INFORME 1.

ESPECTROMETRÍA, CURVA DE CALIBRACIÓN Y CURVA DE

ABSORBANCIA
Juan Esteban Cardozo Rivera, Anderson Patiño y Kevin Valencia
Estudiantes de tecnología biomédica

Laboratorio de bioquímica. Universidad de Antioquia, Seccional Oriente

Enviado: Agosto 19 de 2019

INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría UV-visible es una técnica que permite determinar la concentración de un
compuesto en solución. Se basa en que las moléculas que absorben las radiaciones
electromagnéticas y a su vez que la calidad de luz absorbida dependen de forma lineal de la
concentración. Además es usada para identificar compuestos por su espectro de absorción y
conocer la concentración de un material o sustancia, esto último permite, seguir el curso de
reacciones químicas y enzimáticas así como determinar enzimas y proteínas incluso ácidos
nucleicos. Mediante esta práctica se pretende calcular las concentraciones de dos muestras
problema utilizando la absorbancia mediante la curva de calibración y la ecuación de Beer-
Lambert.

MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
● Reactivo de Biuret.
● Solución patrón de gelatina (8 mg/mL)
● Solución salina (0.9%)
● Solución de gelatina sin sabor (1mg/mL)-Solución problema 1
● Solución de albúmina (1mg/mL)-Solución problema 2

Se preparan dos tubos de ensayo: el tubo 1 con la solución problema 1 y reactivo de Biuret (1:2) y
el tubo 2: Solución problema 2 y reactivo de Biuret (1:2). Se miden las absorbancias a longitud de
onda de 420 nm a cada tubo aumentando de 20 nm en 20 nm hasta 660 nm.
Flujogramas concerniente a la curva de calibración y curva de absorbancia

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 1. Variación de absorbancia de la solución contenida en el tubo 1 y tubo 2 respecto a la
variación de la longitud de onda, inmediatamente después de preparar la solución y 15 minutos
después de preparar.

λ(nm) Tubo 1: Absorbancia Tubo 2: Absorbancia

Sin Reposar 15 minutos de reposo Sin Reposar 15 minutos de reposo
420 0.014 0.017 0.008 0.010
440 0.017 0.019 0.006 0.008
460 0.027 0.029 0.005 0.007
480 0.043 0.046 0.007 0.011
 500 0.062 0.066 0.008 0.014
520 0.080 0.084 0.012 0.014
540 0.093 0.097 0.015 0.018
560 0.099 0.103 0.019 0.022
580 0.101 0.104 0.025 0.027
600 0.097 0.099 0.031 0.032
620 0.087 0.088 0.037 0.037
640 0.074 0.074 0.039 0.040
660 0.061 0.061 0.040 0.041

Figura 1. Absorbancia vs Longitud de onda de Figura 2. Absorbancia vs. Longitud de onda de

la medición del tubo 1 inmediatamente la medición del tubo1 15 minutos después de su
después de su preparación. preparación.

De las gráficas se puede observar que la mayor longitud de onda para el tubo 1 sin reposar y luego
de los 15 minutos de reposo fue de 580nm.
 Figura 3. Absorbancia vs. Longitud de onda Figura 4. Absorbancia vs. Longitud de onda
de la medición del tubo 2 inmediatamente de la medición del tubo 2 15 minutos después
después de su preparación. de su preparación.

Tabla 2. Curva de calibración. Cantidades de sustrato en cada uno de los tubos

TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8 7’ 8’

Solución Patrón 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.2

(mL)
Solución Problema 1 Problema 2
Problema
Solución 0.5 1.0 0.5 1.0
Problema (mL)
Solución Salina 2.0 1.9 1.7 1.5 1.3 1.1 0.8 1.5 1.0 1.5 1.0
(mL)
Absorbancia 0.042 0.11 0.176 0.239 0.281 0.370 0.027 0.038 0.014 0.019
(540 nm) 7
Absorbancia 0.041 0.10 0.168 0.231 0.270 0.356 0.031 0.036 0.017 0.019
(580 nm) 5
Concentración( 0.133 0.4 0.667 0.933 1.2 1.6 0.083 0.166 0.083 0.1667
mg/mL) 3 7 3

