1

INTRODUCCIÓN

Históricamente, el primer intento de terapéutica contra el cáncer de cuello

uterino se remonta en 1882, cuando Freund practica la primera histerectomía con

éxito. En 1895, Ríes, presenta esta operación al Congreso de Frankfurt tal como se

ejecuta hoy. Igualmente desde fines del siglo IX y principios del siglo XX, se han

desarrollados otras ramas terapéuticas tales como la radioterapia y la quimioterapia,

generalizándose esta práctica por ambos continentes desde 1910. Es expresado

también desde aquellos tiempos el estadio avanzado de las pacientes para el momento

del diagnostico, lo cual empeoraba su pronóstico.

La utilización de la técnica de Hibridación in situ en la identificación del virus

de papiloma humano en pacientes con lesiones condilomatosa, neoplasias

intraepitelial y carcinomas de cuello uterino es muy importante, por lo cual decidimos

evaluar las ventajas de esta técnica en tejidos embebidos en parafina para tipificar el

VPH en lesiones de cuello uterino y conocer las desventajas y limitaciones de la

técnica de Hibridación in situ, con la idea de tratar de aportar una técnica

estandarizada que sirva para la detección del VPH y que pueda ser instalado como un

procedimiento de rutina en los laboratorios de patología molecular por la utilidad que

representa su uso en la prevención del cáncer de cuello uterino.

 2

Las técnicas especiales de biología molecular son herramientas fundamentales

para el diagnóstico anatomopatológico, y su aplicación ayuda en el análisis de los

procesos que se desarrollan en los seres vivos, desde el punto de vista molecular,

los conocimientos obtenidos con los avances tecnológicos permitido entender las

alteraciones moleculares que participan en la patogénesis de los tumores y las

enfermedades infecciosas. Estos conocimientos están siendo utilizados en el

diagnóstico de las patologías, así como en la toma de decisiones acerca de las

terapias específicas para determinadas enfermedades. (1).

Por lo tanto, en la medida que la patología a avanzado en el estudio de las

bases genéticas y moleculares de las enfermedades humanas se ha producido no

sólo una mejor comprensión de muchos de estos fenómenos, sino que, además, se

han desarrollado nuevas herramientas diagnósticas en Anatomía Patológica y la

creación de una sub-especialidad en esta disciplina, la Patología Molecular, la cual

se define por las técnicas que se utilizan en ella y por los elementos que se

analizan, básicamente ácidos ribonucleico (ARN) y desoxirribonucleico (ADN), a

partir de muestras de tejidos (especímenes de biopsias o autopsias)(2).

En este contexto existen entre otros dos tipos de hibridaciones de ácidos

nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de

biología molecular. Southernblot y Northernblot. Ambos métodos utilizan una cadena

sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea con radiactividad o

bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y
 3

se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena

sencilla de secuencia parecida.

En relación al tipo Southernblot fue desarrollado por E. M. Southern para la

detección de genes específicos en el ADN celular, donde el ADN es digerido con una

enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una

electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son

desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes

de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es

transferido a un filtro de nitrocelulosa donde queda representada una réplica de la

disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel.

Posteriormente el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada

(radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación, la sonda se va

hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria

(o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede

visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de

rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el

caso de sondas con fluorocromo. La sonda está situada en el filtro en la posición del

fragmento de secuencia complementaria, que es una posición fija fácilmente

localizable en el gel.
 4

El segundo método, tipo northern o northern blot, se utiliza para identificar las

cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda con este

método el ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una

electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas

de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la

hibridación de tipo Southern, este método se utiliza muy frecuentemente para realizar

estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN

mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

Una de las técnicas recientemente utilizadas es la hibridación in situ que data

desde los años 1970 y permite la detección de una secuencia de ADN en una muestra

compleja o no del ácido nucleico, se puede visualizar por fluorescencia. Dicho

procedimiento se realiza tras la transferencia del ADN separado mediante la

electroforesis a una membrana de filtro. En el año 1975, la técnica in situ se

implementa en secciones de tejido fijados en formol e incluidos en parafina, y

permite estudiar la localización celular del ADN, evaluando además su distribución

tisular y la morfología(9).

