Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
PARA LABORATORIO DE
NUTRICION DE PECES Y
CRUSTACEOS
CONTENIDO
Por
Este documento fue realizado como parte de las actividades del Proyecto FAO/Italia
GCP/RLA/102/ITA “Apoyo a las Actividades Regionales de Acuicultura para América
Latina y el Caribe” (AQUILA), cuyo objetivo principal es ayudar a los países miembros
para que incrementen la producción de alimento por medio de la acuicultura, bajo la
consideración de que fomentando la capacitación, la investigación y el intercambio de
información, se fortalecerá el crecimiento de la actividad de acuerdo a las características
de cada país.
E1 trabajo comprende una recopilación de los métodos más comunes de análisis
químicos para evaluar la calidad de los ingredientes alimenticios y las dietas preparadas,
con el propósito de hacerlos disponibles a la mayoría de los técnicos y personal
involucrado en la alimentación de peces y crustáceos. Se señalan además algunas
recomendaciones para el manejo de las muestras para una buena representatividad de
los resultados obtenidos. Las técnicas seleccionadas se presentan divididas en tres
grupos, las incluidas dentro de los análisis proximales, un capítulo de análisis especiales
que comprende técnicas para la determinación más precisa de algunos nutrientes
importantes como son por ejemplo, minerales, carbohidratos y proteína verdadera, y un
tercer apartado con los métodos analíticos para algunos de los tóxicos y antinutrientes
más comunes en los alimentos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresar su agradecimiento al Dr. Albert Tacon por su apoyo e
impulso a las actividades sobre nutrición de organismos acuáticos, así como también a las
autoridades regionales del proyecto AQUILA.
Los hiperenlances que remiten a sitios Internet distintos de los de la FAO no implican, de
parte de la Organización, ratificación oficial o responsabilidad respecto a opiniones, ideas,
datos o productos presentados en dichos sitios, o una garantía de validez acerca de las
informaciones que contienen. El único propósito de los enlaces a sitios distintos de los de
la FAO es proporcionar otras informaciones disponibles sobre asuntos conexos.
Los alimentos balanceados son preparados con base en los requerimientos nutricionales
de cada especie y aún cuando la dieta se formula para satisfacerlos, no siempre contiene
los niveles de nutrientes calculados una vez preparado, debido a que el proceso usado en
su elaboración puede alterar significativamente su valor nutricional; por ejemplo, el calor
puede dañar algunos nutrientes y/o puede hacerlos más disponibles eliminando los
tóxicos termolábiles, mientras que por otro lado la molienda puede afectar la digestibilidad
de proteínas y carbohidratos (Harris, 1980). La calidad del alimento también se modifica
después de pasar cierto tiempo en el almacén, donde además de sufrir cambios en el
valor nutricional, se pueden presentar alterciones en otras características como son el
color, la textura, el sabor y el olor. Por otra parte existe el grave riesgo de contaminarse
con los desechos de roedores, insectos y micoorganismos que aceleran aún más su
deterioro (Limborg, 1979; Chow et al., 1980; Smith and Moss, 1985).
De manera ideal cualquier ingrediente debería pasar por los puntos de control señalados,
sin embargo, si por limitaciones económicas o de equipo no es posible, se debe entonces
procurar cubrir al menos aquellos análisis que garanticen una calidad mínima deseable y
una seguridad de que los animales no presentarán reacciones adversas al alimento.
Aún cuando el control de calidad es un tema que merece tratarse exhaustivamente, este
manual está enfocado particularmente a los métodos básicos de análisis químicos
necesarios para una adecuada evaluación de ingredientes y dietas elaboradas, con el
objeto de ponerlos a la disposición de la mayoría de acuacultores y personas interesadas
en este tipo de evaluaciones que posean conocimientos básicos de química. Los métodos
propuestos han sido recopilados de diferentes fuentes y la mayoría son considerados
como estándares de norma.
Con fines prácticos los análisis se han agrupado en tres secciones; en la primera se
incluyen los métodos considerados dentro del análisis proximal, para determinar el
contenido de humedad, proteína cruda, lípidos crudos, fibra cruda, ceniza y extracto libre
de nitrógeno; este análisis permite conocer los niveles porcentuales de cada nutriente en
el material pero no indica nada acerca de la calidad de los nutrientes, para lo cual se
requieren otros análisis complementarios, algunos de los cuales se incluyen en este
manual en la segunda sección donde se consideran como análisis especiales.
En un tercer apartado se incluyen las técnicas más sencillas para la detección de algunos
de los tóxicos y antinutrientes más comunes, ya que su presencia puede afectar
negativamente la eficiencia de utilización de los alimentos, e inclusive, ser causa de
mortalidad. Consideramos que este capítulo es particularmente importante cuando se
incluye en los alimentos subproductos agroindustriales como harina de soya, algodón, o
nuevas fuentes proteicas, particularmente de origen vegetal.
a. Asegurarse de que cuenta con los reactivos y equipo necesarios para efectuar la
determinación deseada, ya que una vez iniciado un análisis, por lo general no es
posible suspenderlo temporalmente en tanto se consiguen los faltantes.
b. Efectúe cada análisis por TRIPLICADO. Es más exacto trabajar con valores
promedio que con un sólo dato; si los resultados entre las réplicas varían
notablemente, es preferible repetir todo el análisis.
c. Pese la muestra con la mayor aproximación posible. Tres o cuatro decimales nos
dan una mayor exactitud en el cálculo. Siempre utilice una balanza analítica.
d. Después de pasar la muestra al recipiente donde se realizará el análisis, pese
nuevamente el contenedor a fin de ajustar el peso final. La exactitud en el peso es
fundamental para obtener un buen resultado, ya que la mayor parte de las técnicas
son gravimétricas.
e. Nunca modifique el tamaño de muestra, los tiempos en las diferentes etapas o el
tipo de reactivos, a menos de que se hagan pruebas comparativas que garanticen
la precisión de los resultados. Recuerde que los análisis normalmente se basan en
métodos estándar aceptados o exigidos por las autoridades reguladoras.
f. Utilice siempre los equipos y accesorios de seguridad requeridos, como son
campanas de extracción, máscaras y batas.
g. Recuerde que estará manejando substancias tóxicas o peligrosas para el
organismo, por ello extreme las precauciones requeridas según el caso y no omita
ninguna.
a. En lotes a granel menores de 10 ton tomar dos muestras por cada tonelada.
b. En lotes a granel mayores de 10 ton tomar una muestra por tonelada.
c. Para materiales encostalados, para 1 a 10 costales tomar muestras de cada uno;
con más de 10 costales muestrear un 10% del total al azar.
