Nella via alternativa, dopo la rimozione della coda di poli(A) (passaggio 3a), la
degradazione dell’mRNA continua all’estremità 3’ (passaggio 4°). La digestione
dell’mRNA in direzione 3’  5’ è effettuata da un’esonucleasi che fa parte di un
complesso chiamato esosoma.
La longevità di un mRNA non è soltanto basata sulla lunghezza della coda di poli(A), in quanto
molecole di mRNA con emivite molto diverse hanno inizialmente code di dimensioni simili. Si è
dimostrato che differenze nella sequenza nucleotidica della regione 3’-UTR hanno un ruolo
importante nel determinare la velocità con cui la coda di poli(A) viene accorciata.

Il ruolo dei microRNA nel controllo a livello della traduzione


Oltre alle proteine, anche gli miRNA agiscono principalmente legandosi alle sequenze 3’-UTR dei
loro mRNA bersaglio. A livello della traduzione, i miRNA regolano praticamente tutti i processi
biologici.
Anche gli stadi più precoci dello sviluppo embrionale richiedono il coinvolgimento dei miRNA. Il
modo migliore per studiare il ruolo di uno specifico miRNA in un processo biologico è quello di
interferire con la sua produzione mediante la mutazione o la delezione del gene che lo codifica;
questi studi suggeriscono che i miRNA controllano l’espressione di batterie di geni che sono
coinvolti in diverse vie di differenziamento cellulare.
Due membri della classe di miRNA chiamata miR-1, svolgono importanti funzioni nello sviluppo
nel tessuto muscolare. La delezione di uno di questi nell’embrione porta a gravi difetti nello
sviluppo del cuore.
Questi stessi miRNA sono stati anche implicati in patologie cardiache che insorgono nell’uomo in
età adulta. Pazienti che hanno subito un attacco cardiaco e sviluppano successivamente
anomalie elettrofisiologiche, hanno in genere elevati livelli di miR-1 nel loro tessuto cardiaco. I
miRNA esercitano la loro funzione regolativa probabilmente attraverso molti meccanismi,
influenzando sia la traduzione che la stabilità dell’mRNA:
- Alcuni studi indicano che i miRNA passono inibire la sintesi delle proteine in qualche
momento dopo che l’inizio della traduzione è avvenuto. Alcune evidenze suggeriscono
che il RISC (complesso miRNA-proteina Argonauta) legato all’mRNA determini il
prematuro distacco dei ribosomi impegnati nella fase di allungamento, mentre altre
evidenze indicano RISC come il responsabile della degradazione del polipeptide
neosintetizzato.
- Altri studi suggeriscono che il complesso RISC legato all’mRNA interferisca con la fase di
inizio della traduzione. Altri dati invece suggeriscono che RISC non permette il legame
tra le subunità ribosomali maggiore e minore, anch’esso richiesto per l’inizio della
traduzione.
- Ulteriori ricerche hanno suggerito che alcuni miRNA svolgano un controllo a livello
traduzionale, determinando la degradazione dell’mRNA bersaglio.
CONTROLLO POST-TRADUZIONALE: REGOLAZIONE DELLA STABILITA’ DELLE PROTEINE Le
cellule hanno degli elaborati meccanismi per controllare la velocità con cui le proteine
vengono sintetizzate. Le cellule possiedono anche dei meccanismi che controllano il tempo di
sopravvivenza delle proteine, una volta che esse sono diventate completamente funzionali. La
degradazione delle proteine cellulari è svolta da macchine a forma di cilindri cavi, dette
proteasomi, presenti sia nel nucleo che nel citoplasma delle cellule.
I proteasomi sono costituiti da quattro subunità polipeptidiche a forma di anello, impilate l’una
sull’altra e con un cappuccio attaccato a ciascuna estremità. I due anelli centrale sono costituiti
da polipeptidi (subunità β) che agiscono come enzimi proteolitici. I siti attivi di queste subunità
si affacciano verso la parte centrale del complesso, dove la digestione proteolitica pu avvenire
in un ambiente protetto.
I proteasomi digeriscono proteine che sono state selezionate e marcate per essere eliminate.
Alcune proteine vengono selezionate in quanto riconosciute anormali (ripiegate male o associate
male).
Tra queste, ci sono le proteine anormali prodotte dai ribosomi associati alla membrana del RER.
Alcune proteine, come gli enzimi della glicolisi o le molecole di globina di un eritrocita,
permangono per giorni o settimane.
Altre proteine, necessarie per una specifica attività transitoria, come le proteine regolative che
iniziano la replicazione del DNA o avviano la divisione cellulare, possono sopravvivere solo pochi
minuti. La distruzione di queste proteine chiave da parte dei proteasomi gioca un ruolo cruciale
nella progressione dei processi cellulari.
L’importanza dei proteasomi nei processi della cellula pu anche essere dimostrato utilizzando
farmaci che inibiscono specificamente la digestione proteasomica.
I fattori che controllano la durata di vita di una proteina non sono ancora pienamente compresi.
Uno dei fattori principali è lo specifico amminoacido presente all’estremità N-terminale della
catena polipeptidica. Polipeptidi che terminano con l’arginina o la lisina hanno generalmente
emivite brevi.
Molte proteine che agiscono in determinati momenti del ciclo cellulare sono marcate per
l’eliminazione quando alcuni residui vengono fosforilati.
Esistono anche proteine che presentano una specifica sequenza amminoacidica interna,
chiamata degron, che garantisce il fatto che esse non sopravvivano a lungo nella cellula.
L’ubiquitina è una piccola proteina altamente conservata che svolge diverse funzioni in
differenti processi cellulari. Una singola ubiquitina legata funziona principalmente come segnale
di smistamento. Al contrario, le proteine che sono destinate ad essere distrutte vengono legate
da un certo numero di ubiquitine, attaccate l’una all’altra a formare una catena di
poliubiquitina (passaggio 1). In questa prina fase l’ubiquitina è trasferita enzimaticamente da
una proteina carrier su un residuo di lisina della proteina da eliminare.
Enzimi che trasferiscono l’ubiquitina alle proteine bersaglio costituiscono la famiglia di
ubiquitina ligasi e giocanoun ruolo cruciale nel determinare la vita o la morte di proteine chiave.
Una volta poliubiquinata, la proteina viene riconosciuta dal cappuccio del proteosoma (passaggio
2) che rimuove la catena di ubiquitina e denatura la proteina bersaglio. Il polipeptide lineare
viene portato nella camera centrale del proteosoma attraverso il canale dell’anello (passaggio
3). Una volta nella camera centrale, la maggior parte delle cellule, viene digerita in piccoli
peptidi (passaggi 4 e 5).
I prodotti peptidici vengono quindi rilasciati nel citosol, dove sono degradati nelle loro unità
amminoacidiche.

REPLICAZIONE E RIPARAZIONE DEL DNA


Il materiale genetico si duplica per replicazione. Il meccanismo che le cellule usano per la
replicazione viene utilizzato anche per riparare il materiale genetico che ha subito dei danni. I
primi portatori dell’informazione genetica furono probabilmente delle molecole di RNA che
possedevano la capacità di autoduplicarsi. Con il progredire dell’evoluzione, le molecole di RNA
lasciarono il posto alle molecole di DNA, come materiale genetico, e il processo di duplicazione
divenne molto più complesso richiedendo l’intervento di elementi ausiliari. La molecola di DNA,
infatti, contiene l’informazione necessaria per la propria duplicazione ma manca della capacità
di realizzarla.
(il DNA ha bisogno della cellula).
REPLICAZIONE DEL DNA
I due filamenti a doppia elica sono tenuti insieme da legami idrogeno tra le basi. Presi
singolarmente, i legami idrogeno sono deboli e vengono facilmente rotti. Watson e Crick
ipotizzarono che la duplicazione avvenisse per separazione graduale dei due filamenti della
doppia elica, dovuta alla rottura in successione dei legami idrogeno, come le due metà di una
cerniera (ipotesi di autoduplicazione). I due filamenti sono complementari tra loro e ognuno di
essi contiene l’informazione necessaria per la costituzione dell’altro filamento. Una volta che
sono separati quindi, ognuno pu agire da stampo per dirigere l’assemblaggio dei nucleotidi
necessari per formare il filamento complementare e riportarsi alla condizione di doppia elica.

Replicazione semiconservativa
Il meccanismo di replicazione proposto da Watson e Crick conteneva alcune previsioni sul
comportamento del DNA durante la replicazione. Secondo queste ipotesi, ciascuna delle doppie
eliche figlie è composta da un filamento intero derivato dalla doppia elica parentale e da un
filamento completo di nuova sintesi. Questa è detta replicazione semiconservativa poiché ogni
doppia elica figlia riceve un filamento della struttura parentale.
In mancanza di alcune informazioni sul meccanismo di replicazione, si potevano prevedere altri
due tipi di replicazione
- Replicazione conservativa: i due filamenti rimangono insieme (dopo essere serviti da
stampo) e lo stesso succede ai due filamenti neosintetizzati. Una celle cellule figlie
quindi, conterrà solo la doppia elica originaria, mentre l’altra cellula figlia solo DNA di
nuova sintesi.
- Replicazione dispersiva: l’integrità dei filamenti parentali di DNA va persa. Il risultato è
che le due cellule figlie conterranno delle doppie eliche in cui ogni filamento è una
combinazione di DNA vecchio e nuovo, cioè non si conservano né i singoli filamenti né la
doppia elica.
Gli studi confermarono che la replicazione avviene secondo il sistema semiconservativo. Negli
eucarioti, dopo la replicazione, ogni cromosoma è costituito da due cromatidi.

Replicazione nelle cellule batteriche: il meccanismo di replicazione nelle cellule


batteriche è meglio conosciuto di quello degli eucarioti.
La replicazione inizia in un punto specifico sul cromosoma batterico, detto origine. L’origine di
replicazione sul cromosoma di E. coli è una sequenza, detta oriC, alla quale si legano numerose
proteine per dare inizio al processo di replicazione. Una volta iniziata, la replicazione procede a
partire dall’origine in entrambe le direzioni (è bidirezionale). I punti in cui la coppia di segmenti
replicati si incontra e si unisce ai segmenti non replicati sono chiamate forcelle di replicazione.
Ogni forcella di replicazione corrisponde ad un punto in cui:
1. la doppia elica parentale va incontro alla separazione dei filamenti
2. i nucleotidi vengono incorporati nei filamenti complementari neosintetizzati.
Le due forcelle di replicazione si muovono in direzione opposta fino ad incontrarsi dove termina
la replicazione. Le due nuove doppie eliche si staccano l’una dall’altra e vanno a finire in due
cellule diverse.

La separazione dei filamenti di una molecola di DNA circolare a doppia elica rappresenta uno dei
principali problemi. La separazione dei filamenti di una doppia elica è anche un processo di
srotolamento della struttura. La separazione dei due filamenti di una molecola di DNA circolare
è analoga alla condizione di una molecola lineare attaccata al muro: la tensione non pu essere
rilasciata dalla sua rotazione.
Il movimento della forcella di replicazione genera superavvolgimenti positivi nella porzione non
replicata del DNA a monte della forcella.
Le cellule contengono enzimi, chiamati topoisomerasi, che possono cambiare lo stato di
superavvolgimento in una molecola di DNA. Un enzima di questo tipo, chiamato DNA girasi
(topoisomerasi di tipo II) è in grado di eliminare lo stress torsionale che si genera durante la
replicazione.
Le molecole di DNA girasi si muovono lungo il DNA a monte della forcella di replicazione,
eliminando i superavvolgimenti positivi. La DNA girasi svolge questa attività tagliando ambedue i
filamenti del duplex di DNA, facendo passare dall’altra parte un segmento del DNA attraverso un
punto di rottura nel doppio filamento e quindi saldando le rotture, un processo guidato
dall’energia rilasciata dalla idrolisi dell’ATP.
Le cellule eucariotiche hanno enzimi simili che svolgono questa funzione.

DNA polimerasi: sono enzimi responsabili della sintesi di nuovi filamenti di DNA. Durante gli
studi si osserv che i filamenti di DNA aggiunti di partenza funzionavano da stampo per la
reazione di polimerizzazione.
Via via che le proprietà delle DNA polimerasi venivano scoperte, divenne chiaro che la
replicazione era più complessa di quanto non si pensasse. Si scoprì che il DNA stampo doveva
possedere determinate caratteristiche strutturali per far incorporare i precursori mancanti. Una
molecola di DNA a doppio filamento integra non era in grado di consentire l’incorporazione.
Questo non stupisce tenendo conto che i filamenti dell’elica devono essere separati perché
avvenga la replicazione.
Si scoprì presto che una molecola di DNA circolare a singolo filamento non pu essere utilizzata
come stampo per la DNA polimerasi perché l’enzima non è capace di iniziare la formazione di un
filamento di DNA, ma pu solo aggiungere nucleotidi all’estremità 3’ ossidrilica di un filamento
già esistente. Il filamento che fornisce all’enzima l’estremità 3’ OH è detto primer (innesco).
Tutte le DNA polimerasi (sia eucariotiche che procariotiche) hanno due necessità fondamentali:
un filamento di DNA stampo da copiare e un filamento primer a cui attaccare i nucleotidi.
Questo spiega il motivo per cui alcune strutture del DNA non sono in grado di promuovere la
sintesi del DNA. Una doppia elica lineare integra fornisce l’estremità 3’ OH ma non funziona
come stampo; viceversa, un filamento singolo circolare fornisce lo stampo ma manca di un
primer. La molecola parzialmente a doppia elica risponde a entrambe le condizioni e perci
promuove l’incorporazione nucleotidica.
Si studi allora come avesse inizio la sintesi di un nuovo filamento nella cellula. Il primo schema
presentato da Watson e Crick mostra che uno dei filamenti neosintetizzati viene polimerizzato in
direzione 3’  5’, mentre l’altro è polimerizzato in direzione opposta.
Durante gli anni ’60 emerse che l’enzima di Kornberg non fosse l’unica DNA polimerasi delle
cellule batteriche, ma si verific la presenza di DNA polimerasi III. Una cellula batterica contiene
300-400 molecole di DNA polimerasi I, ma solo 10 copie di DNA polimerasi III.

Replicazione semidiscontinua: la mancanza di attività di polimerizzazione in direzione 3’  5’ è


dovuta al fatto che i filamenti di DNA non possono essere sintetizzati in questa direzione.
Entrambi i filamenti neosintetizzati vengono quindi assemblati in direzione 5’  3’. Durante la
reazione di polimerizzazione, il gruppo OH all’estremità 3’ del primer effettua l’attacco
nucleofilico sul 5’α-fosfato del nucleoside trifosfato che deve essere inserito. Ambedue le
molecole di polimerasi responsabili della sintesi dei due nuovi filamenti di DNA si muovono
dall’estremità 3’ all’estremità 5’ lungo lo stampo, ed entrambe assemblano un filamento che si
allunga a partire dall’estremità 5’ – P. Di conseguenza uno dei filamenti neosintetizzati cresce in
direzione della forcella di replicazione a livello della quale i due filamenti di DNA si separano,
mentre l’altro filamento cresce in direzione opposta alla forcella.
Il filamento che cresce in direzione opposta alla forcella di replicazione viene sintetizzato in
modo discontinuo, cioè in frammenti. Prima che la sintesi del frammento inizi, la forcella di
replicazione si deve spostare per esporre un sufficiente tratto di stampo. Una volta iniziata la
sintesi, ogni frammento cresce allontanandosi dalla forcella di replicazione verso l’estremità 5 di
un frammento formato in precedenza, al quale viene successivamente legato. Come risultato i
due filamenti neosintetizzati delle doppie eliche figlie vengono sintetizzati con modalità molto
diverse.
Il filamento guida è quello che viene sintetizzato in modo continuo e continua via via che la
forcella di replicazione avanza.
Il filamento in ritardo è invece quello che viene sintetizzato in modo discontinuo e l’inizio della
sintesi di ogni suo frammento deve aspettare che i filamenti parentali si separino ed espongano
aggiuntive porzioni stampo. Entrambi i filamenti vengono comunque sintetizzati
contemporaneamente.
Visto che un filamento viene sintetizzato in modo continuo e l’altro in modo discontinuo, la
replicazione detta semidiscontinua.
Alcuni studi suggerivano che una parte di DNA veniva sintetizzata in piccoli frammenti
(frammenti di Okazawi), che venivano rapidamente legati a pezzi più lunghi precedentemente
sintetizzati. L’enzima responsabile del congiungimento dei frammenti di Okazaki in un filamento
continuo è detto DNA ligasi.

L’avvio non si deve a una DNA polimerasi ma ad un particolare tipo di RNA polimerasi, chiamato
primasi, che costruisce un piccolo primer composto di RNA e non di DNA. Anche il filamento
guida viene iniziato da una molecola di primasi. I corti RNA sintetizzati dalla primasi
all’estremità 5’ del filamento guida e dall’estremità 5’ di ciascun frammento di Okazaki servono
come primer per la sintesi del DNA da parte della DNA polimerasi.

La replicazione richiede molto più che una semplice incorporazione dei nucleotidi. Lo
srotolamento del duplex e la separazione dei filamenti necessitano dell’intervento di due tipi di
proteine che legano il DNA: una elicasi e le proteine che legano il DNA a singolo filamento
(SSB).
Le elicasi srotolano il duplex di DNA attraverso una reazione che richiede energia fornita
dall’idrolisi di ATP per muoversi lungo uno dei filamenti di DNA, e che consente di rompere i
legami idrogeno che tengono uniti i due filamenti, esponendo così lo stampo di DNA a singolo
filamento.
E. coli possiede almeno 12 diverse elicasi da usare in diversi contesti del metabolismo del DNA e
dell’RNA. Una di queste elicasi rappresenta uno dei principali meccanismi per lo srotolamento
del DNA durante la replicazione. L’elicasi DnaB è costituita da 6 subunità assemblate a formare
una proteina a forma di anello che circonda un singolo filamento di DNA. L’elicasi DnaB viene
prima posizionata sul DNA nel punto di origine della replicazione e quindi si muove in direzione
3’  5’ lungo il filamento stampo in ritardo, srotolando l’elica man mano che procede. Lo
srotolamento del DNA da parte dell’elicasi è coadiuvato dall’attacco delle proteine SSB ai
filamento di DNA separati. Queste proteine legano selettivamente il DNA a singolo filamento,
mantenendolo in uno stato disteso ed impedendo di riavvolgersi.
L’enzima primasi, ha il compito di iniziare la sintesi di ogni frammento di Okazaki. Nei batteri, la
primasi e l’elicasi si associano temporaneamente, formando un primosoma. L’elicasi si muove
lungo lo stampo del filamento in ritardo senza mai essere rilasciata dallo stampo durante tutto il
tempo in cui è presente la forcella di replicazione, aprendo il duplex. La primasi lega l’elicasi ad
intervalli regolari e sintetizza i brevi primer di RNA che quindi iniziano la sintesi dei frammenti
di Okazaki. Gli RNA primer vengono poi allungati come DNA da una DNA polimerasi III.
Esperimenti confermano l’ipotesi che la stessa molecola di DNA polimerasi III sintetizza
successivi frammenti del filamento in ritardo.
La molecola di polimerasi III viene riciclata dal sito in cui ha appena completato un frammento
di Okazaki al sito successivo, lungo lo stampo del filamento in ritardo. Successivamente la
polimerasi si lega al 3’ OH dell’RNA primer appena abbandonato dalla primasi ed inizia ad
incorporare desossiribonucleotidi sull’estremità del breve RNA.
La polimerasi III si muove da un sito all’altro “cavalcando” insieme con la DNA polimerasi che si
muove nella stessa direzione sullo stampo del filamento guida. Le due polimerasi quindi, anche
se si muovono in direzioni opposte lungo i rispettivi filamenti, lavorano insieme come se
facessero parte dello stesso complesso proteico.
Le due polimerasi collegate possono replicare entrambi i filamenti ripiegando ad ansa il DNA
stampo del filamento in ritardo, facendo in modo quindi che questo stampo assuma lo stesso
orientamento dello stampo del filamento guida. Questo meccanismo a sua volta permetterebbe
ad entrambe le polimerasi di muoversi insieme come parti di un unico sistema replicativo, senza
che venga violata la regola della direzione per la sintesi di un filamento di DNA.

DNA polimerasi: struttura e funzione


La DNA polimerasi III, l’enzima che opera nella formazione del filamento di DNA durante la
replicazione in E. coli è parte di un grande complesso chiamato oloenzima DNA polimerasi III o
replisoma. Una delle subunità non catalitiche dell’oloenima, detta pinza β, ha il compito di
mantenere la polimerasi associata al DNA stampo. Le DNA polimerasi (come le RNA polimerasi)
devono possedere due qualità in contrasto tra loro:
1) devono rimanere associate allo stampo per lunghi tratti per poter sintetizzare un
filamento complementare e continuo
2) non possono essere attaccate così saldamente da essere incapaci di spostarsi da un
nucleotide al successivo dello stampo.
Queste proprietà sono dovute a una coppia di subunità β che formano una struttura a ciambella
attraverso la quale passa la molecola di DNA. Le subunità β sono state descritte come una pinza
scorrevole, che permette all’enzima di spostarsi da un nucleotide al successivo senza
abbandonare lo stampo.
La polimerasi sul filamento guida resta legata ad una singola pinza β durante la replicazione.
L’assemblaggio della pinza β attorno al DNA richiede un caricatore della pinza a più subunità,
che è anche parte dell’oloenzima DNA polimerasi III. Quando è legato ATP, il caricatore si lega
ad una giunzione primer-stampo arrestando la pinza β in una conformazione aperta. Una volta
che il DNA è passato attraverso l’apertura, l’ATP legato al caricatore è idrolizzato e si ha il
rilascio della pinza, che si chiude intorno al DNA. La pinza β è quindi pronta per legare la DNA
polimerasi
III.
La DNA polimerasi I, costituita da una singola subunità, partecipa principalmente alla riparazione
del DNA, un processo mediante il quale le parti danneggiate del DNA vengono corrette. La DNA
polimerasi I è anche il principale enzima che rimuove gli RNA primer all’estremità 5’ di ogni
frammento di Okazaki e li sostituisce con DNA.

Le DNA polimerasi I contengono sempre un’attività esonucleasica, sono in grado di degradare un


polimero di DNA rimuovendo uno o più nucleotidi dall’estremità della molecola.
Esistono 2 tipi di esonucleasi: 5’  3’ e 3’  5.
Ha anche inoltre la capacità di polimerizzare. Quindi, a volte, la DNA polimerasi I è
contemporaneamente tre enzimi differenti. Le due attività esonucleasiche hanno compiti
completamente diversi nella replicazione.
La maggior parte delle nucleasi è specifica per DNA o RNA, ma la esonucleasi 5’  3’ della DNA
polimerasi I pu degradare entrambi i tipi di acidi nucleici. L’azione della primasi lascia un tratto
di RNA all’estremità 5’ di ogni frammento di Okazaki che viene rimosso dall’attività
esonucleasica 5’  3’ della DNA polimerasi I.
Quando l’enzima ha rimosso i ribonucleotidi nel primer, la sua attività polimerasica consente di
riempire con desossiribinucleotidi l’intervallo formatosi.
L’ultimo desossiribonucleotide aggiunto viene legato covalentemente dalla DNA ligasi
all’estremità 5’ del frammento di DNA precedentemente sintetizzato.

La sopravvivenza di un organismo dipende dalla accurata duplicazione del suo genoma. Un errore
nel corso della sintesi di una molecola di RNA messaggero da parte di una RNA polimerasi
provoca la sintesi di una proteina difettosa. Una molecola di mRNA, per , è solo uno stampo a
vita breve che fa parte di un’ampia popolazione di molecole simili, perci da un errore di questo
tipo deriva un piccolo danno di breve durata.
Se invece avviene un errore durante la replicazione del DNA, questo provoca una mutazione
permanente e la probabile eliminazione della progenie di quella cellula.
Nell’uomo, l’incorporazione di un particolare nucleotide all’estremità di un filamento in crescita
dipende dalla capacità del nucleoside trifosfato entrante di formare con il nucleotide del
filamento stampo una coppia di basi accettabile. L’analisi della distanza fra gli atomi e degli
angoli di legame indica che le coppie A – T e G – C hanno una geometria quasi identica tra loro.
In ciascun punto lungo lo stampo, la DNA polimerasi deve discriminare tra quattro differenti
potenziali precursori, via via che questi entrano ed escono dal sito attivo. Tra i quattro possibili
nucleosidi trifosfato, solo uno formerà con lo stampo una coppia di basi adeguata, producendo o
una coppia A – T o una coppia G – C, in grado di alloggiarsi correttamente nel sito attivo
dell’enzima.
Se il nucleotide entrante è riconosciuto dall’enzima come corretto, si ha un cambiamento
conformazionale in cui le “dita” della polimerasi ruotano verso il “palmo” afferrando il
nucleotide entrante. Se l’appaiamento di basi ha una geometria scorretta, il sito attivo non pu
assumere la conformazione richiesta per la catalisi e il nucleotide sbagliato non viene
incorporato. Al contrario, in caso di corretto appaiamento di basi, l’enzima catalizza
l’incorporazione del nucleotide nel filamento in crescita.
A volte la polimerasi incorpora un nucleotide errato, formando una coppia di basi appaiate male,
cioè una coppia di basi diversa da A – T o G – C.
Quando la DNA polimerasi I incorpora un nucleotide errato, la nuova estremità del filamento ha
una maggiore tendenza a separarsi dallo stampo e formare un’estremità 3’ a singolo filamento,
che entra nel sito esonucleasico. In seguito all’incorporazione di un nucleotide sbagliato, la
polimerasi si ferma in quel punto, fornendo il tempo necessario perché l’esonucleasi 3’ – 5’
rimuova il nucleotide appaiato male prima che il filamento continui ad allungarsi. Questo lavoro
di correzione delle bozze è una delle più importanti attività enzimatiche e mette in evidenza la
raffinatezza alla quale è giunto il meccanismo molecolare biologico.
I batteri possiedono anche un meccanismo di riparazione dell’appaiamento scorretto, che entra
in azione dopo la replicazione, correggendo quasi tutti gli appaiamenti scorretti che sfuggono
alla tappa della correzione di bozze.
La fedeltà della replicazione del DNA, è dovuta quindi a tre attività distinte:
1. una accurata selezione di nucleotidi
2. una immediata correzione di bozze
3. la riparazione post-replicativa dell’appaiamento errato.