Por otro lado la hibridación in situ es considerada como la combinación de

fragmentos marcados de ADN de una hebra o de ARN con secuencias

complementarias (sondas) a ADN/ARN celular, que en condiciones apropiadas

forman híbridos estables, en general, la hibridación puede hacerse sobre soportes

sólidos (filtros de nylon o nitrocelulosa), en solución (in vitro) o en cortes de tejido o

 5

preparaciones celulares (in situ), para ello se pueden utilizar sondas marcadas con

elementos radioactivos, en estos casos se necesita protección y manipulación

especial, por lo cual no son de elección para uso rutinario. Las técnicas no_isotópicas

o colorimétricas son más rápidas y permiten una localización más precisa de la

reacción. Las sondas marcadas sin elementos radioactivos son más estables y más

baratas. La sensibilidad es igual o levemente inferior a la de los métodos isotópicos,

Se han utilizado sondas marcadas con biotina y digoxigenina.

La hibridación in situ cromogenica (CISH) utiliza sondas marcadas para

localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos a nivel subcelular. Se utiliza la

biotina habitualmente para marcar sondas para la detección no radioactiva del ADN .

Y se optimiza el sistema de detección aprovechando la afinidad el complejo avidita y

la estretavidina con la biotina. (4).

Las estrategias habituales de detección de la biotina utilizan enzimas con

estreptavidina, de modo que se produce una señal de tinción por precipitación a partir

del sustrato enzimático cromogénico. El sistema GenPoint crea un nivel de

amplificación adicional para la detección de la biotina. Tras una unión inicial de la

estreptavidina-peroxidasa a la sonda biotinilada, la peroxidasa cataliza la oxidación

de la biotinil tiramida, con la formación inmediata de enlaces covalentes con los

grupos aromáticos de la muestra. Esta reacción deposita grandes cantidades de biotina

 6

en el sitio de la hibridación. Esta biotina adicional se utiliza a continuación para

capturar más estreptavidina-peroxidasa.

El ciclo de amplificación de estreptavidina-peroxidasa > biotinil tiramida >

estreptavidina-peroxidasa puede repetirse nuevamente para incrementar la presencia

de la biotina. La señal se revela finalmente al incorporar un indicador cromogénico de

diaminobenzidina (DAB), que se oxida por las enzimas de peroxidasa, formándose un

precipitado marrón oscuro en el sitio de la hibridación, el cual puede verse con el

microscopio de luz.

Es de hacer notar que las técnicas de hibridización molecular son muy sensibles

para la detección del ácido nucleico del VPH, existiendo dos fundamentalmente:

hibridización Southern blots e hibridización in situ. En ambas se utilizan sondas de

(ADN) o (ARN) marcado con un radio isótopo, que formarán una molécula híbrida

con el genoma (ADN) viral cuando esté presente en el tejido neoplásico. Esta

molécula marcada se hará visible con un proceso de autorradiografía en el que se

observa la positividad (señal de hibridización) como bandas oscuras en el caso del

Southern blots, y 6 gránulos oscuros (plata de la emulsión fotográfica) en la

hibridización in situ.

La intensidad de esta señal varía de acuerdo al número de copias del genoma

viral presente en cada célula. La hibridación in situ con material no radiactivo se ha

utilizado (CISH), primordialmente en la detección de bajo número de copias de virus,

 7

en particular virus como agentes infecciosos (CMV) y como agentes carcinógenos

(VPH, VHB, VEB). Utilizando técnicas imunohistoquímicas se puede conocer la

localización precisa en los tejidos y células que están expresando los genes de

secuencia complementaria a las sondas utilizadas. Las alteraciones en el epitelio del

cuello uterino, inducidas por el Virus Papiloma Humano (VPH) son de especial

interés y han sido objetos de numerosas investigaciones, debido a que se considera un

factor oncogénico importante.(5).

