Manual Aia19 PDF

INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE COATZACOALCOS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE ANÁLISIS E INOCUIDAD DE ALIMENTOS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA 1ª EDICIÓN JULIO 2019
Manual de prácticas basado en competencias
Materia: Análisis e inocuidad de alimentos
Carrera: Ingeniería bioquímica
Clave de la asignatura: ALD-1301
SATCA: 2-3-5
Semestre: 7°
Elaborado por: M.C. Martha Elena Ortiz Romero

I.A.M. Gustavo Solano Silva
Revisión Autorización
H. Academia de Jefe de División de

Ingeniería Bioquímica Ingeniería Bioquímica
ELABORÓ: M.C. MARTHA ELENA ORTIZ ROMERO I.A.M. GUSTAVO SOLANO SILVA
ÍNDICE
Introducción…………………………………………………………………………………3
Objetivo……………………………………………………………………………………….3
Presentación…………………………………………………………………………………3
Competencias a desarrollar……………………………………………………………….4
Seguridad REGLAMENTO DE LABORATORIO DE …………5

BIOQUÍMICA Y QUÍMICA
Practica No. 1. PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA, MANEJO …………7

Y TRANSPORTE DE MUESTRAS DE
ALIMENTOS PARA SU ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO. (NOM-109-SSA1-1994)
Practica No. 2. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ……….14

ALIMENTOS PARA REALIZAR UN ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO.( NOM-110-SSA1-1994)
Practica No. 3. INOCUIDAD DEL ÁREA DE MANEJO DE ……….21

ALIMENTOS
Practica No. 4. TOMA DE MUESTRAS Y RECUENTO DE ……….23

BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA (CUENTA
VIABLE)
Practica No. 5. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ………..32

MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES
UTILIZANDO EL MÉTODO DE SIEMBRA EN PLACA.
( NOM-113-SSA1-1994)
Practica No. 6. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y ………38

LEVADURAS EN ALIMENTOS
INTRODUCCIÓN.
La microbiología basada en el análisis e inocuidad, estudia a los microorganismos de

interés en el agua y alimentos, así como los factores ecológicos que determinan su
sobrevivencia, crecimiento e inactivación. El tipo de microorganismo que se identifique
en un producto dependerá de la forma en que estos se han elaborado, transportado,
almacenado, manejado o preparado para su consumo. El avalar la inocuidad de los
alimentos tiene impacto a nivel individual y colectivo; en aspectos económicos, sociales
y sanitarios y representa un tema de interés en Salud Pública. La aplicación de técnicas
modernas para el análisis microbiológico de agua y alimentos permite evidenciar
riesgos microbianos e identificar prácticas que puedan comprometer la inocuidad de los
mismos, así como realizar la vigilancia y control sanitario, para abatir riesgos a la salud.
OBJETIVO:
El objetivo general del presente manual de prácticas de Análisis e inocuidad de

alimentos, es que el estudiante obtenga y desarrolle la habilidad en el control sanitario
de, alimentos, agua, equipo e instalaciones, con la finalidad de detectar las alteraciones
de estos por la acción de los microorganismos, así como conocer el efecto benéfico de
los microorganismos a nivel industrial.
PRESENTACIÓN:
Este manual está dirigido a ingenieros bioquímicos, con especialidad de alimentos, que
continúan su experiencia en el manejo de los microorganismos, enfocado
principalmente al análisis microbiológico de los alimentos, para determinar su vida útil,
su calidad sanitaria y la eficiencia de los procesos de conservación de alimentos.
Durante el desarrollo de la materia se realizaran una serie de prácticas que le permitan

al estudiante aplicar en el estudio un conocimiento integrado de la estructura y
mecanismos implicados en la inocuidad alimentaria, sus interrelaciones con el
ambiente, así como de los principios bioquímicos que les regulan y sus aplicaciones e
implicaciones socioeconómicas.
El manual de prácticas se organiza en 5 prácticas, la presentación del reglamento, las

normas de inocuidad en la toma de muestra y análisis de los alimentos, diseñadas para
que el estudiante enriquezca y adquiera las herramientas más comunes en el análisis
sanitario de los alimentos. El orden de presentación corresponde al programa de curso
teórico semestral de análisis e inocuidad de alimentos que forma parte del plan de
estudio de la carrera de Ingeniería bioquímica, impartida en el Instituto Tecnológico
Superior de Coatzacoalcos.
En las prácticas se presentan los objetivos y una breve introducción para facilitar la
comprensión de los mismos, después se indican los materiales necesarios y
procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se
complementan con figuras y esquemas, el manejo de residuos, además se proponen
formas de presentación de los resultados, para que el alumno recopile sus
observaciones y por último se incluyen cuestionarios que el estudiante deberá resolver
consultando materiales bibliográficos.
COMPETENCIAS A DESARROLLAR
Competencia general de la asignatura

Valorar la calidad sanitaria de los alimentos mediante el conocimiento de técnicas de
análisis microbianos, y así mismo determinar las alteraciones de estos producidas por
microorganismos y los posibles efectos en la salud del hombre. Lo que permitirá
diseñar, implementar y evaluar un sistema de control sanitario.
Competencias específicas
Identifica las posibles fuentes de contaminación más frecuentes en alimentos. Valora
el grado de importancia de las enfermedades de origen alimenticio en todos los ámbitos
posibles. Diagnostica las posibles fuentes de contaminación microbiológico en el agua
y establece mecanismos para lograr obtener un agua que se encuentre dentro de los
parámetros establecidos en las normas nacionales. Determina los diversos grupos
microbianos que afectan la calidad de los alimentos de origen animal y sus derivados; y
detecta las principales fuentes de contaminación de estos alimentos. Determina los
diversos grupos microbianos que afectan la calidad de los alimentos de origen vegetal
fresco y procesado. Además determina las principales fuentes de contaminación y

