UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS INFORME DE

Facultad de Ciencias básicas e ingenierías LABORATORIO

Departamento de Biología y Química BIOQUÍMICA

PRODUCCIÓN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIÓN DE GLUCOSA

Jenny Garzón; Alexander Camelo

Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.
Programa

Resumen
El piruvato es un compuesto de importancia crucial en la bioquímica, ya que es el producto final de la glucólisis;
en la práctica se tuvo como objetivo identificar por medio de color la presencia de este durante la fermentación
de levadura, para llevar a cabo esto, se preparó la levadura en solución de fosfato de potasio monobásico y fosfato
de sodio dibásico, luego se separó cierta cantidad en 2 tubos de ensayo y se agregó a cada uno solución de glucosa,
se llevaron a baño maría, se agregó A.T.A y se centrifugaron, con el sobrenadante se realizó la prueba de piruvato
con dinitrofenilhidrazina dando al formación de dinitrofenilhidrazona, de manera que el piruvato se acumuló y se
presenció una formación de color rojo. Finalmente se realizó las mismas pruebas pero sin el sobrenadante con
solución glucosa, esta reacción se pudo evidenciar un color amarillo. Concluyendo que para la producción de
piruvato es necesario aislar y bloquear la enzima que cataliza esta reacción para obtener etanol.

Palabras clave: Glucolisis, fermentación, solución, piruvato

INTRODUCCIÓN se clasifican como ascomicetos. Están distribuidas por

todo el mundo en suelos y superficies vegetales, las le-
La mayoría de microorganismos utilizan la ruta gluco-
vaduras abundan sobre todo en medios azucarados,
lítica para degradar la glucosa y azucares afines (Espi-
como el néctar floral y las frutas (levadura, 2015).
tia, NF), ya sea parcialmente en fragmentos de dos o
La fermentación alcohólica produce muy poca energía
tres átomos de carbono cada uno, o bien, hasta CO2 y
neta: 2 ATP por cada piruvato obtenido de la glicólisis.
H2O (Gálvez y Vidblain, 2018). Cualquiera que sea el
Como resultado se obtiene también etanol (principal
resultado, el camino metabólico final siempre condu-
producto utilizado en las empresas productoras de vi-
cirá a piruvato. El piruvato se oxida a actil-CoA en pre-
nos, cervezas y vinagre) y dióxido de carbono (CO2).
sencia de oxígeno y continúa a través de ciclo de Krebs
La fermentación láctica ocurre en algunos organismos
y más tarde los electrones generados de ésta entran a
unicelulares y en tejidos animales. Su principal uso se
cadena respiratoria, donde dos moléculas de NADH ce-
da en la obtención de quesos, yogur, salsa de soya, y
den sus hidrógenos al oxígeno, de manera que se forma
otros productos derivados de la leche. En los tejidos en
agua y el NADH se oxida a NAD+ para ser nuevamente
animales, se produce ácido láctico (o lactato) a partir
reutilizado en glucolisis y ciclo de Krebs tantas veces
del piruvato. En células musculares, cuando el suminis-
sea necesario, pues su concentración es limitada. Por lo
tro y las reservas de oxígeno (mioglobina) se agotan du-
contrario, en ausencia de oxígeno, la célula debe buscar
rante ejercicio físico extenuante, el piruvato deja de in-
la manera de reoxidar el NADH, de no ser así la gluco-
gresar a las mitocondrias (ingresan en presencia de O2
lisis se detiene y a su vez el ciclo de Krebs, esta nueva
para obtener energía) y comienza la fermentación lác-
manera de oxidación se conoce como fermentación
tica (anaerobia). Las grandes cantidades de lactato son
(Espitia, NF).La Levadura es cualquiera de ciertos hon-
gos normalmente unicelulares, la mayoría de los cuales
las responsables de la fatiga y dolor muscular (Berg J., A se agregó 2.5mL de suspensión de levadura al 10%
Tymoczko J., Stryer L., 2007). P/V en solución de fosfato de potasio monobásico 0,5
Para estas prácticas pueden existir varias situaciones M; al tubo B se agregó 2.5 mL de suspensión de leva-
que no permitan que se den los resultados esperados, dura al 10% P/V en solución de fosfato de sodio dibá-
como lo son: medidas inexactas en los reactivos o sico 0,5M. Luego se colocaron los 2 tubos a baño de
muestras, poco tiempo de los baños maría, contamina- maría a 37°C durante 1 hora (fig. 2).
ción de los reactivos, temperatura no optima, entre Tubos de
otros; para llevar al cabo la práctica se tuvieron en ensayo
cuenta varios objetivos, como: Determinar la produc-
ción de piruvato durante la fermentación de glucosa por Beaker
levadura e Identificar la presencia de piruvato mediante
Agua
cambios de color con la 2,4 – dinitrofenilhidracina.
SECCIÓN EXPERIMENTAL.
En la práctica de producción de piruvato durante la
fermentación de glucosa se utilizaron los siguientes
equipos, materiales y reactivos: balanza, centrifuga y fig. 2, baño maría de tubos de ensayo
baño maría; 4 tubos de ensayo, 2 tubos para centrifuga,
beaker de 400 mL, 3 pipetas de 5 mL, pinzas para tubos Después de pasar la hora al baño de maría, se agregó
de ensayo, gradilla para tubos de ensayo y espátula; so- a cada tubo 2 mL de A.T.A al 10% P/V, se mezcló vi-
lución de glucosa al 10%, fosfato de sodio monobásico gorosamente y centrífugo durante 10 minutos a 2500
al 0.5 M, ácido tricloroacetico al 10%, 2.4 – dinitrofe- rpm (fig. 3).
Centrifuga
nilhidracina saturado en HCl 2M, NaOH al 10% y leva-
dura.
Como primer paso se pesaron 5.0 g de lavadura en un
beaker, allí mismo se adicionaron más o menos 30 mL
de solución de fosfato de potasio monobásico, se revol-
vió hasta disolver (fig. 1), luego se pasó a un balón afo- Tubos para
centrifuga
rado de 50 mL, donde se llenó de la misma solución de
fosfato de potasio monobásico hasta el aforo; este
mismo proceso se realizó pero con la solución de fos-
fato de sodio monobásico.
Varilla de fig. 3. Centrifugación de los 2 tubos de ensayo
agitación