La presencia del virus del VPH en las células epiteliales se ha demostrado por

técnicas de inmunoperoxidasa, hibridación in situ y microscopia electrónica en

lesiones condilomatosas, neoplasia intraepiteliales y cáncer de cuello uterino. Se han

identificado alrededor de más 70 tipos diferentes de VPH, algunos asociados con

lesiones premalignas (VPH 6-11-42-43) y otros con lesiones malignas por lo que se

han catalogado en VPH de bajo y alto riesgo. (VPH 16-18-31-45-46)(5).

En la actualidad el aumento de la frecuencia de la lesión del cuello uterino

asociada a infección por el VPH en la población de mujeres sexualmente activas y su

relación con el cáncer del cuello uterino justifican el estudio y el interés por este

tema. Por otro lado, el carcinoma de células escamosas del cuello del uterino y,

también, las lesiones precursoras del mismo (condiloma y neoplasia intraepitelial

cervical) son una parte más del amplio espectro de lesiones relacionadas con el VPH.

La relación VPH-cáncer de cérvix se sustenta sobre importantes estudios

epidemiológicos basados en la biología molecular. Está científicamente comprobado

 8

que la infección genital femenina por ciertos tipos de virus papiloma humano (VPH)

son un factor necesario para el desarrollo del carcinoma de cuello uterino (6).

En consecuencia las técnicas de Biología Molecular son una herramienta crucial

en el diagnóstico y detección, así como en el manejo de la infección por este virus.

No es posible obtener una infección productiva de VPH en cultivos celulares; puesto

que requiere una diferenciación completa del epitelio Igualmente no se ha logrado

producir la infección en ningún animal de experimentación. Sólo unos pocos

genotipos de VPH conocidos (en la actualidad se dispone de las secuencias completas

de 100 genotipos), denominados genotipos transformantes de alto riesgo oncogénico,

están capacitados para la transformación celular y la génesis de un carcinoma, y la

única forma de diferenciarlos de los genotipos no transformantes es con el empleo de

las técnicas de biología molecular (6).

Cabe destacar, que a pesar de los avances en su detección y manejo, el cáncer

de cuello uterino continúa siendo un problema importante de salud pública. Debido a

las diferencias en la disponibilidad de programas de pesquisa y la prevalencia de

factores de riesgos, existen marcadas diferencias en la frecuencia relativa del

carcinoma de células escamosas de cuello uterino en países desarrollados y en los que

están vías de desarrollo. En estos últimos, el carcinoma de células escamosas de

cuello uterino es uno de los más frecuentes, mientras que ocupa el décimo lugar en

muchos países desarrollados.

 9

El carcinomas de cuello uterino representa el 10% de todos los tipos de cáncer

en mujeres, para un total de, aproximadamente 470.000 casos a nivel mundial, es la

tercera causa más común de cáncer en la población femenina y el tipo más común de

cáncer en el África sub-Sahariana, centro-América, Sur-América, Asia y Melanesia.

Más de 230.000 mujeres mueren cada año por esta enfermedad y, de estas, más de

190.000 provienen de los países en vías de desarrollo(43). Más de 80% de las mujeres

que mueren por cáncer de cuello uterino, viven en países en vías de desarrollo. Brasil

y Colombia son los países con las mayores tasas de incidencia reportadas en

Latinoamérica; por el contrario, en Kuwait y en Israel se han reportado muchos

menores tasas (6).

En Venezuela, el cáncer representa actualmente la segunda causa de muerte en

la población femenina, con una tasa registrada en el 2003, de 18,25%. Actualmente,

el carcinoma de cuello uterino representa la segunda causa de muerte por cáncer en la

población femenina venezolana. En el año 2003, se registraron 1.178 muertes por

cáncer de cuello uterino, lo cual representa el 0,97% sobre la mortalidad general

diagnosticada por medico tratante y/o forense, con una mayor incidencia en pacientes

mayores de 24 años y un pico de mayor incidencia en pacientes con edades

comprendidas entre 45 y 64 años (6).

Se ha señalado incluso un aumento en la incidencia a partir de 1985, estimada

para el año 1987, en 33,3 por cada 100.000 mujeres con tasas de hasta 20% de todas

las muertes por cáncer en la década de 1990. Los estados Trujillo, Yaracuy, Zulia,
 10

Lara, Aragua, Mérida, Táchira, Bolívar y Falcón muestran tasas de mortalidad

superiores al resto de la población (6).