Concentración de solución patrón de gelatina de cada tubo (del 1 al 6)

 8𝑚𝑔 ∗ 0.1𝑚𝐿 0.133𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜1: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
8𝑚𝑔 ∗ 0.3𝑚𝐿 0.4𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜2: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
8𝑚𝑔 ∗ 0.5𝑚𝐿 0.667𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜3: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
8𝑚𝑔 ∗ 0.7𝑚𝐿 0.933𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜4: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
8𝑚𝑔 ∗ 0.9𝑚𝐿 1.2𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜5: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
8𝑚𝑔 ∗ 1.2𝑚𝐿 1.6𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜6: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
Concentración de la solución problema 1:
1𝑚𝑔 ∗ 0.5𝑚𝐿 0.0833𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜7: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
1𝑚𝑔 ∗ 1𝑚𝐿 0.1667𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜8: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
Concentración de la solución problema 2:
1𝑚𝑔 ∗ 0.5𝑚𝐿 0.0833𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜7′: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿
1𝑚𝑔 ∗ 0.1𝑚𝐿 0.1667𝑚𝑔
𝑇𝑢𝑏𝑜8′: 𝐶2 = =
6𝑚𝐿 𝑚𝐿

Figura 5.Curva de calibración a una Figura 6. Curva de calibración en base a una

longitud de onda de 540 nm. longitud de onda de 560 nm.

Concentraciones de las muestras problema:

De la gráfica 5: y = 0.219x + 0.0241
m = 0.219
b = 0.0241
Para el problema 1:
y = 0.027
0.027−0.0241 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟏𝟑𝟐𝟒 𝒎𝒍 .
0.219

y = 0.038.
0.038−0.0241 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟔𝟑𝟓 𝒎𝒍 .
0.219

Para el problema 2:
y = 0.014
0.014−0.0241 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟒𝟔𝟏 𝒎𝒍 .
0.219

y = 0.019
0.019−0.0241 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟐𝟑𝟐𝟗 𝒎𝒍 .
0.219

De la gráfico 6: y = 0.2128x + 0.0202

m = 0.2128.
b = 0.0202.
Para el problema 1:
y = 0.031
0.031−0.0202 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟓𝟏 𝒎𝒍 .
0.2128

y = 0.036.
0.036−0.0202 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟕𝟒 .
0.2128 𝒎𝒍

Para la problema 2:
y = 0.017.
0.017−0.0202 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟏𝟓 𝒎𝒍 .
0.2128

y = 0.019.
0.019−0.0202 𝒎𝒈
𝑥= = 𝟎. 𝟎𝟎𝟔 𝒎𝒍 .
0.2128
Concentraciones de las muestras problema utilizando la ecuación de Beer-Lambert
Cpat × Aprob
Cprob =
Apat
De la tabla 3 para el Tubo 1:
𝑚𝑔
Cpat = 0.133 𝑚𝑙

Absorbancia (λ = 540 nm).

Apat = 0.042
Para el problema 1:
Tubo 7: Aprob = 0.027
𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.027 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟎𝟖𝟓𝟓 𝒎𝒍
Apat 0.042

Tubo 8: Aprob = 0.038

𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.038 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟏𝟐 𝒎𝒍
Apat 0.042

Para la problema 2:
Tubo 7’: Aprob = 0.014
𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.014 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟎𝟒𝟒 𝒎𝒍
Apat 0.042

Tubo 8’: Aprob = 0.019

𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.019 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟎𝟔 𝒎𝒍
Apat 0.042

Absorbancia (λ = 580 nm).