alteraciones. Analiza las diferentes normas y métodos para el control microbiano, y su
implementación en la industria.
Competencias instrumentales
Capacidad de análisis y síntesis Conocimientos básicos de la carrera Habilidad para
buscar y analizar información proveniente de fuentes diversas
Competencias interpersonales
Capacidad crítica y autocrítica Trabajo en equipo Habilidades interpersonales
Competencias sistémicas
Capacidad de aplicar los conocimientos en la práctica Habilidades de Investigación
Habilidad para trabajar en forma autónoma
SEGURIDAD: REGLAMENTO DE LABORATORIO
Estimado usuario, se te exhorta que antes de iniciar con tus actividades dentro del
laboratorio, conozcas el “REGLAMENTO DE LABORATORIO DE INGENIERÍAS
BIOQUÍMICA Y QUÍMICA Y LABORATORIO DE CIENCIAS BÁSICAS” el cuál te guiará
sobre las actitudes, responsabilidades y procedimientos que deberás seguir antes,
durante y al finalizar tus actividades en el laboratorio. De igual forma toma en cuenta las
precauciones o medidas generales que se te presentan a continuación con objeto de
que adquieras una actitud de prudencia frente a riesgos que puedan presentarse en el
laboratorio.
1. Competencia específica a desarrollar.
Llevar a cabo actividades prácticas con seguridad y buen manejo que promuevan el
desarrollo de habilidades para la experimentación, tales como: observación,
identificación manejo y control de variables y datos relevantes, planteamiento de
hipótesis, de trabajo en equipo.
2. Introducción.
El Instituto Tecnológico Superior de Coatzacoalcos, fundado en el año de 1999, cuenta
actualmente con un moderno Laboratorio de Ingeniería Bioquímica y Química el cual
tiene como objetivo principal la atención al alumno en la realización de las prácticas del
docente, así mismo atender las solicitudes de Proyectos Empresariales Estudiantiles y
prestar servicios externos a las dependencias que los soliciten.
Por lo anterior se hace necesario el trabajo en equipo, armonía y respeto en el

desarrollo de nuestras actividades dentro del Laboratorio, obteniendo así la calidad y
exactitud en los resultados y por ende la certificación de nuestro Laboratorio.
El presente reglamento tiene como fin lograr los resultados antes mencionados. Es por
ello que se pide analizar y poner en práctica los lineamientos aquí indicados, así como
el estatuto escolar del Instituto Tecnológico Superior de Coatzacoalcos, del estado de
Veracruz.
3. Cuestionario previo:
¿Cómo debes actuar en caso de una emergencia en el laboratorio?
¿Por qué debes utilizar equipo de protección durante el la desarrollo de la practica en el
laboratorio?
¿Por qué es peligroso comer o beber durante el la desarrollo de la practica en el
laboratorio?
¿Qué medidas de seguridad en el laboratorio conoces?
Cuestionario de 5 a 10 preguntas abiertas, referente a la fundamentación o información
de la práctica.
4. Material, Equipos y Reactivos
Materiales Equipos Reactivos
 Reglamento impreso  N.A. . N.A
5. Procedimiento.
Lectura del reglamento del laboratorio
Análisis del reglamento del laboratorio.
Hacer comentarios finales
6. Cuestionario.
¿Qué utensilios de limpieza debe traer el alumno?
¿Cuáles son las normas de vestimenta en el laboratorio?
¿Cuál es la sanción en caso de incumplir con la vestimenta indicada?
En cuanto al material y equipo ¿cuáles son las principales recomendaciones?
En cuanto a la seguridad, ¿cuáles son las principales recomendaciones?
7. Manejo de residuos:
Residuos Manejo
NA
8. Referencias bibliográficas.
A reglamento de laboratorio de ingenierías bioquímica y química y laboratorio de

ciencias básicas
PRACTICA 1
Nombre de la práctica: PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA, MANEJO Y

TRANSPORTE DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO. (NOM-109-SSA1-1994)
1. Competencia
Realizar y llevar a cabo el procedimiento de la toma, manejo y transporte de alimentos

para un análisis microbiológico de acuerdo con la normatividad.
2. Introducción
En el análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la toma

correcta, los medios de conservación y su transporte al laboratorio, son de primordial
importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto implica precisar el
objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamaño o el
volumen, en lo posible, sean representativos del producto y del lote o partida de donde
provienen, por lo que se da a conocer los pasos y lograr un correcto muestro para
análisis microbiológico.
3. Cuestionario previo
1. ¿Cuáles son los principales riesgos de contaminación de los alimentos?

2. ¿Qué medidas higiénicas se recomiendan para evitar su contaminación?
3. ¿Cuántos tipos de contaminación de alimentos existen?
4. ¿Da dos ejemplos de cada tipo de contaminación de alimentos?
5 ¿Cómo se llama la norma para la toma de muestras en alimentos para su análisis?

5 Frascos de boca ancha Autoclave calibrado a 100 Alcohol
con tapa de rosca o tapón 121 ± 1°C. ml. etílico
esmerilado de material Horno que alcance una
esterilizable, no tóxico y de temperatura de 170 ± 100 Etanol o
tamaño acorde con la 5°C. ml. isopropa-
cantidad de muestra Termómetros metálicos nol 70%,
deseada. con rango de -40 a
5 Bolsas de polietileno 100°C. 100 Agua
estériles de varias medidas. ml clorada
Hieleras de poliéstireno o
de otro material aislante. 150 Tiosulfato
Papel aluminio. ml. de sodio

Papel estraza.
Etiquetas auto adheribles.
Cinta testigo.
Marcadores indelebles
Algodón.
Cerillos o encendedor
Gasas estériles.
Bata, cubre boca, cofia y
guantes estériles.
Muestreadores,
cucharones, espátulas,
cuchillos, pinzas, etc.
(Preferentemente de acero
inoxidable)
Lámparas de alcohol.
5. Procedimiento.
Preparación del Material para la Toma de la Muestra.
 Lavar perfectamente todo el material a utilizar en el muestreo.
 El material para la toma de muestra que requiera esterilización, se deberá

envolver en forma individual, debidamente identificado, con papel de estraza
antes de esterilizarlo.
 Esterilizar todo el material e instrumentos de muestreo limpios, que se

utilizaran para la toma, manejo y transporte de muestras, que van a estar en
contacto directo con el alimento, también deben estar libre de substancias que
pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.
 Las tapas de los frascos se protegerá con papel de estraza o aluminio fijándolos
adecuadamente.
 Colocar cinta testigo en el material a esterilizar.
 El material se meterá a esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos o

en horno a 170°C por dos horas, de acuerdo a su naturaleza.
 Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminación
posterior.
 si se requiere mayor número de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y
empaparlos con etanol o isopropanol al 70%, posteriormente flamearlos y
colocarlos en recipientes estériles para evitar su contaminación o

inmediatamente utilizarlos.
Toma de muestra.
 El procedimiento para la toma de muestra, dependerá del tipo de producto y de

la finalidad del examen.
 Es necesario que al llevar a cabo el muestreo se lave las manos antes de

desarrollar éste. Para muestreo aséptico debe utilizar: bata, cofia y cubre boca.
De ser necesario el contacto directo de las manos con el producto deberán
usarse guantes estériles.
 La toma de muestra de productos envasados se llevará a cabo en forma

aleatoria y no aséptica, tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para
sus análisis, enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.
 Si se Trata de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir
éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación
microbiana.
 Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren
precauciones estrictamente asépticas pero si se debe evitar recontaminarlos.
 Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben tomarse en