Las muestras se deberán tomar de diferentes puntos para que el material sea
representativo del total del lote; posteriormente se mezclan perfectamente y se dividen en
sublotes de 1–2 kg, se colocan en recipientes herméticos y se almacenan de manera
apropiada hasta su análisis.
Para cada material se debe llevar un registro para conocer el tipo de proceso al que ha
estado sujeto previamente (subproductos industriales), su origen (vegetal, animal, mineral,
fármaco) y la parte usada como alimento (principalmente si ha estado sometido a un
proceso que impida su reconocimiento). Estos datos son importantes particularmente
cuando se están usando productos agrícolas, ya que éstos pueden variar su composición
dependiendo de la variedad cultivada, las condiciones de cultivo o la época de cosecha;
pueden también contener residuos de pesticidas o estar contaminados por mohos y en el
caso de subproductos animales, presentar contaminación por antibióticos y hormonas
(Frazer, 1967; Harris, 1980).
Para que un material pueda ser utilizado en el laboratorio de análisis deberá ser
preparado de manera apropiada, esto con el fin de que los resultados obtenidos sean
representativos del total y puedan ser utilizados de manera confiable para la formulación
del alimento o para la valoración del mismo, para lo cual se hacen las siguientes
recomendaciones:
a. La cantidad de material debe ser adecuada para realizar todos los análisis
necesarios; debe ser una muestra homogénea y representativa.
b. El manejo de la muestra debe ser cuidadoso para evitar cualquier cambio o
contaminación.
c. La muestra deberá molerse finamente, tamizarse y mezclarse homogéneamente.
Esta operación debe hacerse rápidamente y con la mínima exposición al medio
ambiente. Evite su sobrecalentamiento durante el molido, por lo cual materiales
sensibles al calor deberán ser molidos a mano. Antes de usar el molino asegúrese
de que está perfectamente limpio.
d. Si la muestra contiene mucha humedad y la preparación del material no puede
hacerse sin cambios significativos en ésta, determine la humedad antes y después
de la preparación.
e. Se recomienda un examen físico macro y microscópico para detectar la presencia
de materiales contaminantes.
f. Mezcle la muestra perfectamente y divídala en dos partes iguales. De ser
necesario haga un molido preliminar para facilitar esta operación. Almacene una
de las partes en un frasco hermético, limpio y seco; la otra parte será usada en los
análisis y su tamaño deberá ser adecuado para la totalidad de las pruebas
requeridas.
g. Al menos que el método de análisis indique lo contrario, los materiales serán
molidos de inmediato y pasados por una malla de 1 mm2; mezcle perfectamente la
muestra tamizada y almacénela en un recipiente hermético. Antes de tomar
material para cada análisis mézclese nuevamente.
h. Al menos que se señale lo contrario, las muestras húmedas deberán secarse para
su molido y tamizado, siguiendo las indicaciones del punto anterior.
i. Las muestras líquidas y semilíquidas deberán conservarse en frascos tapados y
mezclarse perfectamente antes de su análisis.
j. Los materiales deberán conservarse en refrigeración o a temperaturas que eviten
cambios en su composición. Muestras para análisis de vitaminas u otras
substancias sensibles a la luz se colocarán en recipientes de vidrio color ámbar.
3. ANALISIS PROXIMALES.
Los análisis comprendidos dentro de este grupo, también conocido como análisis
proximales Weende, se aplican en primer lugar a los materiales que se usarán para
formular una dieta como fuente de proteína o de energía y a los alimentos terminados,
como un control para verificar que cumplan con las especificaciones o requerimientos
establecidos durante la formulación. Estos análisis nos indicarán el contenido de
humedad, proteína cruda (nitrógeno total), fibra cruda, lípidos crudos, ceniza y extracto
libre de nitrógeno en la muestra. Una descripción más amplia de estos análisis se puede
encontrar en Osborne y Voogt (1978), MAFF (1982) y AOAC (1984).
3.1. Humedad.
Aparatos
Horno de secado.
Desecadores.
Procedimiento
Cálculos
Donde:
Por su costo es este el nutriente más importante en la dieta en una operación comercial;
su adecuada evaluación permite controlar la calidad de los insumos proteicos que están
siendo adquiridos o del alimento que se está suministrando. Su análisis se efectúa
mediante el método de Kjeldahl, mismo que evalúa el contenido de nitrógeno total en la
muestra, después de ser digerida con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador de
mercurio o selenio.
a) Método simple propuesto por Chow et al. (1980)
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
Cálculos:
Reactivos:
Oxido de mercurio.
Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro.
Sacarosa.
Zinc granulado.
Granulado de piedra pomex lavada con ácido sulfúrico y quemada.
Acido sulfúrico concentrado (d = 1.84 g/ml).
Solución de hidróxido de sodio al 40 %.
Solución saturada de sulfato de sodio.
Solución de tiosulfato de sodio; 8g de Na2S2O35H2O en 100ml.
Solución de hidróxido de sodio 0.1N.
Solución de hidróxido de sodio 0.25N.
Solución de ácido sulfúrico 0.1N.