 11

MATERIALES Y METODOS

El presente trabajo es un estudio clínico retrospectivo de corte transversal, fue

realizado entre febrero del 2009 y febrero 2010. Ingresaron al estudio ciento

cincuenta tres casos de cuello uterino, tomamos de los archivos del laboratorio de

Patología Naranjo Gómez entre los años 2005 y 2010. Se revisaron las historias

clínicas de los pacientes para obtener información de la edad y localización de las

lesiones de todos los casos estudiados con la técnica de hibridación in situ

cromogenica (CISH) donde se utilizaron las sondas tipos 6/11/16/18/31/33 en tejidos

fijados en formalina y embebido en parafina para la clasificación histológica de las

lesiones de los bloques de parafina se obtuvieron secciones que fueran teñidas con

Hematoxilina-Eosina.

La hibridación in situ se puede dividir en cuatro fases: preparación de la

sección, desenmascaramiento los tejidos, hibridación, y detección. Para cada una

de estas fases existen múltiples variables que podrían afectar a la sensibilidad y la

tinción de fondo, se utilizo láminas para CISH con poli-L-lisina pretratados.

El procesamiento de los tejidos se realizo en tres etapas: pre tratamiento de

los tejidos, hibridación y detección de ADN del VPH. La hibridación (CISH) se

realizó con GenPoint® catalizado, un sistema de amplificación de señal (DAKO)

para VPH (tipos 6/11,16/18,31/33 código Y1411,1412,1413), de acuerdo con

protocolos del fabricante, y para el procedimiento se siguieron las instrucciones

 12

señalados por el sistema DAKO con pequeñas modificaciones en el tratamiento

previo y en el paso de hibridación.

Se elaboraron cortes de parafina aproximadamente de 3 o 5 μ de grosor y se

aplicaron estufa durante 15 min a temperatura a 80-100° C, para permitir una mejor

adherencia de las secciones de tejidos para el portaobjeto seguidamente desparafinar

en xilol dos cambios 5min c/u y después rehidratar en alcohol isopropilico de

100%,96%,75% 3 min c/u, posteriormente agua destilada 2min. Seguidamente

proseguir la recuperación de antígeno por calor: sumergir en el baño, una cubeta llena

de solución recuperadora de epitope antigénico target retrieval a pH 6 (100 ° C)

introducir los portaobjetos y dejar recuperarla a temperatura a 100º C por 40 min,

dejar enfriar la cubeta temperatura ambiente toda la noche para posteriormente lavar

en agua corriente y luego agua destilada 2 min.

Seguido se aplicó el bloqueo de la peroxidasa endógena: a temperatura

ambiente 10 min, lavar en tampón TBST (100 ml de TBST 10x en 900 ml de agua

destilada) dos cambios por 3 min c/u y luego se secan al aire, el paso de

desenmascaramiento resulto ser uno de los pasos más críticos para la detención

sensible con el fin de aumentar la permeabilidad de las células de las sondas se usa la

solución de la digestión con proteinasa K : diluida en diluyente de proteinasa al

1:5000 solución recién preparado por 5 min en T.A, seguido de lavados en solución

Tris-Buffered saline/Tween (TBST) en T.A 2 cambios 3 min c/u, agua destilada 2

 13

min, posteriormente deshidratamos con alcohol isopropilico 75%,96%,100% por 3

min c/u.

La hibridación y detención se coloco los portaobjetos en el hybridizer y saturar

con agua destilada las “tiras de control de humedad” añadir una gota (~ 20 μL) de cada

sonda de ADN de VPH sonda biotiniladas en el corte y colocarle un cubre objetos sin

que se formen burbujas, seleccionar y ejecutar el programa para virus papiloma

humano en el menú de hybridizer a una temperatura optima de 23°C, la hibridación

se realizara automáticamente en el hybridizer durante 18 horas para desnaturalizar el

ADN.