áreas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminación de
las mismas.
 La toma de muestra debe hacerse con rapidez, y cuidadosamente.
 Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento

de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y
evitar que la tapa se contamine.
 Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin
deberá ser diferente de la que se envía para su análisis.
 Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda

que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los
recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente.
 Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la

temperatura en que se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a
una hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse
en condiciones de refrigeración.
 En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta

conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes
niveles.
 En el caso de alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe

muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados, cucharas,
cuchillos, etc.
 En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para

obtener una muestra representativa.
 Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta

de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las
primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.
Para productos perecederos
 Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a

granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados
en los cuales
No está definida su vida útil o de anaquel, se determinará la fecha de caducidad,
con base en productos de características similares.
 Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia

sanitaria será únicamente por duplicado, la primera se enviará al laboratorio
oficial para su análisis y la segunda se quedará en poder del interesado para su
análisis particular si es necesario.
Procedimiento para Identificación de la muestra
En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente,

inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra, mediante rótulo o etiqueta
(indelebles), conteniendo los siguientes datos:
 Fecha,
 lugar,
 hora del muestreo,
 número de lote y
 temperatura de la toma de muestra si es que procede.
La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja, en el nudo o
cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.
Conservación y transporte de muestras para su análisis
El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida
su ruptura, alteración o contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa.
Las muestras se deben entregar al laboratorio lo más rápidamente posible.
Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a

8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas,
las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección.
En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C,

empleando para conservarla hielo seco.
Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante

o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua
de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los
alimentos muestreados.
En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que puedan ejercer
otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen
derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la
envoltura.
En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o

contaminen con otras.
Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases
originales a temperatura ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C
Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está permitido el

empleo de sustancias químicas.
Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe que

además de contener la identificación de la muestra, incluya los siguientes datos:
Número de unidades y/o cantidad.

Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante, representante y/o
distribuidor.
Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca comercial y
cualquier otra información que se considere importante.
Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se

encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que
sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios.
La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que
indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida
llevar a cabo su impugnación.
Actividad a desarrollar:
 Traer una hielera o instrumento para el transporte de muestras.

 Leer la práctica y analizar la importancia de cada punto.
 Pedir al laboratorio material a utilizar en el muestreo.
 Realizar la envoltura de material para esterilizar tomando en cuenta la técnica.
 Llevar a cabo muestreos de agua de la red municipal, agua purificada, agua de
laguna o arroyo, alimentos envasados a granel y productos de alimentos
perecederos de consumo inmediato considerando los lineamientos de la norma.
 Mostrar al profesor el trabajo realizado y explicar como lo llevo a cabo y porque.
 Lavar perfectamente el material utilizado y entregarlo al laboratorio.
6. Cuestionario.
Da la definición de los siguientes términos
 Asépticamente
 Microbiostasis
 Fecha de caducidad
 Muestra representativa
 Muestra testigo
 Productos perecederos
 Toma de muestra
 Vida útil o vida de anaquel
 Muestreo aleatorio
 Esterilización
 Conservación
 Análisis
Residuos Manejo
Materia orgánica Depósito en bote de residuos
orgánicos
8. Bibliografía sugerida.
 Nickerson , J. T. y Sinskey, A.J. 1978. MICROBIOLOGÍA DE LOS

ALIMENTOS Y SUS PROCESOS DE ELABORACIÓN. Editorial Acribia.
España.
 Pelczar/reid/chan. 1982. MICROBIOLOGIA. Editorial McGraw-Hill. México.
 Forsythe, S.J. y Hayes, P.R. 2002. HIGIENE DE LOS ALIMENTOS

MICROBIOLOGÍA Y HACCP. Editorial Acribia. España.
 Norma Oficial Mexicana -109-SSA1-1994
 Broks, F. Geo. Batel, S. Janet. MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Editorial

Manual Moderno S.A.de C.V. México. 2005.
 Jay, M. James. MICROBIOLOGÍA MODERNA DE LOS ALIMENTOS.

Editorial Acribia. España 2002.
 Mûller, Gunther. MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS VEGETALES.

Editorial Acribia. 1981.
 Madigan, T. Michael. Parker, Jack. BIOLOGÍA DE LOS

MICROORGANISMOS. Editorial Prentice Hall. México. 2001.
PRÁCTICA 2
Nombre de la práctica: PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE

ALIMENTOS PARA REALIZAR UN ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. (NOM-110-SSA1-
1994)
1. Competencia
Comprender y llevar a cabo el procedimiento para la preparación de diluciones para el

análisis microbiológico de productos alimenticios.
2. Introducción:
La preparación de las muestras para análisis microbiológicos se basan en la

realización de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme
posible de los microorganismos presentes en la porción de muestra. Es muy importante
debido a que de esta situación depende la exactitud de un resultado, por ello que se
considera importante tener el conocimiento sobre la preparación de muestras.
Esta norma es técnicamente equivalente a la Norma ISO 6887-1983
1. Explica el proceso de dilución en serie
2. ¿Cuál es el principio de esta técnica?

