DETERMINACIÓN ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Juan Alberto Grisales, Patricia Milena García Romero, Gineth Dayana Grueso

jagrisales342@misena.edu.co , pmgarcia55@misena.edu.co , gdgrueso3@misena.edu.co

Tecnología en Química Aplicada a la Industria

Ficha: 1619388

RESUMEN

En esta práctica se determinó y analizó la acción de la enzima celulosa basados en la medida de la

cantidad de azúcares reductores (glucosa fructosa) liberados durante la hidrólisis de la celulosa presente
en el papel filtro iniciando desde la preparación del tampón citrato el cual se utilizó para hacer las
respectivas diluciones; a su vez la preparación del reactivo DNS (ácido dinitrosalicílico) el cual fue
necesario para detener la reacción mediante su adición. También, se realizó una curva de calibración de
la glucosa. El cálculo de la concentración de enzima se realizó correlacionando los resultados de pruebas
de azúcares reductores por DNS con la pérdida de absorbancia del medio.

Palabras clave: enzima, glucosa, tampón, curva de calibración

INTRODUCCIÓN

Para comprender cómo funcionan las enzimas, es necesario saber qué son y conocer la importancia de
su estructura. Las enzimas son proteínas globulares formadas por una o más cadenas polipeptídicas
plegadas, creando una “hondonada” donde encaja el sustrato y tiene lugar la reacción.
(LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006)

En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se
convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células
necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas
se las denomina reacciones enzimáticas.

Las celulosas tienen un papel fundamental en la intrincada red de degradación de la celulosa, que
pertenece a los más abundantes polisacáridos sobre la biósfera. El hombre, por ejemplo, consume
alimentos de origen vegetal y toda la celulosa presente en estos es considerada como “fibra cruda”.
Posteriormente es eliminada con las heces, pues no cuenta con enzimas para su digestión. (Raquel, s.f.).

Para determinar la actividad enzimática de la celulasa se utilizó la celulosa presente en el papel filtro
que han sido fabricados a partir de algodón de alta calidad tratado para alcanzar un contenido en celulosa
alfa del 98% (Whatman). Estos filtros de celulosa se usan en aplicaciones generales de filtración con
retención de partículas tan baja en los laboratorios.
MATERIALES Y MÉTODOS

En primer lugar se procedió a preparar 500 ml de tampón citrato a 0,05 M y para esto se pesó 5,25 g de
citrato de ácido cítrico monohidratado y se disolvió en 20 mL de agua luego se le adiciona el hidróxido
de sodio hasta que el pH de la solución fue de 4,3. Se aforó la solución hasta 25 mL, se Verificó que el
pH fuera de 4, 5; después, se Transfirió la solución a un balón aforado de 500 mL se aforó y se Verificó
que el pH fuera de 4,8. Como segundo paso se procedió a preparar el reactivo: ácido dinitrosalicílico
(DNS) para esto se Pesó 5,3 g de DNS y 9,9 g de hidróxido de sodio, se Disolvió en 500 mL de agua
destilada, se le Adiciono 3,8 mL de fenol fundido y 4,15 g de metabisulfito de sodio y se protegió el
recipiente de la luz directa. Para cuantificación de azúcares reductores totales, se tomó 100 mL de la
solución preparada, se le adiciono 30,6 g de tartrato de sodio y potasio. se calentó hasta la disolución
completa de sólidos y se completó con agua destilada hasta 146 mL. Como tercer paso se realizó la
Curva de calibración glucosa y para esto se preparó 100 mL de solución madre de glucosa (10 mg/mL)
en solución tampón de citrato y a partir de la solución madre se preparó soluciones seriadas en tubos
de ensayo de: (1,0 mL + 0,5 mL buffer = 1:1.5, 1,0 mL + 1,0 mL buffer = 1:2 , 1,0 mL + 2,0 mL buffer
= 1:3 , 1,0 mL + 4,0 mL buffer = 1:5) también se preparó otros 4 tubos de ensayos y se les adiciono a
cada uno 0,5 mL de cada una de las soluciones anteriores y se les adiciono 1 mL de tampón citrato.

