ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN ORIGINAL

Frente. Physiol., 19 de febrero de 2019 | https://Doi.org/10.3389/fphys.2019.00124

Perfiles osteogénicos y angiogénicos de

células que forman hueso mandibular
Barbora Vesel , 1, 2†
Eva vandov , 1, 2 *†
Jan Bobek , 1
HERV Lesot y 1
Eva matalov1, 2

 1
Laboratorio de morfogénesis molecular, Instituto de fisiología y genética animal, Academia Checa de Ciencias, Brno, Czechia

 2
Departamento de fisiología, Universidad de Ciencias Veterinarias y farmacéuticas, Brno, Czechia

La mandíbula es una estructura portante de dientes que involucra uno de los huesos más prominentes de la región

facial. La condensación de células mesenquimales es el primer signo morfológico de la osteogénesis, y varios estudios se

han centrado en esta etapa también en la mandíbula. Poca información está disponible sobre el período de post-

condensación temprana, durante el cual la condensación suave avascular se convierte en hueso vascularizado, y los tres

principales tipos de células óseas, osteoblastos, osteocitos, y los osteoclastos, diferenciar. En la primera región molar

inferior del ratón, el período posterior a la condensación corresponde a los días 13 – 15 prenatales. Si durante este

período crítico, cuando la osteogénesis alcanza el punto de mayor diferenciación de células óseas, la vascularización ya

tiene que desempeñar un papel crítico, uno debe ser capaz de mostrar cambios moleculares que apoyan ambos tipos de

eventos celulares. El objetivo del presente informe era seguir en el contexto de los órganos la expresión de los

principales marcadores osteogénicos y angiogénicos e identificar los que están arriba o abajo regulados durante este

período. Con este fin, se aplicó la matriz de PCR cubriendo moléculas involucradas en la proliferación de células

osteoblásticas, compromiso o diferenciación, deposición de matriz extracelular (ECM), mineralización, maduración de

osteocitos, angiogénesis, diferenciación osteoclástica, y remodelación ósea inicial. Desde 161 analizaron osteogénico y

factores angiogénicos, la expresión de 37 fue alterado cuando se compara la etapa de condensación con la etapa de

hueso. Los resultados aquí presentados proporcionan un estudio molecular de la fase inicial de la condensación

posterior de desarrollo alveolar mandibular ósea que aún no ha sido investigado en vivo.

Introducción
La mandíbula es una estructura que lleva los dientes y por lo tanto es necesaria especialmente para la masticación, pero también para el

habla, apariencia estética y bienestar humano. El hueso mandibular representa un objetivo atractivo para la ingeniería de tejidos y los

enfoques regenerativos (Ward et al., 2010). Un prerrequisito esencial de estos enfoques es la comprensión de la osteogénesis mandibular

in vivo, incluida la descripción precisa de la señalización molecular asociada a los pasos de desarrollo secuenciales y posiblemente

distintos. Entre estos, los procesos osteogénicos y angiogénicos dominan (Grosso et al., 2017), y en particular, a menudo implican las

mismas moléculas como CD36 (Simantov y silverstein, 2003; Kevorkova et al., 2013), Sphk1 (Pederson et al., 2008) y Vegfa (zelzer et al.,

2002).
El hueso mandibular, aparte del proceso cóndilar, es intramembranoso y su desarrollo se puede dividir en una fase pre-osteogénica, que

cubre la condensación mesenquimal, y luego etapas posteriores a la condensación, incluyendo la mayoría de los osteogénicos

Diferenciación. Varios estudios se han centrado en los eventos previos/condensados (p. ej., Jabalee et al., 2013; Kaul et al., 2015). Sin

embargo, los datos moleculares relacionados con el período en que una condensación mesenquimal se convierte en una estructura ósea

compleja son escasos. En el ratón, esto ocurre entre el día 13 y 15 de desarrollo prenatal.

Dentro de estos 2 días, la condensación suave avascular se convierte en hueso de formación vascularizada incluyendo osteoblastos,

osteocitos y osteoclastos. Se presume que, durante este período importante, cuando la osteogénesis alcanza el punto de las tres

principales diferencias de células óseas, la vascularización ya tiene que desempeñar un papel esencial. Si este es el caso, deben realizarse

cambios moleculares que soporten ambos tipos de eventos celulares. Por lo tanto, el propósito de esta investigación era identificar los

principales marcadores osteogénicos y angiogénicos que mostraban alteraciones de expresión dentro de este período crítico de desarrollo.

