Instituto Académico Pedagógico de Ciencias Básicas y Aplicadas

Universidad Nacional Villa María

Biología
Ingeniería en Alimentos

Trabajo práctico de laboratorio Nº 3

CUERPO DOCENTE

Luciana Bohl

Leopoldo Palma

AYUDANTE DE ALUMNOS

Humberto Quiñonez

Ciclo Lectivo: 2019

Temas: en este laboratorio se abordarán temas de la unidad Nº 3 Ingeniería genética

Objetivos:

 Definir la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa, comprender el

fundamento teórico que permitió el desarrollo de esta técnica.
 Diseñar y efectuar reacciones de PCR en el laboratorio. Conocer los reactivos que
se utilizan y las etapas de cada ciclo de una PCR. Entender los pasos a seguir
desde la obtención de la muestra hasta la interpretación de los resultados en
relación al objetivo del experimento planteado, a partir de la observación de
imágenes de geles de agarosa.
 Adquirir entrenamiento en el uso del material de laboratorio, específicamente
de las pipetas automáticas y el equipamiento requerido para realizar la PCR
(termociclador, fuente de poder, etc).
 Conocer y discutir las aplicaciones y usos de la técnica en el área de los
Alimentos.

Materiales:

 Muestras.
 Reactivos necesarios para PCR y electroforesis horizontal.
 Termociclador, cuba, fuente de poder.
 Calculadora.
 Material de plástico descartable (tubos Eppendorf, tips de distintos volúmenes,
microtubos de PCR).
 Guantes.
 Guardapolvo.
 Descartador.

Evaluación: se tomará un cuestionario sobre los aspectos que se abordaron durante el

trabajo de laboratorio.

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa o polymerase chain reaction (PCR) es

una técnica que permite amplificar de manera exponencial un fragmento específico de
genoma.

La PCR da como resultado, mediante la utilización de una ADN polimerasa, la

amplificación de regiones específicas de ADN de simple cadena, la que actúa como
molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Estos moldes de ADN se
obtienen cuando se calienta el mismo a una temperatura cercana a un punto de
ebullición (desnaturalización), produciéndose la separación de las cadenas de ADN. Para
la iniciación de la síntesis de la cadena complementaria al molde se requiere además de
la presencia de cebadores o primers, que son secuencias cortas de nucleótidos sintéticos
(oligonucléotidos), hibridan de forma específica con las dos hebras complementarias de
ADN. Los cebadores se diseñan de tal manera que hibriden en los extremos opuestos de
cada hebra de la región de interés, así las nuevas cadenas de ADN sintetizadas que
comienzan en cada primer se extiende hacia la posición del primer que se encuentra en
la hebra opuesta. De esta forma se generan en cada cadena de ADN nuevamente
sintetizada nuevos sitios de unión a los primers. La mezcla de reacción se calienta
nuevamente para separar la cadena original de la nueva, las cuales quedan disponibles
para nuevos ciclos de hibridación del primer, síntesis de ADN, separación de las cadenas,
y así sucesivamente.

Es decir que básicamente, la amplificación de la secuencia de interés se consigue

al realizar una serie de ciclos repetitivos que consisten en:

Etapas de cada ciclo de PCR

Cada ciclo de PCR incluye tres etapas que se suceden en la doble hélice de ADN
(templado) y se realizan en un equipo específico para ello, denominado termociclador.
Las etapas son:

1. Desnaturalización del ADN molde, a 95 °C.

2. Hibridización de cebadores o “primers” a las regiones flanqueantes de la
secuencia molde de ADN a amplificar, a 55-65 °C.
3. Elongación de los primers o síntesis del ADN complementario por Taq polimerasa
termoestable en presencia de dNTPs, a 72°C. Como resultado de esta etapa se
forman copias que constan de una hebra de ADN original y una hebra de ADN
recién sintetizado.

Cada ciclo duplica la secuencia original de ADN. El ciclo se repite entre 25 a 40

veces según el tamaño del producto de PCR (amplicón). El resultado de una reacción de

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PCR es que al final de n ciclos, la reacción contiene un máximo teórico de 2n moléculas
de DNA de doble cadena que son copias de la secuencia de DNA comprendida entre los
primers específicos. Si se realizan 20-30 ciclos del proceso de PCR señalado
anteriormente, se pueden obtener varios millones de copias de la secuencia de interés,
flanqueada por los primers utilizados en la amplificación.

Técnica

El proceso se desarrolla en un microtubo de PCR de 0,2 mL que contiene todos

los reactivos de la reacción. La reacción típica de PCR consta de la muestra de ADN que
contiene la secuencia a amplificar, la enzima ADN polimerasa, secuencias cebadoras-
iniciadoras o primers, desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), Mg Cl2, buffer de reacción
y agua ultrapura.

