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Colonización microbiana de aceitunas fermentadas naturalmente

Introducción

La fermentación es una de las tecnologías de procesamiento / conservación de alimentos más antiguas conocidas por

la humanidad, que se considera un factor determinante importante para controlar el crecimiento microbiano, mejorar

la digestibilidad y el valor nutricional de los alimentos, y mejorar la seguridad alimentaria (Nout y Rombouts, 1992). Hoy en día, los procesos de fermentación asociados con productos animales (p. Ej., Carne, pescado y productos lácteos) se han vuelto cada vez más sofisticados, en contraste con la fermentación de vegetales, particularmente aceitunas, que sigue siendo artesanal y empírica. Esto es sorprendente, ya que la importancia económica de las aceitunas en la Unión Europea es indiscutible, ya que el 38% de la producción mundial total proviene de los países miembros España, Italia y Grecia. Después de la cosecha, las aceitunas son transportadas a la fábrica, clasificadas, lavadas y finalmente en salmuera en una solución salina (Balatsouras, 1990). Actualmente, las aceitunas verdes y negras se fermentan 'naturalmente' a escala industrial, sin la adición de cultivos iniciadores de bacterias de ácido láctico. Las fermentaciones naturales (o espontáneas) generalmente resultan de las actividades competitivas de la microflora indígena, junto con una variedad de microorganismos contaminantes de recipientes de fermentación, tuberías, bombas y otros dispositivos en contacto con las aceitunas y la salmuera. Esos microorganismos mejor adaptados al sustrato alimentario y a los parámetros de control técnico eventualmente dominan el proceso. Hoy, el

control de la fermentación se limita al mantenimiento del ecosistema del olivo (Spyropoulou et al., 2001). En general,

el ecosistema de las aceitunas está influenciado por (1) la asociación microbiana de las aceitunas cosechadas en el

campo (Tassou, 1993), (2) una serie de factores intrínsecos inherentes a las aceitunas, como el pH, la actividad del agua, la disponibilidad de nutrientes que se difunden del tejido, la estructura de la piel de olivo, los niveles de compuestos antimicrobianos autóctonos (compuestos fenólicos y ácidos orgánicos) y (3) factores extrínsecos como la temperatura, las condiciones de almacenamiento y el tipo de envase. Estos factores intrínsecos y extrínsecos pueden influir en la tasa así como el tipo de metabolismo de la asociación microbiana en desarrollo y su respuesta al entorno externo (Boddy y Wimpenny, 1992; Fleet, 1999). La colonización (por ejemplo, la distribución espacial de microorganismos en las aceitunas) es de gran importancia ya que la epidermis de las frutas está cubierta por una cutícula gruesa, que no solo restringe el flujo de nutrientes de la fruta hacia la salmuera, sino que también dificulta la penetración. de microorganismos de la salmuera al producto. La presente revisión se centra en la topografía de la población de levaduras y grupos específicos de bacterias, así como en el efecto de la colonización microbiana en diversas características fisicoquímicas del producto fermentado.

Flora microbiana de aceitunas

Las pseudomonas, las enterobacterias, las bacterias del ácido láctico y las levaduras / hongos son los principales miembros de la asociación microbiana aislada de las aceitunas (tabla 44.1). Los diversos grupos bacterianos y de levadura aislados de las aceitunas se muestran en las Tablas 44.2 y 44.3, respectivamente.

Fuentes de contaminación del olivo

El origen de esta flora microbiana se remonta a las hojas de olivo (Tabla 44.4), así como a las aceitunas almacenadas

(Tabla 44.5) y al estado fisiológico de las frutas (aceitunas sanas o dañadas) (Tabla 44.6). Pseudomonas savastanoi es

un microorganismo importante, que ha sido estudiado en detalle, causando la enfermedad endémica, nudo de olivo

o tubérculo, que ocurre en la mayoría de las regiones del mundo donde se cultiva el olivo (Olea europaea). La

enfermedad toma su nombre de las excrecencias leñosas que se encuentran con mayor frecuencia en tallos jóvenes y en ramas y ramitas como consecuencia de infecciones de heridas . Amplios estudios muestran que el desarrollo de nudos implica la colonización del sitio de inyección, el desarrollo de cavidades lisógenas y, finalmente, el agrandamiento anormal y la proliferación de las células huésped a partir del tejido bacteriano. El patrón de desarrollo

de la hipertrofia y la hiperplasia sugiere que son inducidas por una sustancia con actividad similar a la citoquinina, sintetizada por Pseudomonas savastanoi (Surico et al., 1976). La enfermedad está relacionada con una reducción del rendimiento y la calidad de la aceituna. Pseudomonas savastanoi causa una enfermedad similar en otras plantas, incluyendo Fraxinus excelsior (ceniza), Nerium oleander y Ligustrum japonicum.