Uno degli aspetti più notevoli della replicazione batterica è la velocità alla quale avviene:
l’intero processo della sintesi di un frammento di Okazaki, comprendente sia la formazione del
suo RNA primer, l’allungamento del DNA e la sua simultanea correzione di bozze da parte della
DNA polilmerasi, l’escissione dell’RNA, la sua sostituzione con DNA e il legame di questo al resto
del filamento, deve avvenire in circa un secondo.

La replicazione nelle cellule eucariotiche.


I nucleotidi che compongono il genoma umano potrebbero riempire un libro di circa un milione di
pagine.
Visto che gli eucarioti hanno genomi grandi e complesse strutture cromosomiche, è normale che
la conoscenza della replicazione nelle cellule eucariotiche si sia realizzata molto in ritardo
rispetta a quella delle cellule procariotiche.
Inizio della replicazione: le cellule eucariotiche replicano il loro genoma in piccole porzioni,
chiamate repliconi. Ciascun replicone possiede la propria origine di replicazione dalla quale si
dipartono, in entrambe le direzioni, le forcelle di replicazione.
Circa il 10-15% di repliconi è attivo in un certo momento della fase S del ciclo cellulare.
Repliconi vicini in uno stesso cromosoma tendono ad iniziare la replicazione
contemporaneamente. Inoltre, i repliconi attivi in un determinato momento di un ciclo di sintesi
del DNA tendono ad attivarsi sempre allo stesso momento anche nei cicli successivi. Nelle cellule
di mammifero l’inizio della replicazione di una regione cromosomica viene determinato
dall’attività dei geni presenti nella regione e/o dal suo stato di condensazione. La presenza di
istoni acetilati è un probabile fattore nella determinazione della replicazione precoce di loci
genici attivi. Le regioni del cromosoma che risultano più compatte corrispondono
all’eterocromatina e sono le ultime regioni ad essere replicate.
Il meccanismo con cui negli eucarioti inizia la replicazione è stato oggetto di intense ricerche e i
progressi maggiori sono stati ottenuti con le cellule di lievito, potendo farle replicare in
molecole di DNA batterico. Queste sequenze sono chiamate sequenze di replicazione autonoma
(ARS) perché hanno la capacità di promuovere la replicazione del DNA in cui sono contenute. Le
ARS presentano diversi elementi comuni. L’elemento centrale di una ARS consiste in una
sequenze conservata di 11 coppie di basi e funziona come uno specifico sito di legame per il
complesso di riconoscimento dell’origine (ORC). Se non si crea questo legame la replicazione non
inizia.
Le origini della replicazione si sono dimostrate molto più difficili da studiare nelle cellule dei
vertebrati rispetto al lievito. Potrebbe sembrare che il DNA di un vertebrato non possiede ARS
specifiche in cui ha inizio una replicazione, ma invece, studi suggeriscono che la replicazione in
vivo inizia in siti specifici lungo il DNA. L’impressione è che una molecola di DNA contenga molti
siti in cui la replicazione pu essere avviata, ma solo un gruppo di questi siti è realmente
utilizzato in un determinato momento in una data cellula. Le cellule che si riproducono con cicli
cellulari brevi utilizzano numerosi siti in cui la replicazione pu essere avviata, rispetto a cellule
con u ciclo cellulare più lungo.
La selezione di questi siti potrebbe essere governata da fattori epigenetici locali, quali la
posizione di nucleosomi, il tipo di modificazioni istoniche, lo stato di metilazione del DNA, il
grado di superavvolgimento e il livello di trascrizione.

È fondamentale che ogni parte del genoma venga replicata una volta ed una sola nel corso di
ogni ciclo cellulare. Deve esistere quindi, un meccanismo che impedisca la ripetizione della
replicazione di una parte già duplicata. Si ritiene che l’inizio della replicazione in un particolare
punto d’origine richieda il passaggio del punto di origine stesso attraverso una serie di stadi.
- Tappa 1: il complesso proteico ORG lega l’origine della replicazione e nelle cellule di
lievito resta associato ad essa durante tutto il ciclo cellulare. L’ORC è una pista
molecolare, visto il suo ruolo nel legare delle proteine richieste per i passaggi successivi.
- Tappa 2: le proteine dette fattori autorizzanti, legano l’origine di replicazione per
costituire il complesso proteina-DNA detto complesso di pre-replicazione (pre-RC), che è
autorizzato ad iniziare la replicazione.Gli studi si sono incentrati su un gruppo di 6
proteine Mcm correlate (Mcm2-Mcm7). Queste proteine vengono inserite sull’origine di
replicazione ad uno stadio tardivo della mitosi e restano in uno stato inattivo fino a
quando è iniziata la replicazione. Le proteine Mcm2-Mcm7 si associano a formare un
complesso a forma di anello che possiede attività elicasica ; diversi dati suggeriscono che
il complesso Mcm2-Mcm7 è l’elicasi replicativa degli eucarioti, responsabile per lo
svolgimento del DNA alla forcella replicativa.
- Tappa 3: poco prima dell’inizio della fase S del ciclo cellulare, l’attivazione di
proteinchinasi chiave porta all’attivazione del complesso Mcm2-Mcm7 elicasi e all’inizio
della replicazione. Una di queste protein-chinasi è una chinaci ciclina-dipendente (Cdk).
L’attività di Cdk resta elevata dalla fase S alla mitosi, impedendo la formazione di nuovi
complessi di pre-replicazione. Di conseguenza ogni origine pu essere attivata solo una
volta per ciclo cellulare. La cessazione dell’attività Cdk alla fine della mitosi permette
l’assemblaggio di un pre-RC per il successivo ciclo cellulare
- Tappa 4: Una volta che la replicazione è cominciata all’inizio della fase S, le proteine
Mcm si muovono insieme alla forcella di replicazione e svolgono un ruolo fondamentale
per la completa replicazione di un replicone. Il destino delle proteine Mcm dopo la
replicazione dipende dalla specie. Nelle cellule di mammifero le proteine Mcm vengono
allontanate dal DNA ma rimangono nel nucleo. Malgrado tutto, le proteine Mcm non
possono riassociarsi ad un’origine di replicazione che è già stata “accesa”.

Forcella replicativa negli eucarioti: la replicazione è sempre uguale, indipendentemente dal


tipo di genoma che viene replicato, sia esso virale o eucariote. Tutti i sistemi di replicazione
richiedono elicasi, proteine che si legano al DNA a filamento singolo, topoisomerasi, primasi,
DNA polimerasi, caricatore della pinza e pinza scorrevole e DNA ligasi.
Il DNA delle cellule eucariotiche viene sintetizzato in modo semidiscontinuo, anche se i
frammenti di Okazaki del filamento in ritardo sono molto più piccoli rispetto ai batteri. Come
la DNA polimerasi III di E. coli, la DNA polimerasi degli eucarioti esiste in forma di dimero, il
che lascia ipotizzare che il filamento guida ed il filamento in ritardo vengano sintetizzati in
modo coordinato attraverso un singolo complesso replicativo o replisoma.
Finora dalle cellule eucariotiche sono state isolate cinque polimerasi “classiche”, denominate α,
β, γ, δ e ε.
- γ e β non sono coinvolte nella replicazione del DNA nucleare. La polimerasi γ replica il
DNA mitocondriale e la polimerasi β è attiva nella riparazione del DNA.
Le altre tre polimerasi hanno un ruolo nella replicazione:
- la polimerasi α è strettamente associata con la primasi, ed insieme iniziano la sintesi di
ogni frammento di Okazaki. Dopo che la primasi ha sintetizzato un breve RNA primer, la
polimerasi α aggiunge un circa 20 desossiribonucleotidi. Si pensa che la polimerasi δ sia il
principale enzima che sintetizza il DNA durante la replicazione del filamento in ritardo,
mentre la polimerasi ε sia il principale enzima durante la replicazione del filamento
guida.
Entrambe le polimerasi δ e ε necessitano di una pinza scorrevole che blocca l’enzima al DNA
consentendogli di muoversi lungo uno stampo. Negli eucarioti, la pinza scorrevole è chiamata
PCNA. Il caricatore della pinza, responsabile del caricamento di PCNA sul DNA, è chiamato RFC .
Dopo aver sintetizzato un primer di RNA ed un breve segmento di DNA, la polimerasi α viene
sostituita, a livello della giunzione stampo-primer, dal complesso PCNA-polimerasi δ, che
completa la sintesi del frammento di Okazaki. Quando la polimerasi δ raggiunge l’estremità 5’
del frammento di Okawaki la polimerasi continua lungo il filamento in ritardo stampo, spostando
il primer. Il primer spostato viene rimosso dal filamento di DNA neosintetizzato da
un’endonucleasi (FEN-1) e l’interruzione che ne deriva viene saldata da una DNA ligasi. Si pensa
che FEN-1 e la DNA ligasi siano reclutate alla forcella replicativa mediante una interazione con
la pinza scorrevole PCNA.
Si ritiene che PCNA giochi un ruolo importante nell’orchestrare gli eventi che avvengono durante
la replicazione, la riparazione e ricombinazione del DNA. PCNA è stata definita pinza
molecolare.
Tutte le polimerasi eucariotiche allungano i filamenti di DNA in direzione 5’  3’ aggiungendo i
nucleotidi al gruppo ossidrile 3’ e nessuna di esse è in grado di iniziare la sintesi della catena di
DNA senza un primer.
Le polimerasi γ, δ e ε posseggono una esonucleasi 3’  5’, assicurando così che la replicazione
avvenga precisamente.
Ci sono anche altre polimerasi che invece consentono alla cellula di replicare il DNA
danneggiato.

Replicazione e struttura nucleare


L’apparato di replicazione è costituito da un enorme complesso di proteine che opera all’interno
di un nucleo strutturato. Sembra che l’apparato della replicazione sia strettamente associato
alla lamina nucleare e alla matrice nucleare.
Il DNA in replicazione non rimane immobile, ma si muove come una cinghia di trasmissione
attraverso un apparato di replicazione immobile.
Alcuni studi dimostrano che le forcelle di replicazione che sono attive in un certo momento non
sono distribuite a caso nel nucleo delle cellule, ma sono invece localizzate in un numero di punti
detti foci di replicazione.
Il raggruppamento delle forcelle di replicazione pu rappresentare un meccanismo per
coordinare la replicazione dei repliconi adiacenti su un singolo cromosoma.

Struttura della cromatina e replicazione


I cromosomi delle cellule eucariotiche sono formati da DNA strettamente complessato con
particolari gruppi regolarmente distribuiti di proteine istoniche, presenti come nucleosomi. Si
pensa che l’avanzamento dell’apparato di replicazione lungo il DNA sposti i nucleosomi che si
trovano sulla sua strada. Analizzando una molecola di DNA in replicazione, si nota che i
nucleosomi sono presenti su entrambe le doppie eliche in formazione, molto vicino alla forcella
di replicazione, facendo pensare che l’assemblaggio del DNA nei nucleosomi avviene molto
rapidamente.
I nucleosomi che si formano durante il processo di replicazione comprendono una miscela quasi
equivalente di molecole di istoni che provengono dai cromosomi parentali e molecole istoniche
di nuova sintesi. L’ottamero dei nucleo istonico di un nucleosoma consiste di un tetramero
(H3H4)₂ associato con una coppia di dimeri (H2A/H2B).
Secondo un modello, su ciascuna copia della molecola di DNA parentale sono presenti sia
tetrameri nuovi e vecchi e i due dimeri H2A/H2B di ciascun nucleosoma parentale non
rimangono associati mentre la forcella di replicazione si muove lungo la cromatina. I due dimeri
H2A/H2B di un nucleosoma invece, si separano l’uno dall’altro e sembra che si leghino
casualmente a tetrameri nuovi e vecchi già presenti sui duplex fratelli.
Secondo un altro punto di vista, il tetramero parentale pu essere scisso in due dimeri H3-H4,
ognuno dei quali pu associarsi con un dimero di nuova sintesi a formare un tetramero misto, che
si assembla con i dimeri H2A-H2B. Le tappe che portano all’assemblaggio dei nucleosomi e la
loro disposizione ordinata lungo la molecola di DNA è facilitata da una rete di proteine
accessorie. Tra queste proteine ci sono un certo numero di istoni chaperon che sono capaci di
accettare istoni sia di nuova sintesi che parentali e trasferirli ai filamenti fratelli.
CAF-1 è il più studiato tra gli istoni chaperon, ed è reclutato per l’avanzamento della forcella di
replicazione attraverso l’interazione con la pinza scorrevole PCNA.

LA REPLICAZIONE DEL DNA


Tra tutte le molecole della cellula, il DNA è localizzato nella posizione più precarie. Da un lato,
è fondamentale che l’informazione genetica rimanga invariata durante la trasmissione da una
cellula ad un'altra e da un individuo ad un altro; dall’altro il DNA è una delle molecole della
cellula più sensibile ai danni ambientali.
Quando viene trattata con sostanze chimiche comuni, alcune delle quali prodotte dal
metabolismo stesso della cellula, le basi del DNA possono risultare alterate nella loro struttura.
Persino l’assorbimento di energia termica generata dal metabolismo è sufficiente a spostare le
basi adenina e guanina dal loro attacco agli zuccheri dello scheletro della molecola. L’entità di
queste alterazioni spontanee (lesioni) pu essere valutata calcolando che ogni cellula di un
mammifero perde circa 10.000 basi ogni giorno!
Se queste lesioni non vengono riparate, si verificano mutazioni del DNA. Se la mutazione si
verifica in una cellula che si sta differenziando in gamete, l’alterazione genetica pu essere
trasmessa alla generazione successiva. Le mutazioni possono avere effetti anche in cellule
somatiche (non riproduttive) in quanto possono interferire con la trascrizione e la replicazione,
provocare la trasformazione maligna della cellula o accelerare il processo di invecchiamento di
un organismo.
È fondamentale quindi che le cellule possiedano dei meccanismi che permettono la riparazione
del danno genetico. Le cellule hanno un incredibile varietà di sistemi di riparazione che
sembrano in grado di correggere ogni tipo di danno al quale pu essere soggetta una molecola di
DNA.
Le cellule procariotiche ed eucariotiche possiedono un insieme di enzimi che perlustrano il DNA,
cercando alterazioni e distorsioni.
In alcuni casi, il danno pu essere riparato direttamente: nell’uomo ad esempio, esistono enzimi
capaci di riparare direttamente il danno prodotto da agenti alchilanti cancerogeni.
La maggioranza dei sistemi, invece, richiede che la parte danneggiata del DNA venga rimossa
selettivamente. Una delle grandi qualità del DNA a doppia elica consiste nel fatto che ogni
filamento contiene l’informazione richiesta per costruire il filamento complementare. Quindi, se
uno o più nucleotidi vengono rimossi da un filamento, il filamento complementare pu servire da
stampo per la ricostruzione della doppia elica.
La riparazione dei danni al DNA nelle cellule eucariotiche è complicata dalla relativa
inaccessibilità del DNA entro le fibre cromatiniche. La riparazione del DNA implica il
rimodellamento della cromatina da parte di macchinari in grado di modificare enzimaticamente
gli istoni e i complessi di rimodellamento dei nucleosomi.
Riparazione per escissione nucleotidica
I sistemi di riparazione per escissione nucleotidica (NER) agiscono attraverso un meccanismo di
taglio e riparazione che rimuove grosse lesioni, come dimeri di pirimidina o nucleotidi ai quali si
sono attaccati dei gruppi chimici. La riparazione per escissione nucleotidica pu avvenire con 2
strade:
1. una via accoppiata alla trascrizione: in cui viene di preferenza riparato il filamento
stampo che contiene geni che vengono attivamente trascritti. Si pensa che la riparazione
del filamento stampo avvenga contemporaneamente alla trascrizione del DNA, e che la
segnalazione della lesione avvenga attraverso il blocco dell’RNA polimerasi. Questa via
preferenziale della riparazione assicura che i geni di maggiore importanza per la cellula
(quelli trascritti attivamente), ricevano l’assoluta priorità nella tabella di marcia della
riparazione.
2. Una via genomica globale, più lenta e meno efficiente che corregge i filamenti di DNA nel
resto del genoma.

Il riconoscimento delle lesioni avviene probabilmente ad opera di proteine diverse per le due vie
di riparazione (fase 1), mentre i diversi passaggi che succedono durante la riparazione della
lesione sono molto simili. Uno dei componenti chiave del macchinario di riparazione NER è TFIIH,
un enorme proteina che partecipa anche all’inizio della trascrizione. Esiste un legame
importante tra riparazione del DNA e trascrizione, due processi che in passato si riteneva fossero
indipendenti l’uno dall’altro. Tra le diverse subunità di TFIIH ci sono due proteine (XPB e XPC)
che posseggono attività elicasica; questi enzimi separano i due filamenti del duplex (fase 2)
prima della rimozione della lesione. Il filamento danneggiato viene quindi tagliato su ambedue i
lati della lesione mediante due esonucleasi (fase 3) e il segmento di DNA compreso tra i due tagli
viene allontanato (fase 4). Una volta avvenuta l’escissione, l’intervallo viene riempito da una
DNA polimerasi (Fase 5) e il filamento viene ricongiunto da una DNA ligasi (fase 6).

Riparazione per escissione di base


Per la rimozione dei nucleotidi alterati generati da composti chimici reattivi derivanti dalla dieta
o prodotti dal metabolismo interviene un sistema diverso, chiamato riparazione per escissione di
base (BER).
La BER inizia mediante una DNA glicolasi che riconosce l’alterazione (fase 1) e rimuove la base
attraverso la rottura del legame glicosidico che unisce la base alla molecola di zucchero
desossiribosio (fase 2).
Finora sono stati identificati molti tipi di DNA glicosilasi, ognuna più o meno specifica per un
particolare tipo di base alterata (ad es. l’uracile o l’8-ossiguanina ecc..)
Esempio: La DNA glicolasi che rimuove la 8-ossiguanina (oxo-G) nella fase 1 ispeziona ogni coppia
G-C nel duplex. Nella fase 2 l’enzima incontra una coppia di basi oxoG-C, l’enzima si inserisce
sulla nulla molecola di DNA e provoca la rotazione del nucleotide di 180° fuori dallelica di DNA e
verso l’enzima.
Se la base ispezionata risulta essere una oxo-G, viene alloggiata nel sito attivo dell’enzima (fase
3) e tagliata. Se invece la base è una normale guanina, non pu adattarsi al sito attivo (fase 4) e
ritorna nella sua posizione nell’elica.
Una volta rimossa una purina o una pirimidina alterata, il desossiribosio fosfato “decapitato”
viene rimosso dall’azione combinata di una endonucleasi specializzata (AP) e di una DNA
polimerasi β.
L’endonucleasi AP taglia lo scheletro del DNA (fase 3) e l’attività fosfodiesterasica della DNA
polimerasi β rimuove il restante zucchero-fosfato ch era legato alla base escissa (fase 4) e
riempie quindi l’interruzione inserendo un nucleotide complementare (fase 5). Il filamento viene
alla fine ricongiunto dalla DNA ligasi III (fase 6).
La citosina pu trasformarsi in uracile e probabilmente questo è il motivo per cui la selezione
naturale ha favorito l’uso della timina come base del DNA piuttosto che dell’uracile, anche se
questo era presente nell’RNA che serviva da materiale genetico durante la prima evoluzione. Se
l’uracile fosse stato mantenuto come una delle basi del DNA, i sistemi di riparazione avrebbero
avuto delle difficoltà nel distinguere un uracile che “apparteneva” a un partiolare sito da uno
che si era formato per alterazione della citosina.
Riparazione degli appaiamenti errati
Le cellule sono capaci di rimuovere le basi appaiate in modo errato, incorporate dalla DNA
polimerasi e sfuggite al meccanismo esonucleasico di correzione di bozze dell’enzima. Questo
meccanismo è chiamato riparazione degli appaiamenti errati (MMR). Una coppia di basi appaiate
in modo errato provoca nella doppia elica di distorsione che pu essere riconosciuta da un
enzima di riparazione.
Affinché un appaiamento scorretto venga riparato dopo che la DNA polimerasi è passata oltre, è
fondamentale che il sistema di riparazione sia in grado di distinguere il filamento
neosintetizzato, che contiene il nucleotide sbagliato, dal filamento parentale che contiene il
nucleotide corretto.
Nelle cellule procariotiche il sistema di riparazione passa in rassegna il DNA prima della tappa di
metilazione mentre negli eucarioti esiste un altro meccanismo di riparazione degli appaiamenti
scorretti, in quanto non avviene la metilazione.

Riparazione delle rotture a doppio filamento


I raggi x, i ragi gamma e le particelle rilasciate da atomi radioattivi vengono definiti radiazioni
ionizzanti, in quanto generano ioni quando passano attraverso la materia.
Quando queste forme di radiazioni collidono con una fragile molecola di DNA, spesso generano
rotture su ambedue i filamenti della doppia elica. Le rotture a doppio filamento (DSB) possono
essere generare anche da agenti chimici, compresi quelli usati in chemioterapia ed i radicali
liberi generati dal normale metabolismo cellulare.
Le DSB sono introdotte anche durante la replicazione di molecole di DNA danneggiate. Una
singola rottura a doppio filamento pu causare serie anomalie cromosomiche che possono avere
gravi conseguenze per la cellula. Le DSB possono essere riparate attraverso diverse vie alterative
di riparazione. Nelle cellule di mammifero, il meccanismo di riparazione predominante è
chiamato nonhomologous end joining (NHEj) (unione delle estremità non omologhe), in cui un
complesso di proteine si lega alle estremità rotte del duplex di DNA e catalizza una serie di
reazioni per unire nuovamente le estremità rotte del DNA.
La proteina di riparazione NHEJ è localizzata a livello delle DSB subito dopo la loro comparsa. Un
altro meccanismo di riparazione noto come homologous recombination (ricombinazione omologa)
richiede la presenza di un cromosoma omologo che serve da stampo per la riparazione del
filamento rotto.
Difetti in entrambe le vie di riparazione sono stati associati ad un’aumentata suscettibilità al
cancro.

TRA REPLICAZIONE E RIPARAZIONE


Le cellule sono in grado di riparare una grande varietà di lesioni al DNA. In alcuni casi, per , una
lesione al DNA non viene riparata finché quel segmento non va incontro a replicazione. In queste
occasioni, il macchinario di replicazione arriva al punto, sul filamento stampo, dove è presente
il danno e si blocca. Quando questo accade, vengono emessi dei segnali che determinano il
reclutamento di una particolare polimerasi in grado di oltrepassare la lesione.
Ad esempio, se la lesione riguarda un dimero di timidina formatosi in una cellula epiteliale
esposta a raggi uv, la polimerasi raggiunge l’ostacolo e viene temporaneamente sostituita dalla
DNA polimerasi detta pol η che è in grado di inserire due residui di adenina nel filamento
neosintetizzato in corrispondenza delle due timidine del dimero legate covalentemente tra loro.
Dopo che il danno è stato oltrepassato, la cellula riprende la replicazione con la normale
polimerasi replicativa, senza lasciare alcuna traccia del danno risolto.
La polimerasi η è un membro di una superfamiglia di DNA polimerasi, che hanno funzione di
oltrepassare alcuni tipi di lesioni o allineamenti errati tra il filamento e il primer, durante la
replicazione.
Le polimerasi di questa superfamiglia prendono parte alla sintesi per scavalcamento della lesione
(translesion synthesis, TLS). Le TLS polimerasi hanno un sito attivo insolitamente grande, in
grado di alloggiare fisicamente i nucleotidi errati che non potrebbero adattarsi nel sito attivo
della polimerasi replicativa. Le TLS sono in grado di incorporare da uno a pochi nucleotidi nel
filamento di DNA; non hanno la capacità di operare la correzione delle bozze e sono pù propense
ad incorporare un nucleotide errato rispetto alle polimerasi classiche.
LA RIPRODUZIONE CELLULARE
Per divisione cellulare si intende quel processo che dà origine a nuove cellule. Non termina con
la formazione dell’organismo, ma in alcuni tessuti continua per la durata di tutta la vita.

CICLO CELLULARE
Ogni cellula passa attraverso una serie di stadi definiti, che insieme formano il ciclo cellulare.
Il ciclo cellulare si distingue in due fasi principali: la fase M e l’interfase.
- La fase M include: il processo di mitosi, durante il quale i cromosomi duplicati vengono
separati in due nuclei distinti, e la citocinesi, durante la quale l’intera cellula viene
fisicamente divisa in due cellule figlie. Questa fase ha una durata di circa un ora nelle cellule
di mammifero.
- L’interfase, il periodo tra le divisioni cellulari, è il tempo in cui la cellula cresce ed è
impegnata in diverse attività metaboliche. L’interfase pu durare ore, giorni, settimane o
anche più, a seconda del tipo cellulare e delle condizioni.
Durante l’interfase si assiste a numerosi eventi preparativi per la successiva divisione, il più
importante dei quali è la replicazione del DNA cellulare.
Esiste un periodo definito, indicato come fase G₂ (secondo intervallo, o gap), tra la fine della
sintesi di DNA e l’inizio della fase M. La durata di G₂ è variabile ed è definita dall’intervallo di
tempo tra l’inizio del periodo di marcatura e la comparsa di cellule con cromosomi mitotici
marcati.
La fase del ciclo cellulare nella quale avviene la replicazione viene chiamata fase S, che è anche
il periodo durante il quale la cellula sintetizza gli istoni addizionali che saranno necessari perché
la cellula duplichi il numero dei nucleosomi nei suoi cromosomi.
Esiste un'altra fase del ciclo, la fase G₁ (primo intervallo) che è compresa tra la fase M e la fase S
e rappresenta il periodo successivo alla mitosi e che precede l’inizio della sintesi di DNA.

