Universidad de Pamplona

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PRACTICA 8
TINCIONES COMPUESTAS

Linda Ramírez, Marjorie Jaimes, Marcela gamboa, Sandra Riveros.

DOCENTE: CARMEN OMAIRA ROZO GARCIA

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONOMICA

RESUMEN
El objetivo principal de la práctica desarrollada consiste en identificar de manera correcta y
precisa las distintas colonias obtenidas en los medios de cultivos presentes en el laboratorio de
microbiología, para ello se realizó como procedimiento experimental los métodos propuestos.
Las tinciones bacterianas son de gran importancia en la microbiología, debido a que permiten
conocer las propiedades y características de las bacterias. Esta práctica tiene como objetivo
conocer los diferentes tipos de tinciones, simples y compuestas realizadas en los laboratorios de
microbiología. Los colorantes que se usan para realizar una tinción, se pueden clasificar de dos
maneras: naturales y sintéticos. Se utilizó las técnicas de tinción de capsulas como coloración
GRAM, métodos de HISS, tinción de NIGROSINA, tinción de ESPORAS. La tinción de Gram
se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que
la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el rubro
de la parasitología. Hay técnicas tinto riales específicos de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-
Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la
actinomicosis, o la tinción de azul de lacto fenol, que preserva e identifica a los componentes
estructurales de los hongos Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una
utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de
etiología infecciosa.

Palabras clave: * tinción * colorantes * esporas * bacterias

INTRODUCCIÓN colorante utilizado sirve solo para denotar la

TINCIÓN: Es el proceso por el cual las
moléculas de un colorante se adsorben a una
superficie. El uso de colorantes permite
cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio óptico. De
acuerdo a la reacción que ocurre, existen
diferentes tipos de tinción, pero nos
enfocaremos en la Tinción simple el
morfología celular. [1]
La tinción es un proceso por el cual las
moléculas de un colorante se absorben a una
superficie. El uso de colorantes permite
cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio óptico. Dado
que las bacterias son casi incoloras, no
presentan contraste con el medio en el cual
se encuentran suspendidas y no pueden