El baño se mantiene a una temperatura de 53 ° C, se lavan los cubreobjetos en

TBST y se retiran aproximadamente en un lapso de 1 min posteriormente al lavarlo

en TBST se realiza un lavado astringente y posteriormente, se diluye el concentrado

a razon de 1:50 en agua destilada. En una cubeta, con la solucion de recuperacion

antigenica sometida a una temperatura de53 ° C, se colocan las preparaciones

agitando suavemente durante 20 min. Posteriormente se realizaron lavados en TBST

para retirar los restos de solucion para para recuperacion antigenica con dos cambios.

Se aplicaron dos gotas de estreptavidina-HRP (primaria): antes de su utilización, el

concentrado de estreptavidina HRP primaria debe diluirse a razón de 1:100 en el

diluyente que se suministra para incubarse durante 30 min a temperatura ambiente.

Una vez realizado los lavados astringentes se deben lavar los porta objetos varias

veces en solución de TBS agitando suavemente 2 cambios por 3 min c/u se elimina el
 14

exceso de TBST y se limpia cuidadosamente la zona alrededor de la muestra para

retirar el resto del liquido, posteriormente colocan 2 gotas de biotinil tiramida

(reactivo de amplificación) para cubrir la muestra y incubar a temperatura ambiente

por 15 min, luego se debe aclarar en solución TBS agitando suavemente 2 cambios

por 3 min c/u y agitando suavemente.

Por último se colocan dos gotas de estreptavidina-HRP (secundaria) y se

incuban a temperatura ambiente por 15 min, se lavada con TBS 2 cambios por 3 min

c/u, por último, e inmediatamente antes de su utilización, se debe diluir el

concentrado de cromógeno a razón de 1:50 en el tampón sustrato DAB añadiendo 2

gotas de el cromógeno DAB, se incuban en temperatura ambiente por 5-10 min, lo

que permite la visualización del tejido como un precipitado de color púrpura oscuro

en los núcleos de las células infectadas, para detener la reacción se debe realizar

varios lavados con agua destilada para retirar todo resto de la solución.

Al final del procedimiento las secciones se contrastan, con Hematoxilina de

Mayer en15-30 seg, se deshidratan en alcohol isopropilico 75%,96%,100%, y se

aclaran xilol 2 min c/u, y se montanje en medio de montaje Flo-texx. Como control

se usaron bloques de parafina con tejidos infectados con VPH S6-11/S16-18/S31-33

que habian sido fijados en formol y embebidos en parafina. De estos bloques se

obtuvieron las secciones que fueron sometidos a hibridación.

 15

MATERIALES: Kit DAKO Gen punto tiramida amplificación de la señal del

sistema de sondas biotinilado, Cromógeno DAB, DAB tampón sustrato, concentrado

primario estreptavidina-HRP, primaty estreptavidina-HRP diluyente, Secundaria

estreptavidina-HRP, Astringente de Lavado concentrado, Buffer, Dako TBS código

S3001, Cytomation proteinasa K1:5000 código S 3004, Tipos de VPH 31/33- Dako

Cytomation ADN Código Y1413 (Sonda), Tipos de VPH 16/18- Dako Cytomation

ADN Código Y 1413 (Sonda), Biotinilado sondas de ADN 6 / 11 Código Y1411,

Anticuerpo Diluente marca Zymed código 003218, Tiras control de humedad para

hibridizador Código S2452, Hibridisador DAKO Cytomation, Pluma DAKO

Cytomation código S2002, laminas cilanisadas, laminillas, Hematoxilina de Mayer,

Alcohol, Xilol, Vaporera, Cámara húmeda, Flo-texx.

 16

RESULTADOS

En la tabla 1 se muestra la distribución de frecuencia de 153 biopsias de

lesiones de cuello uterino estudiados con la técnica de hibridación in situ

cromogénica (CISH) y realizados en el laboratorio de Patología Naranjo Gómez en el

periodo 2005 a enero del 2010

Tabla 1 VPH en lesiones de cuello uterino estudiados con hibridación in situ

cromogenica (CISH) N: 153

Casos VPH Año Año Año Año Año Año Total

2005 2006 2007 2008 2009 2010

Casos (+) 5 9 37 1 7 1 60 (39.22%)

Casos (-) 0 17 59 0 6 1 83 (54.24%)