Materiales y métodos
Animales
Los ratones (cepa CD1) fueron comprados en las unidades de cría de la Universidad Masaryk de Brno y mantenidos en las instalaciones

del Instituto de fisiología y genética animal, la Academia Checa de Ciencias, Chequia. Se utilizaron cabezas de ratón en etapas entre el día

13 – 15 prenatal/embrionario (E). La cría de ratones se realizó en ciclos de 2 h para garantizar la puesta en escena exacta de la

descendencia. Las ratas embarazadas fueron eutanzadas de acuerdo con el protocolo experimental aprobado por el Comité de Ciencias de

animales de laboratorio de la IAPG CAS, v.v.i., Brno, Czechia (proyecto GA CR 17-14886S).

Análisis histológico/inmunohistológico del hueso mandibular

Para análisis histológicos e inmunohistoquímicos, se corrigen cabezas de ratón en paraformaldehído al 4%, deshidratada (serie de

etanol), tratada con xileno, y se incrusta en parafina.

Se utilizaron secciones de cabezas en la región del primer segmento molar mandibular (5 μm) para el análisis histológico (tinción de

tricromo, von Kossa), inmunohistoquímica (IHC) y detección de osteoclastos (ensayo TRAP). Las secciones histológicas fueron

deparaffinizadas en xileno y rehidratadas en una serie de etanol gradiente, terminando en agua.

Para la IHC, los anticuerpos primarios se aplicaron de la siguiente manera: CD31 (ab28364, Abcam; 1:100), osteopontina (ab91655,

Abcam; 1:100), osteocalcina (ab93876, Abcam; 1:100), esclerostin (AF1589, R & D Systems; 1:200). El kit de ABC (Vectastain) se usó para

la visualización de anticuerpos primarios. La reacción del color fue alcanzada por la cromogeneración POD-DAB.

Se detectó fosfatasa ácida resistente a la tartrato (TRAP) utilizando la sal disódica de fosfato naphthol AS-TR (0.0023 M, N6125; Sigma-

Aldrich, Alemania), ácido acético glacial (0,2 M), acetato de sodio (0,2 M), tartrato de sodio dibásico dihidrato (0,1 M, S-8640; Sigma-

Aldrich, Múnich, Alemania), N-N-dimetilformamida (0,5%) durante 1 h a 37 ° c. La hematoxilina se usó como antimanchas.

Separación de tejidos
Para PCR array, las muestras frescas fueron microdiseccionadas como se describió anteriormente (Minarikova et al., 2015). Brevemente,

las mandíbulas del ratón (E13 y E15) fueron separadas y cortadas en rodajas finas de 250 μm por el helicóptero de tejido McLlwain.

Además, se seleccionaron rebanadas de tejido con región de interés (figura 1) y el hueso mandibular frente al primer molar fue segregado

del tejido circundante por agujas con estereoscopio. Las muestras fueron lisadas por el buffer RLT (Qiagen) para el aislamiento del ARN.
FIGURA 1

Figura 1. Esquema de separación ósea mandibular para análisis de matriz PCR. Las regiones diseccionadas son verdes.

Matriz PCR
RNeasy kit (Qiagen) fue utilizado para el aislamiento de ARN, entonces mRNA fue transcrito en cDNA usando SuperScript VILO

(Invitrogen), y matrices de PCR (Qiagen) se aplicaron en osteogénicas (QIAGEN, PAMM-026Z) y angiogénicas (QIAGEN, PAMM-024Z)

variantes.

Los datos fueron evaluados estadísticamente por QIAGEN Data Analysis Center según lo recomendado por el fabricante (disponible en

línea). La significación estadística se determinó como p < 0,05, el umbral de la regulación de pliegue como ± 2. Se analizaron tres

muestras biológicas independientes para cada etapa. Los genes incluidos en la matriz de PCR se enumeran en el material suplementario.

Control de los genes de limpieza incluidos: ACTB, B2m, GAPDH, GUSB y Hsp90ab1. El formato de matriz de PCR incluía controles

positivos y negativos.

Resultados
Formación ósea mandibular temprana
La formación temprana del hueso mandibular en el segmento conectado con el primer desarrollo del diente molar comienza como la

condensación de las células mesenquimales ubicadas debajo del germen dental, produciendo una capa delgada de matriz colagenosa

(Figuras 2A, una1). Esto se hizo morfológicamente aparente en el día prenatal/embrionario (E) 13. La mineralización no era visible

(Figura 2D) en este momento, sin embargo, apareció un medio día más tarde (Figura 2E). Las células endoteliales CD31-positivas fueron

localizadas en el hueso circundante (figura 2H). Las células mesenquimales condensadas fueron ligeramente positivas para osteopontina

(figura 2K), osteocalcina (figura 2N) y negativas para Esclerostin (figura 2Q). Se observaron células de trampa-positivo mononuclear en

proximidad ósea (figura 2T).