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observarse claramente sin algún tratamiento
previo. De acuerdo a la reacción que ocurre,
existen diferentes tipos de tinción:
· Simple: el colorante utilizado sirve
solo para denotar la morfología celular.
· Diferencial: el colorante utilizado
pone de manifiesto diferencias entre células
bacterianas o entre partes de una misma
célula, estas técnicas utilizan más de un
colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción.
Los colorantes más usados son: azul de
metileno, cristal violeta, safranina, estos son
catiónicos y se combinan fuertemente con
componentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos y
los polisacáridos ácidos.
Las células generalmente son tratadas para
coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso conocido como fijación. Después
de esta habitualmente se realiza la tinción.
La fijación produce generalmente
encogimiento de las células, la tinción, por
el contrario, hace que las células parezcan
mayores de lo que son realmente.
Algunos colorantes teñirán mejor solo
después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es un
colorante por sí mismo. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo
altera de manera que ahora sí podrá atacar el
colorante.
Tinción de Gram
1) Las células son fijadas por medio del
calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero
con una solución de cristal violeta y son
lavadas después para quitar el exceso de
colorante. En este punto las células Gram
positivas y Gram negativas, están teñidas de
azul/violeta.
2) El portaobjetos se cubre con una
solución de yodo-yoduro potásico. El KI
hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las
células y forma un complejo insoluble en
agua con el cristal violeta. En este punto las
células se mantienen iguales.
3) Se inicia con la decoloración usando
una solución de Alcohol-acetona, sustancias
en las que es soluble el complejo I2-Cristal
violeta. Algunos microorganismos no se
decoloran. La diferencia esencial entre los
dos tipos de células es la resistencia que
presentan ante la decoloración.
La tinción de Gram es uno de los métodos
de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico. Su utilidad en la práctica de
referencias a la morfología celular
bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la
tinción de GRAM
1. Se tiñe el espécimen con el primer
colorante, cristal violeta.
2. Se añade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante,
normalmente una solución de acetona o
etanol. En este momento, las bacterias Gram
negativas pierden su tinción violeta, pero las
Gram positivas retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se añade
safranina, que tiñe de rosa las bacterias
Gram negativas, previamente decoloradas;
mientras que a las bacterias Gram positivas
les proporciona un color violeta más intenso.
Esta tinción se denominada así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su
reacción a la tinción de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos,
grampositivas y gramnegativas (en este
caso, los términos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga eléctrico, sino
simplemente designan dos grupos
morfológicos distintos de bacterias).
Descripta en forma breve, la secuencia de la
tinción es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se
lava con agua, se cubre con solución Yodada
durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con
agua, decolorar con mezcla alcohol
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etílico/acetona. Escurrir y cubrir con
Safranina (color de contraste) durante 1 – 2
min. Lavar y secar. Las bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas tiñen de forma
distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la célula bacteriana
sirve para dar su tamaño y forma al
organismo, así como para prevenir la lisis
osmótica. El material de la pared celular
bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula Gram-
positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano, así como
algo de ácido técnico. Generalmente, 80%-
90% de la pared de la célula Gram-positiva
es peptidoglicano. La pared de la célula
Gram-negativa, por otro lado, contiene una
capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una
membrana exterior compuesta de
fosfolípidos, lipopolisacáridos, y son incoloras. Para poner de manifiesto las
lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared
de la célula Gram-negativa es
peptidoglicano.
Las células fijadas al calor sobre un
portaobjetos se tiñen, primero con una
solución de cristal violeta (otros colorantes
básicos no son tan efectivos) y son lavadas
después para quitar el exceso de colorante.
En este estado, todas las células, tanto las
grampositivas como las gramnegativas,
están teñidas de azul. El portaobjetos se
cubre entonces con una solución de yodo-
yoduro potásico. El ingrediente activo es
aquí el I2; el KI simplemente hace soluble
el I2 en agua. El I2 entra en las células y
forma un complejo insoluble en agua con el
cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se
encuentran en la misma situación. Se lleva a
cabo después la decoloración, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se
decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia
esencial entre esos dos tipos de células está
por tanto en su resistencia a la decoloración;
esta resistencia se debe probablemente al
hecho de que en el caso de bacterias gram-
negativas, la mezcla de alcohol/acetona es
un solvente lipídico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la célula (y también
puede dañar la membrana citoplásmica a la
que se une peptidoglicano). La delgada capa
de peptidoglicano es incapaz de retener el de
complejo cristal violeta-yodo y la célula se
decolora. Las células grampositivas, a causa
de sus paredes celulares más espesas (tienen
más peptidoglicano y menos lípido), no son
permeables al disolvente, provocando que el
de complejo cristal violeta-yodo quede
atrapado dentro de la pared celular. Después
de la decoloración las células grampositivas
son todavía azules, pero las gramnegativas
células gramnegativas se utiliza una
coloración de contraste. Habitualmente es
un colorante de color rojo, como la safranina
o la fucsina básica. Después de la coloración
de contraste las células gramnegativas son
rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales
de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con
cristal violeta debe preceder al tratamiento
con yodo. El yodo por sí solo tiene poca
afinidad con las células. 2) EI proceso de
decoloración debe ser corto y es esencial un
cálculo preciso del tiempo para evitar que
pierdan la tinción las células grampositivas.
3) Cultivos de más de 24 horas de teñidos
pueden perder su habilidad de retener el
complejo cristal violeta - yodo.[2]
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TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE 30 segundos. Lave con agua de la llave a
SHAEFFER-FFULTON) baja presión y escurra.

cubra ahora con colorante de contraste y deje

Se trata de un procedimiento de tinción actuar por 45 segundos. Lave con agua de la
diferencial, conocido como método de llave a baja presión y escurra. Permita que se
Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por seque al aire dejando la lámina en posición
su aplicación clínica. Permite poder inclinada. Observe al microscopio con los
distinguir aquellos microorganismos cuya siguientes objetivos: 10X – 40X – 100X
coloración resiste la acción de alcoholes y utilizando este último con aceite de
ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de inmersión
otros que no resisten la decoloración (no
ácido-alcohol resistentes). Dentro de las DIAGRAMA DE FLUJO
bacterias ácido alcohol resistentes
encontramos dos importantes patógenos:
Mycobacterium tuberculosis y
Mycobacterium leprae, microorganismos
responsables de la tuberculosis y la lepra
respectivamente. Estas bacterias pertenecen
al Phyllum Actinobacteria, un grupo grande
y complejo de bacterias gram positivas, que
incluye a la Familia Mycobacteriaceae
caracterizada por contener en sus paredes
celulares un alto contenido lipídico, ceras
Fig1. agrego una gota de agua
con una gran diversidad de ácidos
destilada se realiza el frotis
micólicos,

2. METODOLOGIA

TINCIÓN GRAM
lo primero que se realizo fue limpiar y
desinfectar el área de trabajo luego
procedió encender un mechero, para
continuar con la práctica se puso una gota de
agua destilada en un portaobjeto, luego se
realizó un frotis al cultivo con un asa
caliente se procedió fijarlos al calor.