Solución indicadora de rojo de metilo; disuelva 0.3 g de rojo de metilo en 100 ml de
etanol (95–96 % V/V).
Solución indicadora rojo de metilo-azul de metileno; (a) disuelva 0.2g de rojo de
metilo en 100ml de etanol (95–96 % V/V) y (b) disuelva 0.1g de azul de metileno
en 100ml de etanol (95–96 % V/V), mezcle un volumen de (a) con uno de (b).
Materiales y Equipo
Procedimiento
Cálculos
En este método, las grasas de la muestra son extraídas con éter de petróleo y evaluadas
como porcentaje del peso después de evaporar el solvente.
Procedimiento
1. Saque del horno los matraces de extracción sin tocarlos con los dedos, enfríelos
en un desecador y péselos con aproximación de miligramos.
2. Pese en un dedal de extracción manejado con pinzas, de 3 a 5g de la muestra
seca con aproximación de miligramos y colóquelo en la unidad de extracción.
Conecte al extractor el matraz con éter de petróleo a 2/3 del volumen total.
Cálculos
Reactivos
Materiales y equipo.
Método
Cálculos
Recomendaciones
Con el uso los crisoles de filtración tienden a taparse. Para su limpieza calcínelos a 500°C
y hágales pasar agua en sentido inverso. Cuando se han tapado con partículas minerales,
prepare una solución que contenga 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA sal
sódica, caliéntela y hágala pasar por el crisol en sentido inverso. Este tratamiento
erosiona al filtro de vidrio.
FIGURA 5
3.5. Ceniza
Materiales y equipo.
Crisoles de porcelana.
Mufla.
Desecador.
Procedimiento
Cálculos
Dentro de este concepto se agrupan todos los nutrientes no evaluados con los métodos
señalados anteriormente dentro del análisis proximal, constituido principalmente por
carbohidratos digeribles, así como también vitaminas y demás compuestos orgánicos
solubles no nitrogenados; debido a que se obtiene como la resultante de restar a 100 los
porcientos calculados para cada nutriente, los errores cometidos en su respectiva
evaluación repercutirán en el cómputo final.
Cálculo
Donde:
3.7. Correcciones
Debido a que los análisis normalmente se hacen con muestras preparadas para tal fin, es
necesario realizar ciertas correcciones en los resultados para que reflejen el contenido
real de nutrientes en el material en las condiciones en que se usará.
a) Humedad
b) Lípidos
Cuando se usa material desengrasado, por ejemplo en el análisis de fibra cruda, se aplica
una expresión similar a fin de obtener un valor representativo de la muestra:
Este método permite tener una aproximación del grado de digestibilidad de las fibras en el
alimento. La muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio en ácido sulfúrico y el
residuo es considerado como la fibra no digerible.
Reactivos
Materiales y Equipo
Horno
Matraces erlenmayer de 500 ml.
Mantilla de calentamiento.
Condensador de dedo frío.
Crisoles de filtración, porosidad 1.
Procedimiento
Cálculos
Donde
Reactivos
Materiales y Equipo
Procedimiento
NOTA:
Cálculos
a. Paredes celulares (%) en “base seca” o “como se ofrece”. 100(((peso del crisol +
paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra.
b. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes
celulares.
Van Soest, P.J. and R.H. Wine, 1967, J. Assoc. Official Anal. Chem., 50:50.
FIGURA 8
Determinación del contendido de fibra por el método de detergente neutro
Reactivos
Materiales y Equipo
Placa de calentamiento.
Mufla eléctrica con termostato.
Crisoles de calcinación: Platino o aleación de platino y oro (10% Pt, 90% Au);
Rectangulares (60 × 40 × 25 mm) o circulares (60–75 mm de diámetro con 20 – 25
mm de alto).
Método A
Método B
Agregue otros 50 ml de ácido clorhídrico y espere hasta que cese la liberación de gases y
coloque el vaso en un baño maría a ebullición durante 30 minutos, con el fin de hidrolizar
los almidones presentes. Filtre la solución cuando todavía este caliente con papel filtro
libre de cenizas, posteriormente lave el filtro con 50 ml de agua tibia hasta que el filtrado
deje de ser ácido (ver nota). Coloque el papel filtro conteniendo el residuo en un crisol de
platino previamente pesado, seque y calcine la muestra a 550 – 700°C. Transfiera las
cenizas a un vaso de precipitado usando 75 ml de ácido clorhídrico 3N y continúe el
análisis como en el método anterior a partir de la etapa en la que se calienta la muestra
suavemente por 15 minutos.
NOTA:
Cálculos
Reactivos
Materiales y Equipo
Espectrofotómetro.
Papel filtro Wathman no. 542 o Schleicher y Schill no. 150.
Procedimiento
Extracción:
Determinación:
1. Diluya 10 ml del extracto a 100 ml con agua destilada. Con una pipeta pase a un
tubo de ensaye 1 ml del filtrado diluido.
2. Tome con la pipeta dos muestras de 1 ml de agua destilada que servirán como
blancos por duplicado y coloque cada uno de ellos en un tubo de ensaye.
3. Tome dos blancos duplicados de 1 ml usando la solución de glucosa diluida.
4. Agregue rápidamente a todos los tubos 5ml de reactivo de anthrone recién
preparado. Tape los tubos y mezcle vigorosamente. Colóquelos en un baño maría
y caliente durante 12 minutos.
5. Enfríe rápidamente a temperatura ambiente. Transfiera la solución a celdas para
espectrofotómetro de 1 cm. El color verde es estable sólo por 2 horas.
Cálculos
Donde
W = Peso en g de la muestra.
a = Absorvancia del estándar diluido1.
b = Absorvancia de la muestra diluida.
1
El gráfico es una línea recta én el rango de 0 – 0.15 mg de glucosa (manual) 0.0 – 1.5 mg de glucosa (automático).