FIGURE 2
Figura 2. Formación del hueso mandibular en la región del primer molar inferior en E13 – E15. Morfología del hueso mandibular (tinción de tricromo, colágeno es detectado por Sirius rojo) en

E13 (A, A1)E14 (B, B1), y E15 (C); detección de tejido mineralizado (von Kossa – las partes mineralizadas son negras) a E13 (D), E 13.5 (E), E14 (F), E15 (G); detección inmunohistoquímica

de células endoteliales (CD31) en E13 (H), E14 (I), E15 (J); localización inmunohistoquímica de la osteoponina (Spp1) a E13 (K), E14 (L)y E15 (M); osteocalcina (Bglap) en E13 (N), E14 (O),

E15 (P); esclerostin en E13 (Q), E14 (R)y E15 (S); detección de células positivas TRAP (pre-/osteoclastos) en E13 (T), E14 (U), E15 (V). Las flechas apuntan a las células positivas. M1, primer

molar; MC, cartílago de Meckel. Barra de escala (A – G) = 100 μm; (H – J) = 50 μm; (Un1B1, K – V) = 10 μm.

Un día más tarde (E14) cuando la matriz extracelular (ECM) del hueso formador se hizo más aparente (figuras 2B, B1) y mineralizada

(figura 2F), las células endoteliales CD31-positivas invadieron el hueso mandibular (figura 2i). La osteoponina (figura 2L) y la

osteocalcina (figura 2o) aumentaron (en comparación con E13), la esclerostin raramente estaba presente (figura 2R). Se detectaron

células polinucleares de trampa-positivas adyacentes a la matriz ósea (figura 2U).

En E15, la síntesis ósea mandibular (figura 2C) y la mineralización (figura 2g) progresaron, las células endoteliales CD31-positivas

podrían detectarse en los vasos del hueso mandibular (figura 2J). La osteoponina (figura 2m) y la osteocalcina (figura 2P) fueron

fuertemente expresadas, mientras que la primera esclerostin de células positivas se pudo encontrar en esta etapa (figura 2s). Aparecieron

osteoclastos multinucleados gigantes (TRAP-positivo) en los márgenes de la formación de hueso (figura 2V).

Perfil osteogénico de las células dentro de la formación de hueso

mandibular
Utilizando el array osteogénico, se descubrió que la expresión de 23 genes estaba significativamente arriba/abajo regulada entre E13 y

E15 en el hueso mandibular, con al menos un doble cambio. Las alteraciones más sorprendentes se detectaron en osteopontin/Spp1

(2644-Fold), osteocalcina/Bglap (112-Fold), esclerostin/SOST (30 veces), receptor de vitamina D/VDR (17,17), Col1a1 (13,88), Col1a2

(9,29), catequipsin K/CTSK (8,45) o fosfato regulador endopeptidasa homólogo X-Linked/PHEX (8,53). La lista completa de las

variaciones en la expresión génica osteogénica se resume en la figura 3. También hubo genes con una expresión alta y constante en ambas

etapas examinadas, como factores morfolgenéticos óseos/BMPs, Smads, RUNX2 o Nfkb1. La lista de genes con una expresión alta pero

constante entre las etapas investigadas se proporciona en la tabla 1. El esquema de progresión ósea mandibular en el contexto de factores

osteogénicos con expresión alterada detectada entre las etapas investigadas se muestra en la figura 5.
FIGURE 3
Figura 3. Cambios en la expresión de genes osteogénicos en el desarrollo de hueso mandibular (E13 vs. E15). El análisis muestra las regulaciones de plegado (– 2/+ 2 se utiliza como el umbral)

de la expresión génica entre E13 – E15 detectado por PCR array. Se visualizan cambios estadísticamente significativos.

TABLA 1

Tabla 1. Genes osteogénicos expresados a nivel de genes de limpieza (CT = 17 – 23) en ambas etapas analizadas (E13 y E15) detectadas por matrices de PCR.

Perfil angiogénico de células dentro de la formación de hueso mandibular

Usando el array angiogénico, 13 genes fueron encontrados para ser significativamente arriba/abajo regulados entre E13-E15 de desarrollo

óseo mandibular, con cambios más de dos veces. Los cambios más destacados se observaron en la expresión de integrin beta 3/Itgb3 (9,1-

Fold), factor de crecimiento de fibroblastos 1/Fgf1 (7,5 veces), ligadura de chemokine 1/Cxcl1 (7,4-fold), o metaloproteinasa matricial

9/Mmp9 (5,6-Fold). Todas las alteraciones en el panel angiogénico de genes se resumen en la figura 4. Los factores con expresión alta y

constante comprenden factores de crecimiento transformantes/Tgfbs, PECAM/CD31 o factor de crecimiento endotelial vascular/Vegfa.

