Centro de Estudios Superiores Aloya CIFP

Laboratorio Clínico y Biomédico

Asignatura: Técnicas de análisis hematológico

Práctica IV
Recuento leucocitario

Profesora: Realizado por:

Begoña Varela Stephanie Pernalete
Óscar Fernández
Andrea Vieitez

Vigo 07 de Noviembre de 2019

 Técnicas de análisis hematológico
Curso 2019/20

Índice

Índice .................................................................................................................. 1

Introducción ........................................................................................................ 2

Objetivos ............................................................................................................. 5

Materiales, instrumentos y reactivos................................................................... 5

Muestra ........................................................................................................... 6

Procedimiento ..................................................................................................... 6

Resultados .......................................................................................................... 8

Discusión de resultados...................................................................................... 9

Conclusiones .................................................................................................... 11

Cuestiones ....................................................................................................... 12

Bibliografía ........................................................................................................ 13

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Curso 2019/20

Introducción

La sangre es una forma especializada del tejido conjuntivo, compuesta por una
sustancia intercelular líquida llamada plasma, en la cual se encuentran en
suspensión los elementos figurados: hematíes, leucocitos y plaquetas. La sangre
circula a través de vasos sanguíneos. En el adulto sano el volumen de la sangre
es de 5 L y constituye aproximadamente el 8 % del peso corporal. La sangre
actúa manteniendo la composición adecuada y casi constante de los líquidos
corporales, los que permiten la nutrición, el crecimiento y la función de las células
del organismo. Participa en el intercambio entre el medio externo y los tejidos
corporales y además es portadora de hormonas y de otras sustancias
biológicamente activas, que regulan el funcionamiento de órganos.

Ahora bien, cada célula sanguínea tiene su propia función indispensable para el
mantenimiento de la hemostasia y defensa del organismo, por su parte la función
primaria de los hematíes; es la de mantener en circulación una elevada
concentración de hemoglobina, esencial para el transporte del oxígeno y CO2.
Las plaquetas son elementos formes o figurados de la sangre y participan en la
prevención de las hemorragias a través de los mecanismos de la coagulación y
en el mantenimiento de la integridad del endotelio vascular.

Las células leucocitarias participan en el sistema de defensa del organismo, ya

sea por medio de la respuesta celular inespecífica o por la respuesta inmunitaria
específica. Los glóbulos blancos o leucocitos son células nucleadas que se
encuentran en cantidad mucho menor que los eritrocitos. El número promedio
de leucocitos en la sangre circulante es de 5000 a 10000 mm3. Si bien en los
niños y en algunos estados patológicos las cifras pueden ser más altas. En la
sangre humana pueden distinguirse dos tipos principalmente: Los leucocitos
agranulares y los granulares.

Los linfocitos son células esféricas que en la sangre humana pueden alcanzar
un diámetro de 6-8 μm, aunque en ocasiones son de mayor tamaño. Forman

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Curso 2019/20

parte del 26-40 % de los leucocitos sanguíneos y se presentan generalmente

como células redondeadas, de núcleo grande, rodeado por un escaso borde
citoplasmático. Su núcleo suele teñirse con coloraciones violeta a rojizo,
citoplasma azul o coloraciones pálidas. En la sangre periférica circulante
encontramos dos tipos de linfocitos, unos denominados linfocitos T, provenientes
del timo, de vida prolongada, y los linfocitos B que tienen generalmente una vida
breve.

A su vez, los monocitos están agrupados dentro de los leucocitos agranulares.

Son células de gran tamaño que miden de 9-12μm de diámetro, aunque pueden
alcanzar 20 μm en los frotis secos; comprenden solamente del 2-8 % de los
leucocitos de la sangre normal, poseen un citoplasma abundante de color azul
grisáceo pálido (con las coloraciones de Giemsa), en el cual pueden observarse
gránulos azurófilos.

Continuando con los leucocitos granulares, estos contienen en su citoplasma

gránulos específicos que los caracterizan, así como un núcleo multilobulado, por
lo cual en ocasiones reciben el nombre de leucocitos polimorfonucleares. Los
neutrófilos son las células más abundantes. Comprenden del 55-65% del total
de los leucocitos y su diámetro varia de 10-15μm en estado fresco, este tipo de
célula recibe su nombre según los numerosos gránulos neutrófilos que abundan
en su citoplasma, su núcleo se colorea de color violeta rojizo, citoplasma con
abundantes gránulos de color violeta.