Materiales y Equipo
Procedimiento
Pese 2 g de muestra con más de 25% de proteína cruda, lg para rangos de 25 – 50% de
proteína y 0.5g para materiales con más de 50% de proteína cruda. Transfierala a un
matraz kjeldahl y agregue aproximadamente 50 ml de agua destilada, unos pocos
gránulos de antiebullente y una o dos gotas del antiespumante.
Para evaluar el nitrógeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de nitrógeno
total de kjeldahl. El nitrógeno no proteico se analiza por medio de la misma técnica a partir
del líquido filtrado. Los resultados respectivos de los sólidos y líquidos por medio de
kjeldahl ofrecerán directamente los datos de nitrógeno proteico (NP) y no proteico (NNP)
respectivamente.
FIGURA 12
Reactivos
Procedimiento
1. A 0.1 ml de muestra o sol. estándar, adiciónele 0.1 ml de sol. NaOH 2N. Caliente a
100°C durante 10 min a baño maría hirviendo para hidrolizar la muestra.
2. Deje enfriar a temperatura ambiente y agréguele 1 ml del reactivo de formación de
complejo recién preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min.
3. Adicione 0.1 ml de reactivo de Folín, agite con un mezclador de vórtice y deje
reposar a temperatura ambiente durante 30–60 min (no exceda este tiempo).
4. Lea la absorvancia a 750 nm si la concentración de la proteína fuera menor a 500
μg/ml, ó 550 nm si fuese entre 100 y 2000 μg/ml.
5. Trace una curva estándar de absorvancia como función de concentración inicial de
proteína y úsela para determinar el contenido de proteína en la muestra.
NOTA
Carbón activado
Solución Carrez I: disuelva 21.9 g de acetato de zinc dehidratado en agua,
agregue 3 ml de ácido acético glacial y diluya a 100 ml con agua destilada.
Solución Carrez II: disuelva 10.6 g de ferrocíanuro de potasio en 100 ml de agua
destilada.
Acido clorhídrico 0.02N.
Solución de acetato de sodio: disuelva 136 g de acetato de sodio trihidratado en
1000 ml de agua.
Solución de 4-dimetilaminobenzaldehído: disuelva 1.6 g de 4-
dimetilaminozenzaldehído (4-DMAB) en 100 ml de etanol al 96% y adicione 10 ml
de ácido clorhídrico (d=1.18 g/ml).
Solución estándar de urea: disuelva 0.1 g de urea en 100 ml de agua.
Materiales y Equipo
Agitador rotatorio
Espectrofotómetro con celdas de 10 mm.
Procedimiento
Pese aproximadamente 2 g de muestra con una precisión de 0.001 g, o una cantidad que
se espera contenga de 50 a 200 mg de urea y colóquela en un matraz volumétrico de 500
ml. Agregue 150 ml de ácido clorhídrico 0.02N, agite por 30 min y adicione 10 ml de la
solución de acetato de sodio y mezcle. Agregue 1 g de carbón activado, agite
perfectamente bien y deje reposar la mezcla por 15 min. Adicione 5 ml de la solución
Carrez I, seguido por 5 ml de la solución Carrez II, mezclando perfectamente bien entre
las adiciones. Afore con agua destilada y mezcle bien. Filtre una parte con un papel filtro
seco en un vaso de precipitado de 250 ml limpio y seco.
Determinación
Curva de Calibración
Expresión de Resultados
Determine la cantidad de urea en la muestra por referencia con la curva de calibración
elaborada. Exprese los resultados como por ciento de la muestra.
NOTA:
A través de este método es posible determinar el contenido de ácido úrico y sus sales
tanto en gallinaza como en alimentos e ingredientes que los constituyen.
Reactivos
Donde
b. Prepare una solución neutra que contenga 17.5g de formaldehído con 250ml de
agua y 500ml de etanol. Ajuste el pH a 7.0 con una solución de NaOH 0.1N. Diluya
a 1000ml con agua, mezcle y ajuste nuevamente el pH de ser necesario.
Determinación
Curva de Calibración:
Expresión de Resultados
El contenido de N del ácido úrico como % de la muestra está dado por la fórmula:
% N = A/(6 × W)
Donde
Procedimiento
Cálculos
La evaluación de calcio en la dieta reviste una gran importancia ya que un desbalance con
el fósforo u otros minerales generará un bajo crecimiento.
Reactivos
Acido clorhídrico (1 – 3 %)
Acido nítrico 70%
Hidróxido de amonio (1:1 v/v)
Indicador de rojo de metilo (1 g en 200 ml de etanol)
Solución de oxalato de amonio 4.2 %
Acido sulfúrico 98 %
Solución estándar de permanganato de potasio 0.05N
Materiales y Equipo
crisoles de porcelana
matraces volumétricos de 250 ml
vasos de precipitado de 250 ml
Papel filtro para análisis cuantitativos libre de cenizas
Procedimiento
Calcine en crisol de porcelana 2.5g de muestra finamente molida. Adicione 40ml de HCI y
unas gotas de HNO3 al residuo, caliente el crisol hasta ebullición, enfríe y transfiera a un
matraz volumétrico de 250ml, afore y mezcle. Pase a un vaso de precipitado 100ml de sol.
para cereales o alimentos con cereales ó 25ml para alimentos con minerales. Diluya a
100ml y adicione 2 gotas de rojo de metilo. Adicione NH4OH gota a gota hasta que vire a
pardo anaranjado, luego adicione 2 gotas de HCl para dar un color rosa. Diluya con 50ml
de agua, hierva y adicione con agitación 10ml de sol 4.2% de oxalato de amonio. Ajuste el
pH con ácido para regresar al color rosa si es necesario.