La lista de genes con una expresión alta pero constante entre las etapas investigadas se proporciona en la tabla 2. El esquema de

progresión ósea mandibular en el contexto de factores angiogénicos con la expresión alterada detectada entre las etapas investigadas se

muestra en la figura 5.
FIGURE 4

Figura 4. Cambios en la expresión de genes angiogénicos en el desarrollo de hueso mandibular (E13 vs. E15). El análisis muestra las regulaciones de plegado de la expresión génica (– 2/+ 2 se

utiliza como umbral) entre E13 – E15 detectado por PCR array. Se visualizan cambios estadísticamente significativos.

TABLE 2

Tabla 2. Los genes angiogénicos expresados a nivel de genes de limpieza (CT = 17 – 23) en ambas etapas analizadas (E13 y E15) detectadas por matrices de PCR.

FIGURE 5

Figura 5. Esquema de la progresión ósea mandibular en el contexto de factores osteogénicos y angiogénicos detectados por PCR array. Los genes con expresión alta y estable a lo largo del

período analizado están marcados con un asterisco. Los reguladores negativos son rojos. OB, osteoblast; OC, osteoclastos; EC, células endoteliales; ECM, matriz extracelular.

Discusión
Dada su relevancia para la reparación de defectos óseos craneofacial (Fishero et al., 2015; Tian et al., 2018) e implantología dental (Buser

et al., 2017; Elgali et al., 2017), el hueso mandibular es un modelo común en la investigación básica y clínica. La mayoría de las

investigaciones sobre su formación se han centrado en el período de pre-condensación (por ejemplo, Jabalee et al., 2013; Kaul et al.,

2015). Cuando se trata de etapas posteriores relacionadas con la diferenciación celular, se han desarrollado varios enfoques in vitro (por

ejemplo, Krishnan et al., 2010), aunque se perdió el contexto fisiológico del tejido/órgano. Para ello, se realizó una evaluación directa de

muestras del hueso en desarrollo in vivo donde se mantenía el complejo conjunto de interacciones celulares.

El período de transición investigado aquí incluye varios eventos sucesivos y solapados: expansión de células osteoblásticas, maduración

de osteoblastos, deposición y mineralización de ECM, maduración de osteocitos, progresión angiogénica, osteoclástica diferenciación y

remodelación ósea inicial (Berendsen y Olsen, 2015). Los cambios morfológicos dramáticos deben basarse en una señalización molecular

específica, que aún no se ha investigado con respecto a las etapas de transición. Por lo tanto, el presente estudio apuntaba a la pantalla de

perfiles de expresión angiogénicas y osteogénicas en las etapas tempranas de post-condensación, para buscar marcadores asociados con

el establecimiento de un hueso vascularizado complejo. De acuerdo con nuestra hipótesis sugiriendo la posibilidad de un papel sinérgico

de vascularización durante los pasos iniciales de la osteogénesis, los resultados señalaron alteraciones significativas de la expresión de 37

genes, de 161 factores analizados.

Dentro de los primeros inductores osteoblásticos, nuestro análisis mostró una reducción en la expresión de Bmpr1b y Dlx5 y también de

los componentes de la vía del erizo (IHH, Gli) (Francis-West et al., 1994; NIE et al., 2005; Ulsamer et al., 2008). Simultáneamente, el

patrón de marcadores específicos también se ha paralelo al aumento del número de células osteoblásticas. Entre ellos, Tgfb1 (Oka et al.,

2007) y Fgf1 (Ornitz y Marie, 2015) junto con sus receptores (Tgfβr2 y genes FGFR1/2) fueron elevados o fuertemente expresados

durante el período examinado. Adicionalmente, se observó un aumento significativo en la expresión de Col1a1/2, que codifica el

compuesto más abundante del ECM (Matsuura et al., 2014). En el caso de factores relacionados con la mineralización de ECM (p. ej.,

Feng et al., 2013; Berendsen et al., 2014; Zvackova et al., 2017), la expresión Biglycan fue la más significativamente aumentada durante la

formación de hueso complejo, y otras moléculas que mostraron una mayor expresión incluyeron VDR, Bglap, Phex, y Tgfb1.