Los eosinófilos; como su nombre lo indica, estos los leucocitos granulosos

reciben este nombre por su afinidad con la eosina. En estado fresco tienen
aproximadamente de 9-10 μm de diámetro, mientras que en los frotis secos
varían de 12-14 μm. Estas células representan del 1-3% del total de leucocitos
en sangre normal, pudiendo elevarse en algunas enfermedades alérgicas y
parasitarias, su núcleo se tiñe de coloración violeta a rojizo, granulaciones de
color rojo ladrillo a pardo rojizo.

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Curso 2019/20

Por último, de todos los leucocitos sanguíneos, los basófilos son las células más
difíciles de observar, pues constituyen el 0-1% y su tamaño es aproximadamente
igual al de los neutrófilos, de 10- 12μm. El núcleo es de contornos irregulares y
en ocasiones bilobular. Lo más sobresaliente en la morfología de estas células
es su citoplasma repleto de gránulos redondos de tamaño variable y su afinidad
por los colorantes básicos, su núcleo se colorea con tonos violeta a rojizo y sus
múltiples granulaciones de color violeta a negro.

Partiendo de lo anterior antes expuesto, en una gota de sangre se encuentran

miles de células sanguíneas, a su vez estas células pueden ser teñidas y
visualizadas al microscopio y así establecer su porcentaje relativo en sangre.

La práctica ideal para realizar esta visualización y recuento celular es a través

de un frotis de sangre o extendido de sangre; la cual es una técnica que consiste
en la extensión de una gota de sangre sobre la superficie de un portaobjetos con
el fin de analizarla posteriormente al microscopio. La extensión de sangre
periférica proporciona una instantánea de las células presentes en sangre en el
momento concreto de la obtención de la muestra y permite la evaluación de todos
los tipos de células sanguíneas.

En especial el recuento total de leucocitos forma parte de un análisis llamado

leucograma, esta prueba tiene dos componentes: uno cuantitativo, que
corresponde al recuento total de leucocitos y al recuento diferencial de
leucocitos; y, otro cualitativo, que corresponde al estudio morfológico de los
leucocitos. Por lo tanto, la fórmula leucocitaria es importante para el diagnostico
de muchas enfermedades entre ellas infecciones, leucemias, enfermedades
autoinmunitarias.

Este recuento de leucocitos se puede realizar utilizando métodos manuales o

métodos automáticos. El método manual consiste en analizar un mínimo de 100
leucocitos de una extensión sanguínea teñida mediante una tinción de panóptica;
cabe destacar que la aplicación de esta tinción se debe a que su elaboración es

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más rápida y sencilla, por lo tanto, este recuento se puede realizar haciendo uso
de un microscopio óptico recorriendo la extensión en forma de ese “S” de manera
que no se repita un mismo campo observado. También se pueden emplear re

El recuento automático permite la realización de una fórmula leucocitaria con

rapidez y precisión. El número de células contadas y valoradas es mucho más
elevado que en los métodos manuales.

En el siguiente informa se expondrán la técnica empleada para el contaje de las

células leucocitarias y los resultados obtenidos luego de haber aplicado el
protocolo de actuación pertinente.

Objetivos

- Practicar la extensión de sangre obtenida por punción capilar.

- Practicar la realización de frotis mediante la técnica del portaobjetos cuña.
- Aplicar protocolos de tinción con panóptico rápido.
- Observar al microscopio las distintas zonas del frotis y a su vez las células
leucocitarias que ahí se encuentran.
- Aprender a realizar el recuento de leucocitos de forma manual

Materiales, instrumentos y reactivos

- Materiales -Instrumentos

EPIS (Guantes y bata) Microscopio óptico

Portaobjetos (extensor y soporte)

Pipetas Pasteur -Reactivos

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Cristalizador Tinción panóptica rápida

Cubreobjetos Aceite de inmersión

Lanceta
Alcohol acetona (2:1)

Papel de filtro

Frasco lavador

Cubetas coplin

Muestra
Sangre obtenida por punción capilar a través de lanceta (Stephanie)

Procedimiento

1. Preparación del área de trabajo, mesa de trabajo previamente limpia,

papel de filtro, cristalizador para limpieza de portaobjetos
2. Realizar un frotis cada uno de los
miembros del grupo, perteneciente a una
MISMA muestra. Y dejar secar al aire en
2 posición horizontal.
3. Teñir los frotis con Panóptico
rápido:
a. En tres vasos Coplin se disponen
los colorantes solución nº1, nº2, y nº3.
b. Se sumerge el frotis en el vaso
Coplin con la solución nº 1 durante 1

3 segundo. Se repite la inmersión cuatro

veces (un total de 5 segundos). Se deja escurrir para eliminar el
exceso de colorante.