Flora microbiana de aceitunas relacionadas con la producción de aceite de oliva

Verona y Valleggi (1949) aislaron muchos microorganismos, principalmente levaduras, pero también bacterias y mohos en menor medida, de montones de hoyos (endocarpos) de almazaras. El italiano Picci (1959) aisló bacterias, levaduras y mohos del sitio de oviposición de Dacus oleae de aceitunas (Tabla 44.5).

Flora microbiana de las aceitunas relacionadas con el procedimiento de fermentación

La fermentación natural de las aceitunas negras y verdes involucra una microflora compleja (Figura 44.1) de bacterias de ácido láctico, levaduras y bacterias Gram negativas (Fernández Díez, 1983; Balatsouras, 1990; Özay y Borcakli, 1996). La dinámica de la población de grupos microbianos seleccionados en la salmuera durante la fermentación está bien establecida en la literatura. Al inicio, la microflora de la salmuera consiste en bacterias de ácido láctico, Enterobacteriaceae, levaduras y Pseudomonas spp. (Tabla 44.7). Estos grupos han sido reportados previamente para aceitunas verdes y negras de Conservolea (Balatsouras, 1990; Spyropoulou et al., 2001) y para aceitunas verdes y negras de Manzanilla, Gemlik y Edincik cultivadas en España y Turquía (Borcakli et al., 1993; Ruiz -Barba et al., 1994; Özay y Borcakli, 1996; Durán Quintana et al., 1999). La presencia de levaduras y bacterias en y dentro de las aceitunas fermentadas ha sido estudiada por microscopía electrónica (Nychas et al., 2002). En la superficie de la epidermis del olivo, las áreas con un revestimiento de cera epicuticular proporcionan un sitio de unión tanto para levaduras como para bacterias (Figura 44.2A). Muy pocos microorganismos están presentes en la epidermis lisa (p. Ej., Alrededor del estoma, Figura 44.2B), aunque es posible que se eliminen durante la preparación de la muestra. Cada abertura del estoma está tapada con una colonia microbiana mixta, principalmente de levaduras de morfología alargada, pero también de bacterias (Figura 44.3A). La epidermis se separa fácilmente del mesocarpio, lo que permite observar la asociación microbiana en la cavidad substomal. Las levaduras de forma esférica y alargada están presentes en la parte inferior de la abertura del estoma, que es rica en cera epicuticular (Figura 44.3A). Los espacios intercelulares de las células subestomales están repletos de bacterias en las colonias (figura 44.3B). Los microorganismos no se detectan más profundamente en el mesocarpio del olivo.

Características bioquímicas de la asociación microbiana

Efecto sobre el aceite de oliva

Existe información considerable sobre la microflora, especialmente su actividad lipolítica en los productos de desecho de las fábricas de extracción de aceitunas. Esta actividad lipolítica, especialmente con respecto al efecto determinante sobre el aceite de oliva, ha sido estudiada en detalle. Hasta el momento no se puede llegar a una conclusión clara. La hidrólisis del aceite mediada por las lipasas y la oxidación resultante (ranciedad) afecta principalmente las propiedades organolépticas del producto final. El fruto del olivo contiene tanto una lipasa como una lipoxidasa, esta última en el endocarpio (Tassou, 1993). Según este investigador, el aumento de la acidez titulable del aceite de oliva durante el almacenamiento se atribuye a la acción enzimática más que a la autocatálisis. Simultáneamente