 Taq ADN polimerasa. Thermus aquaticus, es una bacteria termófila que vive en la
proximidad de manantiales de agua caliente (50-80 °C), por ello sus enzimas resisten
tales condiciones. Normalmente las proteínas constitutivas de la mayoría de los seres
vivos se desnaturalizan a esas temperaturas y no vuelven a ser funcionales. Debido a
esa termorresistencia, la enzima que T. aquaticus emplea para replicar su ADN se utiliza
con frecuencia en las reacciones de PCR. En la PCR se separan las cadenas de la doble
hélice del ADN mediante desnaturalización térmica a temperaturas en torno a los 95°C,
lo que conduciría a la inactivación de las ADN polimerasas ordinarias. La polimerasa Taq,

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 en contraste, tiene su máxima actividad a 72 °C y su termoestabilidad es tal que su vida
media a 95°C es de 40 minutos, lo que la hace idónea para este tipo de procesos.
 Primers, iniciadores o cebadores. Con estos nombres se conocen a los oligonucleótidos
de cadena simple que se necesitan para iniciar la replicación ya que la enzima
polimerasa utiliza un OH libre para poder polimerizar.
 Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Durante la realización
de la PCR, los cuatro nucleótidos tienen que encontrarse en igual concentración.
 Mg Cl2. La concentración de Mg2+ afecta la unión de los primers al ADN molde, la
especificidad del producto, la actividad de la enzima, la formación de dímeros de
primers. Es por esto que debe ensayarse la concentración óptima para cada sistema.
 Buffer de reacción. 50 mM KCl y 10 mM Tris-HCl (pH Buffer de reacción 8.3).

Se llevan los tubos (tantos tubos como muestras se estudian, más un control
negativo de reactivos) al termociclador que será programado según protocolo
específico.

Análisis de los productos de PCR

El producto obtenido se somete a electroforesis en gel de agarosa. Al fundir la

agarosa, se agrega bromuro de etidio, un producto mutagénico que actualmente se
reemplaza por SYBR Green (un producto menos cancerígeno), los cuales se intercalan
entre las bases del ADN y son fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta.
Seguidamente se arma el gel con un peine que da forma a los “wells” o pocillos, se
colocan los productos de la amplificación uno en cada pocillo. Antes de sembrar la
muestra se le agrega un volumen determinado de colorante de frente (azul de
bromofenol) para visualizar la corrida. La electroforesis se lleva a cabo a 100 V cm-1
aproximadamente, durante 1 hora, a temperatura ambiente. La separación de bandas
se produce en función sólo de su tamaño, y no de la carga eléctrica porque en este caso
el ADN siempre tiene carga negativa y por lo tanto migrará hacia el ánodo. Una vez
terminada la corrida se coloca el gel en un transiluminador y se observa al UV. Una banda
de masa molecular apropiada (por comparación con patrones de ADN en el mismo gel)
sería indicativa de que el ADN blanco fue amplificado exitosamente.

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Esta técnica puede utilizarse con diversos propósitos, por ejemplo:

 Identificación de un microorganismo por presencia de una secuencia específica

del gen 16S ARNr.
 Detección de genes de microorganismos patógenos (Salmonella spp., Listeria
monocytogenes, Escherichia coli O157:H7) o no en alimentos, por ejemplo en
especies cárnicas y de pescado de interés alimenticio.
 Estudio de presencia/ausencia de organismos genéticamente modificados
(OGM) en los alimentos. Para ello se amplifican marcadores moleculares
específicos por PCR y se detecta su presencia en un gel de agarosa.
 Selección de clones por la presencia de genes asociados a virulencia, resistencia
a antibióticos, etc.
 Establecimiento de relaciones entre cepas durante brotes o en estudios
epidemiológicos.
 Estudiar la presencia/ausencia o expresión de un gen.

PCR
Ventajas Desventajas
Se puede obtener una cantidad Falsos positivos por contaminación
considerable de copias de ADN para el cruzada
estudio que se vaya a realizar, en forma Reactivos costosos
rápida y eficaz, a partir de una muestra Se pueden amplificar solamente aquellas
pequeña partes del genoma en donde se conoce
El producto se puede utilizar para por lo menos una mínima secuencia de
clonación, secuenciación y análisis. 20/40 pb que corresponde a las zonas

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 Se puede amplificar ADN de cualquier donde deben hibridar los primers
organismo vivo o muerto. específicos.
Diagnóstico de patologías genéticas o La polimerización puede generar errores
adquiridas. al sintetizar el ADN.
Aplicación a la medicina forense y legal.
Detección de patógenos responsables de
enfermedades infecciosas.