Casos (+ mixtos) 0 1 6 1 2 0 10 (6.54%)

Total de casos. 5 27 102 2 15 2 153

 17

Grafico 1 Distribución de los 153 de los casos estudiados para VPH

 18

En la tabla 2 se refleja la distribución porcentual de los casos positivos y negativos a

VPH en las biopsias analizadas durante el periodo de 2005 a enero 2010. En relación

a la distribución por grupos etarios se observo que el promedio de las edades fue de

34,07 años. La menor de 16 años y la mayor de 66 años. El porcentaje (36.50%) de

pacientes se ubico entre los 35 y 40 años de edad. (Grafico)

Tabla 2 VPH en biopsias de cuello uterino expresados en % en el periodo 2005 a

enero 2010 N:153

Años 2005 2006 2007 2008 2009 2010 porcentaje

Sonda 6/11 0 1 16 0 3 0 20
Sonda 16/18 2 4 12 0 2 1 21
Sonda 31/33 3 4 9 1 2 0 19
Total de casos 5 9 37 1 7 1 60
 19

Grafico 2 Distribución por grupos etarios 2005-enero 2010

 20

Grafico 3 resultados sondas positivas para VPH

En total con la técnica de CISH se detectaron 70(45,75%) de 153 casos positivos a

VPH 21 (13,72%) se determinaron con sonda de riesgo intermedio ( genotipos 31-

33), 20 (13.07) con sonda de bajo riesgo (genotipos 6-11), 19 (12,41%) con sonda de

alto riesgo (genotipo 16-18), 9(6,53%) de 70 casos fueron positivos con dos tipos de

sondas y fueron clasificados como positivos mixtos. 4(2,61) mostraban infección para

genotipos de riesgo bajo e intermedio, 3 (1.96%) para genotipos de bajo y alto riesgo

y 2 (1.30%) para genotipos de riesgo intermedio y alto. Uno (0.65%) de los casos fue

positivo para las tres sondas utilizadas. El tejido de este último caso pudo servir como

control para los tres tipos de sondas de VPH.

 21

En los gráficos 3 y 4 está representada la distribución de los casos de acuerdo al

genotipo del VPH. 83 (54,25) de 153 biopsias fueron negativos para VPH.

En la tabla 3La distribucion de los casos positivos por grupos etarios se especifican

en el grafico N:2. El promedio de las edades de los pacientes positivos fue 33,68

años. Los infectados por virus de bajo riesgo eran de 34,2 años en promedio

(rango16-63), las que mostraban infecion por virus de riesgo intermedio tenian un

promedio de las edades de 33,10 años (rango18-64) y en las que se demostro virus de

alto riesgo el promedio de las edades fue de 34,33 años (rango19-54), los pacientes

con infeciones mixtos estaban entre los 18-61 años y su promedio de edades eran de

32,40 años.

Tabla Edad de los casos positivos en VPH en biopsias de cuello uterino en el

periodo 2005 a enero 2010 N:70

Edad Rango

Bajo 34,20 16-63

Riesgo 33,10 18-64

Intermedio
Alto Riesgo 34,33 19,54

Mixto 32,40 18-61 Revisar Grafic

cuadro con
70 Casos (+) 33,68 16-64
Italia. o 3

resultados sondas positivas para VPH

22
 23

La distribucion de los casos por cada año de estudio fue variable. El año donde se

observo el mayor numero de paciente fue el 2007 con 102 casos, la edad media de los

pacientes en ese año fue de 34,51 años la de menor edad era de 16 y la mayor de 66

años. 42,15% de los pacientes analizados en ese año fueron positivos a VPH.