Borbolla y col. (1958) no pudo verificar la presencia de una lipasa o una lipoxidasa en la aceituna sana. En consecuencia, dudaron de la presencia de estas enzimas en la naturaleza y concluyeron que las enzimas lipolíticas se derivaban de microorganismos que crecían en la pasta de aceituna en diversas etapas de procesamiento o incluso en el aceite producido a partir de entonces. Si bien se discute la existencia de lipasa y lipoxidasa endógenas en el fruto del olivo, es un hecho que los microorganismos que crecen en las aceitunas almacenadas antes del procesamiento, en la pasta de aceitunas antes de la extracción o en las aceitunas atacadas por el insecto Dacus oleae, son comúnmente lipolíticos como sugerido por estudios en España e Italia (Balatsouras, 1990). La actividad lipolítica de origen microbiano aumenta la acidez del aceite producido a partir de fosas frente al material virgen. Las levaduras aisladas por estos investigadores se enumeran en la Tabla 44.5. En 1954 Verona aisló un nuevo género Trichosporon sp. de muestras de pozos de fábricas de aceite de oliva. Produce lipasa y divide el aceite de oliva en glicerina y ácidos grasos libres. Tassou (1993) revisó la microflora en varias etapas del procesamiento del petróleo. Ella informa que los mohos, bacterias y levaduras son principalmente lipolíticos, mientras que la mayoría de los mohos aislados de montones de pozos producen lipasa. González Cancho (1957a) aisló mohos, levaduras y bacterias de las aceitunas almacenadas en montones antes de la producción de petróleo (Tabla 44.5).

Él señala que Serratia y Pseudomonas son los géneros más lipolíticos seguidos por Trichosporon y Pichia. Los microorganismos restantes son negativos a la lipasa. En otro estudio, González-Cancho (1957b) encontró diferencias geográficas en la composición de la microflora y aisló nuevas especies de bacterias, levaduras y mohos. Las cepas lipolíticas se dan en la Tabla 44.6. Concluyó que la mayoría de los aislamientos producen lipasa con la excepción de

Pichia fermentans, una variedad de Cryptococcus laurentii, Trichosporon behrendii y algunas especies de Penicillium

y Alternaria. Gracián y cols. (1961) analizaron muestras químicamente de huesos de aceituna, el mismo montón se

muestreó varias veces antes del procesamiento. Determinaron la cantidad y la calidad del aceite mediante estándares físicos y químicos y descubrieron que para cuando se produjo la hidrólisis de las sustancias grasas, también se había

producido una disminución en el peso. Ambos se atribuyen a microorganismos que crecen en y sobre la superficie del montón, dividiendo los glicéridos en glicerina y ácidos grasos libres. Los microorganismos usan los productos de hidrólisis para el crecimiento, causando no solo un deterioro de la calidad sino también una pérdida en el rendimiento del aceite. También informan un aumento en la acidez del aceite y la formación de hidroxiácidos, así como otros metabolitos que finalmente se transfieren al aceite de picadura. El ablandamiento de la aceituna se atribuye en parte

a las enzimas pectinolíticas endógenas y microbianas.

La presencia de enzimas pectinolíticas, pectina metilesterasa y poligalacturonasa, se ha confirmado en ciertas variedades de aceituna (Castillo-Gomez et al., 1978a, b; Mínguez Mosquera et al., 1978), así como la presencia de un inhibidor natural de la poligalacturonasa (Castillo -Gomez et al., 1979). Los tipos de enzimas pécticas y los cambios que causan en las sustancias pécticas durante la maduración de la fruta son importantes y deben considerarse para determinar el momento apropiado de cosecha y procesamiento de ciertos cultivares de aceitunas de mesa. La actividad pectinolítica de los microorganismos aislados de las salmueras de fermentación se ha estudiado porque causa deterioro durante y después de la fermentación. Las enzimas lipolíticas (lipasas) producidas por muchos microorganismos en el producto crudo se encuentran en el producto final incluso después de la esterilización UHT y, en consecuencia, pueden causar el deterioro del producto estéril. Para actuar de manera óptima, la lipasa necesita un aceite de oliva de pH 8.08.5 y una temperatura de 40 ° C (Adams y Brawley, 1981a, b). También hay una alta probabilidad de que estas enzimas sobrevivan al procesamiento durante el proceso de maceración de las aceitunas (realizado a 35-40 ° C) antes de la extracción de aceite. Por lo tanto, pueden transferirse al aceite de oliva, donde exacerban el desarrollo de la rancidez oxidativa. Las lipasas de Candida rugosa (Han y Rhee, 1985), Saccharomycopsis lipolytica y Micrococcus caseolyticus (Jonsson, 1976) pueden hidrolizar el aceite de oliva en gran medida. La hidrólisis por la lipasa de S. lipolytica es altamente específica para el ácido oleico, mientras que la de M. caseolyticus es totalmente inespecífica (Jonsson, 1976). El aceite de oliva estimula el crecimiento de Achromobacter lipolytica, lo que aumenta la producción de lipasa y la hidrólisis (Kahn et al., 1967). Lo mismo es cierto para Pseudomonas mephitica (Kosugi y Kamibayashi, 1971). El aceite de oliva estimula la producción de lipasa inicialmente al mejorar el crecimiento de Geotrichum candidum, pero finalmente la liberación de glicerol de los triglicéridos disminuye la producción (Nelson, 1953; Wouters, 1967). Las lipasas de Pseudomonas fragi, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger también pueden hidrolizar el aceite de oliva (Nashif y Nelson, 1953; Alford y Pierce, 1961; Fukumoto et al., 1963). Se activan pequeñas cantidades de ácido oleico, pero las concentraciones más altas inhiben la lipasa de Candida lipolytica (Ota et al., 1972).