Para la Determinación de la actividad enzimática se preparó una solución de enzima 1:20. se utilizó
tampón citrato para realizar las diluciones luego, En balones aforados de 20 mL se adiciono 3,5 mL,
3,0 mL, 2,0 mL, 1,0 mL y 1,5 mL de la solución (1:20) y se aforó con la solución tampón de citrato. Se
preparó 5 tubos de ensayo y se le adiciono a cada tubo 1mL de tampón citrato y 50 mg de papel filtro
enrollado. se llevó los tubos a un baño termostático a 50 °C durante 10 minutos, a cada tubo se le
adiciono 0,5 mL de las soluciones diluidas de enzima. Se dejó actuar la enzima durante 60 minutos.
después, se preparó tres tubos de ensayo adicionales con: Blanco: 1,5 mL de tampón citrato, Control
enzima: 1 mL de tampón citrato + 0,5 mL de enzima, Control sustrato: 1,5 mL de tampón citrato + 50
mg de papel filtro y todas las muestras (El blanco, controles y estándares de glucosa y enzima) se
incubaron a 50 °C durante 60 minutos y al final se detuvo la reacción ya que se le adiciono 3,0 ml de
reactivo DNS. se hirvió todos los tubos de ensayo 5,0 minutos en un baño de agua hirviendo. Para las
lecturas espectrofotométricas, se centrifugo los tubos con el papel filtro y se Diluyeron todos los tubos
en agua (0,400 mL de mezcla de cada tubo, más 5 mL de agua) y finalmente se determinó la formación
de color midiendo la absorbancia frente al blanco de reactivo a 540 nm.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Reacción del ácido cítrico con el hidróxido de Sodio, utilizada como solución buffer

C3H4OH(COOH)3+ 3NaOH C3H4OH(COONa)3 + 3H2O

Imagen 1. MECANISMO DE REDUCCIÓN DEL DNS POR LA GLUCOSA

En presencia de azúcares reductores el 3,5-dinitrosalicilato es reducido a 3,5-diaminosalicilato (con un
máx. de absorción de 540 nm, por lo tanto, el valor de la absorbancia a dicha longitud de onda será
proporcional a la concentración de azúcares reductores (glucosa+fructosa) presentes en el medio.
Cuando el ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido en presencia de calor, por los azúcares reductores que
entran en contacto con él, se desarrolla un cambio de color parecido al café (con variaciones de amarillo
hasta café). El cambio de coloración puede entonces determinarse por lecturas de densidad óptica
(espectrofotometría). (Ávila Núñez, R).

Se realizó una solución patrón de glucosa y a partir de esta se hicieron disoluciones para la curva de
calibración obteniendo los siguientes datos:

Tabla n°1. Datos dsln patrón de glucosa

Concentración mg/0,5mL Absorbancia nm

3,33 0,762

2,5 0,551

1,66 0,384

1 0,206
Fuente: propia

Gráfico 1. Curva de calibración de la glucosa

Fuente: Propia

Para el punto de referencia de la glucosa se partió de varias soluciones en distintas concentraciones de

glucosa en solución buffer, como se observa en el grafico anterior se obtuvo una curva de calibración
lineal, la ecuación de la recta y un R2 de 0,997. Lo que nos permitirá obtener un dato confiable de
concentración de glucosa en las diferentes muestras.

se realizó una solución madre de enzimas y a partir de esta se hicieron disoluciones obteniendo los
siguientes datos:

Tabla n°2. Datos de las disoluciones de Enzima

Dsln de Enzima Absorbancia nm Concentración Concentración

(mL) Glucosa Enzimas

1,0 0,268 1,056 0,00250

1,5 0,316 1,261 0,00375

2,0 0,399 1,616 0,00500

3,0 0,560 2,304 0,00750

3,5 0,591 2,436 0,00875

Fuente: propia
Con las absorbancias de las diluciones y la ecuación de la recta se hallaron las concentraciones de
glucosa y con la ecuación V1 * C1 = V2 * C2 se hallaron las concentraciones de enzimas en cada una de
las diluciones, las cuales están reportadas en la tabla anterior.

Grafica N°2 Actividad enzimática

ACTIVIDAD ENZIMATICA
3.0000
2.6145
2.4821
2.5000

2.0000 1.7940

1.4393
1.5000 1.2342

1.0000

0.5000
0.00250 0.00375 0.00500 0.00750 0.00875
0.0000

CONC. GLUCOSA CONC. ENZIMA

Fuente: propia

0,0075 − 0,0050 0,0075 − 𝑋

= = 0,0070
2,4821 − 1,7940 2,4821 − 2
Ecuación #1

Con la anterior ecuación se calculó que fue necesaria una concentración de enzimas de 0,0070 para
obtener 2 mg de glucosa. Como se puede observar en la gráfica N°2

0,37
𝑈𝑃𝐹 = = 52,86
0,0070
Ecuación #2

Con la anterior ecuación se obtuvo que la actividad enzimática fue de 52,68 UPF

La UPF está basada en la Unidad Internacional (Ul), que corresponde a una conversión de sustrato de
1 µmol en un minuto. En el caso de actividad enzimática sobre papel de filtro, la UPF se define como
la formación de 1 umol/min de azucares reductores.

CONCLUSIONES

 Los datos en los gráficos no presentan mucha dispersión ya que su R2 es mayor a 0,95, por lo
tanto, son aceptables.

 La concentración de enzimas influye directamente en la obtención de glucosa, a mayor

concentración de enzimas fue mayor la producción de glucosa.
  El pH afecta la actividad enzimática, es por esto que se realizó una solución buffer.

BIBLIOGRAFÍA

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