6. ¿Cómo se realiza la visualización de los productos de amplificación?

para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones son visualizados a

través de una electroforesis en geles de agarosa.6 La electroforesis consiste en la
separación de grandes moléculas como los ácidos nucleicos a través de una matriz sólida
que funciona como un filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a
su tamaño y carga eléctrica. Esta separación se hace bajo un buffer o tampón que puede
ser TAE o TBE. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato les proporciona la carga
negativa, por lo que durante la electroforesis migran hacia el polo positivo. Para ello, se
prepara un gel diluyendo una cantidad de agarosa en el buffer, se calienta hasta que la
agarosa hierva lo suficiente y posteriormente se vacía a un recipiente que sirve de base para
que solidifique. Generalmente el porcentaje al que se prepara el gel es al 1.2% aun-que,
dependiendo del tamaño de las moléculas, puede ser de hasta el 2%. Otro ingrediente que
se agrega al gel es un compuesto conocido como bromuro de etidio, una molécula
intercalante capaz de unirse al ADN de doble cadena. Cuando es excitado con luz UV emite
una señal que permite la visualización de los amplicones en forma de bandas. Es importante
manipular con mucho cuidado este compuesto porque se sabe que es mutagénico y
teratógeno.
Cuando los amplicones son corridos en el gel, éstos deben ser cargados junto con un
marcador molecular que contenga un número determinado de segmentos de ADN
conocidos, lo que facilita la identificación de los amplicones y si su tamaño corresponde con
el esperado. El tamaño está dado por el número de pares de pases del amplicón. El
marcador de peso molecular es fácilmente adquirido en el mercado, ya que se ofrece una
gama de marcadores con distintos pesos moleculares para elegir el de nuestro interés.
Finalmente, la visualización de los amplicones se lleva a cabo tomando una foto digital al gel
de agarosa expuesto a luz UV ; adicionalmente un procesador de imágenes se encarga de
analizar las bandas observadas
7. Enuncie los diferentes tipos de PCR e indique las principales ventajas de cada una.

PCR anidada
Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como
molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer, como su amplificación
se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro de la amplicón
inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La
especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido
previamente, los cebadores solo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el
resultado será una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los
cebadores. La desventaja de esta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR de extensión solapada (Mutagénesis)

Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren
2 cebadores (primers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento
3' que se solapan portando ambos la mutación. Se usan los productos en otra reacción para
producir el ADN mutado de longitud completa.

PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los
productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional
con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de
genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente
una población de secuencias de menor representación.

PCR múltiple

PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan
dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la
reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de
ADN. Ventajas: información sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de
molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos.
Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una
cuidadosa optimización del proceso.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea
una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al
ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:

1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.

2.º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estándar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN
o ARN presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad,
muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado
valor Tm, del inglés melting temperature).
Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas
basadas en sondas específicas
En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada
ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es
medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar solo una
secuencia por reacción, pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su
realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas.
Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse);
cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por
resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos
fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa del ADN
polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el
nivel de amplificación del gen.
La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR
realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que
monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de
la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número
predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación
usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN
formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la
amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una
amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversas
opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las
condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos
reactivos determinados.