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c. Se sumerge el frotis en el vaso Coplin con la solución nº 2

durante 1 segundo. Se repite la inmersión cuatro veces (un total
de 5 segundos). Se deja escurrir para eliminar el exceso de
colorante.
d. Se sumerge el frotis en el vaso Coplin con la
solución nº 3 durante 1 segundo. Se repite la
inmersión cuatro veces (un total de 5 segundos).
Se deja escurrir para eliminar el exceso de
colorante.
e. Lavar con abundante agua destilada, y dejar
secar los portaobjetos en posición vertical.
4. Una vez teñidos, dejar secar al aire, colocando
los frotis en posición vertical.
5. Observar la extensión con el objetivo de 10X
y a 20X, verificando que la extensión y tinción, son
correctas (extensión en monocapa, y tinción
homogénea).
3.ede 40X, seleccionar una zona del cuerpo de la extensión
6. Con el objetivo
en la que las células están bien distribuidas.
7. Cambiar el objetivo al de inmersión de 100X (no
olvidar echar aceite de inmersión antes de emplear
este objetivo. Y no olvidar, limpiar dicho objetivo con
alcohol-acetona, inmediatamente después de su
uso).
8. Recorrer en zig-zag, la zona de la extensión
elegida, identificando y anotando cada uno de los
leucocitos observados, hasta llegar a un total de 100
leucocitos. Para que el recorrido sea correcto, es
preciso:
4
a. recorrer el centro y el borde del cuerpo de la
extensión. Las células contadas deben ser
aproximadamente las que están situadas en la mitad del centro
y la otra mitad del borde del cuerpo de la extensión

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b. no repetir los campos de observación para no contar una célula

más de una vez.

Resultados

Frotis Fotografía macro sin tinción Fotografía macro con tinción

Stephanie
Pernalete

Andrea Viéitez

Óscar
Fernández

Fotografía a 100x
Muestra
Neutrófilos Cayado Linfocitos Monocito Eosinófilo Basófilo

Stephanie

Andrea
FROTIS

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Óscar

Frotis % % % % % %
Neutrófilos Cayados Linfocitos Monocito Eosinófilos Basófilos
s

Stephanie 26 20 34 5 8 7

Andrea 34 13 33 7 9 4

Óscar 24 10 37 11 6 28

Media 28 14.3 34.6 7.6 7.6 13

Discusión de resultados

Luego de haber realizado todo el proceso de el análisis y contaje de las células

sanguíneas en especial de los leucocitos, los resultaron que se obtuvieron no
corresponden a lo esperado para dicha práctica. Se sugiere que fue debido a
varios factores que serán descrito a continuación, iniciando por la extensión de
sangre periférica, en prácticas realizadas previamente se mencionó y recalco la
importancia de hacer un frotis en óptimas condiciones, que cumpliera con ciertas
características como velocidad, presión y cantidad de sangre, en esta
oportunidad surgieron otros factores a parte de los conocidos, que dificultaron la
correcta extensión de la muestra, al inicio los portaobjetos empleados eran
reutilizados por la tanto algunos no cumplían con el criterio de limpieza exigido,
al proceder a su limpieza, dichos portaobjetos no secaron correctamente
quedando húmedos para el momento de la extensión de sangre, a su vez con el
papel absorbente que fueron secados dejo resto de partículas en las laminas de
los cubreobjetos, causando interferencia en el momento de la visualización. Se

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debe prestar atención al ángulo de las extensiones ya que este fue otro fallo al
momento de realizarlo provocando la ausencia de una monocapa en dos de las
tres extensiones, por lo tanto, se dificulta más el recuento ya que en esta zona
es donde se encuentran los glóbulos blancos en posición equilibrada.

El segundo paso fue la tinción, la tinción diferencial usada fue la de panóptico

rápida, por su rapidez y sencillez a la hora de aplicarla, sin embargo no se debe
subestimar las normas para su uso, como por ejemplo respetar el tiempo de
tinción, y que todo el portaobjeto que contiene la muestra se impregne de dichas
tinciones, ya que algunas células apreciadas al microscopio presentaban
características estructurales claras pero coloración indefinida lo que hacia dudar
de un tipo celular y otro.

Seguidamente se procedió a la visualización al microscopio, ubicando las

estructuras celulares primero con el objetivo de 40x para luego proceder con el
objetivo de mayor aumento 100x aplicando aceite de inmersión, lo ideal para
hacer un recuento de leucocitario es hacer un barrido de la extensión sin apartar
la vista de las células, gracias a esto se puede obtener la mayor precisión
cuantitativa de las células a estudio, es importante mencionar que las
alteraciones antes mencionadas influyeron significativamente en la visualización
de las células, dando a confusión en la diferencian de un tipo de célula y otra y
esto a su vez alterando el porcentaje de algunas células, con respecto a la
proporción normal de estas.