È possibile individuare tre grandi categorie cellulari, in base alla capacità di crescere e dividersi:
1. Cellule che possiedono una estrema specializzazione strutturale, come le cellule nervose,
quelle muscolari, ed i globuli rossi, che hanno perso la capacità di dividersi. Queste
cellule, terminato il processo di differenziazione, le cellule permangono in quello stato
fino alla loro morte.
2. Cellule che normalmente non si dividono, ma che possono essere indotte a dividersi in
seguito ad un appropriato stimolo. Ne fanno parte le cellule el fegato, che possono
essere indotte alla proliferazione in seguito ad asportazione chirurgica da parte del
fegato stesso, e i linfociti, i quale possono essere indotti a dividersi dall’interazione con
un antigene appropriato.
3. Cellule che possiedono normalmente un livello relativamente alto di attività mitotica.
Alcuni tessuti sono sottoposti ad un continuo rinnovo e nuove cellule devono essere
continuamente formate per divisione cellulare. Vengono inclusi in questa categoria gli
spermatogoni che danno origine ai gameti maschili, le cellule staminali ematopoietiche
che danno origine ai globuli rossi e ai globuli bianchi e le cellule epiteliali.
C’è una grande variabilità della durata del ciclo cellulare, in particolare in differenti stadi dello
sviluppo. La durata del ciclo cellulare pu variare in un intervallo che va da meno di 30 minuti,
per cellule che si dividono molto rapidamente e che mancano delle fasi G₁ e G₂ (degli embrioni),
fino ad arrivare a cicli che durano diversi mesi in tessuti che crescono molto lentamente, come
nel fegato dei mammiferi.
Le cellule che hanno cessato di dividersi, sia temporaneamente che definitivamente, vengono
tutte a trovarsi in uno stadio che precede l’inizio della sintesi di DNA. Le cellule che si trovano
bloccate in questa fase vengono normalmente indicate come cellule in fase G₀. Per passare dalla
fase G₀ o G₁ alla fase S, una cellula deve produrre un segnale interno.
Una volta generato il segnale per iniziare la replicazione del DNA, la cellula invariabilmente
completa la sintesi di DNA ed entra in mitosi.

Lo studio del ciclo cellulare è importante non solo nel campo della biologia cellulare di base, ma
ha enormi implicazioni pratiche anche nella lotta contro il cancro, una malattia che deriva
dall’incapacità di una cellula di regolare la propria divisione.
Ruolo delle protein-chinasi
Diversi esperimenti di fusione cellulare rivelarono l’esistenza di fattori che regolavano il ciclo
cellulare ma non rivelarono l’esistenza sulle loro proprietà biochimiche.
Da altri esperimenti si evinceva che una proteina, chiamata fattore di promozione della
maturazione (MPF) era responsabile dell’entrata della cellula in fase M. MPF è composto da due
subunità:
(1) Una subunità con attività chinasica responsabile del trasferimento dei gruppi fosfato
dall’ATP a specifici residui di serina e treonina di specifiche proteine “substrato”
(2) Una subunità di tipo regolatorio chiamata ciclina, che regola la concentrazione di questa
proteine in funzione al procedimento del ciclo cellulare.
Quando la concentrazione della ciclina è bassa, la chinasi si trova priva della subunità ciclina,
che è quindi inattiva. Quando la concentrazione della ciclina raggiunge un livello sufficiente, la
chinasi viene attivata, con la conseguente entrata della cellula in fase M.
La progressione delle cellule attraverso il ciclo cellulare dipende quindi da un enzima la cui sola
attività quella di fosforilare altre proteine; l’attività di questo enzima è controllata da una
subunità con una concentrazione che varia da uno stadio del ciclo cellulare all’altro.
Negli ultimi 20 anni si sono concentrati gli studi su enzimi MPF indicati con il termine di chinasi
ciclina-dipendenti (Cdk). Le Cdk oltre ad essere coinvolte nella fase M, sono gli elementi chiave
che orchestrano le attività durante tutto il ciclo cellulare.
Le basi molecolari della regolazione del ciclo cellulare si sono conservate bene attraverso
l’evoluzione degli eucarioti. Una volta identificato un gene coinvolto nel controllo del ciclo
cellulare, vengono ricercati geni omologhi e identificati nei genomi degli eucarioti superiori,
compreso l’uomo.
Le ricerche riguardanti il controllo genetico del ciclo cellulare del lievito iniziarono durane gli
anni ’70 in due laboratori, uno sul lievito gemmante e uno sul lievito a fissione. Entrambi
trovarono un gene. Quando risultava mutato, le cellule smettevano di crescere ad alte
temperature e si bloccavano in punti precisi del ciclo cellulare. Il prodotto di questo gene fu
chiamato cdc2 nel lievito a fissione ed era omologo alla subunità catalitica di MPF. Era quindi
una catalisi ciclina-dipendente.
Successive indagini, anche in differenti cellule di vertebrati, rafforzarono l’idea che la
progressione di una cellula eucariote attraverso il suo ciclo è regolata soprattutto a due precisi
stadi: uno è quello vicino alla fine della G₁, l’altro è quello vicino alla fine della G₂. Entrambi
questi studi rappresentano i momenti nel ciclo cellulare nei quali una cellula viene indirizzata ad
avviare un evento cruciale, come l’inizio della replicazione o l’entrata in mitosi. Le chinasi
ciclina-dipententi sono spesso descritte come la “locomotiva” che guida il ciclo attraverso i suoi
diversi stadi. Le attività di questi enzimi sono regolate da numerosi fattori che operano in
associazione, tra cui:
- Legame della ciclina: quando una ciclina è presente nella cellula, si lega alla subunità
catalitica della Cdk causando un profondo cambiamento nella conformazione della
subunità stessa. Il legame con la ciclina causa lo spostamento di un’ansa flessibile della
catena polipeptidica della Cdk lasciando libero il sito attivo dell’enzima e permettendo
alla Cdk di fosforilare i suoi substrati proteici.
- Fosforilazione/defosforilazione di Cdk. I livelli delle cicline mitotiche aumentano dalla
fase S alla fase G₂. In tarda fase G₂, Cdk-ciclina è attivato e si ha la mitosi. Questo
cambiamento dell’attività di Cdk, entrano in gioco altri tre enzimi regolatori – due
chinasi ed una fosfatasi.
Nel passaggio 1, una delle chinasi, detta CAK, fosforila un residuo di treonina critico (Thr
161) ma questa fosforilazione non è sufficiente per attivare Cdk. Una seconda
proteinchinasi detta Wee1, fosforila un residuo chiave di tirosina presente nel sito
legante l’ATP dell’enzima (Tyr 15). Se questo residuo è fosforilato, l’enzima è inattivo,
indipendentemente dallo stato di fosforilazione di ogni altro residuo. Il suo effetto supera
quello di CAK, tenendo la Cdk in uno stato inattivo.
Nelle cellule normali (selvatico) Wee1 mantiene la Cdk inattiva fino alla fine della fase
G₂. Poi, alla fine di G₂, il fosfato inibitore presente a livello di Tyr 15 è rimosso dal terzo
enzima, una fosfatasi detta Cdc25 (passaggio 2). La rimozione del grupo fosfato attiva le
molecole di ciclina-Cdk, permettendo la fosforilazione dei substrati chiave e guidando la
cellula di lievito ad entrare in mitosi.
- Inibitori della Cdk: l’attività della Cdk pu essere bloccata da diversi inibitori (nel lievito
ad esempio Sic1)
- Proteolisi controllata: le cellule regolano la concentrazione delle cicline (e di altre
proteine chiave per il ciclo cellulare), bilanciando sia il grado di sintesi che quello di
degradazione in differenti pnti del ciclo cellulare. La degradazione è effettuata per
mezzo della via ubiquitina-proteasoma, ed è un evento irreversibile che aiuta nel guidare
il ciclo cellulare in una sola direzione. La regolazione del ciclo cellulare richiede due
classi di complessi multisubunità (complessi SCF e APC, che funzionano come ubiquitina
ligasi) che riconoscono proteine marcate per la degradazione e legano queste proteine ad
una catena di poliubiquitina che assicura la loro distruzione in un proteasoma.
I complessi SCF agiscono probabilmente dalla tarda G₁ alla mitosi precoce e mediano la
distribuzione delle cicline G₁, di inibitori delle Cdk e di altre proteine del ciclo cellulare.
Queste proteine diventano bersagli per un complesso SCF dopo essere state fosforilate
dalle protein-chinasi che regolano il ciclo cellulare. Mutazioni che inibiscono a SCF di
mediare la proteolisi di proteine chiave, possono impedire alle cellule di replicare il
proprio DNA. Il complesso APC agisce invece durante la mitosi e
degrada proteine mitotiche fondamentali, comprese le cicline mitotiche. La distribuzione
delle cicline mitotiche permette ad una cellula di uscire dalla mitosi ed iniziare un nuovo
ciclo.
- Localizzazione subcellulare: le cellule contengono diversi compartimenti nei quali
molecole regolatrici possono essere unite o separate dalle proteine con cui interagiscono.
La localizzazione subcellulare è un fenomeno dinamico caratterizzato dallo spostamento
di elementi regolatori del ciclo cellulare nei diversi compartimenti in stadi differenti.

Le proteine ed i processi che controllano il ciclo cellulare sono fortemente conservati in tutti gli
eucarioti. Diversamente dalle cellule di lievito, che hanno una sola Cdk, le cellule di mammifero
producono diverse versioni di questa protein-chinasi. Complessi ciclina – Cdk differenti marcano
gruppi differenti di substrati a punti differenti del ciclo cellulare. L’accoppiamento tra le cicline
e le Cdk è altamente specifico, e sono state identificate solo alcune combinazioni. Nelle cellule
di mammifero il complesso ciclina E – Cdk2 è altamente specifico. Nelle cellule di mammifero, E
– Cdk2 spinge la cellula nella fase S, mentre il complesso ciclina B1 – Cdk1 è attivo nel
condurre la cellula alla mitosi. Non sempre le Cdk stimolano attività, ma a volte possono anche
inibire il verificarsi di eventi. Ad esempio la sua attività durante G₂ impedisce alla cellula la
replicazione del DNA se esso è stato già replicato in precedenza. Ci assicura che ogni regione
del genoma sia replicata una sola volta per ciclo cellulare.
Ultimi studi suggeriscono che la Cdk1 è l’unica Cdk indispensabile per l’attivazione di tutti gli
stadi del ciclo cellulare; quindi anche se le altre Cdk vengono normalmente espresse in
determiate fasi del ciclo cellulare delle cellule di mammifero, la Cdk1 è in grado di “sopperire”
alla loro mancanza, andando a fosforilare tutti i substrati che è necessario siano fosforilati in
momenti specifici del ciclo cellulare.
Si tratta di un caso classico di ridondanza, cioè una situazione in cui una proteina è in grado di
svolgere delle funzioni che in condizioni normali non svolgerebbe. Tuttavia, la mancanza did una
di queste cicline o delle Cdk non essenziali, porta tipicamente ad anomalie precise del ciclo
cellulare.

Punti di controllo: rappresentano meccanismi di sorveglianza che bloccano il progredire del ciclo
cellulare se qualche cromosoma risulta danneggiato o se alcuni processi critici (tipo la
replicazione del DNA durante la fase S o l’allineamento dei cromosomi in mitosi) non sono stati
completati adeguatamente. Questi punti di controllo assicurano che ogni evento del ciclo
cellulare si verifichi in maniera accurata e nell’ordine giusto. Molte delle proteine dei punti di
controllo non hanno alcun ruolo nei normali eventi del ciclo cellulare ed entrano in azione solo
quando si presentano delle anomalie.
Infatti geni codificanti varie proteine dei punti di controllo sono stati identificati in cellule di
lievito mutanti che procedevano nel ciclo cellulare nonostante la presenza di DNA danneggiato o
altre gravi anomalie.
I punti di controllo sono attivati da un sistema di sensori che riconosce il dano al DNA e le
anomalie cellulari. Se una proteina sensore individua la presenza di un danno al DNA o qualche
altra alterazione essa emette un segnale che blocca temporaneamente la progressione del ciclo.
La cellula pu usare il ritardo per riparare il danno o correggere il difetto piuttosto che
progredire nel successivo stadio del ciclo cellulare.
Se il DNA viene danneggiato oltre le possibilità di riparazione, i meccanismi di controllo degli
eucarioti superiori possono trasmettere un segnale che porta o alla morte delle cellule
potenzialmente dannose o al loro ingresso in uno stato di arresto permanente del ciclo cellulare
(senescenza).
Una scoperta che ha avuto importanti ripercussioni è quella della risposta cellulare al danno del
DNA. Il gene responsabile dell’atassia-telangectasia (gene ATM) codifica una protein-chinasi che
è attivata da determinate lesioni al DNA, in particolare rotture a doppio filamento.
Una protein-chinasi correlata è ATR che è attivata da altri tipi di lesioni (es: irradiazione con
UV).
Una volta legate ATM e ATR possono fosforilare una notevole quantità di proteine coinvolte nei
punti di controllo e nella riparazione del DNA.

LA FASE M: MITOSI E CITOCINESI


La MITOSI è un processo di divisione nucleare in cui le molecole di DNA replicate di ciascun
cromosoma sono ripartite accuratamente nei due nuclei. La mitosi è di solito accompagnata
dalla citocinesi, il processo che consente alla cellula di dividersi in due, separando il citoplasma
in due parti più o meno uguali. Le due cellule figlie formate dalla mitosi e dalla citocinesi
possiedono un corredo cromosomico identico fra loro e a quello della cellula madre da cui hanno
avuto origine.
La mitosi conserva il numero dei cromosomi e genera nuove cellule per la crescita e il
mantenimento di un organismo; pu avvenire sia in cellule diploidi che aploidi.
Il processo della mitosi viene diviso in 5 fasi: PROFASE, PROMETAFASE, METAFASE, ANAFASE e
TELOFASE, ognuna caratterizzata da una serie di eventi particolari.

1.PROFASE
è la prima fase, durante la quale i cromosomi duplicati si preparano a segregare e si assembla
il complesso macchinario mitotico.
Formazione dei cromosomi mitotici: il nucleo di una cellula in interfase contiene fibre di
cromatina molto lunghe. La struttura estesa della cromatina all’interfase è l’ideale per
permettere la trascrizione e la replicazione, ma non va bene quando la cellula deve segregare
il proprio corredo cromosomico in due cellule figlie. Per svolgere questa funzione, la cellula
per prima cosa compatta i suoi cromosomi duplicati in fibre sempre più corte e più spesse per
mezzo di un processo di compattazione cromosomica (o condensazione cromosomica) che
avviene precocemente durante la profase.
L’impalcatura del cromosoma è formata da proteine non istoniche, a cui risultano legate le
anse diDNA. Durante l’interfase, le proteine dell’impalcatura del cromosoma sono disperse
all’interno del nucleo, probabilmente fanno parte della matrice nucleare.
Recentemente l’attenzione nella condensazione è stato spostato dagli istoni alla condensina
(complesso proteico), che agisce inducendo un cambiamento importante nell’architettura
della cromatina.
Il DNA superavvolto occupa uno spazio molto minore rispetto al DNA rilassato e studi
suggeriscono che il superavvolgimento gioca un ruolo chiave nel compattare una fibra di
cromatina nel minuscolo volume occupato da un cromosoma mitotico. In presenza di una
topoisomerasi e di ATP, la condensina è in grado di legarsi al DNA e ripiegarlo in anse
superavvolte positivamente.
La compattazione dei cromosomi richiede la presenza della topoisomerasi II, che insieme alla
condensina è presente come parte dell’impalcatura del cromosoma mitotico.
La condensina viene attivata all’inizio della mitosi per mezzo della fosforilazione di alcune
delle sue subunità da parte della Cdk mitotica responsabile di guidare le cellule dalla fase G₂
in mitosi.
La condensina è probabilmente uno dei bersagli tramite i quali le Cdk sono in grado di
innescare le attività del ciclo cellulare.
Come risultato della compattazione, i cromosomi di una cellula mitotica appaiono strutture
distinte simili a bastoncelli. Ciascuna di queste strutture è composta da due distinti
componenti. Ognuno di questi componenti a bastoncello è chiamato cromatidio, ed è formato
durante la replicazione nella precedente interfase.
Prima della replicazione il DNA di ogni cromosoma interfasico si associa per tutta la sua
lunghezza con un complesso multiproteico detto coesina. Dopo la replicazione la coesina
mantiene uniti i due cromatidi fratelli durante la fase G₂ e la mitosi, finchè non vengono
separati.
La condensina e la coesina hanno una organizzazione strutturale simile.
Nei vertebrati la coesina è rilasciata dai cromosomi in due stadi distinti, ma la maggior parte
di essa si dissocia durante la profase.
I cromatidi di ciascun cromosoma mitotico sono associati per la loro lunghezza, ma sono
ancora più saldamente associati a livello dei centromeri. Si ritiene che la coesina resti a
livello dei centromeri per la presenza di una fosfatasi che rimuove i gruppi fosfato addizionati
alla proteina dalle chinasi. Il rilascio della coesina dai centromeri è normalmente ritardato
fino all’anafase.

Centromeri e cinetocori: il principale punto di riferimento sul cromosoma mitotico è dato da


una marcata rientranza, detta costrizione primaria, che individua la posizione del
centromero. Nel centromero si trovano sequenze di DNA altamente ripetute, necessarie per il
legame con proteine specifiche.
Il cinetocore è una struttura appiattita che si trova sul lato esterno della superficie
centromerica, che si unisce al centromero durante la profase. Serve infatti come punto di
contatto tra il cromosoma ed i microtubuli del fuso mitotico, come sito di accatto per
numerose proteine motrici e come componente di un importante punto di controllo mitotico.
Per mantenere l’attacco ai microtubuli fluttuante (flessibile) la struttura che tiene insieme i
cineocori e microtubuli dovrebbe muoversi con l’estremit del microtubulo mano a mano che
le subunità vengano aggiunte o rimosse.
Ndc80 è una proteina essenziale nei cinetocori, perché forma delle fibrille che si estende dal
cinetocore verso la superficie del microtubuloadiacente, alla quale si legano. Tra le varie
proteine motrici associate al cinetocore, CENP – E è la principale indiziata tra le potenziali
proteine di legame con il microtubulo.

Formazione del fuso mitotico: non appena la cellula ha passato la fase G₂ ed è entrata in
mitosi, i microtubuli subiscono un disassemblaggio generale in vista della formazione del fuso
mitotitco. Si pensa che il ripido disassemblaggio del citoscheletro in interfase, sia dovuto
all’inattivazione di proteine che stabilizzano i microtubuli e all’attivazione di proteine che
destabilizzano tali polimeri.
Il ciclo del centrosoma procede parallelamente con quello cellulare: quando una cellula
animale esce dalla mitosi, essa contiene un singolo centrosoma, avente due centrioli disposti
perpendicolarmente tra loro. Prima che la citocinesi sia coompletata, i due centrioli perdono
la loro stretta connessione grazie all’enzima separasi. Successivamente i due centrioli
iniziano la loro duplicazione.
La formazione di ogni nuovo centriolo inizia con la comparsa di un piccolo procentriolo,
accanto a quello già esistente (materno) e disposto perpendicolarmente ad esso. Il successivo
allungamento dei microtubuli porta il precentriolo alla sua maturazione. All’inizio della
mitosi, il centrosoma si duplica producendo due centrosomi adiacenti, ognuno costituito da
una coppia di centrioli madre/figlio.
L’inizio della duplicazione del centrosoma durante la transizione G₂ - S è indotto dalla
fosforilazione di una proteina del centrosoma ad opera della chiinasi Cdk2.
La duplicazione dei centrosomi è strettamente controllato in modo che ogni centriolo
materno origini un solo centriolo figlio.
Il primo momento della formazione del fuso è l’associazione dei microtubuli in una struttura a
stella detta aster, intorno ai centrosomi precocemente durante la profase. I microtubuli
crescono per addizione i subunità alle estremità più, mentre le loro estremità meno restano
associate al centrosoma.
Il processo di formazione dell’aster è seguito dalla separazione dei centrosomi e dalla loro
successiva migrazione intorno al nucleo in direzione dei poli opposti della cellula. La
separazione dei centrosomi è guidata da proteine motrici associate con i microtubuli
adiacenti. Appena separati i centrosomi, i microtubuli situati tra loro iniziano ad aumentare
di numero e ad allungarsi, fino a raggiungere le rispettive posizioni, stabilendo così i due poli
del fuso mitotico bipolare.
Con la mitosi, ciascun centrosoma è distribuito ad una cellula figlia.

Rottura dell’involucro nucleare e ripartizione degli organelli citoplasmatici: Il fuso mitotico


è assemblato nel citoplasma e i cromosomi sono compattati nel nucleoplasma. Nella maggior
parte delle cellule eucariotiche questo è possibile dalla rottura dell’involucro nucleare alla
fine della profase. I tre principali costituenti dell’involucro nucleare (complessi del poro,
lamina e membrane) vengono disaggregati.
Alcuni organelli citoplasmatici provvisti di membrana attraversano la mitosi relativamente
intatti, come i mitocondri, i lisosomi e i perossisomi.
Ci sono poi diverse teorie per quanto riguarda la divisione durante la mitosi del Golgi e del
RE. Una teoria sostiene che il contenuto del complesso di Golgi viene incorporato nel RE ed il
complesso di Golgi cessa in breve di esistere come organello distinto. Secondo una teoria
alternativa, le membrane di Golgi si frammentano e formano una popolazione distinta di
piccole vescicole che vengono suddivise tra le cellule figlie. Una terza teoria vede l’intero
complesso del Golgi diviso in due, per cui ogni cellula figlia riceve metà della struttura
originale.
Differenti tipi di cellule o organismi utilizzano diversi meccanismi per ereditare il Golgi.
Studi recenti su cellule di mammifero suggeriscono che il RE resta relativamente intatto
durante la mitosi, facendo accantonare l’idea della frammentazione del RE.

2.PROMETAFASE
La scomparsa dell’involucro nucleare segna l’inizio della seconda fase della mitosi, la
prometafase, in cui si forma in modo definitivo il fuso mitotico ed i cromosomi vengono
spostati al centro della cellula..
All’inizio della prometafase, i cromosomi compattati sono sparsi nello spazio che era la
regione nucleare. Non appena i microtubuli del fuso penetrano nella regione centrale della
cellula, le loro estremità libere (+) crescono e si contraggono in modo altamente dinamico,
cercando un cromosoma.
I microtubuli che si trovano in vicinanza di un centromero vengono catturati e stabilizzati da
un cinetocore.
Un cinetocore prende inizialmente contatto con la superficie laterale del microtubulo
piuttosto che con quella terminale. Una volta avvenuto il contatto, alcuni cromosomi iniziano
a muoversi attivamente lungo la superficie laterale del microtubulo, trascinati da proteine
motrici situate nel cinetocore, e subito questo tende ad associarsi con le estremità più di uno
o più microtubuli del fuso di uno dei due poli. Alla fine, il cinetocore libero sul cromatide
fratello cattura i suoi microtubuli dal polo opposto.
Alla fine i due cromatidi fratelli di ciascun cromosoma mitotico si vengono a connettere, per
mezzo dei loro cinetocori, con microtubuli che si estendono ai poli opposti.
I cromosomi di una cellula in prometafase vengono mossi per mezzo di un processo chiamato
congressione verso il centro del fuso, a metà strada tra i poli.
Non appena i cromosomi si muovono verso il centro del fuso, tra i due poli, microtubuli più
lunghi si accorciano, mentre quelli più corti si allungano. Questi cambiamenti si ritiene siano
governati da differenze nella tensione sui due cinetocori fratelli. L’accorciamento e
l’allungamento dei microtubuli avvengono principalment per perdita/aggiunta di subunità
all’estremità più.
Alla fine ogni cromosoma si porta su di un piano al centro del fuso, cosicché i microtubuli
derivanti da ciascun polo hanno la stessa lunghezza.

3.METAFASE
Una volta che tutti i cromosomi sono stati allineati all’equatore del fuso, la cellula ha
raggiunto lo stadio di metafase. Il piano di allineamento dei cromosomi in metafase è
indicato come piastra metafasica.
Il fuso della cellula in metafase è costituito da un insieme di microtubuli altamente
organizzato, ideale per il compito di separare i cromosomi duplicati e situati al centro della
cellula. I microtubuli della cellula metafasica possono essere suddivisi, dal punto di vista
funzionale, in tre gruppi:
- Microtubuli astrali (o dell’astral): irradiano dal centrosoma verso la zona esterna del
fuso. Hanno funzione di aiutare a disporre nella giusta posizione l’apparato del fuso nella
cellula e determinare il piano della citocinesi.
- Microtubuli cromosomici (o del cinetocore): si estendono dal centrosoma ai cinetocori dei
cromosomi. Durante la metafase, i microtubuli esercitano una forza trainante sui
cinetocori. Ne risulta che i cromosomi sono mantenuti sul piano equatoriale da una
specie di tiro alla fune tra forze traenti equivalenti esercitate dalle fibre cromosomiche
del fuso dai poli opposti. Durante l’anafase, sono necessari microtubuli cromosomici
verso i poli.
- Microtubuli polari (o interpolari): si estendono dal centrosoma oltre i cromosomi. I
microtubuli polari formano una struttura simile ad un cestello, che mantiene l’integrità
del fuso.