5 Pipetas bacteriológicas Horno para esterilizar 100 Solución
una ml de
para distribuir 10 1 ml que alcance
hidróxido
temperatura mínima de
5 Pipetas bacteriológicas de sodio
170°C.
para distribuir 1 ml 1,0 N
Autoclave con
Paquete de algodón y
termómetro y 100 Solución
gasas
manómetro, calibrada ml regulador
Frascos de vidrio de 250 ml con termómetro de a de
con tapón de rosca máximas y mínimas. fosfatos
Tubos de 16 x 150 mm con Baño de agua con (solución
tapón de rosca. control de temperatura y concentra
circulación mecánica, da).
Utensilios esterilizables
para la obtención de provista con termómetro
muestras: cuchillos, pinzas, calibrado con divisiones 200 Agua
tijeras, cucharas, espátulas, de 0,1°C y que ml peptonada
etc. mantenga la temperatura
a 45 ± 0,5°C.
Cinta maskin tape Licuadora de una o dos

Etiquetas velocidades controladas
3 matraces Erlenmeyer de por un reóstato o bien un
250 ml homogeneizador
Perilla para toma de peristáltico (Stomacher).
reactivos.
Vasos para licuadora
con tapa esterilizables o
bolsas estériles para
homogeneizador
peristáltico.
Balanza granataria con
sensibilidad de 0,1 g.
5. Procedimiento:
a) Preparación del material, reactivos y soluciones diluyentes
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización
repetida y éste debe ser químicamente inerte.
i. Preparación de reactivos
Solución de hidróxido de sodio 1,0 N
Hidróxido de sodio 4,0 g

Agua 100,0 ml
Preparación:
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
ii. Preparación de soluciones diluyentes
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).

Fosfato de sodio monobásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de
sodio 1,0 N.
Llevar a un litro con agua.
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C, o utilizar Horno, durante 2 h a 170 a

175°C o 1 h a 180°C.
Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de
trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. ***
Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo
deberán ser iguales a los iniciales.
Agua peptonada
Peptona 1,0 g
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Pesar y disolver los componentes en un litro de agua destilada.
Agitar levemente hasta una completa disolución o calentar a 60°C para disolver mejor.
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según
se requiera. ***
Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo
deberán ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una

temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que
no alteren su volumen o composición.
iii. Preparación de la dilución primaria.

A partir de muestras líquidas:
 Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la
distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable
por medios mecánicos (agitación, etc.).
 Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir

por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y
homogeneizar agitando vigorosamente.
 Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada

suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de
grasas animales y vegetales).
 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco

de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y
diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a
ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
*** pueden suprimirse para evitar complejidad en el trabajo efectuado
 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por

ejemplo volúmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma
que se describió anteriormente.
iv. A partir de muestras sólidas o semisólidas.

 Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en
refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de
proceder a su análisis.
 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente
estéril o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.
 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura
similar a la de la muestra.
 Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta

obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica
correspondiente para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo
no debe exceder de 2,5 minutos.
 Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad

deseada tomando de las capas superiores de la suspensión.
 Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente,

lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión
de resultados.
 El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para

algunos productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituyentes
que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo cuando exista evidencia
(publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no
difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
v. Preparación de las diluciones decimales adicionales.

 Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9
(10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente
estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente.
 Mezclar cuidadosamente cada tubo de diluyente siempre de la misma manera.
 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van

a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra,
con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga
del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de
información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las

cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser
menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su

capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área
de la caja Petri sin líquido.
 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el

interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este
último debe inclinarse lo necesario.
 En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada

especie de microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar
diluciones mayores.
 El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número

de microorganismos esperado es:
 Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible
demostrar el microorganismo en 10 ml de la dilución más alta.
 Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan

contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en el método
de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos
microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial
Mexicana correspondiente.
Duración del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes
del análisis y éstas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20
minutos posteriores a su preparación.
b) Actividad a desarrollar:
 Leer la técnica para conocer como se va a llevar a cabo las diferentes diluciones
y su identificación.
 Traer una muestra liquida y una sólida de alimentos.
 Traer 3 colorantes vegetales inertes (cantidad a utilizar según la técnica) e
identificarlos con los nombres de las sustancias diluyentes.
 A partir de los colorantes, preparar las soluciones diluyentes indicadas en la
técnica.
 Suponiendo que ya esterilizo los diluyentes, prepare la dilución primaria tomando
en cuenta para una muestra liquida y otra para una muestra sólida de alimentos
a analizar según lo indicado en la técnica.
 Realizar las diluciones decimales correspondientes en cada tubo hasta llegara
10-9.
 Identificar con etiquetas cada dilución.
 Una vez terminado, llame al profesor y explique cómo realizó cada paso y
porque y además indicar como se debe dar un resultado según esta técnica y el
tipo de alimento
6. Cuestionario
1.- Dé la definición de Dilución primaria.

2.- ¿Qué son las Diluciones decimales adicionales?
3.- ¿Por qué es importante hacer estas diluciones?
4.- ¿Qué diferencias existen en los resultados utilizando la técnica del NMP y una
técnica de cuenta en placa?
5.- Dé la definición de inoculación.
Residuos Manejo
Colorante vegetal Desagüe
8. Bibliografía sugerida.

España.
 Norma Oficial Mexicana - NOM-110-SSA1-1994

PRACTICA 3
Nombre de la práctica: INOCUIDAD DEL ÁREA DE MANEJO DE ALIMENTOS

Aplicar técnicas microbiológicas para comprobar la inocuidad del ambiente y las
superficies utilizadas en el procesamiento de alimentos
2. Introducción.
Las bacterias y esporas fúngicas pueden estar suspendidas en el aire aisladamente, en
grumos o adheridas a la superficie del polvo proveniente de los materiales procesados.
Las partículas más pequeñas pueden quedar suspendidas en el aire por largos
periodos, moviéndose con las corrientes de aire, y los filtros de los acondicionadores de
aire suelen no removerlas. Las partículas más grandes se asientan rápidamente y
contaminan las superficies.
1. ¿Qué es inocuidad?
2. ¿Cómo se define el término de contaminación?
3. ¿Qué es una espora?
4. ¿Qué significa el termino de esterilización?