Beaker
Tubos para
Suspensión centrifuga
de leva-
dura

fig. 1. Preparación de levadura con solución de fosfato mo- Sobrenadante

nobásico.
fig. 4. tubos después de los 10 minutos de la centrifuga.
En dos tubos de ensayo A y B se añadió respectiva-
mente 2.5 mL de solución de glucosa al 10%. Al tubo
Al pasar los 10 minutos de centrifugado se sacaron los
tubos (fig. 4); en dos tubos más se sacó 1 mL del so-
brenadante de cada tubo y se agregó 0.5 mL de solu-
ción saturada de 2,4- dinitrofenilhidracina en HCl 2M.
Se Mezclaron fuertemente cada preparado; dé cada
tubo se tomó 0,5 mL de la mezcla y agrego 1 mL de
NaOH al 10% y 0,5 mL de agua. La formación de un
color rojo indico la presencia de piruvato. Este mismo
proceso después del centrifugado se repitió usando una
solución de glucosa en vez del sobrenadante.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
A B
Fig 5. Fermentación de glucosa por levadura (tubo A: Glu-
cosa +suspensión de levadura y fosfato de sodio dibásico;
tubo B: Glucosa +suspensión de levadura y fosfato de pota-
sio monobásico)
Glucosa +
NaOH
Mezcla de sobrena-
dante y 2,4 dinitrofe-
nilhidrazina + NaOH
(positivo)
Fig. 6. Prueba de presencia de piruvato
La fermentación alcohólica en azucares en la levadura,
consiste en la degradación de glucosa mediante la se-
cuencia glicolitica que produce acido pirúvico y NAD2
(Guevara & Jiménez, 2007).
Las levaduras llevan principalmente una fermentación
alcohólica donde el acetaldehído formado por descar-
boxilacion del ácido pirúvico es usado como receptor
de protones para re oxidar el NADH2, produciéndose
por consiguiente etanol (fig. 7)(Guevara B. & Jiménez,
2007).
El procedimiento de baño maría permitió la activación
de la fermentación en las levaduras gracias a las condi-
ciones adecuadas de temperatura que fueron optimas,
para su desarrollo con el vertimiento de A.T.A (fig. 5)
(ácido tricloroacetico) a cada tubo de la centrifuga. Esto
permitió la eliminación a través de precipitación de coa-
gulo de proteínas en las muestras para la obtención del
sobrenadante.
Para completar el proceso fueron importantes dos reac-
ciones, una el ácido pirúvico es descarboxilado por la
acción de la enzima piruvato descarboxilasa producién-
dose acetaldehído; eso a su vez es reducido por la en-
zima alcohol deshidrogenasa empleando los equivalen-
tes reductores del NAD2 produciendo etanol. Con estas
reacciones se consigue manteniendo en equilibrio las
condiciones de óxido reducción del citosol (Nelson &
Cox, 2009).
P
Fig 7. Reacción para la fermentación alcohólica.
El piruvato reacciona con las 2.4 dinitrofenilhidrazina
para poder formar dinitrofenilhidrazona (amarillo), La
adición de NaOH la piruvatodescarboxilasa no es activa
en soluciones alcalinas, de manera que el piruvato se
acumuló y su presencia pudo demostrarse por la forma-
ción de un coloreado rojo (fig. 6).
 no es activa en soluciones ligeramente alcali-
nas y su presencia pudo demostrarse por la
reacción 2,4 dinitrofenilhidrazina
 la presencia de piruvato se determinó cam-
biando las condiciones fisiológicas para que la
enzima funcionara a una velocidad muy por de-
bajo de su actividad máxima.

