PRACTICA N°06

Purificación por HIC de proteínas: GFP

Purificación de green fluorescent protein (GFP)

I. Introducción:
La GFP (Green Fluorescent Protein, GFP, por sus siglas en inglés), es
una proteína expresada naturalmente en muchas medusas
bioluminicentes, fue aislada de la medusa Aequorea victoria, ha tenido un
gran impacto dentro de la comunidad científica. En octubre de 2008, los
investigadores Osamu Shimomura, Martin Chalfie y Roger Tsien fueron
galardonados con el Premio Nobel de Química por sus trabajos con la
proteína verde fluorescente. El descubrimiento tuvo gran importancia al
observar que la GFP conservaba su propiedad fluorescente incluso dentro
de organismos distintos al de la medusa, lo que representaba una gran
ventaja respecto a otros tipos celulares (Chalfie et al., 1994). El gen que
codifica esta proteína, que ya ha sido clonado, se utiliza habitualmente en
biología molecular como marcador. (Perez & Becu, 2009).

La GFP posee 239 aminoácidos y un peso molecular de 26.9 KD, la

estructura terciaria de la proteína tiene la forma de un barril de 40 Å,
formado por once hojas β antiparalelas, en el centro del cual se encuentra
una hélice alfa y el cromóforo fluorescente (Franco & Marinez, 2009).

El cromóforo está formado por tres aminoácidos adyacentes, Ser – Tyr –

Gly (posiciones 65, 66 y 67), los cuales bajo una serie de reacciones de
ciclización forman el cromóforo activo, el cual producirá absorbancia y
fluorescencia. Cuando la luz UV o luz azul impacta sobre el cromóforo,
éste toma la energía de la luz y se excita. En la fase siguiente, el
cromóforo se libera de la energía emitiendo luz en longitud de onda verde
(BIO-RAD)
 Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)

Técnica utilizada para separar moléculas hidrofóbicas. Consiste en dejar fluir una
solución de proteínas (Muestra) y una elevada concentración de una sal
cosmotrofa, a través de una fase estacionaria de Sepharosa la cual tiene grupos
hidrofóbicos unidos a su superficie (fenil, metil, butil). Los aniones producto de
la disolución de la sal interactúan con la superficie de la proteína GFP y con las
moléculas de agua en su superficie inmediata. Incrementando la tensión
superficial del agua y exponiendo la región hidrofóbica de la proteína la cual
mediante fuerzas de van der wall quedará anclada a la superficie hidrofóbica de
la resina. Soluciones menos concentradas de sal son utilizadas para eluir a las
proteínas.

II.OBJETIVOS
III.MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

 Cepas de E. coli expresando GFP

 Extracto lisado de bacteria con lisozima
 Columna cromatografica (HIC)
 Lámpara de luz UV
 Buffer de Equilibrio (NH4)2SO4 2M
 Buffer de Unión (NH4)2SO4 4M
 Buffer de lavado (NH4)2SO4 1.3M
 TE
 Pipetas
 Tubos
 Gradillas

1. Preparar la columna, agregar 2 mL de buffer de equilibrio a la

columna, dejar gotear hasta que el buffer llegue a la marca de 1 mL.

2. Preparar la muestra, (a) transferir 250 uL del extracto lisado a un

eppendorf limpio, (b) luego agregar 250 uL de Buffer de unión y
mezclar.
3. Dejar gotear la columna en un tubo hasta que el buffer de equilibrio
llegue al ras de la resina, en ese momento agregar cuidadosamente
250 uL de la mezcla extracto lisado + buffer de unión.

4. Transferir la columna a un tubo 2, agregar 250 uL de buffer de lavado

y dejar que el buffer pase por la columna. Analizar la columna con la
lámpara
UV

5. Agregar 750 ul de TE y analizar la columna con la lámpara UV.

6. Analizar los 3 tubos con la lámpara UV.

IV.-RESULTADOS

 En la purificación de la proteína GFP se observó

el anillo de proteína GFP adherido a la resina que
contiene la columna de interacción hidrofóbica,
mediante un buffer de lavado dicho anillo
descendió por las paredes de la columna de
cromatografía.
  En la imagen se muetra los resultados después de
agregar el TE (buffer) de lavado observamos la
desaparición de la GFP .

V.-DISCUSIONES

La cromatografía de interacción hidrofóbica ´ (Hydrophobic Interaction

Chromatography, HIC) es uno de los métodos de purificación de macromoléculas ´
biológicas mas utilizado, especialmente para proteínas terapéuticas (Lienqueo ´ y col.,
2007; Mahn y col., 2005). Los mecanismos de adsorción en el ´ cual están basados las
interacciones hidrofóbicas de las moléculas con la fase estacionaria fueron ´
primeramente demostradas por Tiselius en 1940 (Porath 1987).
La HIC explota la interacción reversible entre ´ la superficie hidrofóbica de una proteína
y una matriz cromatografica con un ligando hidrofóbico a ´ moderadamente altas
concentraciones de sal, como el sulfato de amonio. Este tipo de sales tiene alta polaridad
y se unen fuertemente al agua, lo cual induce la exclusión del agua sobre la proteína y
la superficie del ligando lo que promueve las interacciones hidrofóbicas y la
precipitación de la ´ proteína (salting-out) (Lienqueo y col., 2007; Xia y col., 2004).
Las interacciones hidrofóbicas son las fuerzas ´ no covalentes más importantes que
pueden estar ´ relacionadas con diferentes procesos, como la estabilización de la
estructura de las proteínas, la unión de enzimas a un sustrato y el replegamiento de ´
proteínas. Este tipo de interacción aparece cuando ´ compuestos no polares son
colocados dentro de un ambiente acuoso (Lienqueo y col., 2007; Queiroz y col., 2001).
Fase estacionaria o matriz. La fase estacionaria en HIC presenta pequeños grupos no-
polares unidos ˜ a estructuras de polímeros hidrofılicos. Por lo tanto, existen varios tipos
de fases estacionarias en HIC que pueden diferir en la naturaleza qu´ımica del ligando,
las superficie o concentración del ligando sobre el soporte ´ y la naturaleza qu´ımica y el
tamaño de partícula del soporte base (Lienqueo y col., 2007; Queiroz y col., 2001). En la
Tabla 3 se muestran algunas de las matrices comerciales disponibles (O’Farrell 2008).

VI.-CONCLUSIONES
VII.-REFERENCIAS

BIO-RAD. Instruction Manual: Green Fluorescent Protein (GFP) Purification Kit.

http//explorer.bio-rad.com
Chalfie, M; Euskirchen, G; Ward, W; Prasher, D. (1994). Green Fluorescent
Protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148): 802-805.
Perez, M & Becu, D. 2009. La Proteina Verde Fluorescente Ilumina La
Biociencia Medicina Buenos Aires; 69: 370-374
Franco, A. & Longart, M. 2009. Applications of Green Fluorescent Protein
(GFP) in Cell Biology and Visualization of the Nervous System. Revista de
Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. Nº 2. Serie verde – Caracas.
Mayolo-Deloisa, K.; MartÍnez, L.M.; Rito-Palomares, M. TÉCNICAS
CROMATOGRÁFICAS Y SU APLICACIÓN A ESTUDIOS DE CAMBIOS
CONFORMACIONALES, ESTABILIDAD Y REPLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS
Revista Mexicana de Ingeniería Química, vol. 11, núm. 3, 2012, pp. 415-429
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Distrito Federal, México