Flusso dei microtubuli nel fuso in metafase: quando i cromosomi sono allineati nella piastra
metafasica, i microtubuli sono in uno stato altamente dinamico. Le subunità vengono
rapidamente eliminate ed aggiunte all’estremità più dei microtubuli cromosomici anche se
queste estremità sono presumibilmente attaccate ai cinetocori. Così, il cinetocore è una
zona di grande attività.
Visto che, all’estremità più vengono aggiunte molte più subunità rispetto a quelle che
vengono eliminate, si assiste ad un netto aumento di subunità nella zona dei cinetocore. Allo
stesso tempo, si ha una perdita netta di subunità alla estremità meno dei microtubuli, perci
si pensa che le subunità si muovano lungo i microtubuli cromosomici, dal cinetocore al polo.

4. ANAFASE
L’anafase inizia non appena i cromatidi fratelli si allontanano l’uno dall’altro ed
incominciano a muoversi verso i poli opposti.

Il ruolo della proteolisi nella progressione del processo mitotico: due distinti complessi
multiproteici, SCF e APC, agiscono a differenti stati del ciclo per marcare con ubiquitina le
proteine in modo che possano essere distrutte da un proteasoma. SCF agisce principalmente
durante l’intefase. Il secondo complesso, il complesso promotore dell’anafase, o APC, gioca
un ruolo chiave nel regolare gli eventi che si verificano durante la mitosi. APC contiene circa
una dozzina di subunità centrali, oltre ad una proteina adattatrice che ha un ruolo
importante nel determinare quale proteina servirà come substrato per APC. Due versioni di
questa proteina, Cdc20 e Cdh1, giocano un ruolo importante nella selezione del substrato
durante la mitosi. I complessi APC che contengono una delle due subunità vengono
denominati APCCd20 o APCCdh1.
APCCd20 viene attivato prima della transizione metafase/anafase e marca con ubiquitina un
importante inibitore dell’anafase, la securina che è coinvolto nell’unione dei cromatidi
fratelli.
La distruzione della securina al termine della metafase, da inizio ad una serie di reazioni a
catena che portano al taglio del complesso della coesina che teneva uniti i cromatidi,
portando così all’inizio della separazione dei cromatidi e alla loro migrazione verso i poli
opposti, durante l’anafase.
Verso la fine della mitosi, la subunità Cdc20 di APC è inattivata e sostituita dalla subunità
Cdh1.
Quando Cdh1 è associata ad APC, l’enzima mostra preferenza nel marcare con ubiquitina la
ciclina B.
La distruzione della ciclina porta ad una caduta improvvisa dell’attività della Cdk mitotica e
alla progressione della cellula verso l’uscita della mitosi e la fase G₁ del ciclo successivo. Se
la distruzione della ciclina B è impedita da un inibitore del proteasoma, le cellule restano
bloccate in uno stadio tardivo della mitosi. Il completamento della mitosi richiede che
l’attività di Cdk1 abbia termine, o con la normale distruzione della sua componente ciclina,
indispensabile per la sua attività, o per mezzo di un’inibizione sperimentale. La proteolisi è
importante affinché il ciclo cellulare normale possa proseguire in una direzione sola e
irreversibile.
Eventi dell’anafase: tutti i cromosomi della piastra metafasica vengono separati nello stesso
momento all’inizio dell’anafase ed i singoli cromatidi (chiamati oramai cromosomi perché
non sono più legati alla rispettiva controparte) iniziano la loro migrazione verso il polo.
Quando il cromosoma si muove durante l’anafase, è possibile vedere il suo centromero che
traina i bracci del cromosoma e guida così il movimento. Il movimento dei cromosomi verso
i poli opposti è molto lento, per assicurare una segregazione accurata e priva di errori. Il
movimento dei cromosomi verso i poli del fuso è accompagnato dall’ovvio accorciamento
dei microtubuli cromosomici. L’accorciamento dei microtubuli è dovuto principalmente ad
una perdita netta di subunità dalle estremità più, durante l’anafase.
La principale differenza nella dinamica dei microtubuli tra metafase ed anafase è che le
subunità sono aggiunte alle estremità più dei microtubuli durante la metafase, mantenendo
la lunghezza delle fibre cromosomiche costante, mentre le subunità sono perse
dall’estremità più durante l’anafase, risultando in un accorciamento delle fibre
cromosomiche.
Il movimento dei cromosomi verso i poli viene indicato come anafase A, per distinguerlo
dall’anafase B, in cui i due poli del fuso si allontanano. L’allungamento del fuso mitotico
nell’anafase B è dovuto ad un’aggiunta netta di subunità di tubulina all’estremità più dei
microtubuli polari.

Le cellule possiedono meccanismi di controllo dello stato degli eventi durante il ciclo
cellulare. Uno di questi punti di controllo è attivo durante la transizione da metafase ad
anafase. Il punto di controllo dell’assemblaggio del fuso (SAC) risulta evidente quando uno o
più cromosomi non si sono ben allineati sulla piastra metafasica. In questi casi il controllo
ritarda l’inizio dell’anafase fino a quando il cromosoma fuori posto non abbia ripreso la sua
posizione corretta all’equatore del fuso. Se la cellula non è in grado di ritardare il momento
della segregazione dei cromosomi, aumentano le possibilità di generare anomalie.
I cinetocori non attaccati contengono un complesso di proteine, tra le quali la più studiata è
Mad2, che media il punto di controllo dell’assemblaggio del fuso. La presenza di queste
proteine ad un cinetocore non attaccato produce un segnale di attesa che fa ritardare la
progressione in anafase. Una volta che il cromosoma indisciplinato si attacca alle fibre del
fuso di entrambi i poli e quindi risulta allineato idoneamente alla piastra metafasica, il
complesso di segnalazione lascia il cinetocore, spegnendo il segnale di attesa e permettendo
alla cellula di progredire in anafase.
Se la cellula contiene cromosomi non allineati, le molecole Mad2, sono capaci di inibire la
progressione del ciclo cellulare. L’inibizione è realizzata attraverso l’interazione diretta tra
Mad2 e Cdc20 attivatore di APC. Durante il periodo che Cdc20 è legata a Mad2, i complessi
APC sono incapaci di ubiquitinare la securina, inibitore dell’anafase, che mantiene tutti i
cromatidi fratelli attaccati l’uno all’altro mediante la coesina.
Il punto di controllo dell’assemblaggio del fuso viene attivato dalla presenza di un cinetocore
non associato a microtubuli.
Le cellule riescono a correggere gli attacchi sintelici e altri tipi di connessioni anomale tra
cinetocore e microtubuli grazie ad un enzima chiamato chinasi Aurora B, che fa parte di un
complesso di proteine mobili che risiede nei cinetocori durante la prometafase e la
metafase. Tra i substrati della chinasi Aurora B troviamo molte delle proteine che sono
coinvolte nell’attacco microtubuli-cinetocore, compresi alcuni membri del complesso Dam1
e del complesso Ncd80. La chinasi Aurora B fosforila i substrati proteici in presenza di un
cromosoma attaccato in maniera scorretta.

5. TELOFASE
Non appena i cromosomi raggiungono i rispettivi poli, essi tendono a raggrupparsi in una
massa e ci determina l’inizio dell’ultimo stadio della mitosi, la telofase. La telofase
rappresenta il momento in cui le cellule figlie ritornano alle condizioni di interfase: il fuso
mitotico si disassembla, si riforma l’involucro nucleare e i cromosomi si disperdono via via
sempre di più, fino a non essere più visibili al microscopio.

Forze richieste per i movimenti nella mitosi


La mitosi è un processo caratterizzato da ampi movimenti di strutture cellulari.
La profase è accompagnata dal movimento dei poli del fuso verso i lati opposti della cellula,
la prometafase dal movimento dei cromosomi verso l’equatore del fuso, l’anafase A dal
movimento dei cromosomi dall’equatore verso i rispettivi poli e l’anafase B
dall’allungamento del fuso.
Tutte le proteine motrici coinvolte nel movimento mitotico sono motori microtubulari,
comprese la dineina citoplasmatica e altre numerose proteine collegate alla chinesina.
Proteine motrici sono state localizzate ai poli del fuso, lungo le fibre del fuso e all’interno
del cinetocore e dei bracci dei cromosomi.
- Le proteine motrici dei microtubuli polari potrebbero essere responsabili del
mantenimento dei due poli separati
- Le proteine motrici sui cromosomi potrebbero essere importanti per i movimenti di
oscillazione dei cromosomi nella prometafase, nel mantenere i cromosomi sulla piastra
metafasica e nel separare i cromosomi durante l’anafase
- Le proteine motrici dei microtubuli che si sovrappongono nella zona equatoriale del fuso
potrebbero essere responsabili dell’allungamento del fuso durante l’anafase.

Citocinesi
È un processo grazie al quale la cellula viene divisa nelle due cellule figlie. In una cellula
animale, si pu vedere un primo accenno di citocinesi durante la tarda anafase, quando
attorno alla superficie cellulare appare una stretta banda che mostra una sorta di
strozzatura. Con il procedere del tempo la strozzatura diventa più profonda, come un solco
che circonda completamente la cellula. Al momento in cui una cellula è diventata due
cellule, la membrana plasmatica addizionale è trasportata alla superficie cellulare attraverso
vescicole citoplasmatiche che vanno a fondersi con il solco di divisione in avanzamento. Il
solco continua ad approfondirsi e passa attraverso i residui strettamente impaccati dalla
porzione centrale del fuso mitotico, che forma un ponte citoplasmatico tra le cellule figlie.
Le superfici opposte infine, prendono contatto nel centro della cellula e la cellula viene
divisa in due.
Si pensa che il meccanismo responsabile della citocinesi è di Marsland che ipotizz che la
forza necessaria per dividere la cellula in due derivasse da una sottile striscia di citoplasma
contrattile, localizzata nel cortex. Esaminando al microscopio il cortex appena sotto il
solco di una cellula in divisione, si osserva la presenza di numerosi filamenti di actina.
Sparsi tra i filamenti di actina sono presenti numerosi piccoli e corti filamenti bipolari di
miosina, costituiti da miosina II, molto importante nella citocinesi.
Il meccanismo che genera la forza che opera nella citocinesi è simile alla contrazione
actinamiosina della cellula muscolare. Lo slittamento dei filamenti dell’anello contrattile tira
il cortex e la membrana plasmatica ad esso attaccata verso il centro della cellula. Ne risulta
che l’anello contrattile costringe la regione equatoriale della cellula.
Si ritiene che la posizione del solco di divisione sia determinata dal fuso mitotico all’anafase.
È stato dimostrato che l’anello contrattile si forma sempre su un piano che si trova a metà tra
i due poli del fuso, e questi studi suggeriscono anche che il sito di assemblaggio dell’actina (e
quindi il piano della citocinesi) è determinato da segnali che provengono dai poli del fuso. Si
pensa che il segnale viaggi dai poli del fuso al cortex lungo i microtubuli astrali. Quando la
distanza tra i poli e il cortex viene modificata sperimentalmente, i tempi della citocinesi
possono essere alterati in modo significativo.

LA MEIOSI
La formazione di progenie per riproduzione sessuata comporta l’unione di due cellule, ciascuna
con un proprio corredo aploide di cromosomi. La duplicazione del numero dei cromosomi che
avviene durante la fecondazione è compensata da una riduzione equivalente del numero dei
cromosomi, che avviene nello stadio precedente alla formazione dei gameti. La riduzione del
numero dei cromosomi viene raggiunta con la meiosi, che assicura la produzione di una fase
aploide del ciclo vitale, mentre la fecondazione consente una fase diploide. Senza la meiosi, il
numero dei cromosomi raddoppierebbe ad ogni generazione e la riproduzione sessuata non
sarebbe possibile.
Prima della meiosi (o della mitosi), le cellule diploidi in G₂ contengono coppie di cromosomi
omologhi, ciascuno dei quali è composto da due cromatidi. Durante la mitosi, i cromatidi di
ciascun cromosoma vengono divisi e separati nel due nuclei figli in un’unica divisione. Le cellule
prodotte per mitosi contengono coppie di cromosomi omologhi e sono geneticamente identiche
alle cellule progenitrici.
La meiosi differisce in quanto, i quattro cromatidi di una coppia di cromosomi omologhi replicati
vengono distribuiti tra quattro nuclei figli. La meiosi realizza ci con due divisioni sequenziali.
Nella prima divisione meiotica, ciascun cromosoma (formato da 2 cromatidi) è separato dal suo
omologo. Di conseguenza, ciascuna cellula figlia contiene solo un membro di ciascuna coppia di
omologhi. I cromosomi omologhi sono appaiati durante la profase I per mezzo di un processo
complicato. Una volta appaiati, i cromosomi omologhi sono impegnati in un processo di
ricombinazione genetica che produce cromosomi con una nuova combinazione di alleli materni e
paterni.
Durante la seconda divisione meiotica, i due cromatidi di ciascun cromosoma sono separati uno
dall’altro.
Si possono distinguere 3 meiosi a seconda del momento del ciclo vitale in cui avviene:
1. Meiosi gametica o terminale. In questo gruppo la meiosi è strettamente legata alla
formazione dei gameti. Nei maschi dei vertebrati la meiosi avviene appena prima della
differenziazione degli spermatozoi. Gli spermatogoni diventano dapprima spermatociti
primari, che subiscono due divisioni meiotiche e danno luogo a quattro spermatidi non
ancora differenziati. Ogni spermatidio deve subire una complessa trasformazione per
diventare uno spermatozoo specializzato. Nelle femmine dei vertebrati, gli
oogoni diventano oociti primari, che entrano in una profase meiotica che dura molto a
lungo. Durante la profase, l’oocita primario cresce e si riempie di tuorlo e di altre
sostanze. La divisione meiotica avviene solo dopo che l’oocita ha completato la sua
differenziazione. La meiosi viene completata poi dopo la fecondazione, quando lo
spermatozoo si trova nel citoplasma dell’uovo.
2. Meiosi zigotica o iniziale: comprende solo protisti e funghi
3. Meiosi sporofitica o intermedia: comprende tutte le piante più evolute e poche alghe.

Stadi della meiosi


La meiosi viene preceduta dalla replicazione del DNA. La fase S premeiotica è generalmente
molto più lunga della fase S premitotica. Al contrario la profase I della meiosi è molto più lunga
e complessa della profase mitotica. Nella donna, ad esempio, gli oociti entrano nella profase I
prima della nascita e rimangono in questo stadio per molto tempo e riprendono la meiosi appena
prima dell’ovulazione.
Dal momento che la prima profase meiotica è così lunga e complessa, viene suddivisa in varie
fasi che sono simili in tutti gli eucarioti che si riproducono sessualmente.
Leptotene, è la prima fase della profase I ed è il momento in cui i cromosomi diventano via via
più visibili al microscopio ottico, ma non c’è alcuna indicazione che siano effettivamente formati
da un paio di cromatidi identici. Zigotene, invece è la seconda fase dove avviene la sinapsi,
processo che porta all’appaiamento dei due omologhi. La sinapsi è un processo non ancora molto
chiaro. Gli omologhi sono appaiati in qualche misura prima che inizi la profase meiotica. I
telomeri (sequenze terminali) dei cromosomi nel leptotene sono distribuiti in tutto il nucleo.
Quindi, verso la fine del leptotene, c’è una notevole riorganizzazione, così che i telomeri
vengono localizzati sulla superficie interna dell’involucro nucleare ad un lato del nucleo. Il
raggrupparsi dei telomeri ad una estremità dell’involucro nucleare avviene in una ampia varietà
di cellule eucariotiche. Il raggrupparsi dei telomeri facilita l’allineamento egli omologhi in
preparazione della sinapsi.
La sinapsi tra i cromosomi avviene per mezzo di una struttura complessa che è detta complesso
sinaptinemale. Il complesso sinaptinemale (CS) è una struttura che ricorda una scala a pioli, ed è
costituito da due barre parallele, con numerose fibre trasversali che connettono la barra
centrale con le due laterali.
La cromatina di ciascun omologo è organizzata in anse che si estendono da un elemento laterale
del CS.
Gli elementi laterali sono composti principalmente da coesina, che probabilmente lega insieme
la cromatina dei cromatidi fratelli. Il CS non è necessario per la ricombinazione e infatti viene
formato dopo che la ricombinazione è iniziata. Si pensa che il CS funzioni come un impalcatura
per permettere ai cromatidi che interagiscono di completare le loro attività di crossing over.
Quando una coppia di cromosomi omologhi si unisce in sinapsi dà origine ad un complesso
bivalente (fa riferimento alla presenza di 2 omologhi) o tetrade (fa riferimento alla presenza di 4
cromatidi).
La fine della sinapsi segna il termine dello zigotene e l’inizio della fase successiva, il pachitene,
che è caratterizzato dalla completa formazione del complesso sinaptinemale. Durante questa
fase il CS tiene gli omologhi a stretto contatto per tutta la loro lunghezza. Il DNA di cromatidi
fratelli è esteso in anse parallele. All’interno del CS, si possono osservare numerosi noduli di
ricombinazione, perché corrispondono ai siti dove avviene il crossing over. Sembra che i noduli
di ricombinazione contengano il meccanismo enzimatico per la ricombinazione genetica, la
quale viene completata alla fine del pachitene.
La quarta fase della profase I è il diplotene, caratterizzato dal dissolvimento dei CS e alla
tendenza alla dissociazione da parte dei cromosomi omologhi del bivalente. Anche se si
allontanano, gli omologhi restano comunque a stretto contatto in alcuni punti tramite strutture
a forma di X dette chiasmi, che rappresentano le zone dei cromosomi in cui è avvenuto un
crossing over.
I chiasmi sono formati dalle giunzioni covalenti tra due dei quattro cromatidi di un bivalente,
uno da ciascun omologo.
Nei vertebrati, il diplotene rappresenta la fase più lunga dell’oogenesi, ed è il momento in cui la
cellula effettua la maggior parte della propria crescita, ed è quindi una fase con intensa attività
metabolica.
L’ultimo stadio della profase I meiotica è la diacinesi, in cui viene assemblato il fuso meiotico e i
cromosomi sono preparati alla separazione. La scomparsa del nucleolo, la rottura dell’involucro
nucleare, la migrazione delle tetradi verso la piastra metafasica, segnano il termine della
diacinesi. Negli oociti dei vertebrati tutti questi eventi sono innescati da un aumento
dell’attività protein-chinasica di MPF (fattore di promozione della maturazione). Nella maggior
parte degli eucarioti è ancora possibile osservare i chiasmi nei cromosomi omologhi allineati
sulla piastra metafasica. I chiasmi infatti tengono insieme i cromosomi omologhi a formare
ancora il bivalente. Nei vertebrati, compreso l’uomo, ogni coppia di omologhi forma almeno un
chiasma, e nei cromosomi più lunghi se ne possono osservare più di uno.

Alla metafase I, i due cromosomi omologhi di ciascun bivalente sono connessi alle fibre del fuso
provenienti dai poli opposti. Allo stesso tempo, i cromatidi fratelli sono connessi ai microtubuli
dello stesso polo del
fuso, e ci è reso possibile dalla diposizione lato a lato dei loro cinetocori. L’orientamento dei
cromosomi materni e paterni di ciascun bivalente sulla piastra metafasica è casuale.
Quando i cromosomi si separano durante l’anafase I, ogni polo riceve un assortimento casuale di
cromosomi paterni e materni. L’anafase I rappresenta l’evento citologico corrispondente alla
lette di Mendel dell’assortimento indipendente. Gli organismi sono capaci di generare una
varietà quasi illimitata di gameti.
La separazione dei cromosomi omologhi all’anafase I richiede la dissoluzione dei chiasmi che
tengono insieme il bivalente. I chiasmi scompaiono alla transizione metafase I – anafase I,
quando i bracci dei cromatidi di ciascun bivalente perdono coesione. La perdita di coesione tra i
bracci è realizzata dal taglio proteolitico delle molecole di coesina in quelle regioni del
cromosoma. Al contrario, la coesione tra i centromeri attaccati dei cromatidi fratelli resta forte
e i cromatidi fratelli restano saldamente attaccati l’uno all’altro quando essi si muovono insieme
verso un polo del fuso durante l’anafase I.
La telofase I comporta cambiamenti meno vistosi rispetto a quelli della telofase nella mitosi. I
cromosomi non raggiungono lo stato di estrema estensione del nucleo interfasico.
Durante la telofase I, l’involucro nucleare pu essere riformato o meno. L’intervallo tra le due
divisioni meiotiche è detto intercinesi ed ha una durata generalmente breve. Le cellule che negli
animali si trovano in questo stadio di transizione prendono il nome di spermatociti secondari o
oociti secondari. Queste cellule sono caratterizzate dall’avere un numero aploide di cromosomi,
perché contengono solo un membro di ciascuna coppia di omologhi, ma una quantità diploide di
DNA nucleare, infatti ogni cromosoma è ancora costituito da una coppia di cromatidi fratelli.
All’intercinesi fa seguito la profase II, che risulta molto più semplice rispetto alla I. Se
l’involucro nucleare si era riformato nella telofase I, esso viene nuovamente distrutto. I
cromosomi ricondensano e si allineano sulla piastra metafasica.
Nella metafase II, i cinetocori dei cromatidi fratelli sono orientati in maniera opposta rispetto ai
poli e vengono legati da gruppi opposti di fibre cromosomiche del fuso. La metafase II è quello
stadio in cui gli oociti dei vertebrati bloccano la loro progressione in meiosi per aspettare la
fecondazione. Si pensa che il blocco sia causato da fattori che inibiscono l’inattivazione di
APCCdc20, che inibisce la degradazione della ciclina B. Il blocco della metafase II sarà eliminato
solo quando l’oocita (ora uovo) sarà fecondato.
La fecondazione porta ad un rapido influsso di ioni Ca²⁺, l’attivazione di APCCdc20 e la
degradazione della ciclina B. L’uovo fecondato risponde a questi cambiamenti completando la
seconda divisione meiotica.
L’anafase II inizia con la rottura contemporanea di quei legami che tenevano uniti i cromatidi
fratelli, permettendogli di migrare verso i poli opposti della cellula.
La telofase II segna il termine della meiosi II, quando i cromosomi sono di nuovo racchiusi
nell’involucro nucleare. I prodotti della meiosi sono cellule aploidi con un numero aploide di
cromosomi e con una quantità aploide (1C) di DNA nucleare.

Ricombinazione genetica nella meiosi


La meiosi ha un ruolo fondamentale nell’aumentare la variabilità genetica in una popolazione di
organismi da una generazione all’atra. L’assortimento indipendente permette ai cromosomi
paterni e materni di mescolarsi durante la formazione dei gameti, e la ricombinazione genetica
(crossing over) fa sì che gli alleli paterni e materni di un dato cromosoma possano scambiarsi
anch’essi. Senza la ricombinazione genetica, gli alleli presenti su un particolare cromosoma
rimarrebbero legati assieme, generazione dopo generazione.
Mescolando gli alleli paterni e gli alleli materni tra i cromosomi omologhi, la meiosi genera
organismi aventi nuove combinazioni genotipiche e fenotipiche.
La ricombinazione genetica comporta una rottura fisica di singole molecole di DNA ed una
cucitura tra le estremità tagliate di una molecola di DNA a doppio filamento con le estremità
tagliate di una molecola di DNA a doppio filamento del cromosoma omologo.
La ricombinazione è un processo estremamente preciso, che avviene tra siti corrispondenti di
molecole di DNA omologhe e non comporta l’aggiunta o la perdita di una singola coppia di basi.
La ricombinazione deve basarsi sulla complementarietà esistente tra le sequenze di basi tra il
singolo filamento di un cromosoma ed il filamento omologo dell’altro cromosoma.
La precisione della ricombinazione è assicurata dal coinvolgimento degli enzimi del riparo del
DNA, i quali provvedono a riempire i vuoti che si formano durante il processo di scambio. Nelle
cellule eucariotiche, le due molecole di DNA che si preparano a ricombinare sono inizialmente
allineate l’una di fianco all’altra come risultato di una sorta di ricerca di omologia, in cui le
molecole di DNA omologhe si associano in previsione della ricombinazione. Una volta che le
molecole sono allineate, si produce in ogni doppia elica una rottura di ambedue i filamenti ad
opera dell’enzima Spo11 e l’intervallo viene successivamente allargato dall’azione della
esonucleasi 5’  3’ o meccanismo alternativo. I filamenti rotti possiedono code a singolo
filamento libere, ciascuna con un 3’ – OH terminale. Una delle code a singolo filamento lascia la
propria doppia elica ed invade la molecola di DNA di un cromatide non fratello formando legami
idrogeno con il filamento complementare della vicina doppia elica.
L’invasione di un filamento attiva un meccanismo di riparo del DNA che riempie l’intervallo.
Come risultato dello scambio reciproco di filamenti di DNA, le due doppie eliche sono legate
covalentemente l’una all’altra a formare una unica molecola (eteroduplex) che contiene una
coppia di crossover del DNA, dette giunzioni di Holliday, che fiancheggiano la regione di scambio
dei filamenti.
La formazione della giunzione di Holliday e la migrazione della ramificazione si verificano
durante il pachitene.
Per separare le giunzioni di Holliday interconnesse e riparare il DNA è necessario che avvenga un
altro ciclo di rottura. A seconda dei particolari filamenti di DNA che vengono rotti e rilegati,
possono formarsi due prodotti differenti: in un caso, le due doppie eliche contengono solo
piccoli tratti di DNA che hanno avuto uno scambio genetico, e questo rappresenta un assenza di
crossover. Nell’altro caso, la doppia elica di una molecola di DNA sarà unita alla doppia elica
della molecola omologa, creando così un sito di ricombinazione genetica (crossover). I crossover
rappresentano la fusione tra i cromosomi materni e quelli paterni, e si sviluppano nei chiasmi
richiesti per tenere gli omologhi insieme durante la meiosi I.