REFERENCIAS.
Levadura 2015. En enciclopedia moderna. Recuperado
el 25 de octubre de 2015, de enciclopedia Británica:
Berg J., Tymoczko J., Stryer L., (1997) “Bioquímica”
Barcelona (España): editorial reverté, pág. 447-448
Fig 10. Reacción entre 2.4 dinitrofenilhidrazina + glucosa.

Esta reacción dio como resultado un color amarillo de- Contreras Ramon, 2015. Importancia del piruvato, guía
bido a que su glucosa es un azúcar reductor esto le per- biología
mitió reaccionar una Osazona dando como resultado
positivo. Espitia P. Nicolás, NF; Producción de piruvato acetal-
Al añadir NaOH a la solución de glucosa este actúa di- dehído y etanol por fermentación de la glucosa con las
rectamente rompiendo la estructura y convirtiéndola enzimas de la levadura. UTADEO
parcialmente en fructosa y otros productos de descom-
posición (Ege, 2004). Esto es una etapa de suma impor- Gálvez miranda y Vidblain Gabriel, 2018. Producción
tancia en la glicolisis, al llevar a cabo esta reacción se de piruvato y acetaldehído durante la fermentación Di-
produce un cambio de coloración. visión de Ciencias Naturales y Exactas, Biología Expe-
rimental Universidad de Guanajuato
El piruvato es el producto final de la degradación de la Ege, S (2004) Quimica organica estructura y reactivi-
glucosa en la glucolisis y es el sustrato del ciclo de dad Barcelona: Reverte S.A
Krebs, principal ruta de la formación de energía bioquí- Guevara & Jiménez G. (2007) Manuela de laboratorio
mica de las células, tanto en forma de ATP como de San José: Editorial de la Universidad de la Costa Rica
poder reductor NADH.Además el piruvato puede ser
Nelson, D, & amp;amp; cox, M (2009) Lehninger prin-
sustrato para enzimas que cataolizan la formación de
cipios de Bioquímica Barcelona: omega
aminoácidos de alanina; En aquellos seres vivos que
utilizan el oxígeno como dador electrónico la molécula
de piruvato puede ser rota por el complejo enzimático
de la piruvato deshidrogenasa, formándose en el pro-
ceso dióxido de carbono y acetil coenzima A, de esta
manera entrará en el ciclo de Krebs. Si por el contrario
el ser vivo no puede emplear oxígeno o, simplemente
es un organismo anaeróbico, el ácido pirúvico entrará
en la fermentación láctica, donde producirá ácido lác-
tico o alcohólica reduciendo el piruvato o etanol ( Con-
treras, 2015), proceso visto anteriormente.

CONCLUSIONES

 El piruvato se obtuvo a través de la acumula-

ción debido a que la pirúvico-descarboxilasa