1) Seminario Ac nucleicos (GE)

El DNA se replica con el fin

póstumo de transmitir su
información a las células
hijas. Al mismo tiempo, es
usado como molde para la
síntesis de moléculas de
RNA en un proceso
denominado transcripción.
Luego, un tipo de RNA, el
mensajero, se traduce
formando cadenas
polipeptídicas que en última
instancia serán proteínas.
En la década del ’70, el “dogma” se modificó por el descubrimiento de los retrovirus y los areno-virus. Estos
pueden transformar su material genético de RNA a DNA por transcripción inversa o retrotranscripción por la
enzima retrotranscriptasa y, además, algunos en especial los segundos se replican sin este paso previo.

Irreversibilidad y Lamarckismo
Lamarck proponía que aquellos cambios producidos en la vida de un organismo eran heredados por la
descendencia. Sin embargo, esto es erróneo debido a que los cambios que se producen sólo son heredados si se
incluyeron en el DNA del organismo progenitor. El razonamiento evolutivo de Lamarck no parte del
pensamiento lógico-deductivo con foco en lo experimental, sino del intuitivo.
En este aspecto hay un punto en común con la irreversibilidad del flujo de la información genética, ya que se
pensaba en forma unidireccional y sin tener mayor evidencia.

REPLICACIÓN DEL DNA

Experimentos previos

 Modelo semiconservativo (Meselson-Stahl – 1958)

OK, ¿Cómo?

Kornberg, 1957
Purificó una enzima capaz de polimerizar DNA en bacterias E. coli y la denominó DNA polimerasa I. En un
tubo de ensayo con una solución con pH 7 y temperatura de 37° colocó DNA molde 3’-5’ junto con la enzima,
desoxirribonucleótidos trifosfatos, un primer o cebador de DNA y Mg2+ como activador enzimático (coenzima)

Conclusión:
*DNA polimerasa I necesita “primer” con extremo 3’–OH libre para empezar a polimerizar de 5’ a 3’ con gasto
de energía. Esta energía es obtenida de los enlaces fosfatos por ruptura entre el fosfato α y el β, liberándose así
un pirofosfato.
*Apareamiento de nucleótidos por leyes de complementariedad

Cairns 1963
Conclusión:
*DNA de Escherichia coli es circular
*Modelo de y asimétrico con 2 puntos de crecimiento a partir de un
(ORI)

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 C
/mitad

Donde se está
sintetizando

Polimerasas
DNA pol necesitan primer y un extremo 3’-OH libre.
RNA pol sólo necesitan un extremo 3’-OH libre.

DNA polimerasas dependientes de DNA

Procariotas Función Eucariotas Función
DNA pol I DNA pol α
Polimerización y
DNA pol II DNA pol δ
exonucleasa 3’-5’
Polimerización,
exonucleasa 3’-5’ y
DNA pol III DNA pol γ
exonuleasa 5’-3’ (Nick
translation)
DNA pol IV
DNA pol V
DNA polimerasas dependientes de RNA
Telomerasa
RNA polimerasa dependiente de DNA
RNA polimerasa Síntesis de primers o RNA pol I síntesis de ARNr 18s,
(Primasa) cebadores 5s, 8s y 28s.
RNA pol II
RNA pol III sintetiza ARNr 5s y
los ARNm

Procariotas
INICIACIÓN
La síntesis comienza en un origen de replicación (ORI). Las enzimas helicasas rompen los enlaces puente de H
entre las bases y forman la burbuja u ojo de replicación con 2 horquillas. A medida que van abriendo la hélice
de forma bidireccional van generando un superenrollamiento negativo por tensión que es contrarrestado por un
superenrollamiento positivo por parte de una topoisomerasa II denominada DNA girasa. Para distensionar
ambas hebras, la enzima se ubica muchos pares de bases río abajo y lo que hace es romper un enlace fosfato y
regenerarlo nuevamente.
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En la hebra adelantada, la RNA primasa inserta un solo primer siguiendo el régimen de complementariedad a
partir de ribonucleótidos trifosfatos (NTP) y deja un extremo 3’-OH libre. Mientras tanto en la hebra retardada,
se forma un rulo donde las proteínas ligadoras de cadena simple (SSBS) se unen a la hebra evitando su acople
por complementariedad. Tiempo más tarde de la formación del primer en la hebra líder, se forma el de la hebra
retrasada, con la diferencia que este se vuelve a generar continuamente.
En paralelo la DNA pol III (se encuentra siempre en la horquilla) se incorpora a las regiones que contienen el
primer de RNA. En la hebra adelantada, se le añade a la enzima un clamp o anillo que la mantiene firme a la
hebra a pesar del movimiento; en tanto, en la hebra retardada en la medida que la enzima reconoce un primer se
le añade un clamp, el cual se desengancha al encontrar el primer sintetizado anteriormente (recordar que cada
tanto la RNA pol añade primers)