Déje reposar, filtre y lave el precipitado con la solución de NH4OH (1.5%). Coloque el
papel filtro con el precipitado en un vaso, adicione una mezcla de 125ml de agua y 5ml de
H2SO4, caliente a 70°C y titule con la solución de permanganato y calcule:
Al igual que el calcio, este mineral es indispensable para el buen desarrollo de los
organismos cultivados, debiendo estar presente en las dietas en cantidades suficientes
para satisfacer las necesidades metabólicas de los organismos. Este elemento en
proteínas de origen vegetal puede estar formando parte de fitatos, por lo cual su
disponibilidad puede estar limitada, por lo que se recomienda una determinación de ácido
fítico previa al uso de tales materiales.
Reactivos
Procedimiento
Este método permite determinar la cantidad de sal presente en harina de pescado y otros
ingredientes.
Reactivos
Procedimiento
Cálculos
Reactivos
Acido Clorhídrico concentrado.
Solución estándar de Potasio: Para preparar solución stock (500 ppm), disuelva
0.477 g de Cloruro de Potasio y llévelo a 500 ml con agua destilada. Para preparar
el estándar de trabajo (10 ppm), diluya 1:50.
Aceite de oliva (puro)
Materiales y Equipo
Crisoles de Sílice.
Fotómetro de flama
Mufla
Procedimiento
Reactivos
Materiales y equipo
Espectrofotómetro
Digestor kjeldahl para tubos de 100 ml
Matraces kjeldahl de 100 ml
Matraces volumétricos de 25 ml
Procedimiento
Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habrá eliminado previamente
escamas y cualquier otra materia extraña; manténgalos a sequedad. Pese con precisión
de 0.0001g de 50 a 100mg de muestra, colóquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese
nuevamente la charolilla para ajustar peso de la muestra. Adicione 5ml de HNO3 y ponga
a digerir en ebullición suave por un mínimo de 30 min hasta que desaparezcan los
vapores amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad de líquido y
continúe habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de ácido nítrico y siga digiriendo.
Al término la solución debe ser clara, de color verdoso y no debe desprender vapores
ocres. Deje enfriar.
Ya fría la solución, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del matraz 3ml
de ácido perclórico. Realizar la adición dentro de una campana de extracción y con mucho
cuidado, ya que en caso de una digestión incompleta se puede presentar una reacción
explosiva. Coloque nuevamente el matraz en el digestor y continúe la ebullición hasta que
la solución vire de verde a amarillo limón; apague el digestor y deje enfriar. Ya frío se
debe formar un anillo rojizo en el borde del líquido; en caso de no formarse o si el líquido
se torna verde nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea permanente.
Pase el líquido frío a un matraz volumétrico de 25 ml, enjuagando el matraz kjeldahl varias
veces con agua destilada y afore. Ajuste a O el espectrofotómetro con un blanco de
reactivos y leer a 350 mm. El blanco se prepara simultáneo a la muestras usando
solamente los ácidos y agua destilada.
Cálculos
a) Calcule la cantidad de óxido de cromo (mg) presente en la muestra:
X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4
Donde
Y = absorvancia
0.0032 y 0.2089 son constantes
O.C.% = 100(X/A)
Donde
Reactivos
Solución madre de Mono E N dinitrofenil - lisina HCI (p. m. 366.77, 39.85 % lisina)
Disolver 314 mg en 250 ml de HCl concentrado. Se disuelve lentamente, de
manera que hay que iniciar su preparación un día antes.
Solución estándar diluida de DPN-lisina. Diluya 10 ml de la solución madre en 100
ml de agua destilada para formar el estándar. Hecho lo anterior, 2 ml de la
solución contienen alrededor de 0.1 mg de lisina y disuelto a 100 ml da una
absorción neta de alrededor de 0–4 a 435 nm en celdilla de 1 cm.
Solución de 1 - fluoro 2,4 dinitrobenceno (FDNB). Manéjese con guantes de
plástico desechables. Sí el FDNB está sólido colóquese en balo de agua caliente
para que se funda, tome con una pipeta automática aproximadamente 0.4 ml y
disuelva en 15 ml de alcohol etílico por muestra. Debe prepararse diariamente.
Cloruro de metoxicarbonil (cloroformato de metilo). El MCC es inestable por lo que
se debe almacenar en refrigeración. Manéjese con cuidado.
Solución de bicarbonato de sodio al 8% en agua destilada.
Eter etílico libre de peróxidos.
Solución de fenoftaleína, 500 mg/l de alcohol etílico al 60%.
Solución de hidróxido de sodio al 12%. Se usa para incrementar el pH a 8.5
durante la reacción del MCC. Debe almacenarse en frasco de plástico. Tener a la
mano un gotero con HCI 1M para corregir cualquier exceso.
Buffer de bicarbonato de sodio - carbonato, pH 8.5. Disuelva 19.5g de NaHCO3 y
1g de Na2CO3 en 250 ml de agua destilada; ajuste el pH si es necesario.
Almacenar en un frasco bien lleno y bien cerrado para evitar pérdida de CO2
Acido clorhídrico concentrado
Materiales y Equipo
Tamiz de 0.5 mm
Matraces de fondo redondo
Matraz volumétrico de 250 ml
Baño maría
Rotoevaporador
Aparato de reflujo
Papel filtro Whatman 541
Tubos de ensaye con tapón
Perlas de vidrio
Espectrofotómetro
Procedimiento
Muela la muestra para que pase el tamiz de 0.5 mm. La cantidad de muestra a utilizar
deberá contener alrededor de 12mg de lisina disponible, lo que equivale a 0.3 – 2g de la
muestra. Pasela a un matraz de fondo redondo. Agregue 2–3 perlas de vidrio y 10ml de
NaHCO3, agitar suavemente para que la muestra no se adhiera a las paredes.
Enfríe y adicione 30ml de HCI 8.1M para neutralizar al NaHCO3. Sumando el agua
presente, se tendrá un volumen de 40ml y una concentración de ácido de 6M. Reflujar
suavemente durante 16 horas.