SEGNALAZIONE CELLULARE E TRASDUZIONE DEL SEGNALE: COMUNICAZIONE


FRA LE CELLULE
La maggior parte delle cellule animali e vegetali è specializzata e svolge ruoli specifici, ma nei
processi biologici queste cellule lavorano in modo coordinato grazie alla comunicazione
cellulare. Molti processi biologici richiedono a diversi tipi di cellule di lavorare assieme in modo
coordinato e per far questo è necessario che le cellule comunichino tra loro, controllino le
condizioni del loro ambiente e rispondano in modo appropriato ad una serie di stimoli. Le cellule
attuano queste interazioni per mezzo di un fenomeno detto segnalazione cellulare (cell
signaling), che permette alle cellule di rispondere in modo appropriato a specifici stimoli
provenienti dall’ambiente esterno.
La segnalazione cellulare pu riguardare ogni aspetto della struttura e della funzione cellulare.

Di solito le cellule comunicano fra loro grazie a molecole di segnalazione extracellulari. Questi
messaggeri extracellulari possono percorrere brevi distanze andando a stimolare cellule in
prossimità dell’origine del messaggio, oppure possono viaggiare per tutto il corpo per stimolare
potenzialmente cellule che si trovano molto lontano dall’origine del messaggio.
- Segnalazione autocrina: la cellula che produce il messaggero esprime recettori di superficie
capaci di rispondere a quel messaggio. Di conseguenza, le cellule che rilasciano il messaggio
stimolano o inibiscono se stesse.
- Segnalazione paracrina: le molecole di messaggero percorrono solo brevi distanze attraverso
lo spazio extracellulare per raggiungere cellule che si trovano in prossimità della cellula che
sta generando il messaggio. Le molecole di messaggero paracrine sono in genere limitate
nella capacità di circolare per l’organismo poiché o sono intrinsecamente instabili, o sono
degradate da enzimi o si legano alla matrice extracellulare.
- Segnalazione endocrina: le molecole di messaggero raggiungono le cellule bersaglio
viaggiando nel circolo sanguigno. I messaggeri endocrini sono anche detti ormoni e
tipicamente agiscono su cellule bersaglio localizzate in siti distanti all’interno
dell’organismo.
La segnalazione cellulare inizia con il rilascio di molecole segnale da parte di cellule che
mandano dei messaggi ad altre cellule situate in altri distretti del corpo (FASE 1). Le cellule
possono rispondere a segnali extracellulari soltanto se esprimono i recettori specifici che
riconoscono e legano le molecole segnale (FASE 2). Nella maggior part edei casi, le molecole
segnale (o ligandi) si legano a recettori espressi sulla superficie cellulare e questo provoca un
segnale che si propaga attraverso la membrana fino al dominio citoplasmatico del recettore
(FASE 3). Una volta raggiunto il lato interno della membrana citoplasmatica, ci sono due vie
principali mediante le quali il segnale viene trasmesso all’interno della cellula, dove promuove
la risposta appropriata. La via di trasduzione del segnale dipende dal tipo di recettore che è
stato attivato.
nelle due principali vie di trasduzione del segnale sono:
- Un tipo di recettore trasmette il segnale dal suo dominio citoplasmatico a un enzima
chiamato effettore (FASE 4), che catalizza a produzione di un secondo messaggero (FASE 5). I
secondi messaggeri sono piccole molecole che attivano (o inattivano) specifiche proteine. In
base alla sua struttura chimica, un secondo messaggero pu diffondere nel citosol o rimanere
nel doppio strato lipidico della membrana plasmatica.
- Un altro tipo di recettore trasmette il segnale trasformando il proprio dominio
citoplasmatico in una stazione di reclutamento di proteine segnale intracellulari (FASE 4a).
Queste proteine possono interagire tra di loro o con componenti della membrana cellulare,
mediante specifici domini di interazione, come SH3.
Indipendentemente dal fatto che il segnale sia trasmesso da un secondo messaggero o dal
reclutamento di proteine, il risultato è sempre l’attivazione di una proteina situata all’inizio di
una via di segnalazione intracellulare (FASE 6). Le vie di segnalazione sono le autostrade
dell’informazione e ciascuna di queste vie è costituita da una serie di proteine distinte che
operano in sequenza (FASE 7). Le proteine di una via di segnalazione agiscono in genere
modificando la conformazione della proteina successiva (a valle) nella sequenza, un evento che
attiva o inibisce quella proteina.
Modificazioni nella conformazione d proteine di una via di segnalazione sono attuate
comunemente da protein-chinasi e fosfatasi che aggiungono o rimuovono gruppi fosfato. La
maggior parte delle protein-chinasi trasferisce gruppi fosfato a residui di serina o treonina
presenti nelle proprie proteine substrato, ma un gruppo molto importante di protein-chinasi
fosforila residui di tirosina.
Alcune di queste chinasi e fosfatasi sono proteine citoplasmatiche solubili, altre sono proteine
integrali di membrana. Ciascuna protein-chinasi è in grado di riconoscere soltanto i suoi substrati
specifici, ignorando tutti gli altri. Alcune protein-chinasi e fosfatasi hanno numerose proteine
come loro substrati, mentre altre fosforilano o defosforilano solo un singolo substrato proteico.
Molti dei substrati di questi enzimi sono altri enzimi, più spesso altre chinasi o fosfatasi, ma i
substrati proteici possono includere canali ionici, fattori di trascrizione ecc.
La fosforilazione pu modificare le proprietà delle proteine in diversi modi. Mediante
fosforilazione si pu attivare o inattivare un enzima, aumentare o diminuire le interazioni fra
proteine, promuovere la traslocazione di una proteina a un compartimento subcellulare a un
altro, o ancora promuovere la degradazione di una proteina.
I segnali trasmessi lungo le vie di segnalazione raggiungono infine le proteine bersaglio (FASE 8),
che sono proteine coinvolte in processi cellulari fondamentali (FASE 9). Secondo il tipo di cellule
e di messaggio, la risposta iniziata dalla proteina bersaglio potrà riguardare la modifica
dell’espressione genica, la regolazione dell’attività di enzimi metabolici, la riorganizzazione del
citoscheletro, l’aumento o la diminuzione della mobilità cellulare, il cambiamento della
permeabilità ionica, l’attivazione della sintesi del DNA o persino l’induzione della morte
cellulare. Tutte le attività cellulari sono virtualmente regolate da segnali che originano dalla
superficie della cellula.
La trasduzione del segnale è l’intero processo che traduce l’informazione portata dal
messaggero extracellulare in cambiamenti intracellulari.
La segnalazione deve infine essere terminata, e questo permette alla cellula di rispondere di
nuovo ad altri messaggi. Prima di tutto, deve essere eliminato il messaggero extracellulare.
Alcune cellule producono enzimi extracellulari in grado di distruggere il messaggero
extracellulare. In altri casi, i recettori attivati sono internalizzati e una volta all’interno della
cellula, i recettori possono essere degradati assieme ai loro ligandi, lasciando la cellula in uno
stato di minore recettività ad ulteriori stimoli. In alternativa, recettori e ligandi sono separati
nell’endosoma, i ligandi degradati e i recettori riportati alla superficie della cellula.

Una grande varietà di molecole sono veicoli extracellulari di informazioni, tra cui:
- Piccole molecole come amminoacidi e loro derivati, come glutammato, glicina,
acetilcolina, adrenalina ecc. Queste molecole sono neurotrasmettitori e ormoni.
- Gas, come NO e CO.
- Steroidi, derivati dal colesterolo. Gli ormoni steroidei regolano il dimorfismo sessuale, la
gravidanza, il metabolismo dei carboidrati e la fuoriuscita degli ioni sodio e potassio. -
Eicosanoidi, molecole non polari di 20 atomi di carbonio derivate da un acido
grasso (acido arachidonico), che regolano una varietà di processi tra cui dolore,
infiammazione, pressione sanguigna e coagulazione.
- Molti polipeptidi e proteine, alcune delle quali sono proteine transmembrana espresse
sulla superficie di cellule che interagiscono con le cellule bersaglio. Altre proteine fanno
parte della matrice extracellulare o ne sono associate. Infine, un gran numero di proteine
secrete nello spazio extracellulare e regolano la divisione cellulare, la risposta
immunitaria e la morte o sopravvivenza delle cellule.

Le molecole segnale extracellulari sono spesso riconosciute da specifici recettori presenti sulla
superficie della cellula bersaglio. I recettori legano le loro molecole segnale con alta affinità e
traducono l’interazione che avviene sulla superficie esterna della cellula in cambiamenti
intracellulari. I recettori evolutisi per mediare la trasduzione del segnale sono:
- Recettori accoppiati a proteine G (GPCR), un’ampia famiglia di recettori che contengono
sette α – eliche transmembrana. Questi recettori traducono il legame della
molecola segnale extracellulare nell’attivazione i proteine che legano il GTP.
- Recettori tirosin – chinasi (RTK). Il legame di uno specifico RTK provoca di solito la
dimerizzazione del recettore, seguita dall’attivazione del dominio protein-chinasi
associato alla regione citoplasmatica. In seguito all’attivazione, queste protein-chinasi
fosforilano specifici residui di tirosina sui loro substrati citoplasmatici modulando così la
loro attività, la loro localizzazione o la loro capacità di interazione con altre proteine
nella cellula.
- Recettori canale , che sono regolati dal legame con ligandi extracellulari. La capacità di
queste proteine di guidare un flusso di ioni attraverso la membrana plasmatica è regolata
direttamente dall’interazione con il ligando. Il flusso di ioni attraverso la membrana
induce un cambiamento temporaneo del potenziale di membrana al quale sono sensibili
altre proteine di membrana, come i canali voltaggio-dipendenti.
Questa sequenza di eventi è alla base dell’impulso nervoso. Inoltre, il flusso di alcuni
ioni, come Ca²⁺, pu cambiare l’attività di certi enzimi citoplasmatici.
- Recettori per gli ormoni steroidei, che sono fattori trascrizionali regolati da ligando.
Diffondono attraverso la membrana plasmatica e si legano a recettori localizzati nel
citoplasma. Il legame dell’ormone provoca un cambiamento di conformazione del
recettore e la traslocazione del complesso ormone-recettore nel nucleo, dove si lega al
promotore o ad altre regioni regolatrici (enhancer) dei geni sensibili all’ormone. Questa
interazione porta all’aumento o alla diminuzione della trascrizione.
- Infine, esistono numerosi recettori che funzionano secondo altri meccanismi. Alcuni di
questi recettori, come i recettori delle cellule B e T coinvolti nella risposta immunitaria,
si associano a molecole segnale note, come le tirosin-chinasi citoplasmatiche.

Recettori GPCR:
Sono i recettori accoppiate a proteine G, sono recettori a sette passi transmembrana (7TM)
perché contengono sette eliche transmembrana. Sono stati identificati un centinaio di diversi
GPCR in un’ampia gamma di organismi, che insieme mediano molti processi cellulari.
I GPCR costituiscono la più grande superfamiglia di proteine codificata da genomi animali. Tra i
ligandi naturali riconosciuti da questi recettori, ci sono diversi gruppi di ormoni,
neurotrasmettitori, derivati dell’oppio, fattori chemiotattici, fotoni ecc.

Recettori accoppiati a proteine G possiedono di solito la stessa struttura. L’estremità


amminoterminale è esposta all’esterno della cellula, le sette α-eliche che attraversano la
membrana sono unite da anse di diversa lunghezza e l’estremità carbossi-terminale è all’interno
della cellula. Le tre anse all’esterno della cellula formano il sito di legame per il ligando,
mentre le tre anse sul lato citoplasmatico della membrana forniscono i siti di legame per le
proteine di segnalazione intracellulari. L’arrestina lega anch’essa la terza ansa intracellulare e
compete con le proteine G per il legame al recettore.
Si è notato che un numero crescente di proteine è in grado di legare l’estremit
carbossiterminale, e molte di esse agiscono come impalcature molecolari (scaffold) che
collegano il recettore a diverse proteine segnale ed effettori presenti nella cellula.
La rodopsina è stata per molto tempo l’unico membro di questa famiglia della quale si è potuta
determinare la struttura cristallina a raggi X. La rodopsina possiede una struttura molto stabile
per un GPCR, dovuta al fatto che il suo ligando è legato in modo permanente alla proteina e la
molecola proteica pu esistere in una sola conformazione in assenza dello stimolo.
In generale, le strutture cristalline dei GPCR, sono state evienziate nel loro stato inattivo.
La conformazione inattiva di questi recettori è stabilizzata da interazioni non covalenti tra i
residui amminoacidici delle α-eliche transmembrana. Il legame del ligando disturba tali
interazioni, portando il recettore ad assumere una conformazione attiva. Questo richiede
rotazioni e traslocazioni reciproche delle α-eliche transmembrana. La rotazione o la traslazione
reciproca di queste α-eliche transmembrana causa cambiamenti nella conformazione delle anse
citoplasmatiche. Questi, a loro volta, determinano un incremento dell’affinità del recettore per
una proteina G presente sulla superficie citoplasmatica della membrana plasmatica. Di
conseguenza, il legame del ligando al recettore provoca la formazione di un complesso tra
recettore e proteina G (fase 1). L’interazione della proteina G con i recettore provoca, a sua
volta, un cambiamento di conformazione della subunità α della proteina G, causando il rilascio
del GDP, seguito dal legame del GTP (fase 2). Nello stato di attivazione, un singolo recettore pu
attivare un certo numero di molecole di proteina G, fornendo così un modo per amplificare il
segnale.

Proteine G: le proteine eterotrimeriche G sono state scoperte e caratterizzate nei primi anni
’70. Queste proteine sono definite G perché legano i nucleotidi guanidilici, sia GDP sia GTP, ed
eterotrimeriche perché sono composte da tre differenti subunità polipeptidiche, chiamate α, β e
γ.
Le proteine G eterotrimeriche sono agganciate alla membrana plasmatica da catene lipidiche
legate in modo covalente alle subunità α e γ.
Il sito di legame del nucleotide guanilico è localizzato sulla subunità Gα. Ogni subunità Gα (con
attaccato GTP) è libera di attivare una molecola di effettore, come l’adenilato ciclasi (fase 3).
In questo caso, l’attivazione dell’effettore porta alla produzione del cAMP come secondo
messaggero (fase 4). I secondi messaggeri, a loro volta, attivano una o più molecole della
segnalazione cellulare.
Una proteina G è accesa, quando la sua subunità α è legata al GTP. D’altra parte, le subunità Gα
si disattivano quando il loro GTP si idrolizza a GDP e Pi (fase 5)
L’idrolisi del GTP provoca un cambiamento di conformazione della Gα che si dissocia
dall’effettore e si riassocia con il dimero βγ per formare di nuovo la proteina G eterotrimerica
inattiva (fase 6).
Le proteine G eterotrimeriche funzionano come dei timer molecolari: sono attivate
dall’interazione con un recettore attivato e si auto-disattivano per idrolisi del GTP legato dopo
un certo tempo dall’attivazione.
Quando sono attive, le subunità Gα possono attivare i loro effettori.
Le proteine G eterotrimeriche sono suddivise in quattro classi, Gs, Gq, Gi e G12/13; questa
classificazione è basata sulle subunità Gα e sugli effettori che sono in grado di accoppiare. La
specifica risposta indotta da un GPCR attivato dipende dal tipo di proteina G con la quale esso
interagisce, anche se alcuni GPCR possono interagire con differenti proteine G ed attivare più di
una risposta fisiologica. i membri della famiglia delle Gs accoppiano i recettori dell’adenilato
ciclasi. L’adenilato ciclasi è attivata dalle subunità Gs legate al GTP.
I membri della famiglia Gq contengono delle subunità Gα che attivano la PCLβ, la quale idrolizza
il fosfatidilinositolo difosfato producendo l’inositolo trifosfato e il diacilglicerolo.
Le subunità Gi attivate inibiscono l’adenilato ciclasi. Le G12/13 sono le meno caratterizzate tra le
proteine G e sono associate ad eccessiva proliferazione cellulare e trasformazione maligna.

Terminazione della risposta: il legame del ligando provoca l’attivazione del recettore. Il
recettore attivato attiva le proteine G, che a loro volta, attivano gli effettori. Per evitare una
sovrastimolazione, bisogna impedire ai recettori di attivare in modo continuo le proteine G. Per
riacquistare sensibilità a stimoli futuri, i recettori, le proteine G e gli effettori devono essere
riportati allo stato di inattività. La desensibilizzazione, che inibisce al recettore attivato di
attivare ulteriori molecole delle proteine G, si verifica in due fasi:
Nella prima fase, il dominio citoplasmatico del recettore GPCR attivato viene fosforilato da uno
specifico tipo di chinasi, chiamata chinasi del recettore accoppiato a proteine G (GRK). Le GRK
sono una famiglia di serin- e treonin-chinasi che riconoscono in modo specifico i GPCR attivati.
Lo stesso cambiamento di conformazione che permette ai recettori GPCR di attivare le proteine
G, le rende anche un buon substrato per le chinasi GRK. Quindi in seguito al legame del ligando,
i recettori GPCR divengono sensibili alla fosforilazione da parte delle chinasi GRK. La
fosforilazione del recettore GPCR prepara la seconda fase, rappresentata dal legame di proteine
chiamate arrestine. Le arrestine sono un gruppo di piccole proteine che si legano ai recettori
GPCR e competono con le proteine G. Di conseguenza, il legame dell’arrestina impedisce
l’attivazione di ulteriori proteine G. questa azione è una desensibilizzazione, perché la cellula
smette di rispondere allo stimolo, anche quando quello stimolo è ancora presente sulla
superficie esterna della cellula. La desensibilizzazione è uno dei meccanismi che permettono
alla cellula di rispondere a un cambiamento nel suo ambiente, piuttosto che continuare a
eccitarsi indefinitamente in presenza di un ambiente invariato. Le mutazioni che interferiscono
con la fosforilazione del recettore rodopsina da parte di una GRK portano alla morte delle
cellule fotorecettrici della retina e sono probabilmente una delle cause di cecità dovuta alla
retinite pigmentosa.
Le molecole di arrestina sono anche in grado di legarsi a molecole di clatrina situate in fossette
rivestite da questa proteina. L’interazione fra l’arrestina legata e la clatrina promuove
l’internalizzazione del recettore fosforilato mediante endocitosi. In alcuni casi, i recettori
rimossi dalla superficie per endocitosi possono essere defosforilati e ritornare alla membrana
plasmatica, oppure possono essere distrutti dall’apparato endocitotico della cellula. Se i
recettori sono degradati, la cellula perde, almeno temporaneamente, la sensibilità al ligando in
questione. Se i recettori sono riciclati alla superficie della cellula, quell’ultima rimane sensibile
al ligando.
La segnalazione da parte della subunità Gα attivata viene spenta da un meccanismo meno
complesso: la molecola di GTP legata è semplicemente idrolizzata a GDP (fase 5). Quindi, la
forza e la durata del segnale sono determinate in parte dalla velocità di idrolisi del GTP da parte
delle subunità Gα..
Le subunità Gα possiedono una debole attività GTPasica, che permette loro di idrolizzare
lentamente il GTP legato e di inattivarsi da sole. La fine della risposta è accellerata
dall’interazione con dei regolatori della segnalazione da proteine G (RGS). L’interazione con le
proteine RGS aumenta la capacità di idrolisi del GTP, cioè l’efficienza di catalisi GTPasica, da
parte della subunità Gα..
Una volta che il GTP è idrolizzato, la Gα – GDP pu riassociarsi con le subunità Gβγ per riformare
il complesso trimerico inattivo (fase 6) e riportare il sistema allo stato di riposo.
I meccanismi con i quali i segnali sono trasmessi attraverso la membrana plasmatica e proteine G
hanno un’antica origine evolutiva e sono altamente conservati.

Secondi messaggeri
cAMP stimola la mobilizzazione del glucosio attivando una protein-chinasi che aggiunge un
fosfato ad uno specifico residuo di serina della catena polipeptidica della glicogeno fosforilasi.
L’AMP ciclico è un secondo messaggero in grado di diffondere all’interno della cellula. La sintesi
dell’AMP ciclico avviene in seguito al legame di un primo messaggero – un ormone o altro ligando
– con il recettore sulla superficie esterna della cellula.
Mentre il primo messaggero si lega esclusivamente ad una singola specie di recettore, il secondo
messaggero è spesso in grado di innescare varie attività cellulari. I secondi messaggeri rendono
le cellule capaci di attivare una risposta coordinata, su larga scala, in seguito alla stimolazione
da parte di un singolo ligando extracellulare. Altri secondi messaggeri sono: il Ca²⁺, i
fosfatidilinositidi, l’inositolo trifosfato, il diacilglicerolo, il cGMP e l’ossido di azoto.

Secondi messaggeri derivati dal fosfatidilinositolo: i fosfolipidi delle membrane cellulari sono
convertiti in secondi messaggeri da una varietà di enzimi regolati in risposta a segnali
extracellulari. Questi enzimi comprendono: le fosfolipasi (enzimi che tagliano i lipidi), le chinasi
dei fosfolipidi (enzimi che fosforilano i lipidi) e le fosfatasi dei fosfolipidi (enzimi che
defosforilano i lipidi). Le fosfolipasi sono enzimi che idrolizzano legami esterici specifici che
collegano i diversi componenti dei fosfolipidi.
Tutte e quattro le classi sono coinvolte in vie di segnalazione.

Fosforilazione del fosfatidilinositolo: quando il neurotrasmettitore acetilcolina si lega alla


superficie di cellule muscolari lisce nella parete dello stomaco, la cellula muscolare è stimolata
a contrarsi. Quando un antigene estraneo si lega sulla superficie di un mastocita, stimola la
cellula a secernere istamina, una sostanza che pu scatenare i sintomi di un attacco allergico.
Entrambe queste risposte sono attivate dallo stesso messaggero cellulare, una sostanza che pu
scatenare i sintomi di un attacco allergico. Entrambe queste risposte sono attivate dallo stesso
messaggero cellulare, una sostanza derivata dal fosfatidilinositolo, uno dei componenti minori
della membrana cellulare.
Durante alcuni studi, delle analisi dimostrarono che l’isotopo veniva incorporato principalmente
nel fosfatidilinositolo, che veniva poi rapidamente convertito in altri derivati fosforilati,
chiamati fosfoinositidi. Questi risultati indicarono che lipidi a base di inositolo possono essere
fosforilati da chinasi specifiche per i lipidi in risposta a messaggeri extracellulari, come
l’acetilcolina. Le chinasi dei lipidi sono attivate in risposta a molti segnali extracellulari.
L’anello dell’inositolo ha sei atomi di carbonio. Il carbonio numero 1 è coinvolto nel legame tra
l’inositolo e il diacilglicerolo. Gli altri atomi di carbonio possono essere fosforilati da varie
chinasi dei fosfoinositidi presenti nelle cellule. I principali tra questi enzimi sono le chinasi PI 3,
PI 4 e PI 5, che trasferiscono i fosfati dall’ATP alle posizioni 3, 4 e 5, rispettivamente,
dell’anello inositolico.
Ad esempio, il trasferimento di un singolo gruppo fosfato alla posizione 4 dello zucchero del PI
da parte della chinasi PI 4 (PI4K) genera PI 4-fosfato (PIP), che pu essere fosforilato una seconda
volta dalla PIP 5-chinasi (PIP5K) formando PI 4,5-bifosfato (PIP2, fasi 1 e 2); a sua volta, il
PIP2 pu essere di nuovo fosforilato dalla PI 3-chinasi per formare PI 3,4,5-trifosfato
(PIP3).
La fosforilazione del PIP2 e PIP3 è di particolare interesse poiché gli enzimi PI3K coinvolti in
questo processo possono essere controllati da numerose molecole extracellulari e l’iperattività
di PI3K è stata associata allo sviluppo dei tumori nell’uomo.
Tutte queste specie di fosfolipidi rimangono nello strato interno della membrana plasmatica;
sono secondi messaggeri legati alla membrana. Come esistono delle chinasi dei lipidi che
aggiungono dei gruppi fosfato, esistono delle fosfatasi dei lipidi che le rimuovono. Le attività di
chinasi e fosfatasi sono regolate in modo tale da avere specifici fosfoinositidi presenti in
specifiche regioni della membrana plasmatica a un determinato momento dopo l’arrivo del
segnale.
Gli anelli di inositolo fosforilati dei fosfoinositidi formano un sito di legame per il dominio PH
(dominio di legame dei lipidi), che è stato identificato in numerose proteine.
Il legame di una proteina mediante il suo dominio PH ai secondi messaggeri PIP2 o PIP3 recluta
quella proteina sulla faccia citosolica della membrana, dove pu interagire con altre proteine
legate alla membrana stessa, come attivatori, inibitori o substrati.

Chemiotassi: spostamento verso una concentrazione crescente di una particolare sostanza nel
terreno di coltura che agisce da fattore chemiotattico. La chemiotassi dipende dalla produzione
localizzata di messaggeri fosfoinositidici che a loro volta influenzano la formazione di filamenti
di actina e di lamellipodi che sono necessari per il movimento della cellula verso il suo bersaglio.