Apat = 0.041
Para el problema 1:
Tubo 7: Aprob = 0.031
𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.031 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟏𝟎𝟏 𝒎𝒍
Apat 0.041

Tubo 8: Aprob = 0.036

𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.036 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟏𝟏𝟔𝟖 𝒎𝒍
Apat 0.041

Para el problema 2:
Tubo 7’: Aprob = 0.017
𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.017 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟎𝟓𝟓 𝒎𝒍
Apat 0.041

Tubo 8’: Aprob = 0.019

𝑚𝑔
Cpat ×Aprob 0.133 ×0.019 𝒎𝒈
𝑚𝑙
Cprob = = = 𝟎. 𝟎𝟔𝟏𝟔𝟑 𝒎𝒍
Apat 0.041

Los resultados obtenidos para las concentraciones de las muestras problema 1 y 2 mediante el
método grafico despejando de la ecuación de la recta y los obtenidos a partir de la ecuación de
Beer-Lambert son bastantes cercanos y se encuentran en los mismos rangos.
Preguntas propuestas por la guía
1. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir?
Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia (por
ejemplo la albúmina) que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas)
presente en una muestra incógnita. Esta curva de calibración es una gráfica que relaciona la
concentración de al menos cinco soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la
absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λmax).
2. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloreadas?
Sí, siempre y cuando se haga reaccionar ésta sustancia con una especie que genere un producto
coloreado y luego poder medir la absorbancia a este producto.
3. ¿Cuál es el objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas?
Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación entre la muestra
problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje de
transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%, o una absorbancia de cero. Ésta
referencia de 100% es el tubo blanco, la cual utilizamos como absorbancia cero en el
espectrofotómetro.
4. ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante?
La albúmina, la cual está constituida por 585 aminoácidos con puentes disulfuro entrecruzados en
su molécula. Su peso molecular de 67.000 dalton.
5. ¿Por qué no se le puede tomar un espectro de absorción a la albúmina sola?
El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino,
se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya
intensidad de color depende de la concentración de proteínas.
Así, y considerando que la albúmina es incolora, haciéndola reaccionar con la ayuda del reactivo
de biuret podemos medir su absorbancia.
6. ¿Por qué razón se eligió una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la
curva de calibración?
Para poder aplicar la ley de Lambert-Beer es necesario seleccionar previamente una longitud de
onda puesto que la absorbancia varía con ella. Del espectro de absorción puede seleccionarse el
valor de longitud de onda para el cual la absorbancia es máxima.
Para el color violeta la longitud de onda de máxima absorción está entre 380 nm y 420 nm.
Anteriormente se mencionó que la albúmina al reaccionar con el reactivo de Biuret generan un
producto de color violeta, de este modo se selecciona una longitud de onda cubierto en dicho rango.
7. ¿Qué significado tiene la pendiente de la gráfica?
La pendiente de la curva de calibrado lo que muestra es la sensibilidad de la curva por ende en una
curva de calibración se debe apuntar a que sea lineal, es decir, que la sensibilidad sea siempre la
misma. Al hacer la regresión lineal de la curva, de la ecuación Y=mx+b donde m es la pendiente,
m será igual a el coeficiente de absortividad molar, es decir, la cantidad de luz absorbida por una
disolución. De acuerdo con la Ley de Beer-Lambert, la absortividad es proporcional a la
concentración del soluto absorbente.

CONCLUSIONES
- Fue posible determinar las longitudes de onda donde las muestras problema absorbían la
mayor cantidad de luz (540 y 580nm) y de esa manera a partir de ellas tomar las
absorbancias para determinar las concentraciones de las muestras problema.
- Se determinó la concentración de las muestras problema tanto por el método grafico como
por la ecuación de Beer-Lambert, ambos métodos fueron exitosos ya que permitieron
obtener valores muy cercanos para las concentraciones de las muestras.
- El Reactivo de Biuret es un buen indicador de la presencia de proteínas, péptidos cortos y
otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición
desconocida, por lo cual fue útil su implementación en la práctica.