Colocar 2 ml del filtrado en dos tubos con tapón, etiquetándolos A y B. Agregar al tubo B 5
ml de éter y agita. Extraiga el éter (capa superior) con una pipeta automática. Coloque el
tubo en un baño a 90°C hasta que se elimine todo el éter y enfríe.
Agregue una gota de fenoftaleína al tubo, adicione gota a gota la solución de NaOH hasta
que aparezca un ligero color rosado; añada 2ml de buffer de carbonato y agregue dentro
de una campana 0.5 ml de metilcloroformato. Tapar el tubo y agitar vigorosamente,
liberando la presión con cuidado. Después de 5 ó 10 min, adicione gota a gota 0.75 ml de
HCI concentrado agitando para evitar la formación de espuma. Se extrae cuatro veces la
solución con éter como se describió anteriormente. Elimine el éter residual en baño maría,
enfríe y lleve el volumen 10 ml con agua destilada.
Durante las pausas de las manipulaciones del tubo B, extraiga tres veces con éter el tubo
A; elimine el éter residual y lleve a 10 ml con HCl. Lea la absorvancia de ambos tubos a
435 nm en el espectrofotómetro contra agua destilada. La lectura del tubo menos la del
tubo B (blanco) es la absorvancia atribuible al DNP - lisina.
Cálculos
Donde
C= g de lisina/16g de N
Ws= Peso del estándar expresado como mg de Lis en 2 ml; 0.1 sí se prepara como se
indica.
Wu= Peso de la muestra en mg
As= Absorción neta del estándar
Au= Absorción neta del desconocido
V= Volumen del hidrolizado filtrado. Se recomienda 250 ml (menos por la segunda
digestión).
a= Alícuota del filtrado. Se recomiendan 2 ml.
CP= Proteína cruda, 6.25 × g N/100g material.
Para expresar el resultado como g lisina/Kg de PC, cambiar un 100 por 10 en la fórmula.
NOTA:
Los peces, según su especie, presentan una capacidad diferencial para utilizar
carbohidratos en su dieta, por lo cual se considera importante contar con un método
rápido para la determinación de azúcares totales disponibles.
Reactivos:
Materiales y Equipo
Calentador eléctrico
Matraces erlenmayer de 500 ml
Procedimiento
Disuelva 8g de melaza y llévela a 500ml con agua destilada (filtre). Hidrolice 100 ml del
filtrado con 5ml de HCI (Sp. g 1.18) y deje reposar por 24 h. Neutralice con NaOH al 20%
usando fenoftaleína como indicador y diluya a 200 ml.
Estandarización de la Solución Soxhlet: Mida 10ml de la solución Soxhlet (a) y (b) con una
pipeta volumétrica y vacíe a un matraz erlenmayer, mezcle y agregue 30ml de agua.
Adicione con una bureta un volumen de estándar de trabajo casi suficiente para reducir el
Cobre en la solución Soxhlet. Llévelo a ebullición y déjelo hervir por 2 min., adicione 4
gotas de azul de metileno y rápidamente complete la titulación mientras está hirviendo,
hasta que se obtenga un color naranja brillante. Repita varias veces y determine el
volumen de solución requerido para reducir completamente 20 ml de solución Soxhlet.
Titulación de Muestra: Primero realice una titulación aproximada; pase a un matraz 10ml
de las soluciones (a) y (b), adicione alícuotas de 10ml de la solución muestra. Añada 40
ml de agua y llévelo a ebullición. Si persiste el color azul, titule con una solución estándar
de trabajo y calcule el contenido aproximado de azúcar en la muestra. Para determinar
con precisión el contenido de azúcar, pase a un matraz 10 ml de las soluciones Soxhlet
(a) y (b); adicione una alícuota de la solución muestra. El volumen de muestra usado
dependerá del contenido de azúcar en la muestra. Adicione agua como se indica en la
tabla, mezcle y hierva. Durante la ebullición, agregue estándar de trabajo con una bureta
hasta que la titulación sea casi completa. Añada azul de metileno y complete la titulación.
Donde:
Este método determina la ureasa residual en harina de soya y sus derivados de acuerdo
al método Caskey-Knapp (1944) modificado por AACC (1969) y Quím. Leticia Comar
(Nutrimentos del Sureste, Mérida, Yucatán, México). El resultado esta dado en unidades
de pH proporcionales a la actividad ureásica. Los valores aceptables oscilan entre 0.05 y
0.5; valores menores indican sobrecocimiento y mayores falta de cocimiento.
Reactivos
Materiales y Equipo
1. Pese 0.2g de harina de soya finamente molida (sin sobrecalentar) por duplicado y
colocar en tubos de ensaye (A y B); adicione al tubo A 10ml de la solución bufer de
urea. Tape, agite e incube en baño maría por 30 min a 30 ± 0.5°C.
2. Después de 5 min, adicione al tubo B 10ml de sol. bufer de fosfatos, tape, agite y
coloque en el baño maría.
3. Agitar cada uno de los tubos cada 5 minutos (seis agitaciones en 30 min).
4. Retire el tubo A del baño maría, decante el sobrenadante en un vaso de pp de
10ml y mida el pH dentro de un período menor a 3 min. Repita el procedimiento
con el tubo B 5 minutos después del A.
5. Calcule el índice de actividad ureásica como unidades de pH resultantes de la
diferencia de las lecturas del tubo A menos el tubo B y determine la calidad de la
muestra según la tabla de ejemplo incluida:
Reactivos:
Materiales y Equipo
Agitador mecánico.
Espectrofotómetro
Matraces erlenmayer de 250 ml
Matraces Volumétricos de 25 y 250 ml
Baño maría
Procedimiento
Muela la muestra para que pase la malla de 1 mm, cuidando de no sobrecalentarla. Tome
aproximadamente 1 g de la muestra y agréguele 25 ml de acetona pura. Agite por unos
minutos, filtre y divida el filtrado en dos. A una porción, adiciónele una lenteja de Hidróxido
de Sodio y caliente en baño maría por unos minutos. Un extracto ligeramente amarillo que
no cambia de color con el Hidróxido indica que la harina no ha sido tratada, proceda con
el método 1. Si se obtiene un color rojo-anaranjado profundo, indica la presencia de
dianilinogosispol y requiere del método 2.