En la tabla n 4 con la tecnica de (CISH) se detectaron 70 (45,75%) casos positivos a

virus papiloma humano. 11 (------) de 70 (45,75%) para NIC I, NIC II, NIC III. 3 (----

) casos positivos con NIC I se determinaron con sonda de bajo riesgo (genotipos 6-

11). 1 (----) casos positivos con NIC I se determinaron con sonda de Riesgo

Intermedio (genotipos 31-33). 1 (----) casos positivos con NIC I se determinaron con

sonda de Alto Riesgo (genotipos 16-18). 1(----) casos positivos con NIC I se

determinaron con sonda de bajo riesgo, Riesgo Intermedio, Alto Riesgo (genotipos 6-

11/31-33/16-18). 1 (----) casos positivos con NIC II se determinaron con sonda de

Riesgo Intermedio(genotipos 31-33). 1(----) casos positivos con NIC II se

determinaron con sonda de Alto Riesgo (genotipos16-18). 1 (----) casos positivos con

NIC II se determinaron con sonda de Riesgo Intermedio y Alto Riesgo (genotipos 31-

33/16-18). 1 (----) casos positivos con NIC III se determinaron con sonda de Bajo

Riesgo (genotipos 6-11). 1(----) casos positivos con NIC III se determinaron con

sonda de Alto Riesgo (genotipos 16-18). 50 (-----) casos positivos para una dos o tres

sondas positivas para vph. 15 (----) casos positivos se determinaron con sonda de bajo

riesgo (genotipos 6-11). 15(----) casos positivos con se determinaron con sonda de

Riesgo Intermedio (genotipos31-33). 20 (----) casos positivos se determinaron con

sonda de Alto Riesgo (16-18).

24
 25

RESUMEN

Los conocimientos obtenidos con los avances tecnológicos en biología

molecular, han ayudado a comprender la patogenesis de tumores y enfermedades

infecciosas. La técnica de hibridación in situ permite la deteccion del genotipo de

VPH. El objetivo del estudio es el de investigar la presencia del ADN del VPH

integrado en las lesiones de cuellos uterinos infectados con diferentes tipos de VPH y

determinar la asociación del virus en lesiones de bajo y alto grado con la ayuda de la

hibridación in situ. Se estudiaron 153 biopsias de cuello uterino con la técnica de

hibridación in situ cromogénica (CISH) y para detectar el genotipo viral se usaron

sondas de amplio espectro del ADN del VPH que determinan los tipos específicos

6,11,16,18,31, y 33. el ADN del VPH se detecto en 70 de los 153 consultados. La

edad promedio de los pacientes fue de 34.07 años.

Palabras Claves: Hibridación in situ, Virus mde Papiloma Humano (VPH),

Catalizador Signal Sistema amplificador; GenPoint

 26

DISCUSION

Los conocimientos obtenidos con los avances tecnologicos en biologia molecular han

ayudado a comprender la patogenesis de tumores y enfermedades infecciosas y la

hibridacion in situ es una valiosa tecnica molecular de este metodo permite la

evaluacion de los resultados en el contexto de la morfologia de las celulas

preservadas. La hibridacion in situ es un sistema de amplificacion de señal altamente

sensible para la detencion de sondas biotiniladas en preparaciones de tejidos y

celulas, son compatibles con todo tipos de sondas y se pueden utilizar para amplificar

la señal de hibridaciones de ADN o ARN.

Las alteraciones en el epitelio del cuello uterino inducidas por el VPH son especial

interes y han sido objetos de numerosas investigaciones, debido a que se considera un

factor oncogenico importante. La presencia del virus papiloma humano en las celulas

epiteliales se ha demostrado por tecnicas de hibridacion in situ en lesiones

condilomatosas, neoplasia intraepiteliales y cancer de cuello uterino.

Se han identificado mas de 100 subtipos diferentes de virus papiloma humano,

algunos asociados con lesiones premalignas (6-11-42-43) y otras con lesiones

 27

malignas (16-18-31-45-46). En la actualidad el aumento de la frecuencia de la lesion

del cuello uterino asociada a infecion por el virus papiloma humano en la poblacion

de mujeres sexualmente activas y su relacion con el cancer del cuello uterino

justificar la utilizacion de este nuevo metodo tecnologico en Biologia Molecular.

Se estudiaron ciento cincuenta y tres casos con los diagnosticos de condilomas y

Neoplasias intraepiteliales cervical el tejido fijado en formalina e incluido en parafina

para utilizar la tecnica de hibridacion in situ cromogenica (CISH). La edad promedio

fue de 34,07 años. La mayor prevalencia de lesiones intraepitelial. Laq menor de 16

años y la mayor de 66 años.