Los valores medios del recuento no se corresponden totalmente con los valores
normales, véase:

Valor medio obtenido: Valor de referencia:

Neutrófilo segmentado: 28% Neutrófilo segmentado: 55-70%

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Neutrófilo en cayado: 14.3% Neutrófilo en cayado: 0.2-6%

Linfocito: 34.6% Linfocito: 17-45%

Monocito: 7.6% Monocito: 2-8%

Eosinófilo: 7.6% Eosinófilo: 1-4%

Basófilo: 13% Basófilo: 0.2-1.2%

Sólo en los valores obtenidos en el recuento de linfocitos y monocitos se han

obtenido valores considerados normales. La variación en el resto de resultados
puede deberse a un error de contaje o a una identificación equivocada, lo cual
puede provocar que se contabilicen como un tipo celular células de otro tipo.

Ahora bien, a pesar de los inconvenientes, cada integrante logro hacer un

recuento de 100 estructuras celulares y la identificación inequívocas de algunas
células, se plantea como objetivo para la próxima practica realizar el protocolo
de trabajo respetando las normas de control de calidad de cada paso con mas
detalle para así obtener un resultado satisfactorio.

Conclusiones

A pesar de los grandes avances tecnológicos relacionados con las técnicas de

recuento celular, y en particular los derivados de los autoanalizadores de
hematología, cada vez más sofisticados y completos, el extendido de sangre
periférica continúa siendo el “estándar de oro” del diagnóstico, visualización y
contaje de estas estructuras celulares. De acuerdo con las buenas prácticas de
hematología, el extendido de sangre periférica está indicado en todos los casos
que se quieran analizar las células sanguíneas bien sea para recuentos directos,
cuando se sospeche de una enfermedad.

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Por lo tanto, en el día a día de la puesta en marcha de técnicas hematológicas,

la correcta realización del frotis es primordial para poder obtener un buen
resultado posteriormente, es decir, para que la muestra pueda ser observada al
microscopio correctamente. A su vez respetar los tiempos indicados en la tinción
es vital para que las distintas células queden teñidas correctamente, y no se
observen colores demasiado rosados o demasiado azules, esto siempre siendo
esencial para saber diferenciar claramente entre los distintos tipos de leucocitos
para poder efectuar correctamente el recuento.

Así como tener presente que antes de realizar cualquier conteo celular tener en
cuenta que lo ideal es visualizar las células en el cuerpo de la extensión,
proceder a ubicarlas a partir del objetivo 40x, para luego con el objetivo 100x
proceder realizar recorrido en zig-zag por sección elegida se fue diferenciando y
contando las diferentes de células de la serie blanca y obtener finalmente un
porcentaje de las células presentes.

Cuestiones

1. Explica cuál/es son las razones por las que hay que homogeneizar la
muestra, antes de proceder a su análisis.

La homogeneización se usa para que la muestra que puede encontrarse en

diferentes fases se vuelva a mezclar y así poder obtener una mejor suspensión,
la muestra más homogénea, en este caso aunque la sangre estaba mezclada
con EDTA (anticoagulante) al homogeneizar conseguimos una muestra mas
estable y con menor daño a las células.

2. ¿Qué tipo de células suelen encontrarse con mayor abundancia en los

bordes de la extensión?

Células nucleadas grandes, como monocitos o neutrófilos, en los bordes del

frotis cabe destacar que si están deshilachados en ellos las células son difíciles
de reconocer por estar deformadas o destruidas.

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3. ¿A qué aumentos de debe realizar la fórmula leucocitaria?

Nº de ocular x Nº de objetivo = Nª de aumentos

10 x 100 = 1000 aumentos

4. Si el tiempo de tinción es excesivo, ¿qué se espera que suceda con la

intensidad de la coloración?

La coloración será demasiado azul, esto también puede deberse a un grosor

excesivo de la extensión o a un ph alto del colorante.

5. ¿Y si el tiempo es escaso?

La coloración será demasiado rosa, aun que también se puede deber a un pH

bajo del colorante o a un lavado demasiado prolongado.

6. Al realizar la fórmula leucocitaria de tres frotis de un mismo paciente

¿qué resultados son los esperados?

Si se han realizado los frotis correctamente los resultados deberían ser similares,
ya que se está analizando una muestra con la misma procedencia. Además, a
no ser que se sospeche de alguna patología, se espera que los resultados de la
fórmula leucocitaria concuerden con los valores de referencia de la misma.

Bibliografía

Documento:
- La clínica y el laboratorio; Utilidad del extendido de sangre periférica: los
leucocitos

Libro Libro de texto

- Técnicas de análisis hematológicos, Altamar

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Pagina web:

http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/histologia/sangre_y_tejido_hematopoyetico.
pdf

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