Método 1
Método 2.
Donde:
G= Lectura en la Gráfica
W= Peso de la muestra
V= Volumen de la alícuota usada.
Para harinas químicamente tratadas.
Donde:
FIGURA 25
Procedimiento
% Tiogl= (M. wt. tioglucósido × Peso de BaSO4) × 100/M.wt. BaSO4 × Peso Muestra
FIGURA 26
El método que se incluye es adecuado para materiales como harina de cacahuate, harina
de copra y harina de palma kernel; para detalles del método, así como para
procedimientos alternativos, refiérase a Methods of Aflatoxin Analysis por B.D. Jones
(1972), Report No. G70, Tropical Products Institute, London.
Reactivos:
Cloroformo (G.R.)
Eter etílico (G.R.)
Mezcla cloroformo/metanol (95/5 v/v)
Celita, tierra de diatomeas
Gel de sílica “G” (Merck)
Estándares Cualitativos. Permiten distinguir marcas de aflatoxina de otras
manchas fluorescentes que puedan estar presentes. Se puede usar con este
propósito harina de cacahuate conteniendo aflatoxina B obtenible en el Inst. de
Productos Tropicales de Londres.
Materiales y Equipo
Procedimiento
FIGURA 27
Determinación cromatográfica de aflatoxinas en ingredientes alimenticios.
Reactivos
Materiales y Equipo
Colorímetro (usar espectrofotómetro 535 nm) Klett-Summerson con Filtro No. 54.
Matraz Kitazato.
Tubos de ensaye.
Crisol de Filtración.
Vasos de precipitado de 250 ml.
Vasos de precipitado de 150 ml.
Matraz Volumétrico de 250 ml.
Matraz Volumétrico de 100 ml.
Procedimiento
Determinación Colorimétrica:
FIGURA 28
Reactivos
Materiales y Equipo
Tubos de ensaye
Colorímetro
Espectrofotómetro
Procedimiento
Cálculos
Reactivos
Antiespumante (Silicona)
Acido nítrico (d= 1.42g/ml)
Solución de amonio: Prepare diluyendo un volumen de hidróxido de amonio
(d=0.88 g/ml) en dos volúmenes de agua.
Sulfato férrico amoniacal, solución saturada
Suspensión de almendras dulces. Triture 20 almendras dulces blanqueadas en
100 ml de agua a 37–40°C. Asegúrese de que no existe ácido cianhídrico en 10 ml
de la suspensión usando papel de picrato de sodio o corriendo un blanco testigo
como se describe más adelante
Solución de acetato de sodio, neutral a la fenoftaleína: 10g de acetato de sodio
anhidro en 100 ml de agua destilada.
Solución 0.02N de tiocianato de amonio
Solución 0.02N de nitrato de plata.
Materiales y Equipo
Procedimiento
Expresión de resultados
Si el blanco indica que la solución de nitrato de plata ha sido consumida, reste su valor del
volumen consumido por la destilación de la muestra. 1 ml de 0.02N AgNO3 0.54mg de
HCN. Exprese el resultado como porcentaje de la muestra.
NOTA: Si la muestra (ej. frijoles) contiene una elevada cantidad de azufre, se formará un
precipitado negro de sulfato de plata, el cual se filtra junto con el depósito de cianuro de
plata. La formación de este precipitado consume solución de nitrato de plata y su efecto
debe ser eliminado para el cálculo de contenido de HCN, para lo cual, trate el depósito
sobre el papel filtro con 50ml de amoníaco a fin de disolver el cianuro de plata. Lave el
residuo en amoníaco diluido y determine su contenido de plata. Convierta el valor a ml de
solución 0.02N de solución de nitrato de plata y résteselo al volumen de solución de
nitrato de plata consumida por el destilado de la muestra.
FIGURA 30
Reactivos
Procedimiento
1. Extraiga 2g de muestra durante 20 horas con éter anhidro. Hierva el residuo por 2
horas con 300ml de agua, enfríe, diluya a 500 ml y filtre.
2. Mida 25 ml de la infusión dentro de una cápsula de porcelana de 2 litros, adicione
20ml de la solución de índigo y 750ml de agua. Adicione la solución estándar de
permanganato, 1 ml a la vez, hasta que cambie el color azul a verde, luego
agregue otras gotas hasta que se torne de color amarillo dorado.
3. De manera similar, titule una mezcla de 20ml de solución de índigo y 750ml de
agua. Multiplique la diferencia entre las titulaciones por el factor deseado para
obtener ácido quercitánico u oxígeno absorbido.
FIGURA 31
Método simple para la determinación de taninos en ingredientes alimenticios
El ácido fítico se puede encontrar en algunas semillas como ajonjolí, trigo, arroz, avena,
sorgo, cebada, etc. Su presencia puede provocar deficiencias de fósforo en
monogástricos por ligar y formar fitatos indigeribles que hacen indisponible ese elemento;
afecta también la disponibilidad de calcio, magnesio o el fierro con los que forma el
complejo fitina.
Reactivos
Materiales y equipo
Procedimiento
Cálculos
Calcule el fitato-P a partir de los resultados de fierro, asumiendo una tasa molecular de
4:6 fierro:fósforo
FIGURA 32
Las saponinas se pueden encontrar en una gran variedad de plantas incluyendo la alfalfa,
soya y semillas de leguminosas, habiéndose demostrado un efecto negativo sobre el
crecimiento de monogástricos. Es un antinutriente estable al calor.
Reactivos
Acetona G.R.