Efecto sobre la fermentación

Los principales productos metabólicos en la salmuera durante la fermentación son los ácidos cítrico, tartárico, málico, succínico, láctico y acético (Nychas et al., 2002; Panagou, 2002). Su acumulación en la salmuera da como resultado una disminución constante del pH a un valor de 4.4 o inferior (Figura 44.1b). Aunque la presencia de estos ácidos ha sido reportada en estudios previos para aceitunas de mesa verdes (Durán Quintana et al., 1999; Spyropoulou et al., 2001), se cree que este es el primer informe de su presencia en la salmuera de fermentado naturalmente. Aceitunas negras al estilo griego.

La fermentación de aceitunas negras a alta concentración de sal es lenta y se ve obstaculizada por la disponibilidad de nutrientes necesarios para iniciar la fermentación (Balatsouras, 1990). La cutícula del olivo actúa como una barrera para la difusión de solutos dentro y fuera del fruto del olivo, ya que no existe un tratamiento previo de la lejía para interrumpir la cutícula, por lo que el intercambio solo puede tener lugar a través de aberturas en la superficie del fruto (estomas). Las sustancias que se lixivian de las aceitunas incluyen nutrientes inorgánicos (minerales), azúcares, sustancias pécticas, alcoholes de azúcar, hormonas, vitaminas, alcaloides y fenólicos (Balatsouras, 1990; Tassou,

1993).

En las primeras etapas del desarrollo del fruto del olivo, el intercambio gaseoso se realiza a través de los estomas, pero luego algunos se obstruyen con cera que se elimina durante el procedimiento de lavado antes de la fermentación (Proietti et al., 1999). Se considera que los estomas de las hojas de olivo son el sitio de entrada de las suspensiones

bacterianas aplicadas como aerosoles (Surico, 1993), y es posible que algunos de los microorganismos en las aceitunas maduras puedan estar asociados con los estomas y la superficie de la piel. Se sabe que las ceras epicuticulares, presentes como una floración en la superficie de las aceitunas maduras, influyen en la humectabilidad de las hojas de las plantas (Leben, 1988), y proporcionan inicialmente un sitio para la unión microbiana y un sustrato sobre el cual se desarrollan las biopelículas de levaduras y bacterias durante la

Al final de la fermentación, las levaduras y las bacterias del ácido láctico son los microorganismos dominantes en la salmuera. Nuestras observaciones (Nychas et al., 2002) de las aceitunas mismas muestran que existe una diferenciación espacial entre los dos grupos. Específicamente, las levaduras tienden a predominar en la superficie de la piel y justo debajo de las aberturas del estoma, mientras que las bacterias predominan en los espacios intercelulares de las cavidades subestomales. El muestreo solo de la salmuera tenderá a subestimar la cantidad de microorganismos presentes. Del mismo modo, el pH y los niveles de ácido orgánico en la salmuera pueden no ser representativos de las condiciones locales en el mesocarpio. El tejido vegetal amortiguará los cambios en el pH en los materiales alimenticios, y el pH en el centro de las colonias microbianas puede ser más bajo que en el borde (Boddy y Wimpenny, 1992; Malakar et al., 2000). Los productos finales de ácido orgánico se ven afectados por los factores extrínsecos e intrínsecos, como la limitación de oxígeno, la concentración de glucosa y sal, el pH bajo (Bobillo y Marshall, 1991, 1992; Spyropoulou et al., 2001) que prevalecen al comienzo y al final de la fermentación. Se necesita más investigación para investigar el desarrollo y la importancia de la asociación microbiana en y dentro de las aceitunas verdes y negras durante la fermentación.