 Esponja de celulosa  Autoclave 10ml Diluyente
 Bolsas de papel  Campana de flujo Agar para
 Bolsas de plástico laminar recuento
tipo ziplop de
 Guantes bacterias
esterilizados
 Pinza para crisol
 Pipeta 10ml
 Vaso de precipitado
 Cajas de Petri
estériles
5. Procedimiento.
a) VIGILANCIA DE SUPERFICIES
Cortar esponjas de celulosa en piezas de 1 x 5 x 5 cm, ponerlas en bolsas individuales

de papel y esterilizarlas en autoclave.
Humedecer una pieza con 10 ml de diluyente y frotar vigorosamente 1 m2 de la zona

seleccionada, sujetándola con una pinza o un guante esterilizado.
Colocarla en una bolsa plástica esterilizada, agregar 100 ml de diluyente, aplicar un
masaje vigoroso a la esponja durante 1 minuto y dejar 20-30 minutos.
Transferir dos alícuotas de 1 ml a sendas cajas de Petri y volcar 15 ml de agar para
recuento fundido y enfriado a 45-50ºC.
Incubar las placas a 30 y 35ºC durante 48 horas. Calcular el número de
microorganismos en el área frotada.
b) CONTROL DEL AIRE Exponer dos placas de agar para recuento al ambiente
del laboratorio durante 15 minutos. Colocar las tapas e incubar a 30ºC. Contar el
número de colonias. Más de 15 colonias por placa indican que la calidad del aire
es inapropiada.
AGAR PARA RECUENTO. Triptona 5 g, extracto de levadura 2,5 g, glucosa 1 g, agar

15 g, agua 1 litro, pH 7. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos.
6. Cuestionario.
¿Cómo deben almacenarse los medios, reactivos y los materiales de vidrio que se
ocupan al llevan a cabo los análisis microbiológicos?
¿Por qué debe realizarse un análisis de las superficies donde se procesan alimentos?
¿Qué pruebas se deben realizar para evaluar el funcionamiento correcto de la
autoclave?
7. Manejo de residuos
Residuos Manejo
Agar contaminado Esterilizar en autoclave y desechar
microbiológicamente en orgánico e inorgánico
1. Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. 7ª ed. Butterworth Heinemann,

Oxford, pp 11, 19, 39.
2. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. 1992. La
Garantía de la Calidad en el Laboratorio Microbiológico de Control de los Alimentos.
Roma.
3. Downes FP, Ito K, editores. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods. 4º ed. American Public Health Association, Washington, pp 1, 13,
25.
PRACTICA 4
Nombre de la práctica: TOMA DE MUESTRAS Y RECUENTO DE BACTERIAS
AEROBIAS EN PLACA (CUENTA VIABLE)

Preparara diluciones de muestras de alimentos, sembrará en placa y será capaz de
analizar el crecimiento de microorganismos mesolíticos aerobios tomando como
referencia la NOM-092-SSA1-1994
2. Introducción.
Los determinación de microorganismos mesófilos son una buena forma de conocer las
condiciones higiénicas en que se encuentra el alimento que se desea consumir, el
fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el
medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación,
presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo
estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas
controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
Esta técnica se complementa con la NOM-109-SSA-1-1994 y NOM-110-SSA1-1994 y
puede emplearse para estimar la cantidad de microorganismos viables presentes en un
alimento. Agua potable y agua purificada, por la cuenta de colonias en un medio sólido,
incubado aeróbicamente. Esta norma es equivalente a la Norma ISO-4832-
1991.Microbiology-General Guidance for the Enumeration of Coliforms-Colony Count
Technique.
¿Qué es un conteo bacteriano?
¿Qué es una unidad formadora de colonias UFC?
Menciona y explica los métodos de determinación del crecimiento microbiano.

2 Matraces erlenmeyer de 1 balanza digital 100 Solución
1 autoclave ml
500 ml. de NaOH
1 incubadora
Cinta masking tape Contador de colonias de 1.0 N
1 Pipetas de 5 ml. campo oscuro Agua

Papel de estraza 1 lt
destilada
2 Pipeta de 1 ml. Baño de agua con
1 paquete de algodón control de temperatura. Peptona
10 tubos de ensaye de 16 x 1gr
150 Potenciómetro con una
NaCl
Gasas estériles escala mínima de 0,1 8.5
1 Termómetro unidades de pH a 25 °C. gr
1 Mortero con pistilo
10 Cajas Petri desechables Campana de flujo
estériles laminar como medio
1 Frasco con tapa esmerilada
estéril.
Vaso de precipitado de 200
1 ml.
Etiquetas
Marcador indeleble
1Pizeta
1 1 gradilla
1 Mecheros Fisher o
2 campana de flujo laminar
1 Asa de platino
5. Procedimiento.
Lavar perfectamente todo el material a esterilizar, secar envolver indicando todos sus
datos (No. De equipo, grupo, fecha, y nombre del medio y el procedimiento que se está
llevando a cabo).
Prepare 250 ml. de agua peptonada según la técnica preparación de soluciones
diluyentes (NOM 110).
Prepare el medio de cultivo Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta
estándar) según la formulación si no lo hay.
Formula
Extracto de levadura 2,5 g
Triptona 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1,0 l
Preparación del medio de cultivo.
Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. (Hacer la

relación para preparar solo 300 ml.)
Hervir hasta total disolución.
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml,

(matraces erlenmeyer o matraz balón de fondo plano).
Una vez preparado el agar y el medio de dilución, se tapan las bocas de los matraces
perfectamente y se meten a esterilizar en autoclave a 121 ± 1,0 ºC, durante 15 minutos.
El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC.
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de

agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de
fundirse más de una vez.
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.
Distribuir las 10 cajas estériles en la mesa de trabajo y marcar las cajas en sus tapas
con los datos pertinentes (dilución 10-1, 10-2, ...... 10-9, previamente a su inoculación y
realizarlo por duplicado.
Preparación de la muestra a analizar (dilución primaria).

Para la preparación de la muestra seguir la técnica de PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE
MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA REALIZAR UN ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.
(NOM-110-SSA1-1994).
A partir de muestras líquidas:
 Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la
distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable
por medios mecánicos (agitación, etc.).
 Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir

por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y
homogeneizar agitando vigorosamente.
 Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada

suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de
grasas animales y vegetales).
 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco

de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y
diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a
ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por

ejemplo volúmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma
que se describió anteriormente.
A partir de muestras sólidas o semisólidas.

 Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en
refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de
proceder a su análisis.
 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o

bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.
 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura

similar a la de la muestra.
 Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta

obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica
correspondiente para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo
no debe exceder de 2,5 minutos.
 Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad

deseada tomando de las capas superiores de la suspensión.
 Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente,
lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión
de resultados.
Si el contenido del envase no es homogéneo deberá tomarse una muestra de 50 gr. a

partir del macerado de todos los componentes.
 Homogeneizar la muestra con el diluyente, según las indicaciones anteriores.
 Prepare una serie de tubos conteniendo 9 ml del diluyente estéril y taparlos para
evitar que se contaminen y márquelos como 10-2, 10-3, .... , 10-9 .
 Transferir 1 ml de la dilución primaria (10-1), en 9 ml. del diluyente contenido en
el tubo 10-2.
 De este tubo preparado, tomar 1 ml y transferirlo al siguiente tubo (10 -3) , y así
sucesivamente hasta llegar a la dilución 9, agitando suavemente para que se
homogenice la muestra con el diluyente.
 No dejar pasar más de 15 minutos desde la preparación de la muestra hasta la
hechura de la última dilución y empezar a sembrar en las cajas Petri.(no debe
exceder de 20 minutos en total).
 Agregar a las cajas Petri 1 ml de dilución realizada según corresponda a cada
tubo.
 Agregar a las cajas Petri de 12 a 15 ml del medio preparado y mezclarlo
mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en sentido de las manecillas
del reloj y 6 en sentido contrario y otras 6 de adelante hacia atrás.
 Cuidar de que el medio no moje la tapa de la caja.
 Dejar solidificar.
 Se debe realizar por duplicado cada muestra (2 cajas Petri por dilución).
 Una caja se debe tomar como testigo en la cual no se sembrara nada.

 Incubar las cajas en posición invertida durante 48 hrs a 37°C.
 Observar si hubo o no crecimiento a las 24hrs y 48hrs.
Contar las colonias en las cajas, desechando aquellas que presentan recuentos
menores a 25 y mayores a 250 colonias por caja (UFC) excepto los mohos y levaduras,
para disminuir errores de medición.
Reporte de resultados
Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250.
Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el siguiente cuadro
ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.
Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio
dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener
la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase el cuadro , ejemplo 2.
Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde
las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se
presentan las siguientes guías:
Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor
dilución muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias
presentes en dicha dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por el factor
de dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe
esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro, ejemplo 3.
Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de
250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de
la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de
la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden
contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de
diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta
situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro, ejemplo 4.
Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes

formas:
 Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser

causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias.
 Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.
 Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie
del agar.
 Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de
inhibición del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión
del crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de la caja.
Si la caja contiene una sola cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene
varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena
como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena individualmente.
En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y otra dilución presente
colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden contar las
colonias, véase el cuadro, ejemplo 5.
Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias,
reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja
usada, véase el cuadro, ejemplo 6.
Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y
otra con más de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su
duplicado más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del
intervalo para determinar la cuenta en placa, véase el cuadro, ejemplo 7.
Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a
250 colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de
colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas
para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro, ejemplo 8.
Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de
25 a 250 y sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro cajas
incluyendo aquélla con menos de 25 o más de 250 colonias, para calcular la cuenta en
placa.
Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la

inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la
muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos
dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dígito al
número inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por
ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el
tercer dígito con cero y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400):
Informe de la prueba
Reportar como: Unidades formadoras de colonias,___ UFC/g o ml, de bacterias
aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar,
incubadas ________ horas a _______ ºC.
Ejemplo Colonias contadas UFC /g o ml.
número
1: 100 1: 1000 1: 10000
1 250 178 16 180000
250 190 17
2 250 220 25 250000
238 28
3 18 2 0 1600
14 0 0
4 250 250 512 5000000
250 250 495
5 250 240 34 290000
250 235 crecimiento
extendido
6 0 0 0  100
7 250 240 24 250000
250 268 19
250 216 23 280000
250 262 42
9 250 215 20 270000
250 235 26
250 275 32
250 225 26
Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación
Termófilos aerobios 55  2°C 48  2 Hrs.

Mesófilas aerobios 35  2°C 48  2 Hrs.
Psicrófílos 5  2°C 7 – 10 Días
psicotróficos 20  2°C 3 - 5 Días
6. Cuestionario.
1.- Define bacterias aerobias.
2.- Da ejemplos de bacterias aerobias comunes en los alimentos o medio ambiente.
3.- Por qué se utiliza este método para identificar bacterias aerobias?
4.- Qué tan confiable consideras que es el método para llevar a cabo esta
determinación?
5.- Por qué un análisis microbiológico se tiene que hacer por duplicado?
Residuos Manejo
España.
 Norma Oficial Mexicana -092-SSA1-1994
Manual Moderno S.A. de C.V. México. 2005.
PRACTICA 5
Nombre de la práctica:
DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES
UTILIZANDO EL METODO DE SIEMBRA EN PLACA. ( NOM-113-SSA1-1994)

Determina el número de microorganismos coliformes totales presentes en una muestra
de alimento por medio de la técnica de cuenta en placa
2. Introducción.
Los alimentos provienen de seres vivos, lo que los hace perecederos. Una gran cantidad de
alimentos se destruye antes de ser consumida debido a una mala manipulación o forma de de
cosecha, este grupo de microorganismos coliformes se utiliza como indicador de prácticas
higiénicas inadecuadas, este método permite determinar el número de microorganismos
coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el
que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la
producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales
biliares.
¿Cuáles son los microorganismos llamados coliformes?
¿Cuál es el impacto en la salud la presencia de coliformes en los alimentos?