Fosfolipasi C: Non tutti i secondi messaggeri contenenti inositolo rimangono nel doppio strato
lipidico della membrana. Quando l’acetilcolina si lega ad una cellula muscolare liscia o un
antigene si lega ad un mastocita, il recettore legato stimola una proteina G eterotrimerica che a
sua volta attiva un effettore specifico del fosfatidilinositolo, la fosfolipasi C-β (PLCβ) (fase 4). La
PLCβ è localizzata sulla superficie interna della membrana, legata grazi all’interazione tra il suo
dominio PH e fosfoinositidi immersi nel doppio strato.
L’enzima PLCβ catalizza una reazione che scinde PIP2 in due molecole, inositolo 1,4,5-trifosfato
(IP3) e diacilglicerolo (DAG, fase 5), che giocano entrambe un ruolo importante come secondi
messaggeri nella segnalazione cellulare.

…integra libro pag 617

Risposte associate alle proteine G


Una grande varietà di agenti differenti, inclusi ormoni, neurotrasmettitori e stimoli sensoriali,
agisce mediante recettori GPCR e proteine G eterotrimeriche per trasmettere informazioni
attraverso la membrana plasmatica e innescare le più diverse risposte cellulari. il recettore per
un determinato ligando pu esistere in isoforme diverse. Differenti isoforme possono avere
differenti affinità per il ligando, oppure possono interagire con differenti tipi di proteine G.
Differenti isofome di un recettore possono coesistere nella stessa membrana plasmatica, o
possono trovarsi sulla membrana di diversi tipi di cellule bersaglio. Anche le proteine
eterotrimeriche G che trasmettono i segnali dal recettore all’effettore possono esistere in forme
multiple, analogalmente a molti degli effettori.
Alcune proteine G agiscono inibendo i propri effettori. Lo stesso stimolo pu attivare una
proteina G stimolatrice in un tipo cellulare e una proteina G inibitoria in un altro tipo cellulare.
Livelli di glucosio nel sangue
Il glucosio pu essere utilizzato come fonte energetica da tutti i tipi cellulari dell’organismo. Il
glucosio è ossidato a CO2 e H2O per mezzo della glicolisi e del ciclo dei TCA, fornendo alla
cellula l’ATP necessario allo svolgimento delle reazioni che richiedono energia. L’organismo
mantiene i livelli di glucosio nel circolo sanguigno a dei livelli controllati. Nelle cellule animali il
glucosio in eccesso è immagazzinato sotto forma di glicogeno, un grande polimero ramificato
composto da monomeri di glucosio uniti mediante legami glicosidici. L’ormone glucagone è
prodotto dalle cellule alfa del pancreas in risposta a bassi livelli ematici di glucosio. Il glucagone
stimola la scissione del glicogeno ed il rilascio di glucosio nel torrente circolatorio,
determinando un innalzamento dei livelli di glucosio. L’ormone insulina è prodotto dalle cellule
beta del pancreas in risposta ad elevati livelli di glucosio e stimola l’incorporazione del glucosio
da parte delle cellule ed il suo immagazzinamento sotto forma di glicogeno. L’adrenalina invece
è prodotta dalla ghiandola surrenale in situazioni stressanti e determina un innalzamento dei
livelli ematici di glucosio per fornire all’organismo le risorse energetiche aggiuntive necessarie
per far fronte alle situazioni stressanti.
L’insulina agisce mediante un recettore tirosin-chinasi; invece sia il glucagone che l’adrenalina
agiscono legandosi a GPCR.
Il glucagone è una piccola proteina costituita da 29 amminoacidi, mentre l’adrenalina è una
piccola molecola derivata dall’amminoacido tirosina. Dal punto di vista strutturale, queste due
molecole non hanno niente in comune, ma entrambe si legano a GPCR e stimolano la scissione
del glicogeno in molecole di glucosio 1-fosfato. Inoltre, il legame di entrambi questi ormoni ai
propri recettori determina l’inibizione dell’enzima glicogeno sinteasi, che catalizza la reazione
opposta, nella quale le unità di glucosio sono aggiunte a molecole di glicogeno in accrescimento.
Pertanto, due stimoli differenti (glucagone e adrenalina), riconosciuti da recettori diversi,
inducono la stessa risposta in una singola cellula bersaglio.
In seguito all’attivazione da parte dei rispettivi ligandi, entrambi i recettori attivano lo stesso
tipo di proteine G eterotrimeriche, le quali determinano un innalzamento dei livelli di cAMP.

Mobilizzazione del glucosio: l’AMP ciclico è prodotto da una proteina integrale di membrana
chiamata adenilato ciclasi, i cui domini catalitici si trovano sulla superficie interna della
membrana plasmatica. L’AMP ciclico evoca una risposta che porta alla mobilizzazione del
glucosio mediante l’innesco di una cascata di reazioni.
La prima fase si verifica quando l’ormone si lega al suo recettore, attivando una subunità Gαs
che attiva l’effettore adenilato ciclasi. L’enzima attivo catalizza la formazione di cAMP (fasi 1 e
2).
Una volta formate, le molecole di cAMP diffondono nel citoplasma, dove si legano al sito
allosterico su una subunità regolatrice di una specifica protein-chinasi dipendente cAMP,
chiamata protein-chinasi A (PKA) (fase 3). Nella sua forma inattiva, PKA è un eterotetramero
costituito da due subunità regolatrici (R) e due subunità catalitiche (C). Le subunità regolatrici
inibiscono l’attività enzimatica delle subunità catalitiche dell’enzima. Il legame dell’AMP ciclico
causa la dissociazione delle subunità regolatrici, rilasciando le subunità catalitiche di PKA nella
loro forma attiva. I substrati bersaglio della PKA in una cellula di fegato includono due enzimi
che svolgono un ruolo centrale nel metabolismo del glucosio, la glicogeno sinteasi e la fosforilasi
chinasi (fasi 4 e 5). La fosforilazione del glicogeno sinteasi inibisce la sua attività catalitica e
previene così la conversione del glucosio in glicogeno. Al contrario, la fosforilazione della
fosforilasi chinasi attiva l’enzima per catalizzare il trasferimento di gruppi fosfato a molecole di
glicogeno fosforilasi.
L’aggiunta di un singolo gruppo fosfato ad uno specifico residuo di serina nella molecola della
glicogeno fosforilasi attiva questo enzima (fase 6), stimolando la degradazione del glicogeno
(fase 7). Il glucosio
1-fosfato formato nella reazione di fosforilazione è convertito in glucosio, che diffonde nel
sangue e raggiunge i tessuti del corpo (fase 8). Esiste ovviamente un meccanismo per invertire i
passaggi discussi.
Le cellule epatiche contengono fosfatasi che rimuovono i gruppi fosfato aggiunti dalle chinasi. In
particolare la protein fosfatasi-1, è capace di rimuovere i fosfati da tutti gli enzimi fosforilati:
fosforilasi chinasi, glicogeno sinteasi e glicogeno fosforilasi. La degradazione delle molecole di
cAMP fosfodiesterasi, che contribuisce alla terminazione della risposta.
Amplificazione del segnale. Il legame di una singola molecola d’ormone sulla superficie cellulare
pu attivare molte proteine G, ciascuna delle quali pu attivare diverse molecole di adenilato
ciclasi, ognuna delle quali pu produrre un gran numero di messaggeri cAMP in breve tempo.
Così, la produzione di un secondo messaggero fornisce un meccanismo che amplifica
enormemente il segnale generato dal messaggio originale. Ogni molecola di cAMP è poi capace
di attivare una singola molecola di PKA, che fosforila un gran numero di molecole di fosforilasi
chinasi, che a loro volta sono in grado di fosforilare un numero ancora più grande di molecole di
glicogeno fosforilasi, che possono così catalizzare la formazione di un numero ancora maggiore
di glucosio fosfati. Quindi, quello che inizia come uno stimolo appena percettibile sulla
superficie della cellula si trasforma in una grossa mobilizzazione di glucosio nella cellula.

Aspetti della trasduzione del segnale mediata da cAMP. Gli effetti più rapidi e meglio studiati del
cAMP sono prodotti nel cioplasma, anche il nucleo e i suoi geni partecipano alla risposta. Una
parte delle molecole attivate da PKA trasloca nel nucleo, dove fosforila proteine nucleari chiave
(fase 9), fra le quali il fattore di trascrizione chiamato CREB (cAMP response element-binding
protein). La versione fosforilata di CREB si lega, sotto forma di dimero, ai siti sul DNA (fase 10)
che contengono una particolare sequenza nucleotidica (TGACGTCA), nota come elmento di
risposta al cAMP (CRE, cAMP-response element).
Gli elementi di risposta sono dei siti nel DNA ai quali si legano fattori di trascrizione che agiscono
aumentando la velocità d’inizio della trascrizione. I siti CRE sono localizzati in regioni regolatrici
dei geni che svolgono un ruolo nella risposta al cAMP. Nelle cellule del fegato ad esempio, molti
degli enzimi coinvolti nella gluconeogenesi, via di formazione del glucosio, sono coificati da geni
che contengono siti CRE.
Quindi, adrenalina e glucagone non solo attivano enzimicatabolici utilizzati nella degradazione
del glicogeno, ma conducono anche alla sintesi di enzimi anabolici necessari per formare
glucosio da precursori più piccoli.
L’AMP ciclico è prodotto da molte cellule differenti in risposta ad un’ampia varietà di ligandi
diversi.
Le vie di segnalazione del cAMP sono coinvolte anche nei processi che avvengono nel sistema
nervoso, come l’apprendimento, la memoria e la dipendenza da droghe. L’uso cronico degli
oppiacei porta ad esempio, a livelli alti di adenilato ciclasi e di PKA, che portano alla risposta
fisiologica che si verifica durante l’astinenza dalla droga.
Anche un altro nucleotide cicico, il cGMP, agisce in alcune cellule come secondo messaggero, e
svolge un ruolo importante nella via di segnalazione della visione.
Visto che il cAMP esercita i suoi effetti attivando la PKA, la risposta di una data cellula la cAMP è
determinata dalle proteine specifiche che vengono fosforilate da questo enzima.
Sono stati descritti più di 100 substrati della PKA, la maggior parte dei quali svolge funzioni
distinte. Cellule diverse esprimono differenti substrati della PKA ed in parte nella scoperta delle
proteine che ancorano la PKA, o AKAP, che funzionano come nodi di smistamento delle
segnalazioni.
Esempio: l’attivazione della PKA in una cellula del fegato in risposta all’adrenalina porta alla
degradazione del glicogeno; mentre l’attivazione dello stesso enzima in una cellula del tubulo
renale, in risposta alla vasopressina, causa un aumento nella permeabilità della membrana
all’acqua, e nella cellula tiroidea, in risposta al TSH, porta alla secrezione dell’ormone
tiroideo.
Le AKAP forniscono una rete strutturale per la coordinazione delle interazioni proteina-proteina
sequestrando la PKA in posizioni specifiche all’interno della cellula. La PKA quindi si accumula in
prossimità di uno o più substrati. Quando vi è un innalzamento dei livelli di cAMP e l’attivazione
della PKA, i substrati appropriati si trovano nelle immediate vicinanze e sono i primi ad essere
fosforilati. La selezione del substrato quindi è in parte una conseguenza della localizzazione
della PKA nelle vicinanze di determinati substrati. Cellule differenti esprimono AKAP differenti,
il che risulta nella localizzazione della PKA nelle vicinanze di substrati differenti e, di
conseguenza, nella fosforilazione di substrati differenti in seguito ad un innalzamento dei livelli
di cAMP.

Ruolo delle proteine G nella percezione sensoriale


La nostra capacità di vedere, gustare e annusare dipende in gran parte dai recettori GPCR. La
rodopsina è la proteina sensibile alla luce presente nei bastoncelli della nostra retina, che sono
cellule fotorecettrici che rispondono alla luce di bassa intensità e ci forniscono una vista in
bianco e nero in un ambiente notturno o in una stanza buia. Diversi recettori GPCR strettamente
correlati che sono presenti nei coni della retina ci forniscono una visione a colori in presenza di
una luce più intensa.
Il nostro senso dell’olfatto dipende da impulsi nervosi trasmessi lungo i neuroni olfattivi, che si
estendono dall’epitelio che riveste le nostre cavità nasali fino al bulbo olfattivo localizzato nel
tronco encefalico. Le parti più estreme di questi neuroni, localizzate nell’epitelio nasale,
contengono recettori GPCR o recettori olfattivi, in grado di legare varie sostanze chimiche che
entrano nel naso.
L’attivazione di differenti neuroni contenenti recettori olfattivi diversi ci dà la possibilità di
percepire aromi diversi. Mutazioni di un gene che codifica per un particolare recettore olfattivo
possono rendere una persona incapace di percepire una particolare sostanza nell’ambiente. La
nostra percezione del gusto invece è più semplice. I bottoni gustativi sulla lingua contengono
cellule recettrici che possono trasmettere solo la sensazione di uno di quattro gusti base: salato,
acido, dolce o amaro. La percezione che un tipo di cibo o bevanda sia salato o acido è indotta
direttamente dagli ioni sodio o dai protoni presenti, che entrano nei canali cationici della
membrana plasmatica delle cellule recettrici del gusto, portando alla depolarizzazione della
membrana. Al contrario, percezione che un cibo sia amaro, dolce o saporito dipende dalla
sostanza che interagisce con il recettore GPCR sulla superficie della cellula recettrice. L’uomo
ha circa 30 recettori per il gusto amaro, chiamati T2R, tutti accoppiati alla stessa proteina G
eterotrimerica.
Una cellula recettrice del gusto che evoca la sensazione di amaro contiene un’ampia varietà di
recettori T2R diversi che rispondono a molte sostanze nocive non correlate tra loro. Di
conseguenza, tutte queste sostanze diverse evocano lo stesso gusto base, cioè amaro e
sgradevole.

FOSFORILAZIONE DI PROTEINE SU RESIDUI DI TIROSINA


Le tirosin-chinasi sono enzimi che fosforilano specifici residui di tirosina sui oro substrati
proteici. La fosforilazione in tirosina è un meccanismo per la trasduzione del segnale apparso
nell’evoluzione degli organismi pluricellulari. Il genoma umano codifica per più di 90
tirosinchinasi differenti. Queste chinasi sono coinvolte nella regolazione di diversi processi
cellulari: crescita, proliferazione, differenziamento, sopravvivenza, adesione alla matrice
extracellulare e migrazione. L’espressione di protein-chinasi mutate, pu portare alla
proliferazione cellulare incontrollata e allo sviluppo di tumori.
Le tirosin-chinasi si suddividono in due gruppi: le tirosin-chinasi recettoriali (RTK), che sono
proteine transmembrana con una singola regione transmembrana ed un dominio extracellulare
per il legame con il ligando , e le tirosin-chinasi citoplasmatiche.
Il genoma umano codifica per circa 60 PTK e 32 TK non recettoriali. Gli RTK sono attivate
direttamente da fattori extracellulari della crescita e del differenziamento, quali il fattore di
crescita per l’epidermide (EGF) e il fattore di crescita derivante dalle piastrine (PDGF), o da
regolatori metabolici come l’insulina.
Le tirosin-chinasi non recettoriali sono regolate indirettamente dai segnali extracellulari e
controllano processi come la risposta immunitaria, l’adesione cellulare e la migrazione dei
neuroni.

Dimerizzazione del rettore: il ligando induce la dimerizzazione del dominio extracellulare di


legame di due molecole recettoriali. Sono stati identificati due meccanismi di dimerizzazione
dei recettori: uno mediato dal ligando e uno mediato dal recettore. I primi lavori sui ligandi
degli RTK suggerirono la presenza di due siti di legame al recettore. Questo permise di capire
come un’unica molecola di fattore di crescita o di differenziamento potesse legare
simultaneamente due recettori, causando di conseguenza la dimerizzazione indotta dal ligando.
Questa teoria è stata rinforzata dal fatto che molti fattori di crescita e di differenziamento sono
composti da due subunità simili o identiche, legate fra loro da ponti disolfuro e che possiedono
ciascuna un sito di legame al recettore. Alcuni fattori di crescita invece non sono conformi a
questo modello ma ne sono stati identificati alcuni con un unico sito di legame al recettore. In
questo modello il ligando provoca un cambiamento di conformazione del dominio extracellulare
del recettore e la formazione (o esposizione) di un dominio di dimerizzazione. I ligandi quindi, in
questo caso, agiscono come regolatori allosterici che innescano la capacità dei loro recettori di
formare dimeri.
In ogni caso, la dimerizzazione del recettore porta alla giustapposizione dei due domini
tirosinchinasi sul lato citoplasmatico della membrana. L’avvicinamento dei due domini chinasici
permette la trans-autofosforilazione e cioè la capacità di fosforilare residui di
tirosina del dominio citoplasmatico dell’altro e viceversa.
Attivazione della proteina chinasi. I siti di autofosforilazione sugli RTK hanno una doppia
funzione: regolano l’attività chinasica e servono da sito di legame per proteine segnale
citoplasmatiche. L’attività chinasica è comunemente regolata dall’autofosforilazione di residui
di tirosina localizzati nell’ansa di attivazione del dominio chinasico. In assenza di fosforilazione,
l’ansa di attivazione nasconde il sito di legame al substrato, impedendo l’interazione con l’ATP.
In seguito a fosforilazione, l’ansa di attivazione si stabilizza in una posizione distante dal sito di
legame del substrato, attivando il dominio chinasico. Dopo l’attivazione del dominio chinasico,
le subunità recettoriali continuano a fosforilarsi a vicenda su residui di tirosina localizzati in
regioni adiacenti al dominio chinasico. Sono questi siti di autofosforilazione a servire da sito di
legame per le molecole della segnalazione cellulare.

Interazioni proteina-proteina dipendenti da fosfotirosine. Le vie di segnalazione sono catene di


proteine segnale che interagiscono le une con le altre in modo sequenziale. Le proteine segnale
sono in grado di associarsi a recettori tirosin-chinasi attivati perché contengono dei domini che si
legano specificamente a residui di tirosina fosforilati. Al momento, sono stati identificati due
domini: il dominio di omologia a Src2 (SH2) e il dominio di legame fosfotirosinico (PTB). I domini
SH2 sono stati inizialmente identificati in proteine chinasi codificati dal genoma di virus
oncogeni. Il genoma umano codifica per più di 110 domini SH2 che mediano un gran numero di
interazioni proteina-proteina dipendenti dalla fosforilazione.
Le interazioni hanno luogo in seguito alla fosforilazione di specifici residui di tirosina e la
specificità dell’interazione è determinata dalla sequenza amminoacidica immediatamente
adiacente al residuo di tirosina fosforilato.
I domini PTB possono legare residui fosforilati di tirosina generalmente presenti nel seguente
contesto: asparagina-prolina-X-tirosina (Ans-Pro-X-Tyr). La situazione è per molto più
complessa, visto che alcuni domini PTB legano specificamente sequenze Ans-Pro-X-Tyr non
fosforilate ed altri lo stesso motivo fosforilato. I domini PTB non sono molto conservati e i
residui che interagiscono con i ligandi sono diversi in domini PTB differenti.
Attivazione delle vie di segnalazione a valle
I recettori tirosin-chinasi (RTK) sono autofosforilati su uno o più residui di tirosina e un gran
numero di proteine segnale con domini SH2 o PTB è presente nel citoplasma. L’attivazione del
recettore promuove la formazione di complessi di segnalazione, in quanto specifiche proteine
segnale con domini SH2 e PTB si legano ai siti di autofosforilazione presenti sul recettore. Si
possono distinguere diversi gruppi di molecole segnale, che comprendono proteine adattatrici,
proteine di attracco, fattori trascrizionali ed enzimi.
- Le proteine adattatrici funzionano come intermedi per permettere a due o più proteine
segnale con le quali interagiscono di diventare parte del complesso di segnalazione. Le
proteine adattatrici contengono domini SH2 e uno o più domini d’interazione
proteinaproteina. Il dominio SH2 lega residui di fosfotirosina inseriti nel contesto Tyr-X-
Asn.
- Le proteine d’attacco, come IRS, forniscono al recettore siti addizionali di fosforilazione
tirosinici. Le proteine d’attracco contengono domini PTB o SH2 e un certo numero di
siti di fosforilazione tirosinici. Il legame del segnale extracellulare al recettore promuove
l’autofosforilazione del recettore e la produzione di siti di legame per il dominio PTB o
SH2 della proteina di attracco. Una volta legata al recettore, la proteina d’attracco viene
fosforilata dal recettore e quindi fornisce siti di legame aggiuntivi per legare proteine
segnale. Le proteine d’attracco aumentano la versatilità della segnalazione, perché uno
stesso recettore pu attivare diverse combinazioni di proteine segnale in funzione della
proteina di attracco espressa dalla cellula.
- Fattori trascrizionali che appartengono alla famiglia STAT giocano un ruolo importante
nel funzionamento del sistema immunitario. Le STAT contengono un dominio SH2 e un
sito di fosforilazione tirosinico che pu legare il dominio SH2 di un’altra molecola di STAT.
La fosforilazione tirosinica del recettore dimerizzato nel sito riconosciuto dal dominio
SH2 delle STAT favorisce il reclutamento delle STAT da parte del recettore e
l’associazione
con il recettore promuove la fosforilazione dei residui tirosinici delle STAT. In seguito, i
residuo fosfotirosinico di una delle due proteine STAT pu interagire con il dominio SH2 di
una seconda proteina STAT e viceversa. Il risultato finale è la dimerizzazione
di questi fattori trascrizionali. I dimeri sono trasportati nel nucleo, dove stimolano la
trascrizione dei geni coinvolti nella risposta immunitaria.
- Le proteine segnale ed attività enzimatica comprendono proteine chinasi, proteine
fosfatasi, chinasi dei lipidi, fosfolipasi e proteine ad attività GTPasica. Quando sono
provvisti di domini SH2, questi enzimi si associano agli RTK e la loro attivazione dipende
direttamente o indirettamente da questa associazione. Si conoscono tre meccanismi
d’attivazione di questi enzimi. L’attivazione di alcuni enzimi è solo frutto del loro
avvicinamento alla membrana plasmatica e al loro substrato. In altri casi, l’attivazione è
di tipo allosterico: il legame del dominio SH2 al residuo fosfotirosinico del recettore
induce un cambio di conformazione dello stesso dominio SH2 dell’enzima, che si traduce
in un cambio di conformazione e quindi di attività del sito catalitico. Infine, gli enzimi
possono essere attivati dalla fosforilazione di una tirosina che regola l’attività catalitica.
Le proteine segnale attivate dai recettori RTK iniziano le cascate di reazioni che portano
ai cambiamenti biochimici richiesti per rispondere alla presenza delle molecole di
messaggero extracellulare.

Terminazione della risposta


La trasduzione del segnale da recettore RTK termina solitamente con l’internalizzazione del
recettore. Le cause dell’internalizzazione dei recettori sono ancora oggetto di attive ricerche.
Un meccanismo vede coinvolta una proteina Cbl, che si lega ai recettori. I recettori RTK attivati
da ligandi si autofosforilano su residui tirosinici che servono da sito di legame per proteine Cbl.
Cbl si associa al recettore portandosi presso un enzima in grado di aggiungere ubiquitina al
recettore. Il legame del complesso Cbl ai recettori attivati è seguito dall’ubiquitinazione del
recettore e dalla sua internalizzazione.
Sono due le vie più importanti a valle dei recettori RTK:
- La via Ras-MAP chinasi, la cascata di segnaliattivata da tirosin-chinasi attualmente meglio
caratterizzata
- L’altra legata durante l’attivazione del recettore dell’insulina

La via di Ras-MAP chinasi


I retrovirus sono piccoli virus la cui informazione genetica è sotto forma di RNA. Alcuni di questi
virus contengono geni (oncogeni) che gli permettono di trasformar cellule normali in cellule
tumorali.
Il gene che codifica per Ras deriva dalle cellule ospiti di mammifero. Successivamente, è stato
scoperto che circa il 30% di tutti i tumori umani contiene forme mutate dei geni RAS. Le proteine
Ras appartengono ad una superfamiglia coinvolte nella regolazione di numerosi processi, come la
divisione cellulare, il differenziamento, l’espressione genica, l’organizzazione del citoscheletro,
il traffico vescicolare ed il trasporto nucleocitoplasmatico.
Ras è una piccola GTPasi mantenuta sulla faccia interna della membrana plasmatica da un
gruppo lipidico immerso nello strato interno del doppio strato. Da un punto di vista funzionale,
Ras è simile ad una delle proteine G eterotrimeriche discusse in precedenza e, allo stesso modo,
agisce da timer molecolare.
Nonostante questo, Ras è costituita da un’unica piccola subunità. Le proteine Ras sono presenti
in due diverse forme: -una attiva legata al GTP
-una inattiva legata al GDP
Mutazioni del gene RAS umano che portano alla formazione di tumori impediscono alla proteina
di idrolizzare il suo GTP per tornare alla forma legata al GDP. La forma mutata di Ras rimane
nella posizione “on” e manda continuamente il segnale a valle, sottoponendo costantemente la
cellula allo stimolo proliferativo.
Il passaggio ciclico dalla forma attiva alla forma inattiva delle proteine G monomeriche (come
Ras), dipende dal legame di proteine accessorie che si legano a queste proteine G e ne regolano
l’attività. Queste proteine accessorie comprendono:
1. Proteine di attivazione della GTPasi (GAP). La maggior parte delle proteine G monomeriche
ha la capacità di idrolizzare il GTP legato, ma questa capacità è fortemente accelerata
dall’interazione con specifiche GAP. Le proteine GAP abbreviano notevolmente la durata
di una risposta mediata da proteine G. Le mutazioni in uno dei geni Ras-GAP (NF1)
provocano la neurofibromatosi 1.
2. Fattori di scambio del nucleotide guanilico (GEF). Una proteina G inattiva è convertita nella
sua forma attiva quando il GDP legato è sostituito con GTP. Le GEF sono proteine che si
legano alle proteine G inattive e stimolano la dissociazione del GDP legato. Una volta che
il GDP è stato rilasciato, la proteina G si lega rapidamente al GTP, che nella cellula è
presente a concentrazioni più alte, attivandosi.
3. Inibitori della dissociazione del nucleotide guanilico (GDI). Le GDI sono proteine che
inibiscono il rilascio del GDP dalla proteina G, mantenendo così la proteina nello stato
inattivo.

