Prácticas de Bioquímica Mgr.

Soledad Bornás Acosta

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PRACTICA 6

ENZIMAS

1. INTRODUCCION

Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que modifican la velocidad de las
reacciones químicas dentro del organismo, esta acción se como biocatálisis o cinética
enzimática.
La actividad de una enzima es eficiente en pequeñas concentraciones y altamente
específicas. Algunas enzimas dependen para su actividad solamente de su estructura
proteica y otras dependen de estructuras no proteicas llamados cofactores enzimáticos. El
cofactor puede ser un ión metálico (ejemplo Fe++, Mg++, Ca++, k+, Na+, etc.) o puede ser una
molécula orgánica llamada coenzima (ejemplo NAD, FAD, FMN, ácido lipoico, etc.).
Existen cuatro factores (temperatura, pH, concentración de sustrato y enzima) que pueden
regular la actividad de la enzima proteolítica llamada pepsina, la cual es secretada por las
células principales del estómago, en forma de zimógeno o proenzima llamado pepsinógeno.
Como sustrato se considera a la ovoalbúmina, la cual es una proteína globular presente en
la clara de huevo a elevadas concentraciones. Esta proteína es su estado natural mide
13x3nm y está constituida por 584 residuos de aminoácidos agrupados en una sola cadena
y con un PM de 64000 y un pI de 4,6.
La ovoalbúmina debe ser desnaturalizada previamente para su uso; esto se consigue
sometiendo al huevo a ebullición se extrae la clara y se licua con agua destilada y esta
solución se filtra a través de una gasa, obteniéndose así una solución turbia y su aclaración
será producto de la degradación de la ovoalbúmina por la pepsina.

2. OBJETIVOS
• Determinar la acción hidrolítica de la pepsina sobre la ovoalbúmina desnaturalizada.
• Estudiar los cuatro factores influyentes sobre la actividad enzimática de la pepsina.
• Evaluar la actividad enzimática a través de la formación del producto.

3. MATERIAL Y METODOS

3.1. MATERIALES
3.1.1. Materiales biológicos
• Ovoalbúmina 1%

3.1.2. Materiales de vidrio

• Tubos de ensayo
• Pipetas
• Cubetas
• Vasos de precipitación
• matraces

3.1.3. Reactivos
• HCl 1N
• Na2CO3 10%
• Pepsina 1%
• Agua destilada

3.1.4. Equipos y otros

• Espectrofotómetro
• Piseta
• Baño María
• Cocina

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• Termómetro

3.2. METODOS
Mediante la observación y exploración se aplicará el método de solubilidad, el método
de absorción utilizando el espectrofotómetro para determinar el comportamiento y
concentración de una enzima.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
• Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera:
1 2 3 4 5
Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL
HCl 1% 1mL 0,25mL
Agua destilada 0,75mL 1mL 0,75mL
Na2CO3 10% 0,25mL 1mL
Pre-Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Pepsina 1% 1,5mL 1,5mL 1,5mL 1,5mL 1,5mL
Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
• Nota: Antes de pre-Incubar e incubar mezclar bien cada sistema.

4.2. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

• Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera:
1 2 3 4 5
Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL
HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25% 0,25mL
Agua destilada 1,75mL 1,75mL 1,75mL 1,75mL 1,75mL
Pre-Incubar x 5minutos 0°C 20°C 37°C 60°C 90°C
Pepsina 1% 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL
Incubar 0°C 20°C 37°C 60°C 90°C
• Nota: Antes de pre-Incubar e incubar mezclar bien cada sistema.

4.3. Efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad enzimática

• Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera:
1 2 3 4 5
Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL
HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL
Agua destilada 2,25mL 2,00mL 1,75mL 1,25mL 0,75mL
Pepsina 1% 0mL 0,25mL 0,50mL 1,00mL 1,50mL
Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
• Nota: Antes de incubar mezclar bien cada sistema.

4.4. Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática

• Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera:
1 2 3 4 5
Ovoalbúmina 1% 1,0mL 1,5mL 2,0mL 2,5mL 3,0mL
HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL
Agua destilada 3,5mL 3,0mL 2,5mL 2,0mL 1,5mL
Lectura de Absorbancia 1
Pre-Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Pepsina 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL
Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Lectura de Absorbancia 2

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• Nota: Antes de pre-Incubar e incubar mezclar bien cada sistema.
• Realizar las lecturas de absorbancia a 440nm de longitud de onda.

5. RESULTADOS
En el experimento 4.1. realizar lo siguiente:
• Determinar el pH de cada sistema
• Observar cuidadosamente la turbidez de cada sistema.
• Expresar por medio de número de cruces la turbidez.
• Expresar la actividad enzimática determinando el inverso del número de cruces.
• Realizar el gráfico correspondiente.
1 2 3 4 5
Valor de pH
Turbidez (1-5 cruces)
Actividad enzimática

En el experimento 4.2. realizar lo siguiente:

• Observar cuidadosamente la turbidez de cada sistema.
• Expresar por medio de número de cruces la turbidez.
• Expresar la actividad enzimática determinando el inverso del número de cruces.
• Realizar el gráfico correspondiente.
1 2 3 4 5
Valor de pH
Turbidez (1-5 cruces)
Actividad enzimática

En el experimento 4.3. realizar lo siguiente:

• Observar cuidadosamente la turbidez de cada sistema.
• Expresar por medio de número de cruces la turbidez.
• Expresar la actividad enzimática determinando el inverso del número de cruces.
• Calcular la concentración de la enzima de cada sistema.
• Realizar el gráfico correspondiente.
1 2 3 4 5
Valor de pH
Turbidez (1-16 cruces)
Actividad enzimática

En el experimento 4.4. realizar lo siguiente:

• Calcular teóricamente la concentración del sustrato de cada sistema.
• Para determinar la actividad enzimática restar la absorbancia 1 (inicial) de la
absorbancia 2 (final) en cada tubo.
• Realizar el gráfico correspondiente.
1 2 3 4 5
Absorbancia 1 (inicial)
Absorbancia 2 (final)
Actividad enzimática

6. CONCLUSIONES

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7. CUESTIONARIO
7.1. ¿Qué es un zimógeno, cite al menos cuatro ejemplos?
7.2. ¿Cuáles son las formas de evaluar la actividad enzimática?
7.3. Determinar el km gráfica o teóricamente, teniendo en cuenta la Vmáx.
7.4. ¿Cómo influye los factores de pH, temperatura, concentración de enzima y sustrato
sobre la actividad enzimática de la pepsina?
7.5. ¿Cómo será la actividad enzimática de la pepsina al nivel del pH del jugo gástrico?

8. BIBLIOGRAFIA