Matraces erlenmeyer de 500 1 balanza digital Solución
1 autoclave reguladora de
ml.
1 incubadora fosfatos (solución
Cinta masking tape 1 Contador de de trabajo)
colonias de campo Agua peptonada
3 pipetas de 5 ml.
oscuro Agar rojo
Papel de estraza Baño de agua con violeta bilis
control de lactosa
3 pipetas de 1 ml.
temperatura. (RVBA)
1 paquete de algodón Potenciómetro con
una escala mínima
10 tubos de ensaye de 16 x
de 0,1 unidades de
150 con tapón de rosca. pH a 25 °C.
Campana de flujo
Gasas estériles
laminar como
1 termómetro medio
1 mortero con pistilo

10 cajas petri desechables
estériles
1 frasco con tapa esmerilada
1 vaso deprecipitado de 200
ml.
Etiquetas
Marcador indeleble
1Pizeta
1 gradilla
2 mecheros fisher o campana
de flujo laminar
Tijeras
espátula
4. Procedimiento.
Preparación de Soluciones diluyentes
- Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
Formula
Fosfato monopotásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio
1,0 N.
Llevar con agua a un litro. (En este caso solo haga la relación para preparar 250 ml.)
Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos.
Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0°C.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser

iguales a los iniciales.
- Agua peptonada ( sólo los equipos 3,4,5)
Formula
Peptona 1,0 g
NaCl 8,5 g
Agua 1,0 l
Preparación:
 Disolver los componentes en un litro de agua.
 Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.
 Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.
 Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo

deben ser iguales a los iniciales.
 Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una

temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones
tales que no alteren su volumen o composición.
Medio de cultivo
- Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA)
Formula (en caso de no contar con el medio deshidratado, sino seguir las instrucciones del
fabricante)
Peptona 7,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Lactosa 10,0 g
Sales biliares 1,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 15,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
 Para este caso sacar la relación y preparar aproximadamente 300ml del medio de
cultivo para el análisis a realizar. Si tiene dudas pregunte al profesor.
 Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
 Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido
de sodio 0,1N a 25°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este
valor.
 Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.
 Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C.
 Evitar el sobrecalentamiento del medio.

 No debe esterilizarse en autoclave.
 Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.
Preparación de la muestra
MUESTRA A ANALIZAR: Alimento fresco con posibilidad de contaminación por coliformes.

También puede ser agua o hielo.
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la técnica

PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA REALIZAR UN
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.( NOM-110-SSA1-1994)
 Preparar todo el material a esterilizar.

 Preparar las soluciones diluyentes.
 Preparar los medios de cultivo según la formula o indicaciones del fabricante.
 Esterilizar en Horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante
15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
 Dejar enfriar.
 Preparar la muestra de alimento a analizar suficiente para 5 diluciones.
Los siguientes pasos se deben realizar en la campana de flujo laminar.
 Colocar en cajas Petri (previamente etiquetadas) por duplicado 1 ml de la muestra

líquida directa o de la dilución primaria, con una pipeta estéril, utilizar una pipeta para
cada caja. En caso de no contar con suficientes pipetas, lavar con agua destilada y
flamear la pipeta en el mechero.
 Repetir el procedimiento 5 veces para las diluciones decimales que se requieren

sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
 Vertir de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de

agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio.
 El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que

se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a

izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos
en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante.
 Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie
horizontal fría.
 Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.
 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter

aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio
inoculado.
 Dejar que solidifique.
 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.
 Después del periodo de incubación, contar las colonias con el contador de colonias.
 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias.
 Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de
un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa,
la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0
mm.
Resultados.
Cálculo del método
Separar las placas que contienen entre 15 y 150 colonias características en dos diluciones
consecutivas.
Contar las colonias presentes.
Calcular el número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el número
de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los criterios de la NOM-092-
SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número
obtenido seguido de la dilución correspondiente.
Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un

coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.
Informe de la prueba
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h.
En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la

dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1.
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de

coliformes por ml".
5. Cuestionario.
1.- Da la definición de coliformes.
2.- ¿Qué son los coliformes totales?, cita ejemplos.
3.- ¿Por qué se utiliza el RVBA como medio de cultivo y no otro medio?
4.- ¿Por qué se pueden utilizar cualquiera de las dos soluciones diluyentes?
Residuos Manejo
 Nickerson , J. T. y Sinskey, A.J. 1978. MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y SUS

PROCESOS DE ELABORACIÓN. Editorial Acribia. España.
 Forsythe, S.J. y Hayes, P.R. 2002. HIGIENE DE LOS ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA Y

HACCP. Editorial Acribia. España.
 Norma Oficial Mexicana -113-SSA1-1994.
 Broks, F. Geo. Batel, S. Janet. MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Editorial Manual Moderno

S.A.de C.V. México. 2005.
 Jay, M. James. MICROBIOLOGÍA MODERNA DE LOS ALIMENTOS. Editorial Acribia.

España 2002.
 Mûller, Gunther. MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS VEGETALES. Editorial Acribia.

1981.
 Madigan, T. Michael. Parker, Jack. BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS. Editorial

Prentice Hall. México. 2001.
Practica 6
Nombre de la práctica: MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN

ALIMENTOS.

Determinará el contenido de mohos y levaduras viables (NOM-111-SSA1-1994)
presentes en placa a 25 1 °C. En productos destinados al consumo humano por
medio de la cuenta en placa.
2. Introducción.
Los mohos y las levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden
encontrar formando parte de la flora normal de un alimento o como agente s
contaminantes en los equipos utilizados en los procesos alimentarios. El método se
basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo
específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando
como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de
microorganismos. Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los
alimentos, puesto que al establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su
utilización como un indicador de prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción
y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia prima inadecuada.
¿Qué son las micotoxinas?
¿Cuáles son las principales micotoxinas?
¿Qué efectos pueden tener las micotoxinas en los consumidores de alimentos
contaminados?

5 Pipetas bacteriológicas o 1 Autoclave 250 Agua
graduadas de 10 y 1 1 Incubadora destilada
ml
20 Cajas Petri. 1 Contador de colonias Agar papa
1 Frasco de vidrio de 250 ml 2 Mecheros Fisher o – dextrosa
con tapón de rosca. campana de flujo Solución
250
10 Tubos de 16 x 150 mm. laminar reguladora
1 Espátula 1 Balanza digital ml de fosfatos