Il ruolo di Ras meglio studiato è quello di componente della cascata Ras-MAP chinasi, cascata che
gioca un ruolo essenziale nel controllo di attività vitali come la proliferazione cellulare. Questa
via trasmette il segnale extracellulare della membrana citoplasmatica attraverso il citoplasma fino
al nucleo.
Questa via è attivata quando un fattore di crescita, come EGF o PDGF, si lega al dominio
extracellulare del suo recettore RTK. Molti RTK attivati contengono dei residui tirosinici fosforilati
che servono da sito di reclutamento per la proteina adattatrice Grb2. Grb2, a sua volta, lega Sos,
un fattore di scambio del nucleotide guanilico (GEF) per Ras. La comparsa sul recettore attivato
di un sito di legame per Grb2 promuove lo spostamento di Grb2-Sos dal citoplasma alla superficie
citoplasmatica della membrana plasmatica, vicino a Ras. Lo spostamento di Sos a livello della
membrana plasmatica è sufficiente ad attivare Ras.
Un espressione mutata di Sos associata alla membrana plasmatica risulta nell’attivazione
costitutiva di Ras e nella trasformazione delle cellule nel fenotipo maligno.
L’interazione di Sos con Ras apre il sito di legame dei nucleotidi di Ras. Il GDP viene così
rilasciato e sostituito dal GTP. Lo scambio del GDP con il GTP nel sito di legame del nucleotide
di Ras induce un cambio di conformazione e la comparsa di una interfaccia di legame per
numerose proteine, compresa la proteina segnale Raf. Raf è una serina-treonina chinasi e uno
dei suoi substrati è la proteina chinasi MEK.
MEK, che è attivata dalla fosforilazione di Raf, fosforila ed attiva a sua volta due MAP chinasi.
Una volta attivata MAP chinasi pu essere spostata nel nucleo, dove fosforila ed attiva fattori
trascrizionali ed atre proteine nucleari. Infine, la via attiva geni coinvolti nella proliferazione
cellulare, compresa la ciclina D1, che contribuisce a condurre la cellula dalla fase G1 alla fase S.
Gli oncogeni sono identificati per la loro capacità di far diventare cancerose le cellule. Derivano
da geni cellulari normali che sono mutati o espressi in modo eccessivo. Molte delle proteine che
costituiscono la via di segnalazione di Ras sono state scoperte perché codificate da oncogeni che
causano il cancro, tra cui Ras, Raf, fattori trascrizionali attivati alla fine della via (Fos e Jun…), i
geni per molti recettori RTK (situati all’inizio della via) ecc..

L’evoluzione ha adattato la via per raggiungere molti fini diversi. In ogni caso, la parte
principale della via comprende un trio di enzimi che agiscono in sequenza: la MAPKKK, la MAPKK
e la MAPK. Ciascuno di questi componenti è rappresentato da una piccola famiglia di proteine
(14 diverse MAPKKK, 7 MAKK e 13 MAPK).
Utilizzando differenti membri di queste famiglie, i mammiferi sono in grado di assemblare un
ceto numero di vie delle MAP chinasi che trasmettono diversi segnali extracellulari. Gli
stimoli mitogeni sono trasmessi lungo un tipo di via delle MAP chinasi che porta alla
proliferazione cellulare.
Quando invece le cellule sono esposte a stimoli di stress i segnali sono trasmessi lungo vie
differenti delle MAP chinasi che fanno uscire la cellula dal ciclo cellulare. L’uscita dal ciclo dà
alla cellula il tempo di riparare i danni risultanti dalle condizioni avverse.
La specificità di queste vie sta nelle interazioni selettive tra gli enzimi e i substrati ed è
raggiunta anche grazie alla localizzazione spaziale delle proteine componenti. Una precisa
localizzazione nello spazio avviene ad opera di proteine strutturali non enzimatiche, proteine
impalcatura, la cui apparente funzione è quella di mantenere gli appropriati membri di una via
di segnalazione in uno specifico orientamento che favorisce le loro interazioni reciproche. Le
AKAP sono esempi di proteine impalcatura, e proteine simili svolgono un ruolo cruciale nel
convogliare i segnali attraverso una delle diverse vie delle MAP chinasi.
Le proteine impalcatura possono anche svolgere un ruolo attivo nelle vie di trasduzione del
segnale inducendo un cambiamento nella conformazione delle proteine legate. Infine
impediscono alle proteine coinvolte in una via di segnalazione di partecipare ad altre vie.
Segnalazione del recettore per l’insulina
Il nostro organismo spende molta energia per mantenere stabili i livelli di glucosio nel sangue. Il
SNC dipende molto dal glucosio per il suo metabolismo energetico e la diminuzione della
concentrazione del glucosio nel sangue pu condurre alla perdita di conoscenza e al coma. Un
aumento della glicemia induce la perdita di glucosio, di liquidi e di elettroliti nelle urine. I livelli
di glucosio in circolo sono monitorati dal pancreas. Quando i livelli di glucosio scendono sotto un
certo livello, le cellule α del pancreas secernono il glucagone. Il glucagone agisce tramite GPCR e
stimola la scissione del glicogeno portando ad un aumento dei livelli ematici del glucosio.
Quando i livelli di glucosio si alzano le cellule β del pancreas secernono insulina. L’insulina funziona
come messaggero extracellulare che comunica alle cellule che i livelli di glucosio sono alti.
Le cellule che esprimono i recettori dell’insulina sulla loro superficie rispondono a questo segnale
aumentando il sequestro di glucosio, la sintesi di glicogeno e di trigliceridi, e diminuendo la
gluconeogenesi.

Ciascun recettore per l’insulina è composto da una catena α e da una catena β che derivano dal
taglio proteolitico di un unico precursore proteico. La catena α è extracellulare e contiene il sito
di legame dell’insulina. La catena β è formata da una regione extracellulare, un singolo passo
transmembrana e una regione citoplasmatica. Le catene α e β sono legate l’una all’altra da ponti
disolfuro e due eterodimeri αβ sono tenuti assieme da ponti disolfuro a livello delle catene α.
I recettori dell’insulina sono quindi dimeri stabili e sono inattivi in assenza di ligando. Il recettore
dimerico lega una sola molecola di insulina. Questa interazione extracellulare modifica il dominio
di legame che provoca la giustapposizione dei domini tirosin-chinasi sul lato interno della cellula.
La giustapposizione dei domini chinasici permette la trans-autofosforilazione e quindi l’attivazione
del recettore.
Nella regione citoplasmatica del recettore per l’insulina sono stati identificati diversi potenziali
siti di fosforilazione su residui di tirosina. Tre di questi sono presenti nell’ansa di attivazione. In
seguito a fosforilazione dei tre residui di tirosina, l’ansa di attivazione assume una nuova
conformazione che libera la tasca catalitica. L’ansa di attivazione lascia il sito catalitico aperto,
in grado di legare il suo substrato. In seguito all’attivazione del dominio chinasico, il recettore
fosforila se stesso su residui tirosinici adiacenti alla membrana e nella coda carbossi-terminale.

Il recettore dell’insulina associa delle piccole proteine di attacco chiamate substrati del recettore
per l’insulina (IRS). Gli IRS forniscono i siti di legame per le proteine segnale che contengono
domini SH2.
In seguito al legame del ligando e all’attivazione dell’attività chinasica, il recettore autofosforila
la tirosina 960, che è il sito di legame per i domini di legame delle fosfotirosine (PTB) dei substrati
del recettore per l’insulina. I substrati del recettore dell’insulina sono caratterizzati da un
dominio PH all’estremità N-terminale, da un dominio PTB e da una lunga coda ricca di
siti di fosforilazione in tirosina. Il dominio PH permette l’interazione con i fosfolipidi dello strato
interno della membrana plasmatica, il dominio PTB si lega con recettori attivati, e i siti di
fosforilazione in tirosina forniscono il sito di legame per proteine segnale con domini SH2.
Sono stati identificati almeno quattro membri della famiglia IRS.
I substrati IRS-1 e IRS-2 sono quelli più coinvolti nella segnalazione del recettore per l’insulina.
L’autofosforilazione sulla tirosina 960 del recettore per l’insulina fornisce il sito di legame per IRS-
1 e IRS-2. In seguito all’associazione stabile di IRS-1 o IRS-2, il recettore attivato fosforila queste
proteine di attracco su residui di tirosina. Sia IRS-1 che IRS-2 hanno un gran numero di siti di
fosforilazione su residui di tirosina. Attualmente, i siti identificati sono siti di legame per i domini
SH2 delle proteine PI 3-chinasi, Grb2 e Shp2, che si associano a IRS-1 o IRS-2 associate al recettore,
attivando così le vie di segnalazione a valle.

La PI 3-chinasi è costituita da due subunità, una che contiene due domini SH2 e l’altra il dominio
catalitico. La PI 3-chinasi è attivata direttamente dal legame dei 2 domini SH2 a siti fosfotirosinici
e fosforila i fosfoinositidi, in posizione 3, sull’anello di inositolo. I prodotti di questa fosforilazione
rimangono incassati nello strato citosolico della membrana plasmatica, dove costituiscono dei siti
di legame per le proteine che contengono dei domini PH, come ad esempio gli enzimi serina-
treonina chinasi PKB e PDK1.
PKB (o AKT) gioca un ruolo nel mediare la risposta all’insulina, così come atri segnali
extracellulari.
La PKB è coinvolta nella regolazione del trasporto del glucosio e della sintesi del glicogeno. Il
trasportatore del glucosio GLUT4 è responsabile del trasporto del glucosio, dal sangue all’interno
della cellula, regolato dall’insulina. In assenza di insulina, GLUT4 è localizzato in vescicole di
trasporto nel citoplasma delle cellule che rispondono all’insulina. In risposta all’insulina, le
vescicole si fondono con la membrana plasmatica (traslocazione di GLUT4). L’aumento del numero
di trasportatori del glucosio nella membrana plasmatica favorisce l’assorbimento del glucosio. La
traslocazione di GLUT4 dipende dall’attivazione di PI 3-chinasi (PI3K) e PKB. La sovraespressione
di PI3K o PKB stimola la traslocazione di GLUT4.
Molti recettori attivano PI3K ma solo il recettore dell’insulina stimola la traslocazione di GLUT4.
Questo suggerisce l’esistenza di una seconda via a valle del recettore dell’insulina che è necessaria
per la traslocazione di GLUT4. Resta ancora da chiarire come le due vie lavorino insieme per
stimolare la traslocazione di GLUT4.
Il glucosio in eccesso è immagazzinato nel muscolo e nel fegato sotto forma di glicogeno. La sintesi
del glicogeno è catalizzata dalla glicogeno sinteasi, un enzima la cui attività è inibita dalla
fosforilazione su residui di serina e treonina ad opera della glicogeno sinteasi chinasi-3 (GSK-3),
che a sua volta è inattivata dalla fosforilazione catalizzata dalla PKB.
L’attivazione della via PI3K – PKB in risposta all’insulina porta ad una diminuzione dell’attività
della GSK-3 e un aumento dell’attività della glicogeno sinteasi. L’attivazione della proteina
fosfatasi-1 (enzima per defosforilare la glicogeno sinteasi) contribuisce ulteriormente
all’attivazione della glicogeno sinteasi.

Diabete Mellito: è una patologia dovuta ad un’alterazione della segnalazione dell’insulina.


Esistono due tipologie di diabete:
- Il diabete di tipo I (5-10% dei casi): dovuto alla mancanza di produzione di insulina
- Il diabete di tipo II (90-95% dei casi): è una patologia più complessa. Dieta ipercalorica e
stile di vita sedentario conducono all’aumento cronico della secrezione di insulina. Livelli
elevati di insulina sovrastimolano le cellule bersaglio nel fegato ed altrove si verifica la
condizione di resistenza all’insulina, in cui le cellule bersaglio smettono di rispondere
all’ormone.

Uomini che vivono particolarmente a lungo spesso presentano una sensibilità all’insulina più alta
della norma, e i loro tessuti rispondono in modo completo a livelli circolanti di insulina
relativamente bassi.
L’aumentata resistenza all’insulina è associata a cattivo stato di salute, mentre l’aumentata
sensibilità all’insulina sembra essere associata a buone condizioni di salute.

IL RUOLO DEL CALCIO COME MESSAGGERO INTRACELLULARE


Gli ioni calcio hanno un ruolo chiave in una grande varietà di attività cellulari, come la contrazione
muscolare, la divisione cellulare, la secrezione, l’endocitosi, la fecondazione, la trasmissione
sinaptica, il metabolismo e il movimento cellulare.
In ogni caso, lo stimolo extracellulare ricevuto alla superficie della cellula provoca un aumento
della concentrazione del calcio nel citosol. La concentrazione degli ioni calcio è controllata
dall’attività regolata di pompe, di scambiatori e/o canali ionici del Ca²⁺, situati nelle membrane
che circondano il medesimo comportamento.
La concentrazione del Ca²⁺ nel citosol di una cellula non stimolata è mantenuto a livelli bassi,
circa 10⁻⁷ M.
Al contrario la sua concentrazione nello spazio extracellulare o all’interno del lume del RE o di
un vacuolo pu essere più di 10.000 volte maggiore che nel citosol.
I livelli di calcio citosolico sono tenuti molto bassi perché i canali ionici del Ca²⁺ della membrana
plasmatica e del RE sono tenuti chiusi, rendendo le membrane impermeabili a questi ioni e perché
i sistemi di trasporto del calcio regolati da ATP di queste membrane in genere pompano il calcio
fuori dal citosol.
Un innalzamento eccessivo della concentrazione citosolica di Ca²⁺ (ad es. dopo un ictus) pu
portare a massiccia morte cellulare.
Canali del Ca²⁺ IP3-dipendenti e voltaggio-dipendenti
IP3 aprono i canali del calcio a livello delle membrane del RE, provocando l’aumento della
concentrazione di Ca²⁺ citosolica. Messaggeri extracellulari che attivano recettori RTK possono
indurre lo stesso tipo di risposta. I recettori RTK attivano delle fosfolipasi della famiglia C-γ, che
possiedono dei domini SH2 di legame alle fosfotirosine del recettore attivato. Ci sono numerose
altre isoforme di PLC:
-PLCδ, che è attivato dagli ioni calcio -PLCε,
che è attivata da Ras-GTP.
Tutte e 4 queste isoforme producono IP3 e legano una moltitudine dei recettori della superficie
cellulare all’aumento del Ca²⁺ citoplasmatico.
Un’altra via che porta all’aumento della concentrazione di calcio è data dalla trasmissione
sinaptica: l’impulso nervoso provoca una depolarizzazione della membrana plasmatica, che a sua
volta induce l’apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti localizzati nella membrana
plasmatica con conseguente entrata di Ca²⁺ dal mezzo extracellulare.

In base al tipo cellulare, un particolare stimolo pu indurre dei rapidi picchi di oscillazione nella
concentrazione di ioni calcio liberi, causare un’onda di rilascio di Ca²⁺ che si diffonde da una parte
all’altra della cellula oppure innescare un rilascio localizzato e transitorio di Ca²⁺ in una precisa
zona della cellula.
I recettori IP3 sono uno dei tipi principali di canali ionici presenti nella membrana del RE; gli altri
sono chiamati recettori rianodinici (Ryr) perché legano l’alcaloide vegetale rianodina. I recettori
rianodinici si trovano soprattutto nelle cellule eccitabili e nelle cellule cardiache e muscolari
scheletriche sono responsabili dell’aumento dei livelli di Ca²⁺ in seguito all’arrivo di un potenziale
d’azione.
A seconda del tipo di cellula, i recettori rianodinici possono essere aperti da una varietà di agenti,
ma apparentemente non da IP3. Tra gli agenti che possono aprire i canali rianodinici del Ca²⁺ c’è
il calcio stesso. Questo fenomeno è chiamato rilascio di calcio indotto dal calcio (CIRC). I segnali
extracellulari trasmessi dagli ioni Ca²⁺ agiscono tipicamente aprendo un piccolo numero di canali
ionici del Ca²⁺ sulla superficie cellulare nel sito dello stimolo. Appena gli ioni Ca²⁺ passano
attraverso questi canali ed entrano nel citosol, essi agiscono sui vicini canali ionici del Ca²⁺ del
RE, aprendoli e provocando quindi il rilascio di ulteriore calcio nelle regioni adiacenti del citosol.
In alcune risposte, l’aumento dei livelli di calcio rimane localizzato in una piccola regione del
citosol, mentre in altri casi si propaga un’onda di rilascio di calcio che si diffonde attraverso
l’intero compartimento citoplasmatico.
L’aumento della concentrazione degli ioni calcio è transitorio perché gli ioni sono rapidamente
pompati fuori dal citosol, nel RE e/o nello spazio extracellulare.
Fenomeno di entrata del calcio regolato dal deposito intracellulare (SOCE): la deplezione dei livelli
di calcio nel RE innesca una risposta che porta all’apertura di canali del calcio a livello della
membrana plasmatica, con conseguente entrata degli ioni Ca²⁺ nel citosol, da dove possono essere
in seguito pompati nel RE, ristabilendo così i depositi dello ione. (Per deposito si intendono gli ioni
calcio accumulati nel RE). Questi eventi sono orchestrati da un sistema di segnalazione tra il RE e
la membrana plasmatica. In questo sistema, la deplezione di Ca²⁺ nel RE porta all’accumulo di una
proteina sensibile al Ca²⁺, chiamata STIM1, all’interno delle membrane del RE stesso.
Mentre le proteine STIM1 si riarrangiano all’interno di queste membrane, una proteina detta
Ora1 va incontro ad un simile riarrangiamento all’interno della membrana plasmatica.
Le membrane del RE e la membrana plasmatica vengono in stretto contatto tra loro in punti
specifici dove vengono in contatto anche le proteine STIM1 e Ora1, determinando l’apertura dei
canali Ora1, l’influsso di Ca²⁺ nella cellula e il ripristino dei depositi di calcio nel RE.

Proteine che legano Ca²⁺


A seconda del tipo cellulare, gli ioni calcio possono arrivare o inibire vari enzimi e sistemi di
trasporto, modificare la permeabilità di membrana agli ioni, indurre la fusione di membrane o
alterare la struttura e la funzione del citoscheletro. Il ciclo non agisce di solito su questi vari
bersagli allo stato di ione libero, ma si lega a diverse proteine leganti-calcio, provocando la
risposta. La proteina legante-calcio più studiata è la calmodulina. Ogni molecola di calmodulina
contiene quattro siti di legami per il calcio, ma non ha una sufficiente affinità per legarsi allo ione
in una cellula non stimolata. Tuttavia, se la concentrazione di calcio aumenta in risposta ad uno
stimolo, gli ioni si legano alla calmodulina, ne cambiano la conformazione e aumentano la sua
affinità per una varietà di effettori. Il complesso calcio-calmodulina si pu legare ad una protein-
chinasi, ad una fosfodiesterasi per il nucleotide ciclico, a canali ionici o, perfino al sistema di
trasporto del calcio della membrana plasmatica.

VIE DI SEGNALAZIONE
Le vie di segnalazione in una cellula sono molto complesse:
- Segnali provenienti da una varietà di recettori non correlati, ognuno dei quali si lega al
proprio ligando, possono convergere per attivare un effettore comune (es: Ras o Raf).
- Segnali provenienti dallo stesso ligando, come EGF o insulina, possono divergere per
attivare diversi effettori, portando a risposte cellulari diverse;
- Segnali possono essere trasmessi avanti e indietro fra diverse vie, un fenomeno
conosciuto come dialogo crociato (cross-talk).

Le vie di segnalazione forniscono un meccanismo per inviare informazioni attraverso la cellula. La


cellula riceve informazioni sul suo ambiente attraverso l’attivazione di vari recettori di superficie,
che agiscono come sensori per raccogliere gli stimoli extracellulari. I recettori della superficie
cellulare sono in grado di legarsi solo a ligandi specifici e non sono influenzati da una grande
varietà di molecole non correlate. Una singola cellula potrebbe avere dozzine di recettori diversi,
capaci di inviare contemporaneamente segnali all’interno della cellula.
Una volta trasmessi all’interno della cellula, i segnali provenienti da questi recettori possono
essere inviati selettivamente lungo diverse vie di segnalazione, che possono determinare la
divisione cellulare, il cambiamento di forma, l’attivazione di una particolare via metabolica o
l’apoptosi (suicidio cellulare).

APOPTOSI (Morte cellulare)


L’apoptosi, o morte cellulare programmata, è un processo normale che segue una sequenza ben
orchestrata di eventi che si concludono con la morte della cellula.
La morte per apoptosi è un processo pulito e ordinato, caratterizzato da una complessiva
diminuzione del volume della cellula e del suo nucleo, dalla perdita di adesione alle cellule vicine,
dalla formazione di bolle alla superficie cellulare, dalla rottura della cromatina in piccoli
frammenti e dalla rapida eliminazione delle cellule morenti tramite fagocitosi.
L’apoptosi è un processo importante in quanto ci sono cellule indesiderate praticamente ovunque.
Ad esempio, l’apoptosi è coinvolta nell’eliminazione di cellule il cui genoma è irreparabilmente
danneggiato. Questo è molto importante in quando alterazioni a carico di geni coinvolti nella
regolazione del ciclo cellulare possono portar allo sviluppo di tumori.
I linfociti T sono cellule del sistema immunitario che, grazie a specifici recettori di superficie,
riconoscono ed uccidono cellule anormali o infette. Alcuni dei linfociti T prodotti durante lo
sviluppo embrionale, per , sono pericolosi per l’organismo, perché espongono dei recettori che si
legano con alta affinità a proteine esposte alla superficie delle cellule normali e sono eliminati
per apoptosi.
Infine, l’apoptosi sembra coinvolta in patologie neurodegenerative, come Alzheimer, Parkinson o
sindrome di Huntington. In questo caso, durante la progressione della malattia, l’eliminazione
anomala di neuroni essenziali porta alla perdita della memoria o della condizione motoria. Questo
indica l’importanza dell’apoptosi nel mantenimento dell’omeostasi cellulare negli organismi
pluricellulari e i rischi che comporta una sua alterata regolazione,
il termine apoptosi è stato coniato nel 1972 da John Kerr, Andrew Wyllie e A.R. Curie, in Scozia,
in un articolo nel quale sono stati descritti per la prima volta gli eventi coordinati dell’apoptosi.
Informazioni sulle basi molecolari dell’apoptosi sono state rilevate inizialmente da studi sul
nematode C. elegans, le cui cellule possono essere seguite con assoluta precisione durante lo
sviluppo embrionale. Si evidenzi che delle 1090 cellule prodotte, 131 sono destinate a morire per
apoptosi.
Nel 1986, Robert Horvitz e i suoi colleghi del MIT scoprirono che i vermi con una mutazione del
gene CED-3 procedevano attraverso lo sviluppo senza perdere alcuna cellula per apoptosi.
Questo suggerì che il prodotto del gene CED-3 aveva un ruolo fondamentale nel processo
dell’apoptosi in questo organismo.
L’identificazione del gene CED-3 nei nematodi ha portato alla scoperta di una famiglia omologa di
proteine nei mammiferi, chiamate caspasi. Le caspasi sono un gruppo caratteristico di cisteina
proteasi (cioè proteasi con un residuo di cisteina nel loro sito catalitico) che sono attivate a uno
stadio precoce dell’apoptosi e sono responsabili dell’innesco della maggior parte, se non di tutti,
i cambiamenti che si osservano nella fase di esecuzione.
Le capsasi effettuano questa impresa taglando un gruppo altamente selezionato di proteine
essenziali. I bersagli sono:
- Più di una dozzina di protein-chinasi, comprese le chinasi dei contatti focali
- Lamine, che formano il rivestimento all’interno dell’involucro nucleare. Il taglio delle
lamine porta alla scomposizione della lamina nucleare e alla diminuzione del volume del
nucleo
- Proteine del citoscheletro, come quelle dei filamenti intermedi, actina, tubulina e
gelsolina. Il taglio e la conseguente inattivazione di queste proteine portano a cambiamenti
nella forma cellulare.
- Un’endonucleasi chiamata Dnasi attivata dalla caspasi (CAD), che è attivata in seguito al
taglio da parte della caspasi di una proteina inibitoria. Una volta attivata, CAD trasloca dal
citoplasma al nucleo, dove attacca il DNA tagliandolo in frammenti.

L’apoptosi pu essere innescata sia da stimoli interni, come anomalie del DNA, sia da stimoli
esterni, come alcune citochine (proteine secrete da cellule del sistema immunitario). Ad esempio,
le cellule epiteliali della prostata diventano apoptotiche quando sono private dell’ormone
maschile testosterone. Questa è la regione per cui il cancro alla prostata che si è diffuso in altri
tessuti viene spesso trattato con farmaci che influenzano la produzione di testosterone.
Alcuni studi indicano che gli stimoli esterni attivano l’apoptosi mediante la via estrinseca,
diversa da quella utilizzata dagli stimoli interni, chiamata via intrinseca.