Cuantificación de Proteínas

Los aminoácidos (aa) son los monómeros que componen las proteínas. Una proteína
está compuesta de una o más cadenas lineales de aminoácidos, cada una de la cuales
se denomina polipéptido. En un extremo, el polipéptido tiene un grupo amino libre,
llamado amino terminal (o extremo N-terminal). El otro extremo, que tiene un grupo carboxilo
libre, seconoce como carboxilo terminal, o extremo C-terminal (OpenStax College, 2013).
La estructura básica de los aa consiste en un átomo central de carbono, también llamado
carbono alfa (α), unido a un grupoamino (NH2), un grupo carboxilo (COOH). A pH
fisiológico (7.2 -7.4), el grupo amino generalmente se encuentra protonado y tiene una carga
positiva, mientras que el grupo carboxilo está desprotonado y tiene una carga negativa
(OpenStax College,2013).
Las proteínas son un constituyente muy importante de las células y los tejidos del cuerpo
humano. Las proteínas totales séricas se pueden separar en dos grandes grupos la
Albúmina y las Globulinas. La albúmina es la proteína de más concentración en la sangre.
Transporta muchas moléculas pequeñas y mantiene la presión sanguínea. Las globulinas
se pueden dividir en alfa-1, alfa2, beta y gamma globulinas. La albúmina representa el 60%
de las proteínas que contiene el suero, el resto son las globulinas. La determinación de proteínas
totales se realiza para evaluar la posiblepresencia de enfermedades nutricionales, enfermedades del
riñón o del hígado. (García, 2010)

Flujograma concerniente a la cuantificación de proteínas

Tabla3. Absorbancias

Tubos Blanco Patrón Globulinas Proteínas Absorbancia

(mL) (mL) (mL) Totales (580 nm)
(mL)

Solución 1.0
salina

Solución 1.0 0.218

patrón

Solución de 1.0 0.236

globulinas

Suero 1.0 0.193

diluido 1:10

Solución de 4.0 4.0 4.0 4.0

Biuret

Cálculos:
a) Dilución del patrón
𝑪 𝟏 ∗ 𝑽𝟏 = 𝑪 𝟐 ∗ 𝑽 𝟐

Preguntas
1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albúmina, con los reportados
como normales para el suero. ¿Existen diferencias? ¿Por qué?
Los porcentajes de estas proteínas pueden variar y salirse del rango normal debido a diferentes
factores tales como el sexo, la edad, problemas de salud y características especiales en cada
persona.
Niveles bajos de globulina pueden indicar una posible enfermedad celíaca, mala absorción de
proteínas, mal funcionamiento del hígado o una enfermedad intestinal. En algunos casos la anemia
aguda contribuye a tener bajos esos niveles, así como las enfermedades renales. (Zumalacárregui,
2017).
Los altos niveles de globulina pueden indicar una enfermedad grave como tuberculosis o sífilis,
trastorno de la médula ósea (mieloma múltiple), leucemia o el lupus sistémico. La ictericia y la
cirrosis biliar pueden provocar también altos niveles de globulina. La artritis, colitis ulcerosa, una
enfermedad renal o infecciones provocadas por diferentes bacterias y virus pueden causar un
aumento de globulinas.
Los valores de albúmina bajos pueden estar relacionados con: Problemas en el hígado que es donde
se sintetiza mayoritariamente la albúmina. En este caso cuantos más bajos sean los valores indican
mayor gravedad del daño hepático (por cirrosis o hepatitis), problemas en los riñones que están
excretando demasiada albúmina, problemas de malnutrición o de mala absorción.
Los niveles elevados de albúmina en sangre (suero) no suelen tener una significación clínica y por
tanto no suelen ser preocupantes. Normalmente se debe a deshidratación por pérdida de agua
debido al calor o al ejercicio. También se observa si existe una ingesta limitada de líquidos,
particularmente agua, en la dieta.
Los niveles de albumina altos son poco frecuentes ya que no existe una causa natural para la
elevación de la albumina. Puede deberse principalmente a tres razones: Deshidratación, Consumo
muy alto de proteína, Torniquete aplicado por un largo periodo. (Zumalacárregui, 2017)

2. Consulte la función de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el procedimiento

de separación de globulinas.
La mayoría de las globulinas animales se precipitan con sulfato de amonio al 50% de saturación;
Las albuminas se precipitan con soluciones de sulfato de amonio al 100% de saturación lo que hace
que se disminuya el grado de hidratación y se reduce el número de cargas de las proteínas.
(Fiorentino, 1994).
Esto nos da la oportunidad de separar las albuminas de las globulinas y la manera de evidenciar la
separación de estas globulinas es por cuantificación de las proteínas del suero total y luego las de
su precipitado. (Herrera, 2003).
La función del sulfato de amonio es disminuir la solubilidad de las globulinas en el suero
sanguíneo, produciendo la precipitación de estas; mientras que el cloruro de sodio tiene como
función diluir las globulinas que fueron separadas del suero sanguíneo.