1 Agitador de vidrio 1 Potenciómetro Solución
100
1 1 Probeta 1 Baño de agua con estéril de
2 Matraces aforaros de 500 control de temperatura ml ácido
ml. o normales tartárico al
1 Vaso de precipitado de 500 10%
ml Alimento en
1 Peseta estado de
Algodón descompos
Gasas ición, de
Etiquetas preferen-
Papel estraza cia fruta o
Cinta masking tape verdura.
Etanol o
isopropa-
nol a 70 %
5. Procedimiento.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio,
deben esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos
como mínimo a 121 ± 1,0°C.
Limpiar y esterilizar el área de trabajo con etanol o isopropanol al 70%, posteriormente
flamearlo antes de empezar a trabajar.
Preparación del medio de cultivo.
 Preparar 250 ml de agar papa – dextrosa siguiendo las especificaciones del

fabricante.
 Esterilizar el medio de cultivo en el autoclave según las indicaciones del
fabricante.
 Enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C.
 Acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10%
(aproximadamente 1,4 ml de ácido tartárico por 100 ml de medio).
 Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con el potenciómetro.
 Dejar solidificar una porción del medio.
 Hacer esto en cada lote de medio preparado.
 A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de

agregar el ácido tartárico.
Preparación del ácido tartárico al 10%
Formula
Ácido tartárico 10,0 g
Agua destilada 100,0 ml
Preparación:
 Disolver el ácido en el agua destilada y esterilizar a 121 ± 1,0 ° durante 15
minutos o por filtración a través de membrana de 0.45.
Preparación de la solución reguladora de fosfatos. (Solución concentrada)
 Disolver 34 gr. de fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N.
 Llevar a 1.0 l de agua (pesar solo para preparar 250 ml requeridos en la
práctica).
 Esterilizar a 121°C durante 15 minutos, conservar en refrigeración (solución
concentrada)
Preparación de la muestra.
 Una vez obtenida las solución diluyente, tomar 1,25 ml de la solución

concentrada y llevar a 1 lt con agua (solución de trabajo). Como no se va a
utilizar 1 litro, sacar la relación para preparar solo 250 ml de solución de
trabajo.
 Vaciar 90 ml de la solución de trabajo en el tubo de ensaye etiquetado como el
número 1 para la preparación de la muestra.
 Vaciar 9 ml de la misma solución de trabajo en cada tubo estéril hasta llegar al
etiquetado con el número 8 para hacer las diluciones correspondientes según la
NOM-110-SSA1-1994. taparlos inmediatamente para evitar contaminación.
 Preparar la muestra de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994.
Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis
Microbiológico.
 Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la

dilución primaria.
 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera
sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
 Verter de 15 a 20 ml de agar papa - dextrosa acidificado, fundido y mantenido a
45 ± 1 °C en un baño de agua.
 El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento
en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
 Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda,
seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de
atrás para adelante, sobre una superficie lisa.
 Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una
superficie horizontal fría.
 Etiquetar con los datos suficientes y necesarios para su fácil identificación.
 Preparar una caja de control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad.
 Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.
 Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación.
 Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150
colonias.
 Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil
contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 o de 3 días de
incubación según sea el caso. En este caso, informar el periodo de incubación
de 3 o 4 días en los resultados del análisis.
 Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar
microscópicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las
bacterias.
Resultados
Cálculo del Método

Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el
informe.
Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la

NOM-092-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la
expresión de resultados.
Reporte de resultados de la prueba
El resultado obtenido, se deberá reportar como unidades formadoras de colonias por

gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas
a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en
agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
6. Cuestionario.
Definir qué se entiende por:
a) Colonias.
b) Levaduras,
c) Reproducción sexual
d) Reproducción asexual
e) Ascosporas
f) Esporas
g) Saco o asca.
h) Mohos
i) Hongos
j) Reino Fungi,
k) Hifas,
l) Micelio,
m) Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
Residuos Manejo

España.
 Norma Oficial Mexicana -111-SSA1-1994.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE COATZACOALCOS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE ANÁLISIS E INOCUIDAD DE ALIMENTOS

Manual de prácticas basado en competencias

Materia: Análisis e inocuidad de alimentos

Carrera: Ingeniería bioquímica

Clave de la asignatura: ALD-1301

Elaborado por: M.C. Martha Elena Ortiz Romero

H. Academia de Jefe de División de

Seguridad REGLAMENTO DE LABORATORIO DE …………5

Practica No. 1. PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA, MANEJO …………7

Practica No. 2. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ……….14

Practica No. 3. INOCUIDAD DEL ÁREA DE MANEJO DE ……….21

Practica No. 4. TOMA DE MUESTRAS Y RECUENTO DE ……….23

Practica No. 5. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ………..32

Practica No. 6. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y ………38

La microbiología basada en el análisis e inocuidad, estudia a los microorganismos de

El objetivo general del presente manual de prácticas de Análisis e inocuidad de

Durante el desarrollo de la materia se realizaran una serie de prácticas que le permitan

El manual de prácticas se organiza en 5 prácticas, la presentación del reglamento, las

Competencia general de la asignatura

fresco y procesado. Además determina las principales fuentes de contaminación y

SEGURIDAD: REGLAMENTO DE LABORATORIO

1. Competencia específica a desarrollar.

Por lo anterior se hace necesario el trabajo en equipo, armonía y respeto en el

A reglamento de laboratorio de ingenierías bioquímica y química y laboratorio de

Nombre de la práctica: PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA, MANEJO Y

Realizar y llevar a cabo el procedimiento de la toma, manejo y transporte de alimentos

En el análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la toma

1. ¿Cuáles son los principales riesgos de contaminación de los alimentos?

4. Material, Equipos y Reactivos

Materiales Equipos Reactivos

Papel aluminio. ml. de sodio

Preparación del Material para la Toma de la Muestra.

 Lavar perfectamente todo el material a utilizar en el muestreo.

 El material para la toma de muestra que requiera esterilización, se deberá

 Esterilizar todo el material e instrumentos de muestreo limpios, que se

 Colocar cinta testigo en el material a esterilizar.

 El material se meterá a esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos o

colocarlos en recipientes estériles para evitar su contaminación o

 El procedimiento para la toma de muestra, dependerá del tipo de producto y de

 Es necesario que al llevar a cabo el muestreo se lave las manos antes de

 La toma de muestra de productos envasados se llevará a cabo en forma

 Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben tomarse en

 La toma de muestra debe hacerse con rapidez, y cuidadosamente.

 Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento

 Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda

 Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la

 En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta

 En el caso de alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe

 En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para

 Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta

Para productos perecederos

 Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a

 Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia

Procedimiento para Identificación de la muestra

En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente,

Conservación y transporte de muestras para su análisis

Las muestras se deben entregar al laboratorio lo más rápidamente posible.

Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a

En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C,

Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante

En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o