1. Características de las inmunoglobulinas usadas para su aislamiento.

 Hidrofobicidad: Permite que precipite más rápido que otras proteínas en un

medio de altas concentraciones salinas. (27-34%).
 Solubilidad: Varía del balance entre proteína y disolvente que permite que se
mantenga en solución y la interacción proteína-proteína que hace que se
agregue y precipite.
 Carga iónica: Con el uso de resinas para separarlas por carga.
 pH: Es un factor importante en los diferentes métodos de separación de
inmunoglobulinas
 Peso molecular: permite separar las de menor peso molecular de las
inmunoglobulinas.

2. Métodos de separación de inmunoglobulinas.

 Por fraccionamiento: Características físico-químicas
 Por precipitación con sulfato amónico: Cuando aumenta la
concentración salina, las inmunoglobulinas precipitan.
 Cromatografía de intercambio iónico (IEC): Con el uso de resinas se
pueden separar las inmunoglobulinas por su carga en un buffer y pH
adecuados.
 Cromatografía de exclusión molecular (SEC): El peso de las
inmunoglobulinas (>140kDa) permite que se las separe de aquellas con
menor peso molecular.

3. Precipitación salina en etapas:

a) Toma de muestra
b) Separación de suero
c) Agregar al suero separado la sal (SSSA 1 - suero 2) mezclar bien y centrifugar
3000rpm 15 min.
d) Mientras se va mezclando la solución se inició con el salting in, a baja
concentración de sal aumenta la solubilidad, luego se va a dar el salting out, la
solubilidad disminuye haciendo que precipite la proteína deseada
(inmunoglobulinas).
e) Se realiza dos veces para precipitar la mayor cantidad inmunoglobulinas
presentes en el suero. Cuidando los volúmenes a agregar para no salirse del
rango de concentración salina al que precipitará la proteína deseada.

4. Factores que afectan la precipitación salina

a) Solubilidad:
 Naturaleza del compuesto
 Naturaleza del disolvente
 Temperatura

b) Producto iónico:
 Ion común
 Efecto salino
 5. Características del sulfato de amonio
Aniones más efectivos (serie de Hofmeister):
𝐶𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 −3 >𝑇𝑎𝑟𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 −2 > (𝑺𝑶𝟒 ) −𝟐> 𝐹 −1 > (𝐼𝑂3 )−1 > (𝐻2 𝑃𝑂4 )−1>
(𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂)−1 >𝐶𝑙 −1> (𝐶𝑙𝑂3 ) −1 > 𝐵𝑟 −1 > (𝑁𝑂3 )−1> (𝐶𝑙𝑂4 )−1 >𝐼 −1
Cationes más efectivos
(𝑵𝑯𝟒 )+𝟏 >𝐾 +1 > 𝑁𝑎+1

Es muy soluble en agua, no tiene efectos adversos sobre la actividad enzimática, no

desnaturaliza la proteína, método barato, carece de toxicidad para la mayoría de las enzimas y
proteínas y tiene un efecto estabilizador con algunas enzimas.

6. Concentraciones salinas precipitantes de Inmunoglobulinas séricas humanas

27 - 34%

7. Diálisis:
a) Fundamento: Filtración molecular, proceso que separa moléculas por su tamaño,
mediante el uso de membranas semipermeables (saco de diálisis) que contienen poros
de diferentes dimensiones según sea necesario. Se emplea para cambiar el disolvente
en el que se encuentra disueltas las moléculas deseadas; dentro del saco de diálisis se
encuentra la solución a dializar, esta se pone en un recipiente con una solución con
menos cantidad de sales hacia donde fluirá la sal a eliminar buscando mantener el
equilibrio del medio, esta solución de diálisis se debe cambiar a fin de lograr la
separación molecular deseada.

b) Factores que la afectan:

 Solvente: La velocidad de diálisis es mayor en agua destilada.
 Condiciones físicas: Temperatura (mayor T°, mayor velocidad de diálisis)

c) Membranas usadas: Diferentes clasificaciones.