Se vertió sobre el frotis Cristal Violeta

déjelo actuar por 1 minuto. Luego lavamos
con agua de la llave a baja presión y se dejó
escurrir . Después Cubrió el frotis con lugol
dejándolo actuar por 1 minuto. Lave con
agua de la llave a baja presión y escurra. Fig.2 ese está fijando le frotis
Cubra ahora con solución decolorante por

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 Fig.6 Lavar con presión baja

Fig.3.Cristal violeta déjelo actuar por

un minuto

Fig7. alcohol

Fig.4 Lavar con presión baja

Fig.8.Lavar con presión baja

Fig. 5. lugol

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 TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE
SHAEFFER-FULTON)

Se realizó un extendido fino con una

suspensión del microorganismo esporulado en
un portaobjeto y luego lo fijamos al calor. Se
cubrió el portaobjetos con solución acuosa de
verde de malaquita al 5 %.

A continuación, calentamos sobre la llama

del mechero de Bunsen hasta causar
Fig.9.Cubra ahora con solución desprendimiento de vapores y retirar la llama.
decolorante por 30 segundos Repetir la operación durante de 6 a 10
minutos.

Luego lavamos a presión baja con agua. El

siguiente paso fue cubrir el portaobjetos con
safranina acuosa al 0,5 % durante
30seg.Observe al microscopio con los
siguientes objetivos: 10X – 40X – 100X
utilizando este último con aceite de
inmersión segundos; Con esta técnica las
esporas se presentan de color verde y los
bacilos de color rojo.

Fig.10.Lavar con presión baja

DIAGRAMA DE FLUJO

Fig1. Gota de agua

Fig.11.Dejar secar y luego observar

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 FIG.2 frotis Fig.4. evaporar el frotis

Fig.5. lavar con agua a baja presión

Fig.3.Colorante verde malaquita

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 4 RESULTADOS

TINCIÓN DE GRAM (e-coli)

Fig.6. agregar safranina dejar durante

30seg Imagen de e-coli

E. coli (bacilos rosa)

Escherichia coli es un bacilo Gram negativo

por dar un resultado de (color rosado),
anaerobio facultativo de la
Fig.7. cubrir con cubreobjetos y familia Enterobacteriaceae.
observar en el microscopio

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 TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE
TINCIÓN DE GRAM SHAEFFER-FULTON) (Bacillus)
(staphylococcus aureus)

Im. De bacillus

Imagen de staphylococcus aureus

imagen de bacillos en el microscopio 40x

En esta práctica pudimos observar los

bacilos Gram positivos formadores de
staphylococcus aureus (color violeta ) esporas son de las especies de Bacillus y
Clostridium. Estos bacilos son ubicuos y,
debido a su capacidad para formar esporas,
Staphylococcus aureus conocido pueden vivir en el ambiente por varios años.
como estafilococo áureo o estafilococo Si bien las especies de Bacillus son aerobias,
dorado, es una bacteria anaerobia las especies de Clostridium son anaerobias.
facultativa, Gram positiva por la razón de De las muchas especies de Bacillus y
que se tiño de morado. géneros afines que aún no han sido bien
clasificadas en la microbiología médica, la
mayoría no causa enfermedades. Sin