Análisis:
Durante la sección experimental se buscó mediante una serie de mediciones realizadas en el
espectrofotómetro hallar las concentraciones correspondientes a las proteínas totales, globulinas y
albúmina, con ayuda de las absorbancias encontradas previamente de cada uno de estas proteínas
y la concentración final de la solución patrón (gelatina).
El suero sanguíneo está compuesto principalmente por dos proteínas: albúmina y globulinas,
(Cardona, 2018) para encontrar las concentraciones de dichas proteínas inicialmente se tuvo que
efectuar una separación de las globulinas del suero sanguíneo, la cual se hizo agregando solución
saturada de sulfato de amonio, y luego de centrifugar y separar las globulinas, éstas fueron diluidas
en solución salina.
El uso de las soluciones de sulfato de amonio y salina se debe a que a una fuerza iónica lo
suficientemente elevada, una proteína puede ser casi completamente precipitada de su disolución;
efecto llamado insolubilización por salado, que es el resultado de la competencia por moléculas de
solvatación entre los iones salinos agregados y los otros solutos disueltos. Uno de los factores que
explican este efecto es que la concentración elevada de la sal puede eliminar el agua de hidratación
de las moléculas de proteína, reduciendo entonces su solubilidad. 101 (Voet, 2007) La
solubilización e insolubilización por salado son procedimientos importantes para la separación de
mezclas de proteínas, ya que las diferentes proteínas varían en su respuesta frente a la concentración
de sales neutras. Las proteínas precipitadas por salado retienen su conformación nativa y pueden
disolverse de nuevo, normalmente sin experimentar desnaturalización. El sulfato de amonio es el
preferido para precipitar las proteínas por salado, debido a su gran solubilidad en agua, lo que
permite alcanzar fuerzas iónicas muy elevadas. (Voet, 2004)
Las absorbancias de las proteínas fueron halladas a una longitud de onda λ = 580 nm, se usó esta
longitud de onda debido a que en solución alcalina y en presencia de iones Cu2+ (reactivo de Biuret)
los cuales reaccionan formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos
de las proteínas y éstas, desarrollan un complejo coloreado de gran estabilidad que se detecta
fotometricamente a 580 nm. (Ruiz, 1995) Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.
Según lo encontrado en la literatura, la albúmina es la principal proteína del plasma humano y
comprende cerca el 60% de la proteína plasmática total, (Zumalacárregui, 2017) el resto
corresponde a las globulinas, es decir, el 40 %; por lo que se puede deducir que existe una mayor
cantidad de albúmina y una deficiencia de globulinas. (Murray, 1996)

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 Celia E.Coto. “Las curvas de calibración” Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA.
Recuperado de:
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm
 Fiorentino, S. (1994). La Inmunología en el Diagnóstico clínico. Santafé de Bogotá: Centro
Editorial Javeriano, CEJA. 70-73

 Herrera, C. (2003). Química de Alimentos. Costa Rica: Editorial de la Universidad de Costa

Rica. 33
 Cardona, W. (2018). Manual de prácticas de laboratorio de Bioquímica. 1-6.
 Voet, D. (2007). Fundamentos de Bioquímica: La vida a nivel molecular. Buenos Aires:
Editorial Médica Panamericana. 101

 Voet, D. (2004). Bioquímica. Argentina: Editorial Médica Panamericana. 140

 Ruiz, S. (1995). Manual de prácticas de fisiología animal veterinaria. Murcia: Servicio de
publicaciones. 52
 Zumalacárregui, J. A. (2017). tuotromedico.com. Obtenido de
https://www.tuotromedico.com/temas/albumina_en_sangre.htm
 Murray, R. (1996). Bioquímica de Harper. México: Editorial Manual Moderno. 832-833