Departamento de Ingeniería Bioquímica

Microbiología Aplicada

Practica No. 3
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

Introducción

La fermentación alcohólica en mostos azucarados se origina por el metabolismo

anaerobio de Saccharomyces cerevisiae, que forma etanol y CO2 como
productos principales, a través de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas. Esta
fermentación puede representarse por la ecuación estequiométrica de Gay –
Lussac (3) (Pinney, 2012, Reyes et al., 1992):

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 (3)

glucosa etanol
Los rendimientos de etanol y CO2 en la práctica son siempre menores a los
valores teóricos. Estos dependen del inóculo (tipo, actividad y concentración de
la cepa de levadura), de la composición del medio de cultivo (concentraciones
de fuentes de macronutrientes, micronutrientes, factores de crecimiento, e
inhibidores), de las condiciones ambientales (temperatura, presencia o ausencia
de O2, pH y aW), del crecimiento microbiano, y de la formación de más de 800
metabolitos en pequeñas cantidades (Quintero, 1993, Pinney, 2012, Reyes et
al., 1993).
El cultivo inicia al inocular la levadura. Inicialmente predomina el metabolismo
aerobio a expensas del O2 disuelto en el mosto; cuando éste se termina, se
establece el metabolismo anaerobio, que se ve favorecido por la saturación del
medio con el CO2 desprendido. A partir de ese momento inicia la
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA PRIMARIA O FERMENTACIÓN TUMUL-
TUOSA. En esta etapa, la cinética de producción de etanol se presenta
relacionada directamente con las cinéticas de crecimiento microbiano y de
consumo de sustrato (Quintero, 1993). Durante este período, se observa un
burbujeo muy enérgico, mientras que las tasas de consumo de sustrato y de
formación de productos son máximas.
La actividad de la fermentación disminuye cuando la disponibilidad del
sustrato principal (azúcares) llega a una concentración limitante, observándose
entonces un desprendimiento mínimo de burbujas.

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Materiales y equipo
Material de casa Equipo
Garrafón con agua de 4 lts Autoclave
1 recipiente metálico de 40 – 50 cm de alto y Balanza granataria
20 a 30 cm de diámetro Balanza digital
Algodón Congelador
Bata Incubadora o baño de temperatura controlada
Cerillos o encendedor Parrillas de calentamiento y agitación
Cinta adhesiva tipo masking tape autoregulables
Cuaderno de registros Potenciómetro
Papel aluminio Refrigerador
Papel estraza o reciclado Refractometro de Abbé
Pluma Densimetro (0 a 20 y 40 a 60 grados Brix)
Plumón marcador negro
Cubrebocas
Tela pañalina o gasa
Tijeras
Trapo de franela

Material Reactivos
1 asa bacteriológica Agua destilada o desionizada
1 baño de temperatura controlada Fructosa
2 barras agitación magnéticas Sulfato de amonio
2 embudos de 7 cm de diámetro Sulfato de magnesio
3 espátulas acero inoxidable Fosfato de amonio
1 gradilla Melaza
1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Soluciones amortiguadoras de referencia pH
2 Mecheros Fischer con manguera 4.0 y 7.0
3 pipetas graduadas de 1 ml Azul de metileno
1 pipeta 5 ml Levadura seca de panificación
5 pipetas de 10 ml
1 probeta de 250 ml
1 termómetro -10 a 50°C
1 tubo de vidrio en U
4 tubos de ensaye 15 x 100 con tapón de
rosca
2 vasos de precipitado 50 ml
1 vaso de precipitado de 600 ml
1 vaso de precipitado de 1000 ml
1 equipo de destilación simple

Procedimiento
1. Lavar en forma cuidadosa todo el equipo y la cristalería que se usará en
el proceso de fermentación alcohólica. Enjuagar con agua destilada, para
reducir al mínimo el desarrollo de otros microorganismos (diferentes a la
levadura).
2. Determinar el contenido de sólidos totales de la melaza que se utilizará
en el proceso de fermentación. Para tal efecto, usar el un refractómetro
de Abbé para medir los grados Brix y el índice de refracción de la melaza.
Realizar los cálculos correspondientes, para diluir la melaza hasta 12 a 15
°Brix, por adición de la cantidad adecuada de agua
3. Calentar a ebullición la melaza diluida, por un periodo de 30 minutos.
Dejar enfriar.