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embargo, existen algunas especies que
generan enfermedades importantes en los
seres humanos.
5 CONCLUSIONES
* Las tinciones utilizadas en el laboratorio
de microbiología permite el diagnóstico
oportuno y sugerente por lo que juegan un
papel en la decisión de tratamientos. Las
tinciones son herramientas elementales en el
laboratorio de microbiología
* Se conoció las técnicas de coloración
compuesta
* Se observaron las distintas formas
tamañas de microorganismos analizadas en
el laboratorio
* Las tinciones Gram es una prueba potente
y rápida que nos permite diferenciar dos
clases de bacterias que son grampositivas y
gramnegativas.
* Las grampositivas se tiñen de morado ya
que el colorante se queda atrapado en la
cepa gruesa de peptidoglucano mucho más
delgada
6. ANEXOS
1 ¿En que radican las diferencias
estructurales entre bacterias Gram
positivas y Gram negativas?
Las bacterias Gram positivas poseen una
pared celular interna y una pared de
peptidocluno. En cambio, las negativas
poseen una pared celular más completa.
Las positivas no cuentan con una membrana
externa. Las negativas tienen membrana
externa que forma un saco rígido alrededor
de la bacteria.
Las Gram positivas no tienen espacio
periplasmático, mientras que las Gram
negativas sí tienen, entre la superficie
externa de la membrana citoplasmática y la
interna de la membrana externa
2 ¿Por qué razón los colorantes deben
guardarse en frascos de color ámbar?
Generalmente se usan frascos de color
ámbar para guardar sustancias que pueden
sufrir descomposición o algún tipo de
reacción química catalizada por la luz, así el
frasco absorbe la luz y la sustancia se
mantiene como tal.
3 ¿Que se debe tener en cuenta al
preparar un colorante?
Tinción simple: En la tinción simple se
utiliza un solo colorante con el que se tiñe
rápidamente el microorganismo,
utilizándose fundamentalmente para
observar su morfología y tamaño. Los
colorantes empleados con mayor frecuencia
para este tipo de tinción son los siguientes:
azul de metileno, violeta cristal y fascina
fenicada, entre otros Tinción compuesta: En
este tipo de tinción, se utiliza más de una
sustancia tintórea. Los colorantes se aplican,
a la preparación, separados o juntos,
formando parte de una solución. En
consecuencia se puede determinar algunas
características propias de diversos géneros
que permiten diferenciarlo de los demás, por
que reciben también el nombre de
coloraciones diferenciales. Entre los
métodos más utilizados se encuentran: La
coloración de Gram. y la de Ziehl Neelsen.
Coloración de Gram.En 1884, el danés Hans
Chistian Gram, ideó un método de
coloración, que es en la actualidad, el más
empleado en los laboratorios de
bacteriología, mediante el cual, la bacteria
sometida a esta tinción, en dependencia de la
composición química de la especie, queda
teñida de color violeta o de color rojo.
Principios. A pesar de que esta técnica de
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coloración se ha venido empleando desde
hace más de un siglo, aún no se ha podido
determinar con exactitud la base molecular
de la reacción, existiendo controversias al
respecto. El criterio más generalizado es que
la violeta y el lugol forman un complejo que
reacciona con los componentes bioquímicos
de la pared celular deshidratada, fijándose
en esta. Teniendo en cuenta que la
composición química de la pared, no es
igual en todos los géneros, la reacción
resultante será obviamente diferente, lo que
da lugar, que mientras algunos géneros
retienen firmemente el colorante al resultar
el complejo impenetrable para el
decolorante, en otros géneros la barrera que
se produce es más permeable, lo que permite
al solvente penetrar y extraer el complejo
violeta-lugol, dejando a la bacteria
nuevamente incolora.
Fundamento técnico En el primer paso de la
coloración, cuando los microorganismos
presentes en el frotis son expuestos a la
acción colorante de la violeta de genciana,
todos los géneros que se encuentran en el
frotis se tiñen de color violeta. Al adicionar
el lugol, no se produce ningún cambio de
color, ya que el lugol no es un colorante,
sino un mordiente, que se adiciona con el
objetivo de formar un complejo violeta-
lugol, para fijar el color en la bacteria.
4 ¿por qué algunas tinciones no se fijan
por color?
Algunos colorantes teñirán mejor sólo
después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es un
colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual
es el ácido tánico. El mordiente se combina
con un constituyente celular y lo altera de tal
modo que ahora sí podrá atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el
contraste de las células para la microscopía,
son suficientes los procedimientos simples
de tinción. El azul de metileno es un buen
colorante simple que actúa sobre todas las
células bacterianas rápidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca
los detalles celulares. Es especialmente útil
para detectar la presencia de bacterias en
muestras naturales, puesto que la mayor
parte del material no celular no se tiñe.
La tinción negativa es el reverso del
procedimiento de tinción usual: las células
se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio
el medio que las rodea. Lo que se ve, por
tanto, es el perfil de las células. La sustancia
utilizada para la tinción negativa es un
material opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente
rodea las células, tal como la tinta china (que
es una suspensión de partículas de carbono
coloidal) o la tirosina (un colorante negro
insoluble en agua). La tinción negativa es un
modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las células en la microscopia óptica, pero
su máxima utilidad está en revelar la
presencia de cápsulas alrededor de las
células bacterianas.Los métodos de tinción
son de gran utilidad, pero deben usarse
siempre con precaución, ya que pueden
conducir a errores. Las moléculas de
colorante forman en ocasiones precipitados
o agregados que parecen estructuras
celulares auténticas, pero que son
formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben
tomarse muchas precauciones para tener la
seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es una
estructura realmente existente.
5 ¿Por qué la edad de un cultivo afecta las
tinciones?
La edad de las células, las condiciones de
cultivo y la actividad de su auto lisinas
pueden afectar el resultado de la tinción. Las
células envejecidas, o crecidas en
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condiciones que impiden la síntesis de
mucopéptido pueden verse de color rojo. La
intensidad de la decoloración con alcohol
suele ser el problema más común

6 BILBIOGRAFIAS

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https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/13
098/1/Moneras%20y%20protistas.pdf

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