 Por su composición:
 M. celulósicas: Cuprofán, hemofán, acetato de celulosa, triacetato de
celulosa (alta permeabilidad).
 M. celulósicas modificadas.
 M. sintéticas

 Por sus características y propiedades:

 Biocompatibilidad: reacciones adversas.
 Permeabilidad
 Eficacia depuradora
 Distribución simétrica o asimétrica: tamaño y distribución del poro.
 Polaridad
 Hidrofílicas: Policarbonato, etilvinil alcohol (EVAL)
 Hidrofóbicas: Polisulfona, polimetacrilato

d) Comprobación:
En el método usado en la clase (separación de inmunoglobulinas con sulfato de
amonio) se comprobó la diálisis añadiendo cloruro de Bario al líquido de diálisis
(solución salina) en relación volumen/volumen, la presencia de turbidez indica la
reacción entre el cloruro de bario y el sulfato de amonio con la producción de sulfato
de Bario, esto indica que se necesita mayor tiempo de diálisis.
8. Liofilización:
Técnica de deshidratación, el objetivo es separar el agua u otro solvente mediante congelación
y sublimación del hielo a presión reducida, es un proceso suave para secar productos y
compuestos orgánicos e inorgánicos sin alterar su composición cualitativa o cuantitativa, se usa
vacío y baja temperatura.

9. Aislamiento de clases y subclases de Inmunoglobulinas

Clase-específica: Unión a fase solida mediante ligandos inmovilizados con afinidad hacia una
clase de inmunoglobulinas independiente de la afinidad hacia antígenos. Uso de proteínas de
origen bacteriano.
Proteína A: Staphylococcus aureus (IgG, IgE)
Proteína G: Streptococcus spp. (IgG)
Proteína L: Peptostreptococcus magnus. (Todas)

 IgM:
a) Precipitación de sulfato amónico → filtración por exclusión molecular →
cromatografía de intercambio iónico

b) Precipitación con sulfato amónico → eliminación de IgG por purificación de

anticuerpos con proteína A o G.

 IgA: uso de lectinas vegetales (jacalina).

 IgG: Protocolo similar con sulfato de amonio variada.

10. ¿Es lo mismo aislar una Inmunoglobulina que aislar un anticuerpo?

No porque el término inmunoglobulinas se refiere a la estructura, mientras que los anticuerpos
a su función, al separar las inmunoglobulinas consideramos las características físico-químicas y
de estructura, mientras que a los anticuerpos por medio de su actividad inmunológica.

11. Métodos de aislamiento de anticuerpos

A partir de suero: Anticuerpos policlonales.
A partir de líquido ascítico o sobrenadante de cultivo: Anticuerpos monoclonales

 Cromatografía de quelatos metálicos (IMAC): Con el uso de quelatos de iones metálicos

divalentes permite unirse a proteínas o péptidos que contengan clusters de histidina
(IgG de mamíferos), o más de 3 residuos de histidina consecutivos.

 Purificación por afinidad: Por unión específica.

Antígeno específica: Las separa uniéndolas a un antígeno inmovilizado, separa todos los
anticuerpos para ese antígeno independiente de la clase o el isotipo.

12. Eficacia de la purificación de Igs: Pureza, concentración y reactividad

13. Aplicaciones clínicas y de laboratorio de aislamiento de Igs y/o anticuerpos

 Inmunización pasiva
 Terapia inmunológica intramuscular
 Terapia inmunológica intravenosa
 Terapia de reemplazo en desórdenes con deficiencia de anticuerpos: inmunodeficiencia
primaria asociada a deficiencia de anticuerpos, infección por VIH en pediatría, trasplante
de médula ósea, leucemia linfocítica crónica, terapia inmunoreguladora.
  Tratamiento y profilaxis de infecciones bacterianas y virales Hepatitis A, sarampión,
rubeola.
 Terapia específica para Hepatitis B, rabia, tétanos, varicela zoster.
 Tratamiento en patologías inmunohematológicas: trombocitopenia, anemia hemolítica
autoinmune, aplasia de línea roja, inmunización Rh feto-materna, neutropenia,
Hemofilia A y B, Lupus eritematoso sistémico, síndrome de Kawasaki, artritis
reumatoidea juvenil, Enfermedad de Crohn
 Método cualitativo y cuantitativo para el diagnóstico de una enfermedad: western blot,
inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, citrometría de flujo, inmunoprecipitación,
inmunoensayo, ensayo funcional, espectrometría de masas.

14. Fórmula de la reacción del sulfato de amonio con cloruro de bario:

(𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 + 𝐵𝑎𝐶𝑙2 → 𝐵𝑎𝑆𝑂4 + 2 𝑁𝐻4 Cl