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4. Realizar los cálculos correspondientes para enriquecer la melaza diluida
con los siguientes nutrimentos en la proporción descrita a continuación:
1.5 g/L de sulfato de amonio, 0.30 g/L de sulfato de magnesio y 1.3 g/L de
fosfato de amonio. Agitar la mezcla hasta disolución de las sales
agregadas. (mosto de fermentación)
5. Medir el pH de la mezcla anterior utilizando un potenciómetro previamente
calibrado. Agregar a esta mezcla en forma lenta y con agitación constante
una disolución de ácido sulfúrico 3M, hasta obtener un pH de 4.5 a 5.0.
6. Para llevar a cabo la inoculación del mosto preparar previamente, 6 g/L
de levadura seca, activada en una disolución al 15% m/v de fructosa, 0.2
g/L de fosfato de amonio y 0.01 g/L de sulfato de magnesio. Permitir que
la levadura se active hasta que se observe el efecto de formación de
burbujas de CO2. Regular la temperatura entre 28 y 30 °C. Agitar,
cuidadosamente, hasta dispersar la levadura. (levadura activada)
7. Colocar (en el recipiente preparado para la fermentación alcohólica en
condiciones anaerobias) un tapón de hule provisto de un tubo de vidrio
doblado en “U” (invertido), destinado a la expulsión del dióxido de carbono
formado durante el proceso de fermentación. En el otro extremo del tubo
en “U”, colocar un trozo de manguera y un gotero, el cual deberá estar
sumergido en agua para asegurar condiciones anaeróbicas en la cámara
de fermentación. (ver figura 1)

Figura 1 Equipo de fermentación

8. Llenar el recipiente que servirá como tanque de fermentación con el

“mosto”, hasta ¾ partes de su capacidad.
9. Inocular el recipiente de fermentación con el 10% v/v de la levadura
activada
10. Agitar vigorosamente el fermentador para que se aire el mosto, lo cual es
indispensable para la levadura.

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11. Dejar en reposo a temperatura ambiente por un periodo de 3 días para la
que la fermentación se lleve a cabo. Vigilar la producción de CO2 midiendo
para ello el volumen de agua desplazado en la probeta.
12. Después de este periodo, separar el líquido sobrenadante del residuo
solido en el mosto fermentado, utilizando respectivamente las técnicas de
decantación, filtración o centrifugación.
13. Secar el residuo sólido o “biomasa” formada en el proceso de
fermentación alcohólica en una estufa a 50 – 60°C. Determinar la masa
para calcular el porcentaje (% m/m) de rendimiento de formación de
biomasa.
14. El sobrenadante destilarlo en un aparato de destilación (figura 2) provisto
de una columna de fraccionamiento. Descartar las primeras fracciones del
destilado inicial o “cabezas” que se producen a temperaturas inferiores a
los 78°C, así como las últimas fracciones del destilado o “colas” a
temperaturas mayores a los 90°C. Medir el volumen del destilado
(cabezas, cuerpo y colas). Determinar el contenido de alcohol (%, v/v) en
el destilado y calcular el rendimiento porcentual (%, m/m) del proceso.

Figura 2 Equipo de destilación

15. Medir el volumen del residuo (vinazas) en el recipiente o cámara de

destilación y calcular la relación de volumen de alcohol /volumen de
vinazas producido durante la fermentación.

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Cuestionario

1. ¿Qué relación existe entre glucólisis y fermentación?

2. ¿Por qué en la respiración anaerobia o fermentación se produce menor
cantidad de energía (2ATP), que en la respiración aerobia (38 ATP)?
3. ¿Cuál es la importancia de la fermentación en los microorganismos que
la realizan?
4. Indica y explica cuáles son las enzimas que participan en la vía metabólica
para la obtención de los productos principales de la levadura
5. ¿Cuáles son los puntos críticos o de riesgo que encontraste en esta
práctica que influyan en el resultado?

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