¡A TRABAJAR!

El objetivo de este laboratorio es detectar la presencia de Staphylococcus aureus

en muestras de alimentos.

Pasos a seguir:

Extracción del ADN

La extracción del ADN fue realizada por los docentes a partir de diferentes tipos
de alimentos. Posteriormente, se evaluó la calidad y pureza del ADN obtenido y se
cuantificó para conocer su concentración (Abs 260/280).

Preparación de la mezcla de reacción

Se recomienda preparar en un único tubo la mezcla de reacción que se utilizará

para todas las muestras, luego se debe repartir 18 μL de la misma en tantos microtubos
como muestras se tenga, finalmente se debe añadir 2 μL de ADN en la concentración
deseada (100 ng/tubo).

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 De ser posible debe incluirse siempre un control positivo (muestra que posee
el gen de interés), un control negativo (muestra que no posee el gen de interés) y un
control de reactivos (mezcla de reacción más agua ultrapura).

Un tubo (μL) … tubos

Buffer de reacción 10X 10
Primer forward 0,4
Primer reverse 0,4
Mg Cl2 0,4
Desoxinucleótidos 0,4
trifosfatos (dNTPs)
ADN polimerasa 0,4
Agua ultrapura 6
Muestra 2
Volumen total 20

PCR

Ubique los microtubos en el termociclador y realice la PCR teniendo en cuenta

las condiciones que figuran a continuación.

 Pre-PCR: 94 °C 5 min (garantiza la completa desnaturalización del ADN)

 PCR: 30 ciclos de: 94 °C 30 s, 55°C 30 s, 72 °C 30 s
 Post-PCR: extensión a 72 °C 10 min (asegura la completa extensión de las hebras
de ADN)

Detección de los productos de amplificación

Media hora antes de que finalice el programa en el termociclador prepararemos

un gel de agarosa al 1,5 % (pesar 0,45 g de agarosa en 30 ml de buffer TAE 1X). Fundir
en microondas, esperar que la temperatura descienda ligeramente y agregar 1,5 µL de
solución stock del colorante SYBR Green. Al igual que cualquier molécula de unión a
ADN, SYBR Green puede causar mutaciones y es un posible carcinógeno. ¡Manipular con
cuidado y utilizar guantes! Mezclar agitando suavemente y verter sobre el molde del gel,
¡no olvide ubicar los peines para formar los pocillos donde colocará las muestras!
Esperar aproximadamente 30 minutos para asegurar la solidificación completa de la
agarosa. Colocar el soporte con la agarosa solidificada en la cuba de electroforesis y
verter buffer TAE 1X hasta cubrir ligeramente los pocillos. Colocar 2 µL de buffer de
siembra en cada tubo con 10 µL producto de PCR (la muestra se tiñe de color azul y, por
el glicerol del buffer, adquiere suficiente densidad para permanecer dentro del pocillo
de agarosa), mezclar varias veces con tip y sembrar 12 µL en cada pocillo. No olvide

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sembrar el marcador de peso molecular (1,5 µL). Correr a 80 Volts por 45 minutos.
Observar en un transiluminador UV. Fotografiar e interpretar los resultados.

BIBLIOGRAFÍA

1. http://es.scribd.com/doc/20805277/GUIA-DE-PRACTICAS-DE-LAB-BIOLOGIA-
CELULAR#scribd, consulta septiembre 2015
2. http://www.academia.edu/4726817/MANUAL_DE_PR%C3%81CTICAS_BIOLOG
%C3%8DA_CELULAR_Y_MOLECULAR_II, consulta septiembre 2015
3. Manual de procedimientos. Normas generales para el trabajo en laboratorios de
docencia, investigación y/o prestación de servicios. UNRC-FCEFQyN-PG-05. Rev.
1. Pág 1-8
4. MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS 2015 INGENIERÍA EN ALIMENTOS –
LICENCIATURA EN BIOQUÍMICA TRABAJO PRÁCTICO N° 1 REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
http://microbiologiaunsl.wikispaces.com/file/view/TP+PCR+para+Ingenieros.pd
f, consulta 14 de octubre de 2015.
5. Trabajos Prácticos. Cátedra Biología Molecular. Facultad de Ciencias Naturales
e IML, 2014.
file:///C:/Users/Invitado/Downloads/1504909265.Trabajo%20Pr%C3%A1ctico%
20N%C2%BA1%202014%20(1).pdf, consulta 14 de octubre de 2015.