Metanol
Solución n-butanol-metanol-amoníaco concentrado (3.5:1:2.5)
Solución estándar de saponina purificada en metanol
Solución de ácido sulfúrico en metanol (100 ml por litro)
Materiales y equipo
Extractor soxhlet
Rotoevaporador
Densitómetro con graficador
Planímetro
Desecador
Placa de gel de sílica para cromatografía (Kieselgel 60 F-254 Merck)
Procedimiento
En este punto hay una modificación al método propuesta por Miriam Monforte (CICY,
Mérida, Yucatán, México). En lugar de llevarlo a 250 ml como sugiere el método original,
es más recomendable concentrar la muestra, lo que permite cuantificar cantidades muy
pequeñas de saponina, para lo cual, pase el extracto metanólico a un rotoevaporador y
concentre a sequedad. Resuspenda el residuo con un mínimo de metanol y páselo a un
vial previamente pesado; si no se va a usar de inmediato, seque con nitrógeno y guárdelo
en desecador. Pese el vial con la muestra seca y calcule el peso del residuo. Para utilizar
la muestra, resuspenda con una cantidad conocida de metanol (alrededor de 1 ml).
Coloque puntos del extracto sobre una placa de gel de sílica y revélelos con una solución
n-butanol-etanol-amoníaco concentrado (3.5:1:2.5). Se pueden aplicar tres diferentes
métodos para identificar las manchas de saponina: (1) aspersíon con ácido acético-
anisaldeido; (2) tratamiento con nitrato de plata seguido de hidróxido de sodio y (3)
tratamiento con una suspensión de eritrocitos en buffer isotónico. Para mayores detalles
consulte a Fenwick y Oakenfull (1981).
Coloque series de puntos con volúmenes conocidos del extracto y de una solución
estándar de saponina sobre las placas de cromatografía. Los puntos deben ser colocados
de tal manera que cada punto de extracto vaya al lado de los de estándar de saponina.
Revele las placas de la misma manera que en el apartado anterior y las manchas deben
ser visualizadas mediante la aspersíon de una solución de ácido sulfúrico en metanol,
seguida de calentamiento a 110°C por 30 min. Mida la intensidad de las manchas de
saponina por medio de un densitómetro y calcule las áreas de los picos en el graficador
con un planímetro. los resultados son expresados como la relación (R) de las áreas de los
picos de la muestra desconocida con respecto a la del estándar.
6. REFERENCIAS
AOAC, 1984. Official Methods for Analysis of the Association of Official Analytical
Chemists, 14th edition. Arlington, VA, 1141 pp.
Archibald, R.M., 1946. Colorimetric determination of canavanine. J.Biol.Chem., 165: 169–
178.
Chow, K.W., Rumsey, G.L. and Woldroup, P.W., 1980. Linear programming in fish diet
formulation. In: Fish feed technology, UNDP/FAO/ADCO/REP/80/11, 395 pp.
Cockerell, I., Francis, B. and Halliday, D., 1971. Changes in nutritive value of concentrate
feedingstuffs during storage. Tropical Products Institute, London, U.K.
F.A.O., 1983. Fish feeds and feeding in developing countries - An interim report on the
ADCP Feedo Development Programme. ADCP/REP/83/18. 97 pp.
Fenwick, D.E. and Oakenfull, D., 1981. Saponin content of soya beans and some
commercial soya bean products. J. Sci. Food Agric., 32:273–278.
Frazer, A.C., 1967. Health problems in quality control: Chemical aspects. In: S. M.
Herschdoerfer (Editor), Quality Control in the Food Industry. Academic Press, London,
U. K., 385 pp.
Furukawa, H. and Tsukahara, H., 1966. On the acid digestion method for the
determination of chromic oxide as an index substance in the study of digestibility of
fish fed. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish., 32(6):502–508.
Caskey, D. D., Jr. and Knapp, F. C., 1944. Method for detecting inadequately heathed
soybean oil meal. Ind. Eng. Chem. Anal., 16:640.
Kent-Jones, D. W. and Amos, A. J. 1957. Modern Cereal Chemistry, fifth edition. The
Northern Publishing Co., LTD, Liverpool, England. pp. 59–60.
Krishna, G. and Ranjhan, S.K., 1980. Laboratory manual for nutrition research. Vikas
Publishing House PVT LTD, New Delhi, India. 134 pp.
Limborg, C. L., 1979. Industrial production of ready to use feeds for mass rearing of fish
larvae. Proc. World Symp. on Finfish Nutrition and Fish Feed Technology, Hamburg
20–23 june, 1978. Vol. II.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J., 1951. Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265–275
MAFF, 1982. The feeding stuffs (sampling and Analysis) regulations 1982. Minister of
Agriculture, Fisheries and Food. Her Majesty's Stationery Office, London U.K., 99 pp.
Matsumoto, H. and Sherman, G., 1951. A rapid colorimetric method for the determination
of mimosine. Arch. Biochem. Biophys., 33: 195–200.
New, B. B., 1987. Feed and feeding of fish and shrimp. A manual on the preparation and
presentation of compound feeds for shrimp and fish in aquaculture. FAO,
ADCP/REP/87/26, 275 pp.
Osborne, D. R. and Voogt, P. 1978. The analysis of nutrients in foods. Academic Press,
London, U.K., 240-pp.
Smith, J. E. and Moss, M. O. 1985. Micotoxins, formation, analysis and significance. John
Wiley & Sons. 148 pp.
Tacon, A. G. J., 1979. The nutritional evaluation of animal and food processing wastes.
3rd International Conference on Effluent Treatment in the Biochemical Industries.
London, 7th november 1979.
Wheeler, E. L. and Ferrel, R. E., 1971. A method for phytic acid determination in wheat
and wheat fractions. Cereal Chem., 48:312–320.
Williams, D. R., 1987. Animal feeding stuffs legislation of the U. K. A concise guide
Butterworths, London, U. K., 135 pp.