La via estrinseca dell’apoptosi


La più nota via apoptotica attivata da stimoli che originano nell’ambiente extracellulare, deriva
dallo stimolo dato da una proteina chiamata tumor necrosis factor (TNF), così nominata per la sua
capacità di uccidere le cellule tumorali.
Il TNF è prodotto da alcune cellule del sistema immunitario in risposta a condizioni avverse, come
la temperatura elevata, infezioni virali ecc. Il TNF evoca la sua risposta legandosi a un recettore
transmembrana TNFR1, membro di una famiglia di “recettori della morte” correlati che mediano
l’apoptosi.
Studi recenti indicano che il recettore per il TNF è presente sulla membrana plasmatica come
trimero preassemblato. Il dominio citoplasmatico di ogni subunità del recettore del TNF contiene
un segmento di circa 70 amminoacidi chiamato “dominio della morte” che media le interazioni
proteina-proteina.
Il legame del TNF al recettore trimerico produce un cambiamento nella conformazione del
dominio della morte del recettore, che porta al reclutamento di numerose proteine.
Le ultime proteine che si legano al complesso assemblato sulla superficie interna della membrana
plasmatica sono due molecole di procaspasi-8. Queste proteine sono precursori delle caspasi:
contengono una porzione extra che deve essere rimossa tramite un processo proteolitico. La sintesi
delle caspasi sotto forma di proenzimi protegge la cellula dal danno proteolitico accidentale. Le
procaspasi hanno comunque un basso livello di attività proteolitica, quindi, quando due o più
procaspasi sono in stretta associazione tra loro, sono in grado di tagliarsi reciprocamente la catena
polipeptidica e di convertire l’altra molecola in una caspasi pienamente attiva.
L’enzima finale maturo contiene quattro catene polipeptidiche derivate dai due precursiori
(procaspasi).
In tutte queste vie di segnalazione, il legame di un ligando extracellulare causa un cambiamento
nella conformazione di un recettore, che porta al legame e all’attivazione di proteine situate a
valle nella via.
La caspasi-8 è descritta come una caspasi iniziatrice perché inizia l’apoptosi tagliando e attivando
le caspasi a valle, definite esecutrici, che eseguono l’autodistruzione controllata della cellula.
La via intrinseca dell’apoptosi
Gli stimoli interni, come un danno genetico irreparabile, mancanza di ossigeno (ipossia),
concentrazioni di calcio citosolico estremamente alte, infezioni virali ecc, innescano l’apoptosi
per via intrinseca.
L’attivazione della via intrinseca è regolata da proteine appartenenti alla famiglia di proteine Bcl-
2, che sono caratterizzate dalla presenza di uno o più domini BH. La famiglia delle proteine Bcl-2
si divide in tre gruppi:
1) Un gruppo detto proapoptotico che comprende le proteine che promuovono l’apoptosi
(ad esempio Bax e Bak)
2) Un gruppo detto antiapoptotico che comprende le proteine che proteggono le cellule
dall’apoptosi (ad esempio, Bcl-XL e Bcl-2)
3) Il gruppo delle proteine BH3-only, che promuove l’apoptosi mediante un meccanismo
indiretto. Si pensa che le BH3-only esercitino il loro effetto proapoptotico in due modi
differenti, a seconda della specifica proteina coinvolta. In alcuni casi, queste proteine
sembrano promuovere l’apoptosi inibendo i membri antiapoptotici della famiglia Bcl-2,
mentre in altri casi sembrano promuovere l’apoptosi attivando i membri proapoptotici
della stessa famiglia.
È solo in condizioni di alcuni tipi di stress che le proteine BH3-only sono espresse o attivate,
spostando così l’equilibrio verso l’apoptosi. In queste condizioni, il blocco operato dalle
proteine Bcl-2 antiapoptotiche viene superato e alcuni membri proapoptotici della stessa
famiglia, come Bax, possono traslocare liberamente dal citosol alla membrana
mitocondriale esterna. Si pensa che le molecole Bax vadano
incontro ad una modifica conformazionale che favorisce il loro inserimento nella membrana
mitocondriale esterna, dove si assemblano per formare un canale delimitato da più
subunità proteiche. Una volta formatosi, questo canale aumenta la permeabilità della
membrana mitocondriale esterna e promuove il rilascio di alcune proteine mitocondriali,
in particolare del citocromo c, che risiede nello spazio intermembrana. La
permeabilizzazione della membrana mitocondriale pu essere accelerata da un aumento
dei livelli citosolici di Ca²⁺ in seguito al rilascio dello ione dal RE.

Il rilascio delle proteine proapoptotiche mitocondriali come il citocromo c è


apparentemente l’evento che spinge la cellula verso l’apoptosi.
Una volta nel citoplasma, il citocromo c forma parte di un complesso multiproteico, chiamato
apoptosoma, che include anche molte molecole di procaspasi-9. La procaspasi-9 si attiva legandosi
al complesso multiproteico e non è necessario il taglio proteolitico.
La caspasi-9 è una caspasi iniziatrice che attiva le caspasi a valle esecutrici, che compiono il
processo apoptotico.

Le due vie, estrinseca (mediata da recettori) ed intrinseca (mediata dai mitocondri), alla fine
convergono attivando le stesse caspasi esecutrici, che tagliano gli stessi bersagli cellulari.
Mentre le cellule eseguono il loro programma apoptotico, perdono contatto con le cellule vicine e
diminuiscono di volume. Per ultimo, la cellula si disintegra in corpi apoptotici, chiusi da membrana
e densi di contenuto.
L’intero programma apoptotico pu essere eseguito in meno di un’ora. I corpi apoptotici sono
riconosciuti perché espongono alla loro superficie la fosfatidilserina.
Durante l’apoptosi, un traslocatore di fosfolipidi sposta le molecole di fosfatidilserina dallo strato
interno della membrana plasmatica a quello esterno, dove fungono da segnale perché i corpi
apoptotici siano riconosciuti e fagocitati dai macrofagi.
La morte cellulare per apoptosi quindi non rilascia materiale citoplasmatico nello spazio
extracellulare e questo evita l’innescamento di una reazione infiammatoria dannosa per il tessuto.

Come esistono segnali che mandano la cellula verso l’autodistruzione, così esistono segnali opposti
che mantengono la cellula in vita. Infatti, l’interazione del TNF con il suo recettore spesso
trasmette due segnali distinti e opposti verso l’interno della cellula: uno che stimola l’apoptosi e
l’altro che stimola la sopravvivenza cellulare.
Di conseguenza, la maggior parte delle cellule che possiedono i recettori per il TNF non va in
apoptosi quando viene trattata con questa citochina.
Questo è un dato spiacevole, perché inizialmente si sperava che il TNF potesse essere utilizzato
in terapia per uccidere le cellule tumorali.
Sembra che la sopravvivenza o morte di una cellula dipenda dal bilanciamento delicato tra
segnali proapoptotici e segnali antiapoptotici.
IL CANCRO
Il cancro è una malattia genetica in quanto pu essere associata ad alterazioni all’interno di geni
specifici, ma nella maggioranza dei casi non è una malattia ereditaria.
Al contrario le alterazioni genetiche che conducono alla maggior parte dei tumori insorgono nel
DNA di una cellula somatica durante la vita dell’individuo affetto. A causa di questi cambiamenti
genetici, le cellule tumorali proliferano in modo incontrollato formando tumori maligni che
invadono i tessuti sani circostanti.
Finché la crescita del tumore rimane localizzata, la malattia di solito pu essere trattata e curata
tramite rimozione chirurgica del tumore stesso. Ma i tumori maligni tendono a metastatizzare,
cioè a produrre cellule che si distaccano dalla massa di origine, entrano nel circolo linfatico o
vascolare e invadono zone distanti del corpo dove formano tumori secondari letali (metastasi) che
non sono più trattabili tramite rimozione chirurgica.
Studi degli ultimi decenni hanno portato ad un notevole miglioramento nella comprensione delle
basi cellulari e molecolari del cancro, ma hanno avuto un impatto limitato sulla prevenzione o
sull’incremento del tasso di sopravvivenza, nella maggior parte dei tumori.
Le attuali terapie, come la chemioterapia e le radiazioni, non sono in grado di uccidere
selettivamente le cellule tumorali senza danneggiare le cellule sane, come evidenziato dai gravi
effetti collaterali che accompagnano questi trattamenti.
I pazienti non possono di solito essere sottoposti a dosi sufficientemente elevate di questi
trattamenti da uccidere tutte quelle cellule tumorali presenti nel loro corpo.
Proprietà di una cellula cancerosa
Le cellule tumorali possono essere ottenute asportando un tumore maligno, dissociando il tessuto
nelle singole cellule e ponendo tali cellule in coltura. Negli anni, molte linee cellulari diverse
derivate da tumori umani sono state raccolte in banche di cellule e sono disponibili per vari studi.
In alternativa cellule sane possono essere convertite in cellule tumorali tramite trattamento con
agenti chimici cancerogeni, radiazioni o virus tumorali.
Ci sono molte differenze tra le proprietà di diverse cellule cancerose, ma le cellule cancerose
condividono un certo numero di proprietà comuni, che sono indipendenti dal tessuto dal quale
originano.
A livello cellulare, la caratteristica più importante di una cellula tumorale è la perdita del controllo
della crescita. Le cellule maligne infatti non rispondono ai tipi di segnali regolatori che fanno
arrestare la crescita e la divisione delle loro controparti sane. Non sono le cellule tumorali
ignorano i segnali inibitori della crescita, ma continuano a crescere in assenza dei segnali
stimolatori per la crescita che sono richiesti dalle cellule normali. Il ciclo cellulare delle cellule
maligne non dipende dall’interazioni tra fattori di crescita e loro recettori localizzati all’interno
della superficie cellulari.
Le cellule normali in coltura hanno una limitata capacità di dividersi; dopo un certo numero di
divisioni mitotiche, esse vanno incontro ad un processo di invecchiamento che le rende incapaci
di crescere e dividersi. Le cellule tumorali invece, possono essere considerate immortali perché
continuano a dividersi all’infinito. Questa differenza nel potenziale di crescita è spesso attribuita
alla telomerasi presente nelle cellule cancerose ed assente nelle cellule normali. La telomerasi è
l’enzima che consente il mantenimento dei telomeri alle estremità dei cromosomi, permettendo
quindi alle cellule di continuare a dividersi.
Si ritiene che l’assenza della telomerasi nella maggior parte delle cellule normali sia una delle
principali difese dell’organismo capaci di proteggerle dalla crescita tumorale.
Le alterazioni più sorprendenti che avvengono nel nucleo a seguito della trasformazione tumorale
si verificano nei cromosomi. Le cellule tumorali sono geneticamente instabili ed hanno spesso degli
assetti cromosomici decisamente alterati, una condizione definita aneuploidia, risultato di difetti
nei punti di controllo mitotici oppure della presenza di un numero abnorme di centrosomi. La
crescita delle cellule tumorali dipende molto meno da un normale corredo cromosomico diploide
rispetto a quella delle cellule sane. Al contrario, le cellule tumorali solitamente non attivano la
risposta apoptotica anche quando il loro assetto cromosomico viene fortemente alterato. La
protezione contro l’apoptosi è un’altra proprietà importante che distingue le cellule tumorali da
quelle sane.
Le cellule tumorali inoltre dipendono spesso dalla glicolisi, che è una via metabolica anaerobica.
Questa proprietà potrebbe essere dovuta alle loro grandi richieste metaboliche ed all’inadeguato
apporto sanguigno alla massa tumorale. In condizioni di ipossia le cellule tumorali attivano un
fattore di trascrizione (HIF) che induce la formazione di nuovi vasi sanguigni e promuove le
proprietà migratorie delle cellule, ci potrebbe contribuire all’invasività del tumore. Tuttavia,
anche quando vi è un eccesso di ossigeno, le cellule tumorali continuano a generare la maggior
parte dell’ATP tramite la glicolisi. Il prodotto finale della glicolisi è l’acido lattico, che viene
secreto nel microambiente della massa tumorale, ove potrebbe promuovere la crescita del
tumore.

Le cause del cancro


Nel 1775, Percival Pott, chirurgo inglese, formul la prima correlazione nota tra un agente
ambientale e lo sviluppo del cancro.
Oltre a numerose sostanze chimiche, sono stati individuati parecchi altri tipi di agenti cancerogeni,
incluse le radiazioni ionizzanti e una varietà di virus a DNA e RNA. Tutti questi agenti hanno una
proprietà comune: sono in grado di causare alterazioni nel genoma. Sostanze chimiche
cancerogene, come quelle presenti nella fuliggine o nel fumo di sigaretta, possono dimostrarsi sia
mutagene come tali oppure essere convertite in sostanze mutagene da enzimi cellulari. Anche le
radiazioni ultraviolette sono fortemente mutagene.
Numerosi virus sono capaci di infettare le cellule dei mammiferi cresciute in coltura e trasformarle
in cellule tumorali. Questi virus sono generalmente divisi in due grandi gruppi: virus tumorali a
DNA e virus tumorali a RNA, a seconda del tipo di acido nucleico ritrovato all’interno della
particella virale matura. Tra i virus a DNA capaci di trasformare le cellule troviamo il virus del
polioma, l’adenovirus ed i virus tipo herpes.
I virus tumorali a RNA, o retrovirus, sono simili per struttura a quello dell’HIV.
I virus tumorali possono trasformare le cellule perché possiedono geni i cui prodotti interferiscono
con le normali attività di regolazione della crescita. I virus tumorali sono associati solamente ad
un numero limitato di tumori umani. Altri tipi di virus invece sono tuttavia associati ad almeno un
20% dei casi di tumore. Nella maggioranza dei casi, questi virus aumentano considerevolmente il
rischio di un individuo di sviluppare il cancro, piuttosto che essere l’unica causa responsabile della
malattia. Questa relazione tra l’infezione virale e il tumore è rappresentata ad esempio dal virus
del papilloma umano (HPV), che pu essere trasmesso mediante rapporti sessuali e la cui frequenza
sta aumentando nella popolazione. L’HPV, oltre a comparire nel 90% dei tumori della cervice, è
stato anche associato come agente causativo, a tumori della bocca e della lingua sia negli uomini
che nelle donne.
Altri virus legati a tumori umani includono il virus dell’epatite B, che è associato con il tumore del
fegato; il virus di Epstein-Barr, che è associato con il linfoma di Burkitt in aree in cui è frequente
la malaria; un herpes virus (HHV-8), che è associato con il sarcoma di Kaposi.
Alcuni linfomi gastrici sono associati con l’infezione cronica dovuta al batterio Helicobacter pylori,
che dimora nello stomaco e che è responsabile anche delle ulcere. Studi recenti suggeriscono che
molti di questi tipi di cancro legati ad infezioni sono in realtà causati dall’infiammazione cronica
scatenata dalla presenza del patogeno. La malattia infiammatoria dell’intestino, caratterizzata
da infiammazione cronica, è stata associata ad un aumentato rischio di cancro al colon.
La determinazione delle cause dei differenti tipi di tumori è un’analisi effettuata dagli
epidemiologi; ricercatori che studiano la distribuzione delle malattie nella popolazione. Le cause
di certi tumori sono ovvie: il fumo causa il tumore del polmone, l’esposizione alle radiazioni
ultraviolette causa il tumore della pelle e l’inalazione di fibre di amianto causa il mesotelioma.
Ma nonostante i numerosi studi, c’è ancora molta incertezza sulle cause della maggior parte dei
tipi di tumori umani.
Gli esseri umani vivono in condizioni ambientali complesse e sono esposti a numerosi cancerogeni
potenziali, soggetti a continui cambiamenti. Il tentativo di determinare le cause del cancro
utilizzando una montagna di dati statistici ottenuti si è rivelato difficile.
L’importanza dei fattori ambientali (ad esempio, la dieta) è stata dimostrata in diversi studi.
Alcuni ingredienti della dieta, come i grassi animali e gli alcolici, possono aumentare il rischio di
sviluppare il cancro mentre certi composti che si ritrovano in frutta e verdura possano ridurre tale
rischio. È stato dimostrato che l’uso continuo di farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS)
come l’aspirina e l’indometacina diminuisca consistentemente il rischio di tumore al colon.
Si pensa che essi raggiungano questo risultato inibendo la cicloossigenasi 2, un enzima che catalizza
la sintesi di prostaglandine simili agli ormoni, capaci di promuovere la crescita di polipi intestinali.
L’azione anti-tumorale dei FANS supporta il concetto che l’infiammazione gioca un ruolo
primario nello sviluppo di diversi tumori.
La genetica del cancro
Il cancro è una delle due principali cause di morte nei Paesi occidentali e colpisce circa un
individuo su tre. Visto in questa ottica il cancro è una malattia molto comune, ma a livello
cellulare, lo sviluppo di un tumore è un evento particolarmente raro.
Il cancro origina dalla proliferazione incontrollata di un’unica cellula ribelle (è monoclonale). Il
corpo umano contiene trilioni di cellule, miliardi delle quali vanno incontro a divisione cellulare
ogni giorno. Sebbene quasi ognuna di queste cellule in divisione abbia il potenziale di cambiare la
propria composizione genetica e degenerare il tumore maligno, questo si verifica soltanto in un
terzo della popolazione umana durante il corso dell’intera vita.
La trasformazione maligna richiede più di una singola alterazione genetica. Possiamo distinguere
due tipi di alterazioni genetiche che possono renderci più predisposti a sviluppare un particolare
tipo di cancro – quelle che noi ereditiamo da uno dei nostri genitori (mutazioni della linea
germinale) e quelle che avvengono durante la nostra vita (mutazioni somatiche).
Ci sono alcune rare mutazioni che noi possiamo ereditare e che ci rendono più esposti allo sviluppo
di un tumore. La maggior parte delle mutazioni ereditarie non sono il fattore principale
responsabile dello sviluppo di molti casi di tumore.
Chiaramente, i geni che noi ereditiamo hanno un’influenza significativa sul nostro rischio di
sviluppare il cancro, ma l’impatto maggiore deriva dai geni che si alterano nel corso della nostra
vita.
Lo sviluppo di un tumore maligno (tumorigenesi) è un processo a più stadi caratterizzato da una
progressione di alterazioni genetiche in una singola linea cellulare che potrebbero verificarsi nel
corso di molte divisioni cellulari successive e richiedere anni per completarsi.
Ogni cambiamento genetico potrebbe dare avvio ad una particolare caratteristica dello stato
maligno, come ad esempio la protezione dall’apoptosi. Man mano che si verificano questi
cambiamenti, le cellule diventano sempre meno responsive ai normali meccanismi di regolazione
del corpo e sempre più capaci di invadere i tessuti normali. La tumorigenesi richiede quindi che
la cellula responsabile dello sviluppo di un cancro debba essere capace di un gran numero di
divisioni cellulari.
I tumori solidi più comuni (mammella, colon, prostata, polmone…) nascono in tessuti epiteliali che
sono normalmente caratterizzati da un livello relativamente alto di divisioni cellulari. Lo stesso
vale per le leucemie, che si sviluppano in tessuti in rapida divisione. Le cellule di questi tessuti
possono essere divise in tre gruppi:
- Cellule staminali, che possidono un potenziale di proliferazione illimitato, hanno una gran
capacità di autoriprodursi e possono dare origine a tutte le cellule del tessuto; - Cellule
progenitrici, che derivano dalle staminali e hanno capacità di proliferare limitata; - I prodotti
finali differenziati del tessuto, che in genere non hanno la capacità di dividersi. Visto che la
formazione di un tumore richiede che una cellula sia capace di dividersi continuativamente, si
possono identificare due diverse condizioni per l’origine dei tumori:
1. Il cancro insorge a partire da una piccola popolazione di cellule staminali che sono presenti
in ciascun tessuto adulto. Dato il loro potenziale di divisione illimitato e la loro vita lunga,
le cellule staminali hanno la possibilità di accumulare le mutazioni richieste per la
trasformazione maligna. Studi suggeriscono che le cellule staminali sono all’origine di una
varietà di differenti tipi di tumori.
2. Le cellule progenitrici destinate ad un particolare tipo cellulare (committed) possono dare
origine a tumori maligni grazie all’acquisizione di alcune proprietà, come la capacità di
proliferare in modo illimitato, come parte del processo di progressione tumorale.
Queste due opzioni non si escludono a vicenda.
Quando un tumore cresce, le cellule nella massa tumorale sono soggette ad un tipo di selezione
naturale che porta all’accumulo di cellule con proprietà più favorevoli per la crescita tumorale.
In un tumore, la cellula che esprime la telomerasi avrà un enorme vantaggio di crescita rispetto
alle cellule che non la esprimono. Nel tempo le cellule che non la esprimono moriranno, quindi
tutte le cellule tumorali conterranno la telomerasi.
L’attivazione dell’espressione della telomerasi pu essere considerata una variazione epigenetica,
che risulta dall’attivazione di un gene che è normalmente represso. Questo tipo di attivazione
probabilmente coinvolge un cambiamento nella struttura della cromatina del gene e/o un
cambiamento nello stato di metilazione del DNA. Una volta che si è avuto un cambiamento
epigenetico, questo è trasmesso a tutta la progenie cellulare e rappresenta quindi un’alterazione
permanente, ereditabile. Anche dopo essere diventate maligne, le cellule continuano ad
accumulare mutazioni e cambiamenti epigenetici che conferiscono nuove proprietà, rendendole
sempre più pericolose.
L’instabilità genetica rende le cellule cancerose più difficili da trattare mediante la chemioterapia
convenzionale perché le cellule spesso sorgono all’interno della massa tumorale che è resistente
al farmaco.
I cambiamenti genetici che si verificano durante la progressione tumorale sono spesso
accompagnati da cambiamenti istologici, cioè cambiamenti nell’aspetto delle cellule. I
cambiamenti iniziali spesso producono cellule che possono essere definite come precancerose, ad
indicare che hanno acquisito alcune proprietà di una cellula tumorale ma mancano della capacità
di invadere tessuti normali o metastatizzare siti lontani.
Esempio: lo sviluppo del cancro alla cervice progredisce per un periodo di oltre 10 anni ed è
caratterizzato da cellule che appaiono sempre più anomale (meno ben differenziate e con nuclei
più grandi). Quando le cellule che hanno un aspetto anomalo vengono individuate, si pu localizzare
il sito precanceroso nella cervice e distruggerlo tramite trattamento laser, congelamento o
asportazione chirurgica.
Alcuni tessuti generano tumori benigni, che contengono cellule che hanno proliferato a formare
una massa con una certa possibilità di diventare maligna. I nevi che abbiamo sono un esempio di
tumori benigni. Studi recenti indicano che le cellule pigmentate che costituiscono un nevo sono
soggette ad una risposta che le porta ad entrare in uno stato permanente di arresto della crescita
(senescenza).

Geni onco-soppressori e oncogeni: freni e accelleratori


I geni coinvolti nella cancerogenes si dividono in due categorie: i geni onco-soppressori e gli
oncogeni.
I geni onco-soppressori agiscono da freni cellulari: codificano per proteine che limitano la
crescita cellulare e impediscono alle cellule di diventare maligne.
L’assenza di tali geni è correlata con lo sviluppo di un tumore, quindi ne consegue che la
presenza di questi geni normalmente sopprime la formazione del tumore.
Gli oncogeni invece, codificano per proteine che favoriscono la perdita del controllo di crescita e
la conversione di una cellula allo stato maligno. Molti oncogeni agiscono per lo più da acceleratori
della proliferazione cellulare, ma possono anche condurre ad instabilità genetica, impedire
l’apoptosi o promuovere metastasi.
Le cellule possiedono una varietà di geni definiti proto-oncogeni, che hanno la potenzialità di
sovvertire le attività proprie della cellula e spingerla verso lo stato maligno.
I proto-oncogeni possono essere attivati (cioè diventare oncogeni) con diversi meccanismi:
1. Il gene pu essere mutato in modo tale da alterare le proprietà del prodotto genico che
non è più in grado di svolgere la sua normale attività
2. Il gene pu essere duplicato una o più volte, portando ad amplificazione genica e
produzione in eccesso della proteina codificata
3. Si pu verificare un riarrangiamento cromosomico che porti una sequenza di DNA da un
sito distante nel genoma in stretta vicinanza del gene, e ci pu alterare l’espressione del
gene o la natura del prodotto genico.

Gli oncogeni si comportano in maniera dominante, cioè una sola copia dell’oncogene pu far
esprimere alla cellula il fenotipo alterato, indipendentemente dalla presenza o meno sul
cromosoma omologo della copia normale o inattivata del gene.
Lo sviluppo della condizione di malignità per l’uomo richiede più di un’unica alterazione genetica
e ci sono due tipi di geni responsabili della formazione di un tumore. Fino a quando una cellula
possiede il corredo dei geni onco-soppressori al completo, pu risultare protetta dagli effetti di un
oncogene. La maggior parte dei tumori contiene alterazioni sia nei geni oncosoppressori che negli
oncogeni, suggerendo che la perdita della funzione di un onco-soppressore in una cellula sia
accompagnata dalla conversione di un proto-oncogene in un oncogene, prima che la cellula diventi
completamente maligna. Potrebbero essere necessarie mutazioni in ulteriori geni prima che
queste cellule realizzino un fenotipo decisamente maligno.

Geni onco-soppressori. La trasformazione di una cellula normale in una cellula cancerosa è


accompagnata dalla perdita di funzione di uno o più geni onco-soppressori. Nell’uomo, circa due
dozzine di geni sono state indicate come onco-soppressori, inclusi quelli che codificano per fattori
di trascrizione (TP53 e WT1), regolatori del ciclo cellulari (RB e P16), componenti che regolano le
proteine G (NF1), la fosfatasi per i fosfoinositidi (PTEN) e una proteina che regola la degradazione
proteica (VHL).
Per la maggior parte le proteine codificate dai geni onco-soppressori agiscono come regolatori
negativi della proliferazione cellulare, motivo per cui la loro eliminazione promuove la crescita
cellulare incontrollata. I prodotti dei geni onco-soppressori aiutano anche a mantenere la stabilità
genica. Alcuni di questi geni sono coinvolti nello sviluppo di una grande varietà di tumori differenti,
mentre altri giocano un ruolo nella formazione di uno solo o di un numero limitato di tipi tumorali.