Aceitunas Saladas Secas

Un tipo importante de aceitunas negras son las llamadas 'aceitunas saladas en seco'. Las frutas se cosechan a plena madurez y se procesan con sal gruesa sin agregar salmuera. Como resultado de la alta presión osmótica ejercida por la sal, los frutos se vuelven gradualmente amargados, marchitos y comestibles. Las características fisicoquímicas finales del producto son: actividad del agua (aw), 0,750,85; pH, 4.55.5; contenido de aceite, 3540%; humedad, 3035%; azúcares reductores, 2.02.5%; Contenido de NaCl, 410% (Panagou, 2006). A pesar del pH relativamente alto, en comparación con las aceitunas fermentadas en salmuera, la baja actividad del agua / alto contenido de sal puede garantizar su seguridad microbiológica durante el almacenamiento, aunque los microorganismos de deterioro potencial, principalmente hongos, pueden crecer en estas condiciones (Panagou et al.2003 ).

La microflora inicial consiste en bacterias de ácido láctico, levaduras, pseudomonas y enterobacterias (Tabla 44.8). Dentro de los primeros 20 días, las levaduras se convierten en la especie dominante, mientras que ningún otro grupo microbiano sobrevive durante más de 20 días debido a la baja actividad de agua del producto en ese período (Figura 44.4). La especie de levadura dominante es Candida famata. El estudio de las aceitunas procesadas con microscopio electrónico revela la presencia de una biopelícula de levaduras que cubre casi toda la superficie de las aceitunas (Figura 44.5). En una sección transversal de los frutos, se observan grandes espacios intercelulares debajo de las células epidérmicas (Figura 44.6). El desarrollo de estos espacios se debe a la etapa avanzada de madurez en que se cosechan las aceitunas, así como al proceso de salazón en seco. En esta área, se observa una extensa red de hifas fúngicas que penetra más profundamente en las células del parénquima del mesocarpio en el almacenamiento prolongado de aceitunas (Figura 44.7). No se observa crecimiento fúngico en la superficie de las aceitunas; en cambio, el micelio extenso es evidente en el mesocarpio que inicialmente está restringido en los espacios intercelulares de las células del parénquima, pero finalmente penetra y desintegra las células de las aceitunas. El crecimiento de hongos puede afectar negativamente tanto el valor nutricional como estético de las aceitunas. Más importante aún, cada vez hay más pruebas que relacionan el crecimiento de hongos y la producción de micotoxinas en las aceitunas saladas secas, pero se necesita más investigación para este propósito.

Resumen de puntos

Las pseudomonas, las bacterias del ácido láctico, las levaduras, los hongos y las enterobacterias son miembros de la asociación microbiana de las aceitunas.

Las hojas, las aceitunas sanas o dañadas y las condiciones de almacenamiento influyen en la asociación microbiana de las aceitunas.

La principal actividad bioquímica de esta flora microbiana está relacionada con la lipólisis y la fermentación de azúcares disponibles.

Inicialmente, en la superficie de la epidermis del olivo, las áreas con un revestimiento de cera epicuticular proporcionan un sitio de unión tanto para levaduras como para bacterias.

Los estomas de las hojas de olivo proporcionan un sitio de entrada de microorganismos.

Durante la fermentación, las levaduras tienden a predominar en la superficie de la piel y justo debajo de las aberturas del estoma, mientras que las bacterias predominan en los espacios intercelulares de las cavidades subestomales.

Se observa una extensa red de hifas fúngicas más profundas en las células del parénquima del mesocarpio en el almacenamiento prolongado de aceitunas saladas secas.

más profundas en las células del parénquima del mesocarpio en el almacenamiento prolongado de aceitunas saladas
más profundas en las células del parénquima del mesocarpio en el almacenamiento prolongado de aceitunas saladas
más profundas en las células del parénquima del mesocarpio en el almacenamiento prolongado de aceitunas saladas