Como era de esperar, la diferenciación masiva de osteoblastos durante el período examinado se asoció con un enorme aumento en los

niveles de marcadores de diferenciación osteoblástica (Zóhar et al., 1998), Spp1 y Bglap, que fueron confirmados en la proteína nivel por

análisis inmunohistoquímico del hueso mandibular. Los componentes de la vía BMP (Chen et al., 2012) y RUNX2 (Bruderer et al., 2014),

que son fundamentales para los siguientes pasos de desarrollo óseo, se mantuvieron en niveles de expresión consistentemente elevados.

En el día 15, los primeros osteocitos que mostraba SOST-positividad, aparecieron en la región ósea mandibular que fue investigado por

inmunohistoquímica. Estos hallazgos correspondían a los datos a nivel del transcriptoma. Entre las integrinas que son necesarias para

este período de desarrollo, se observaron mayores niveles de Itga2, Itgb3 (Haugh et al., 2015), Itgb3 y Itgam (Yang et al., 2017).

La aparición de integrinas se asoció también con osteoclastos (Nesbitt et al., 1993; Nakamura et al., 1999). Las primeras células TRAP-

positivas (Takeshita et al., 2000) adyacentes al hueso mandibular en desarrollo se identificaron en las secciones histológicas tan
temprano como el día 13, sin embargo, seguían siendo mononucleares. Dos días después, estas células habían adquirido un volumen

gigante y una morfología multicelular (Alfaqeeh et al., 2013), y se había iniciado una intensa remodelación ósea para acomodar el

creciente germen dental (radlanski et al., 2015). En el caso de las proteasas que son críticas para la resorción ósea (Salo et al., 1997);

CTSK, Mmp9 y Mmp10 fueron reguladas durante el período investigado. Estas moléculas son necesarias también para la remodelación de

la ECM vascular (Burbridge et al., 2002; Bruni-Cardoso et al., 2010).

La migración de precursores osteoclásticos de la médula ósea depende de la red vascular. Los recipientes son visibles alrededor de la

condensación mesenquimal que precede al hueso mandibular, tan pronto como el día 13. Sin embargo, el análisis histológico reveló que

estos vasos penetran la condensación un día después, y la estructura ósea fue vascularizada por el día 15. En términos de moléculas

involucradas en la iniciación y el brote (Morbidelli et al., 1995; Xue y Greisler, 2002; Spiegel y Milstien, 2003); Fgf1, Edn1 y Sphk1

mostraron una mayor expresión dentro del período investigado. La vascularización se asocia con factores inducibles por la hipoxia; en el

caso de autos, se incrementó el Hif2/Epas2. Entre las moléculas conectadas con la elongación del recipiente (revisado, por ejemplo, en

Rodas y Simons, 2007); se observó una mayor expresión de Cd36, Itga2, Itgb3 y Col5a1, y constantemente se detectaron altas expresiones

de Col3a1, Col4a1 y Cdh5 durante el período investigado de desarrollo óseo mandibular.

Este informe se centró en un período transitorio pero muy importante de la formación ósea mandibular, durante el cual una

condensación mesenquimatosa osteogénica se convierte en una estructura ósea compleja. Aunque no pretendemos identificar nuevos

genes, los resultados contribuyen al escaso conocimiento que existe en relación con los factores moleculares a pasos específicos de

osteogénesis y angiogénesis. Los niveles de expresión de 37; de los 161 analizados; factores osteogénicos y angiogénicos, fueron alterados

comparados entre la etapa de condensación y las etapas óseas, que apoyan firmemente nuestra hipótesis también sobre la relación entre

la vascularización y las etapas muy tempranas de la osteogénesis. Los datos de Perfil de expresión que son específicos para un período de

desarrollo determinado, como el que se presenta aquí, proporcionan una visión general de la red molecular que está activa en la etapa

posterior a la condensación antes de la aparición de hueso complejo, y puede ofrecer una base importante para otros estudios

experimentales.

Contribuciones de autor
BV realizó la preparación de la muestra, matrices de PCR y siguientes análisis, y contribuyó a la preparación del manuscrito. EŠ realizó la

disección de tejido, (inmuno) manchas histológicas, y contribuyó a la construcción del manuscrito. JB contribuyó a los datos preliminares

y participó en la preparación del manuscrito. HL contribuyó al análisis de datos y la preparación de manuscritos. EM fue jefe de este

proyecto, contribuyó al diseño de la investigación y a la construcción y terminación de manuscritos.

Financiación
Esta obra fue apoyada por la Fundación científica Checa (GACR, proyecto 17-14886S).

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera

interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Material suplementario
El material suplementario para este artículo se puede encontrar en línea en:

https://www.frontiersin.org/Articles/10.3389/fphys.2019.00124/Full#supplementary-material