Al formarse el rulo lo nuevo que se sintetiza parecería ser que se sintetiza en sentido contrario al de la hebra
adelantada, pero en realidad siempre está avanzado hacia adelante la DNA pol III. Lo que daba esa idea era que
como la cadena líder corre de 3’-5’, la retrasada de 5’-3 y la polimerasa sólo sintetiza de 5’-3’ leyendo de 3’-5’,
se pensaba que había dos enzimas polimerasas, una para cada hebra. En consecuencia, en la líder se formaría
DNA continuamente mientras que en la hebra molde complementaria lo hacía de a trozos, pero la enzima que
estaba sobre la líder tenía que esperar a la otra.

Sin embargo, al formarse el rulo lo que se sintetizó antes está más alejado de la horquilla y atrás por el doblez y,
en efecto, la enzima choca con el fragmento de Okazaki anterior después. Por ello se piensa que la hebra
retardada se sintetiza al revés.

DNA pol III tiene 2 sitios activos con actividades distintas:

1. Polimerización: inserción de nucleótidos por reglas de
Watson y Crick (A – T, C – G) y formación de enlace
fosfodiéster con gasto de energía que se obtiene de la
ruptura entre el fosfato α y β
2. Exonucleasa 3’-5’ (Proofreadig): desemparejamiento de Fragmento de
Fragmento de
bases mal apareadas mediante la detección de un relieve Okazaki sintetizado
Okazaki sintetizado
en su avance (en última instancia reconoce que los puentes anteriormente
recientemente
de hidrogeno están mal) y con actividad 1 adición del
nucleótido correcto

Una vez producida una cierta polimerización, la DNA pol I remplaza los primers de RNA en el fragmento de
Okazaki más reciente y en la hebra líder. Esta enzima tiene 3 sitios activos correspondientes a polimerización,
exonucleasa 3’-5’ y exonucleasa 5’-3’ (Nick-translation). Con esta última actividad la enzima detecta un nick,
una rotura en los enlaces fosfodiéster, y lo que hace es sacar el nucleótido apareado, adicionar otro generando el
enlace e ir trasladando así el nick y, en efecto, le permite llegar al extremo del primer y seguir, aunque luego
termina desenganchándose por la acción de la DNA ligasa. Ésta enzima lo que hace es sellar ese nick que va
quedando mediante la formación del enlace fosfodiéster.

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TELÓMEROS en

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica in vitro de amplificación de un fragmento de

ADN específico que puede ser mediano o pequeño.

El mecanismo consiste en 3 pasos repetidos consecutivamente en un promedio de entre 30 y 40 ciclos para

obtener una elevada cantidad de DNA.

1) Desnaturalización: calentamiento para la separación de las dos hebras del DNA a 95°C mediante una
incubación breve.

2) Hibridación: enfriamiento rápido a 60°C evitando que ambas hebras se hibriden. Lo único que se
hibrida o emparejan son los primers de DNA (diseñados por la química orgánica).

3) Elongación: etapa de amplificación propiamente dicha realizada a 72°C. La Taq polimerasa (DNA
polimerasa de una bacteria termófila) extiende las cadenas empleando como sustrato los cuatro
desoxirribonucleótidos a partir del 3’-OH de los primers y en dirección 5’-3’ hasta terminar la lectura
del molde o hasta que se eleve la temperatura en una nueva etapa de desnaturalización.

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Producto de PCR se mide como X 2n . moléculas de DNA iniciales Ciclos de PCR

Requisitos previos:
 Agregar DNA molde
 Conocer secuencias en los extremos del molde para agregar primers sintéticos de DNA
complementarios
 Agregar Taq polimerasas
 Agregar dNTP en exceso (dGTP, dCTP, dATP, dTTP)

Ciclo 1, 2 y 3….      30

Luego de varios ciclos se obtienen miles de millones de secuencias

Las proteínas son polímeros de aminoácidos.

Hay 2 tipos: dextrógiros (D) o levógiros (L). En todos los seres vivos se encuentra el 1er tipo.
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Dogma Anfinsen
La secuencia lineal de una proteína se pliega en una estructura tridimensional única. Este plegamiento genera
sitios específicos a los que se unen los sustratos y en los que tiene lugar la reacción catalítica. La conformación
tridimensional de una proteína, crucial para su función, está determinada en gran parte por su estructura
primaria (secuencia lineal de aminoácidos). Por tanto, los genes pueden controlar la función de las enzimas
mediante la determinación de la estructura primaria de las proteínas

Estructura secundaria

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